Borrelia 14kD + OspC IgM ELISA

Transkript

1 Instructions for Use Borrelia 14kD + OspC IgM ELISA Enzyme immunoassay for the in-vitro diagnostic semi-quantitative or quantitative determination of IgM antibodies against the 14 kd and OspC antigens of Borrelia burgdorferi in human serum, plasma and CSF. Infections with all three B. burgdorferi subspecies (garinii, afzelii and senso strictu) are detected. RE C IBL GESELLSCHAFT FÜR IMMUNCHEMIE UND IMMUNBIOLOGIE MBH FLUGHAFENSTRASSE 52a D HAMBURG GERMANY Phone: +49 (0) IBL@IBL-Hamburg.com Fax: +49 (0)

2 ENGLISH 1. INTENDED USE Enzyme immunoassay for the in-vitro diagnostic semi-quantitative or quantitative determination of IgM antibodies against the 14 kd and OspC antigens of Borrelia burgdorferi in human serum, plasma and CSF. Infections with all three B. burgdorferi subspecies (garinii, afzelii and senso strictu) are detected. 2. SUMMARY AND EXPLANATION Borrelia burgdorferi, a bacterium of the Spirochaetaceae, is the ethiologic agent of Lyme disease (Borreliosis) being the most common disease in Europe and the USA transmitted by tics (Ixodes sp.). Lyme borreliosis is a multi-systemic disease with a broad spectrum of clinical symptoms. A typical symptom of the acute phase is the erythema chronicum migrans (ECM), often accompanied by flue-like symptoms. In later stages of the disease arthritis, carditis, as well as neurological and dermatological manifestations may occur. Lyme borreliosis can be treated with antibiotics in all stages. Therefore, a safe and sensitive laboratory diagnosis of Lyme borreliosis, also detecting the early stage of diseases, is of major importance, since an early treatment is most appreciated. IgM antibodies usually appear approximately three weeks after the infection, IgG antibodies after four to six weeks. The early immune reaction is mainly directed against the 14 kd region of the flagellin and the OspC (Outer surface protein C) and is then spread on more and more bacterial proteins. In the Borrelia burgdorferi 14 kd + OspC IgM ELISA the Borrelia burgdorferi-specific part of the flagellin is used as a recombinant protein for antibody binding. The results of extensive comparative studies with ELISA, IFA and agglutination tests as well as Western Blot demonstrate that the 14 kd IgM ELISA shows a higher specificity as well as an increased sensitivity for the early immune response in Lyme borreliosis. In addition to the recombinant 14 kd protein the native OspC protein is used as coating antigen in the IBL Borrelia 14 kd + OspC IgM ELISA. Usually the acute phase is indicated by high titers of IgM antibodies. High IgG titers with low or without IgM antibodies occur when borreliosis is subsiding (due to therapy or spontaneously) or during the chronic stage. The Borrelia IgM test can be used for the diagnosis of Lyme borreliosis in the acute and chronic stage of the disease both requiring a therapy. Patients with a subsided borreliosis which does not require therapy any more will not show positive results. 3. TEST PRINCIPLE Solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on the sandwich principle. The wells are coated with antigen. Specific antibodies of the sample binding to the antigen coated wells are detected by a secondary enzyme conjugated antibody (E-Ab) specific for human IgM. After the substrate reaction the intensity of the color developed is proportional to the amount of IgM-specific antibodies detected. Results of samples can be determined directly using the standard curve or Cut-off standard. 4. WARNINGS AND PRECAUTIONS 1. For in-vitro diagnostic use only. For professional use only. 2. Before starting the assay, read the instructions completely and carefully. Use the valid version of the package insert provided with the kit. Be sure that everything is understood. 3. In case of severe damage of the kit package please contact IBL or your supplier in written form, latest one week after receiving the kit. Do not use damaged components in test runs, but keep safe for complaint related issues. 4. Observe lot number and expiry date. Do not mix reagents of different lots. Do not use expired reagents. 5. Follow good laboratory practice and safety guidelines. Wear lab coats, disposable latex gloves and protective glasses where necessary. 6. Reagents of this kit containing hazardous material may cause eye and skin irritations. See MATERIALS SUPPLIED and labels for details. Material Safety Data Sheets for this product are available on the IBL- Homepage or upon request directly from IBL. 7. Chemicals and prepared or used reagents have to be treated as hazardous waste according to national biohazard and safety guidelines or regulations. 8. Avoid contact with Stop solution. It may cause skin irritations and burns. 9. All reagents of this kit containing human serum or plasma have been tested and were found negative for HIV I/II, HBsAg and HCV. However, a presence of these or other infectious agents cannot be excluded absolutely and therefore reagents should be treated as potential biohazards in use and for disposal. Version 2.1 / / 6

3 ENGLISH 5. STORAGE AND STABILITY The kit is shipped at ambient temperature and should be stored at 2-8 C. Keep away from heat or direct sun light. The storage and stability of specimen and prepared reagents is stated in the corresponding chapters. The microtiter strips are stable up to 3 mon in the broken, but tightly closed bag when stored at 2 8 C. 6. SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE Serum, Plasma (EDTA) The usual precautions for venipuncture should be observed. It is important to preserve the chemical integrity of a blood specimen from the moment it is collected until it is assayed. Do not use grossly hemolytic, icteric or grossly lipemic specimens. Samples appearing turbid should be centrifuged before testing to remove any particulate material. Storage Serum/Plasma/CSF: 2-8 C -20 C (Aliquots) Stability Serum/Plasma/CSF: 5 d 12 mon 7. MATERIALS SUPPLIED Quantity Symbol Component 1 x 12x8 MTP IgM 1 x 12 ml ENZCONJ IgM 4 x 1.5 ml CAL A-D 1 x 1.5 ml CONTROL + 1 x 1.5 ml CONTROL - 1 x 100 ml DILBUF M 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 12 ml TMB SUBS 1 x 12 ml TMB STOP Microtiter Plate Break apart strips. Coated with specific antigen. Keep away from heat or direct sun light. Avoid repeated freeze-thaw cycles. Enzyme Conjugate Ready to use. Red colored. Contains: anti-human IgM, conjugated to peroxidase. Standard A-D 2; 10; 25; 100 U/mL Standard B = Cut-off Standard Ready to use. Contains: IgM antibodies against B. burgdorferi, stabilizers. Positive Control Ready to use. Contains: IgM antibodies against B. burgdorferi, stabilizers. Negative Control Ready to use. Contains: human serum, stabilizers. Diluent Buffer IgM Ready to use. Blue colored. Contains: RF-Absorbent (goat anti-human IgG). Wash Buffer, Concentrate (10x) Contains: phosphate buffer, stabilizers. TMB Substrate Solution Ready to use. Contains: TMB, Buffer, stabilizers. TMB Stop Solution Ready to use. 1 M H 2SO MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 1. Micropipettes (Multipette Eppendorf or similar devices, < 3% CV). Volumes: 5; 10; 100; 1000 µl (adjustable) 2. Vortex mixer 3. Tubes ( 1 ml) for sample dilution 4. Incubator, 37 C 5. 8-Channel Micropipettor with reagent reservoirs 6. Wash bottle, automated or semi-automated microtiter plate washing system 7. Microtiter plate reader capable of reading absorbance at 450 nm (reference wavelength nm) 8. Bidistilled or deionised water 9. Paper towels, pipette tips and timer 9. PROCEDURE NOTES 1. Any improper handling of samples or modification of the test procedure may influence the results. The indicated pipetting volumes, incubation times, temperatures and pretreatment steps have to be performed strictly according to the instructions. Use calibrated pipettes and devices only. 2. Once the test has been started, all steps should be completed without interruption. Make sure that required reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time. Allow all reagents Version 2.1 / / 6

4 ENGLISH and specimens to reach room temperature (18-25 C) and gently swirl each vial of liquid reagent and sample before use. Mix reagents without foaming. 3. Avoid contamination of reagents, pipettes and wells/tubes. Use new disposable plastic pipette tips for each component and specimen. Do not interchange caps. Always cap not used vials. Do not reuse wells/tubes or reagents. 4. Use a pipetting scheme to verify an appropriate plate layout. 5. Incubation time affects results. All wells should be handled in the same order and time sequences. It is recommended to use an 8-channel Micropipettor for pipetting of solutions in all wells. 6. Microplate washing is important. Improperly washed wells will give erroneous results. It is recommended to use a multichannel pipette or an automatic microplate washing system. Do not allow the wells to dry between incubations. Do not scratch coated wells during rinsing and aspiration. Rinse and fill all reagents with care. While rinsing, check that all wells are filled precisely with Wash Buffer, and that there are no residues in the wells. 7. Humidity affects the coated wells/tubes. Do not open the pouch until it reaches room temperature. Unused wells/tubes should be returned immediately to the resealed pouch including the desiccant. 10. PRE-TEST SETUP INSTRUCTIONS Preparation of lyophilized or concentrated components Dilute/ dissolve Component 100 ml Wash Buffer Dilution of Samples ad 1000 ml Diluent bidist. water 1:10 Remarks Storage Stability Resolve crystals at C. 2-8 C 2-3 mon Relation Serum, Plasma Sample to be diluted with Relation Remarks Serum, Plasma generally Diluent Buffer 1:101 e.g. 10 µl + 1 ml Samples containing concentrations higher than the highest standard have to be diluted further Serum/CSF For diagnostics of cerebrospinal fluid (CSF) according to Reiber, it is necessary to use approximately similar concentrations or Cut-off indices (COI) in the OD range of 2.0 to 0.3 for serum and CSF. This is generally ensured with the following dilutions: Sample to be diluted with Relation Remarks Serum generally Diluent Buffer 1:401 e.g. 5 µl + 2 ml CSF generally Diluent Buffer 1:4 50 µl µl The Cut-off indices are corrected by the dilution factors of each dilution in relation to the 1:101 dilution: The Cut-off index for the 1:401 serum dilution must be multiplied by 4 and the 1:4 CSF dilution must be divided by 25. A set of dilutions should be performed, if the test sample results are not within the range of 2.0 to 0.3 OD. The following dilutions are recommended: Serum 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 CSF 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 IgM samples must not be treated with RF-Absorbent, because the RF-Absorbent is already part of the Diluent Buffer. The time until the samples are dispensed should be < min. Version 2.1 / / 6

5 ENGLISH 11. TEST PROCEDURE 1. Pipette 100 µl of each Standard, Control and diluted sample into the respective wells of the Microtiter Plate. In the semiquantitative test only Standard B (Cut-off Standard) is used. 2. Incubate 1 h at 37 C. Use cover or moisture chamber. 3. Remove adhesive foil. Discard incubation solution. Wash plate 3 x with 300 µl of diluted Wash Buffer. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. 4. Pipette 100 µl of Enzyme Conjugate into each well. 5. Incubate 30 min at 37 C. Use cover or moisture chamber. 6. Remove adhesive foil. Discard incubation solution. Wash plate 3 x with 300 µl of diluted Wash Buffer. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. 7. For adding of Substrate and Stop Solution use, if available, an 8-channel Micropipettor. Pipetting should be carried out in the same time intervals for Substrate and Stop Solution. Use positive displacement and avoid formation of air bubbles. 8. Pipette 100 µl of TMB Substrate Solution into each well. 9. Incubate 30 min at RT in the dark. 10. Stop the substrate reaction by adding 100 µl of TMB Stop Solution into each well. Briefly mix contents by gently shaking the plate. 11. Measure optical density with a photometer at 450 nm (Reference-wavelength: nm) within 60 min after pipetting of the Stop Solution. 12. QUALITY CONTROL The test results are only valid if the test has been performed following the instructions. Moreover the user must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All kit controls must be found within the acceptable ranges as stated on the vial labels. If the criteria are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples as further controls. In case of any deviation the following technical issues should be proven: Expiration dates of (prepared) reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials. 13. CALCULATION OF RESULTS The evaluation of the test can be performed either semi-quantitatively or quantitatively Semi-Quantitative Evaluation The Cut-off value is given by the optical density (OD) of the Standard B (Cut-off standard). The Cut-off index (COI) is calculated from the mean optical density of the sample and Cut-off value. If the optical density of the sample is within a range of 10 % around the Cut-off value (grey zone), the sample has to be considered as borderline. Samples with higher ODs are positive, samples with lower ODs are negative. Typical Example: Cut-off = OD (Standard B, Cut-off standard) = 0.45 Sample OD = 0.60 Cut-off index (COI): 0.60 / 0.45 = The sample has to be considered positive Quantitative Evaluation The obtained OD of the standards (y-axis, linear) are plotted against their concentration (x-axis, logarithmic) either on semi-logarithmic graph paper or using an automated method. A good fit is provided with cubic spline, 4 Parameter Logisitcs or Logit-Log. For the calculation of the standard curve, apply each signal of the standards (one obvious outlier of duplicates might be omitted and the more plausible single value might be used). The concentration of the samples can be read from the standard curve. The initial dilution has been taken into consideration when reading the results from the graph. Results of samples of higher predilution have to be multiplied with the dilution factor. Samples showing concentrations above the highest standard can be diluted as described in PRE-TEST SETUP INSTRUCTIONS and reassayed. Version 2.1 / / 6

6 ENGLISH Typical Calibration Curve (Example. Do not use for calculation!) Standard U/mL Mean OD A B C D ,50 2,00 1,50 1,00 0,50 OD 450 nm 0, Borrelia IgM (U/mL) 14. INTERPRETATION OF RESULTS / EXPECTED VALUES Method Range Interpretation Quantitative (Standard curve): Semi-Quantitative (Cut-off Index, COI): >11 U/mL positive 9 11 U/mL borderline <9 U/mL negative >1.1 positive borderline <0.9 negative The results themselves should not be the only reason for any therapeutical consequences. They have to be correlated to other clinical observations and diagnostic tests. In case of IgM negative results with negative IgG an acute borreliosis is unlikely. However, a fresh infection can not be fully excluded if the sample has been collected within less than three weeks after infection as no specific antibodies are formed within this period. If the sample is borderline or positive for IgG, the result indicates a late or chronic infection as well as polyclonal antibody stimulation caused by other infections. A polyclonal stimulation can be excluded by a Western Blot analysis. Results should be confirmed by a followup control after 14 days. IgM borderline results accompanied by negative IgG results may occur in acute infection and should be confirmed by a follow-up control after 14 days (titers constant or increasing) or by Western Blot analysis. If IgG results are positive or borderline, this result is indicative for a persisting acute infection requiring therapy. However, polyclonal stimulation should be excluded as above. IgM positive values with coincident negative IgG results are indicative for an acute infection in the early phase. IgM positive results with positive or borderline IgG are indicative for a persisting acute infection. The Borrelia 14 kd + OspC IgM ELISA shows high sensitivity and specificity for the detection of the early immune response to Borrelia burgdorferi infection. Due to the use of the recombinant 14 kd fragment of Borrelia flagellin and the purified native OspC, to which the early immune response is mainly directed, this test recognizes a Borrelia infection much earlier than other ELISA, hemagglutination or Western Blot techniques which employ an antigen prepared from ultrasonicated Borreliae. During further course of infection antibodies are formed against various other antigens. This results in a decrease of the absolute concentration of antibodies against the 14 kd fragment and the OspC. However, these antibodies will not disappear totally, so that also persisting or chronic infections are detected with high reliability. The Borrelia 14 kd + OspC IgM ELISA is also suitable for the follow-up control of a successful therapy. In this case it has to be taken into account that antibody titers do not decrease significantly until 2-4 months after the infection is cured. The results for the IgM assay may be increased unspecifically in pregnants. In such a case a reconfirmation of the results with a blot and observation of the course after 14 days is advised. 15. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Specimen collection has a significant effect on the test results. See SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE for details. For cross-reactivities, see PERFORMANCE. Azide and thimerosal at concentrations > 0.1 % interfere in this assay and may lead to false results. Version 2.1 / / 6

7 ENGLISH The following blood components do not have a significant effect (+/- 20 %of expected) on the test results up to the below stated concentrations: Hemoglobin 2.0 mg/ml Bilirubin 0.3 mg/ml Triglyceride 2.5 mg/ml 16. PERFORMANCE Analytical Specificity (Cross Reactivity) Precision Linearity Intra-Assay Method Comparison versus ELISA & Western Patient Group Negative Results / tested samples Lues (Treponema pallidum) 8/8 Rubella IgM positive 7/9 Parvovirus IgM positive 18/19 Measles IgM positive 8/8 CMV IgM/IgG positive 8/8 HSV IgM/IgG positive 8/8 VZV IgM positive 15/18 EBV IgM positive 6/8 Range COI / U/mL CV (%) <1 / < n=20 >1 / > Inter-Assay 0.3 / / n= / / Range (OD) Serial dilution range Range (%) :1 1: Rel. Sensitivity 100 % Blot Rel. Specificity > 95 % Automation This test has been validated with, e.g, BEPIII (Dade Behring), TRITURUS (Grifols) CSF Determination The ELISA for Lyme specific IgM has been performed with serum and CSF in 5 appropriate dilutions each: Serum 1:100-1:1600 and CSF 1:2-1:32. Serum/CSF pairs have been taken from the same day and the determination has been based on the evaluation program for CSF diagnosis by Prof. Reiber. For the evaluation serum/csf pairs with intrathecally produced Lyme specific IgM with and without pathologic diffusion rate from blood to brain were taken. All IBL-Hamburg ELISA test results were in accordance to the clinical symptoms and reference test results. Version 2.1 / / 6

8 DEUTSCH 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunoassay zur semi-quantitativen oder quantitativen in-vitro-bestimmung von IgM-Antikörpern gegen die Borrelia burgdorferi-antigene 14 kd (Flagellinfragment) und OspC in humanem Serum, Plasma und Liquor. Es werden Infektionen mit allen drei Borrelia burgdorferi-subspecies (garinii, afzelii und senso strictu) erfasst. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Die Lyme-Borreliose, die durch die Infektionen mit der Spirochaete Borrelia burgdorferi ausgelöst wird, stellt heute die häufigste durch Zecken übertragene Infektionskrankheit in Europa und den USA dar. Es handelt sich dabei um eine multisystemische Erkrankung mit vielfältigen klinischen Manifestationen. Die Krankheit verläuft in drei Stadien mit zunehmend schwerem Krankheitsbild. Typisch für die Akutphase ist das Erythema chronicum migrans (ECM), das häufig von grippeähnlichen Symptomen begleitet wird. Später können Arthritis, Karditis sowie neurologische und dermatologische Manifestationen auftreten. Obwohl die Borreliose in allen Stadien mit Antibiotika behandelt werden kann, ist eine frühestmögliche Behandlung wegen der besseren Heilungschancen wünschenswert. Daher ist eine sichere und sensitive Labordiagnose gerade in den frühen Stadien von großer Wichtigkeit. IgM-Antikörper treten meist ca. 3 Wochen, IgG-Antikörper 4-6 Wochen nach Beginn der Infektion auf. Die Akutphasen zeichnen sich im Allgemeinen durch hohe IgM-Antikörperkonzentrationen im Serum aus. Dabei richtet sich die frühe Immunantwort hauptsächlich gegen das Flagellin (41 kd) und gegen das Outer Surface Protein C (OspC). Das Flagellin (41 kd) besteht aus einem Borrelien-spezifischen Bereich und Bereichen, die auch bei anderen Bakterien vorkommen. Das in diesem Test verwendete, in E. coli exprimierte, rekombinante 14 kd-fragment entspricht der Borrelien-spezifischen Region des Flagellins, die bei allen drei Subspecies identisch ist. Zusätzlich wird in dem vorliegenden ELISA natives OspC als Antigen eingesetzt. Bei spontan oder therapiebedingt abklingenden Akutphasen bzw. beim Übergang zu chronischen Stadien können hohe Serum-IgG-Konzentrationen neben niedrigen bis negativen IgM-Antikörpertitern auftreten. Auch hier ist eine Therapie erforderlich. Aus diesem Grunde ist die Durchführung des Borrelien-IgG-Tests insbesondere dann sinnvoll, wenn Seren von Patienten mit Verdacht auf Borreliose negativ im IgM-Test sind oder wenn eine genauere Abklärung des Immunstatus stattfinden soll. Bei einer abgeklungenen, nicht mehr behandlungsbedürftigen Borrelien-Infektion sind weder IgM- noch IgG-Antikörper nachweisbar. 3. TESTPRINZIP Sandwich-Enzymimmunoassay (ELISA). Die Wells der Mikrotiterstreifen sind mit Antigen beschichtet. Die spezifischen Antikörper der Probe binden an die Antigen-beschichteten Wells und werden von einem zweiten enzymmarkierten Antikörper (E-Ab), der gegen humanes IgM gerichtet ist, detektiert. Die Intensität der gebildeten Farbe nach der Substratreaktion ist proportional zur IgM-Konzentration. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve oder des Cut-off Standards bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. Version 2.1 / / 7

9 DEUTSCH 9. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf HCV, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zu 3 mon haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2 8 C gelagert wird. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Serum, Plasma (EDTA) Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Die chemische Integrität der Blutproben muss vom Zeitpunkt der Blutabnahme bis zur Testdurchführung erhalten bleiben. Keine hämolytischen, ikterischen oder lipämischen Proben verwenden. Getrübte Proben sollten vor der Testdurchführung zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Lagerung Serum/Plasma/Liquor: 2-8 C -20 C (aliquotiert) Haltbarkeit Serum/Plasma/Liquor: 5 d 12 mon 7. KOMPONENTEN DES KITS Anzahl/ Menge Symbol 1 x 12x8 MTP IgM 1 x 12 ml ENZCONJ IgM 4 x 1.5 ml CAL A-D 1 x 1.5 ml CONTROL + 1 x 1.5 ml CONTROL - 1 x 100 ml DILBUF M 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 12 ml TMB SUBS 1 x 12 ml TMB STOP Komponente Vor Hitze und Sonneneinstrahlung schützen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Mikrotiterplatte Wells einzeln abbrechbar. Beschichtet mit spezifischem Antigen. Enzymkonjugat Gebrauchsfertig. Rot gefärbt. Enthält: anti-human IgM, konjugiert mit Peroxidase. Standard A-D 2; 10; 25; 100 U/mL Standard B = Cut-off Standard Gebrauchsfertig. Enthält: IgM Antikörper gegen B. burgdorferi, Stabilisatoren. Positivkontrolle Gebrauchsfertig. Enthält: IgM Antikörper gegen B. burgdorferi, Stabilisatoren. Negativkontrolle Gebrauchsfertig. Enthält: Humanserum, Stabilisatoren. Verdünnungspuffer IgM Gebrauchsfertig. Blau gefärbt. Enthält: RF-Absorbens (Ziege anti-humanes IgG). Waschpuffer, Konzentrat (10x) Enthält: Phosphatpuffer, Stabilisatoren. TMB Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: TMB, Puffer, Stabilisatoren. TMB Stopplösung Gebrauchsfertig. 1 M H 2SO ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3% VK). Volumina: 5; 10; 100; 1000 µl (verstellbar) 2. Vortex-Mischer 3. Röhrchen ( 1 ml) zur Probenverdünnung 4. Inkubator, 37 C 5. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 6. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 7. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge nm) 8. Bidest. oder deionisiertes Wasser Version 2.1 / / 7

10 DEUTSCH 9. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 5. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 6. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 7. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. TESTVORBEREITUNGEN Vorbereitung lyophilisierter oder konzentrierter Komponenten Verd./ rekonst. Komponente 100 ml Waschpuffer Probenverdünnung ad 1000 ml Diluent bidest. Wasser Verhältnis 1:10 Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit Kristalle bei C lösen. 2-8 C 2-3 mon Serum, Plasma Probe zu verdünnen mit Verhältnis Bemerkungen Serum, Verdünnungspu immer Plasma ffer 1:101 z.b. 10 µl + 1 ml Proben mit Konzentrationen über dem höchsten Standard müssen weiter verdünnt werden Serum/Liquor Für die Untersuchung von Liquor nach Reiber sollten ähnliche Konzentrationen oder Cut-off Indices (COI) im OD Bereich von für Serum und Liquor verwendet werden. Dies ist normalerweise mit den folgenden Verdünnungen gewährleistet: Probe zu verdünnen mit Verhältnis Bemerkungen Serum immer Verdünnungspuffer 1:401 z.b. 5 µl + 2 ml Liquor immer Verdünnungspuffer 1:4 50 µl µl Version 2.1 / / 7

11 DEUTSCH Die Cut-off Indices werden mit den Verdünnungsfaktoren für jede Verdünnung in Relation zur 1:101 Verdünnung korrigiert: Der Cut-off Index für die 1:401 Serum Verdünnung wird mit 4 multipliziert und die 1:4 Liquor Verdünnung durch 25 dividiert. Wenn die Ergebnisse nicht im OD Bereich sind, sollten die Proben als Verdünnungsreihe gemessen werden. Dafür werden folgende Verdünnungen empfohlen: Serum 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 Liquor 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 IgM-Proben dürfen nicht mit RF-Absorbens behandelt werden, da dieses bereits im Verdünnungspuffer enthalten ist. Die Zeit zwischen Probenverdünnung und Auftrag auf die Mikrotiterplatte sollte min nicht überschreiten. 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Je 100 µl von jedem Standard, jeder Kontrolle sowie verdünnten Probe in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren. Für den semi-quantitativen Test wird nur Standard B (Cut-off Standard) verwendet h bei 37 C inkubieren. Haftklebefolie oder Feuchtigkeitskammer verwenden. 3. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 3 x mit je 300 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen µl Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren min bei 37 C inkubieren. Haftklebefolie oder Feuchtigkeitskammer verwenden. 6. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 3 x mit je 300 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 7. Substrat- und Stopplösung möglichst mit einer 8-Kanal-Pipette pipettieren und Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden µl TMB Substratlösung in jedes Well pipettieren min bei RT im Dunkeln inkubieren. 10. Substratreaktion durch Zugabe von je 100 µl TMB Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 11. Die optische Dichte innerhalb von 60 min nach Zugabe der Stopplösung mit einem Photometer bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge: nm). 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP- Regeln (Good Laboratory Practice) und andere einschlägige Normen und Gesetze beachten. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Die Testauswertung kann wahlweise semi-quantitativ oder quantitativ erfolgen Semi-Quantitative Auswertung Der Cut-off Wert ergibt sich aus der optischen Dichte (OD) des Standards B (Cut-off Standard). Der Cut-off Index (COI) wird aus der mittleren optischen Dichte der Probe und der des Cut-offs berechnet. Proben, deren optische Dichte sich nicht mehr als 10 % (Graubereich) von der des Cut-off Wertes unterscheidet, sind als grenzwertig zu beurteilen. Darüberliegende Proben sind positiv, darunterliegende negativ zu bewerten. Version 2.1 / / 7

12 DEUTSCH Typisches Beispiel: Cut-off = OD (Standard B, Cut-off Standard) = 0.45 OD (Probe) = 0.60 Cut-off Index (COI): 0.60 / 0.45 = Die Probe ist als positiv zu bewerten Quantitative Auswertung Die erhaltenen OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (linlog) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Konzentrationen der Proben können von der Standardkurve abgelesen werden. Die standardmäßig durchzuführende Verdünnung ist in dem oben beschriebenen Auswerteverfahren bereits berücksichtigt. Wenn Proben anders oder weiter verdünnt wurden, müssen die Ergebnisse mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, können wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Typische Standardkurve (Beispiel. Nicht zur Berechnung verwenden!) Standard U/mL Mittelwert OD A B C D ,50 2,00 1,50 1,00 0,50 OD 450 nm 0, Borrelia IgM (U/mL) 14. INTERPRETATION DER ERGEBNISSE / NORMWERTE Methode Bereich Interpretation Quantitativ (Standardkurve): Semi-Quantitativ (Cut-off Index, COI): >11 U/mL positiv 9 11 U/mL grenzwertig <9 U/mL negativ >1.1 positiv grenzwertig <0.9 negativ Therapeutische Konsequenzen sollten nicht allein aufgrund der mit diesem Test ermittelten Werte getroffen werden, sondern nur unter Berücksichtigung aller klinischen Beobachtungen und weiterer diagnostischer Mittel. IgM-negative Ergebnisse zusammen mit IgG-negativen Resultaten sprechen gegen eine Borrelien- Infektion. Dabei ist zu beachten, daß negative IgG- und negative IgM-Ergebnisse eine frische Borrelien- Infektion nicht ausschließen können, wenn die Blutentnahme weniger als 3 Wochen nach dem Zeckenstich erfolgte. Bei negativen IgM-Werten mit gleichzeitig positiven/grenzwertigen IgG-Werten kann es sich um eine schon länger persistierende Borreliose oder um eine polyklonale IgG-Stimulation aufgrund eines anderen Infektes handeln. Zum Ausschluß einer akuten Borreliose sollte eine Verlaufskontrolle nach 2 Wochen durchgeführt werden und eine Abklärung durch einen Western-Blot Test mit Vollantigen (Borrelien- Ultrasonikat) vorgenommen werden. IgM-grenzwertige Resultate mit IgG-negativen Ergebnissen können für eine akute Borreliose sprechen und sollten mit einer Verlaufskontrolle nach 14 Tagen kontrolliert (gleichbleibend oder Anstieg) bzw. im Western-Blot überprüft werden. Bei Patienten mit IgM-grenzwertigen und IgG-positiven/grenzwertigen Ergebnissen ist eine schon länger persistierende akute Borrelien-Infektion anzunehmen; es kann jedoch auch eine polyklonale Antikörperstimulation vorliegen, die im Western-Blot oder durch Verlaufskontrolle nach 14 Tagen ausgeschlossen werden sollte. Version 2.1 / / 7

13 DEUTSCH IgM-positive Ergebnisse sprechen zusammen mit negativen IgG-Werten für eine akute Borrelien-Infektion in der frühen Infektionsphase. Bei Patienten mit positiven IgM- und positiven/grenzwertigen IgG- Antikörperwerten liegt eine schon länger persistierende akute Borrelien-Infektion vor. Der Vorteil des Borrelia 14 kd + OspC IgM ELISA Tests liegt in seiner hohen Sensitivität bei ebenso hoher Spezifität gegenüber der frühen Immunantwort. Durch den Einsatz des rekombinanten 14 kd Flagellin-Fragments und des gereinigten nativen OspC als Antigen, gegen welche die frühe Immunantwort nahezu ausschließlich gerichtet ist, erkennt dieser Test eine Borrelien-Infektion deutlich früher als ein ELISA, Hämagglutinations oder Western-Blot-Test auf der Basis eines Borrelien-Ultrasonikats (Vollantigen). Im Verlauf einer Borrelien-Infektion weitet sich das Antikörperspektrum nach Wochen und Monaten zunehmend aus, so daß die absolute Konzentration der gegen das 14 kd Flagellin-Fragment und das OspC gerichteten Antikörper zwar abnimmt, jedoch die Antikörper nicht ganz verschwinden. Somit werden mit dem Borrelia 14 kd + OspC IgM ELISA auch lange persistierende bzw. chronisch verlaufende Borrelien- Infektionen mit hoher Sensitivität und Spezifität nachgewiesen. Der Borrelia 14 kd + OspC IgM ELISA läßt sich ebenfalls zur Therapie-Erfolgskontrolle einsetzen, jedoch sinken bei einer ausheilenden Borrelien-Infektion generell die Antikörperkonzentrationen erst nach 2-4 Monaten deutlich ab. Bei Schwangeren kann der IgM-Wert unspezifisch erhöht sein. Ein solcher Fall sollte mit einem Blot abgeklärt und der Verlauf nach 14 Tagen beurteilt werden. 15. GRENZEN DES VERFAHRENS Die korrekte Durchführung der Probengewinnung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -LAGERUNG. Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. Azid und Thimerosal in Konzentrationen > 0.1 % stören im Assay und führen evtl. zu falschen Ergebnissen. Die folgenden Blutbestandteile haben bis zu der angegebenen Konzentration keinen Einfluss auf die Testergebnisse (+/- 20 %): Hämoglobin 2.0 mg/ml Bilirubin 0.3 mg/ml Triglyceride 2.5 mg/ml 16. TESTCHARAKTERISTIKA Analytische Spezifität (Kreuzreaktivität) Präzision Linearität Intra-Assay Methodenvergleich versus ELISA & Western Patientengruppe Negative Ergebnisse / bestimmte Proben Lues (Treponema pallidum) 8/8 Röteln IgM positiv 7/9 Parvovirus IgM positiv 18/19 Masern IgM positiv 8/8 CMV IgM/IgG positiv 8/8 HSV IgM/IgG positiv 8/8 VZV IgM positiv 15/18 EBV IgM positiv 6/8 Bereich COI / U/mL VK (%) <1 / < n=20 >1 / > Inter-Assay 0.3 / / n= / / Bereich (OD) Serielle Verdünnung Bereich Bereich (%) :1 1: Rel. Sensitivität 100 % Blot Rel. Spezifität > 95 % Automatisierung Dieser Test wurde validiert mit, z.b., BEPIII (Dade Behring), TRITURUS (Grifols) Version 2.1 / / 7

14 DEUTSCH CSF Bestimmung Der Borrelia IgM ELISA wurde mit Serum und Liquor Proben in 5 geeigneten Verdünnungen durchgeführt: Serum 1:100-1:1600 und Liquor 1:2-1:32. Die Serum/Liquor Paare wurden den Patienten am selben Tag entnommen und die Auswertung der Ergebnisse wurde basierend auf dem Schema zur Liquor Diagnostik nach Prof. Reiber durchgeführt. Für die Validierung wurden Serum/Liquor Paare mit intrathekalen Borrelia spezifischen IgM mit und ohne Schrankenstörung des Blut-Liquorkompartments eingesetzt. Alle Ergebnisse, die mit dem IBL-Hamburg ELISA ermittelt wurden, waren in Übereinstimmung mit den klinischen Symptomen und den Ergebnissen der Referenzteste. Version 2.1 / / 7

15 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL - Hamburg GmbH Flughafenstr. 52A, D Hamburg, Germany IBL - Transatlantic LLC th Street, Osceola, WI 54020, USA Tel.: + 49 (0) Fax: ibl@ibl-hamburg.com WEB: Tel.: +1 (715) Fax: ibl@ibl-transatlantic.com WEB: LIABILITY: Complaints will only be accepted in written and if all details of the test performance and results are included (complaint form available from IBL or supplier). Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer. Symbols Version 3 /