Wie funktioniert der FORD Test (Free Oxygen Radicals Defence)?

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1 Wie funktioniert der FORD Test (Free Oxygen Radicals Defence)? Eine validierte Methode zur Messung der antioxidativen Kapazität des Blutes Einleitung Der oxidative Stress ist ein Phänomen des Gleichgewichts von Oxidanzien und Antioxidanzien. Lebende Organismen haben ein komplexes antioxidatives System entwickelt, um den freien Radikalen begegnen zu können. Auf diese Weise wird eine Gewebeschädigung durch oxidativen Stress vermindert. Ein Mangel an Antioxidanzien oder eine Überproduktion freier Radikale kann jedoch zu einem gefährlichen Ungleichgewicht im Organismus führen und somit zu einem Anstieg des oxidativen Stresses. Ein reduzierter Antioxidanzienspiegel wurde bei verschiedenen Krankheiten beobachtet, so bei Krebs und bei Herzinfarkt/ Schlaganfall, den häufigsten Todesursachen heutzutage. Die intrazelluläre antioxidative Kapazität lässt sich hauptsächlich auf enzymatische Reaktionen zurückführen, wohingegen im extrazellulären Bereich aus der Nahrung aufgenommene Antioxidanzien diese Funktion wahrnehmen. Das Blut spielt bei der Aufrechterhaltung des Redox-Gleichgewichts eine große Rolle, denn es dient dem Transport und der Verteilung der Antioxidanzien im Körper. Der Antioxidanzienspiegel im Plasma ergibt sich dabei aus der Interaktion vieler chemischer Verbindungen und metabolischer Reaktionen. Die wichtigsten Komponenten sind: - wasserlösliche Antioxidanzien 1. Proteine / SH-Gruppe / Albumin 2. Harnsäure 3. Ascorbinsäure - fettlösliche Antioxidanzien 1. Tocopherole 2. Carotenoide 1/13

2 Das Zusammenwirken verschiedener Antioxidanzien schützt besser vor dem Angriff aggressiver Sauerstoffverbindungen als die Einzelkomponenten für sich. Die Antioxidanzien im menschlichen Blut stellen eine heterogene Gruppe von Substanzen dar. Einige werden vom Körper selbst produziert, andere ausschließlich über die Nahrung zugeführt. Die Messmethoden zur Bestimmung des Antioxidanzienspiegels lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Im ersten Fall werden nur bestimmte Substanzen herausgegriffen und untersucht. Im zweiten Fall wird die gesamte antioxidative Kapazität abgeschätzt, indem die reduzierenden Eigenschaften bestimmter Körperflüssigkeiten (z. B. Plasma) untersucht werden. Den größten Beitrag leisten dabei Ascorbinsäure (Vitamin C), Harnsäure, Polyphenole und Proteine, wie Untersuchungen mit herkömmlichen Testverfahren mit hydrophilem Ansatz zeigen. Da sich diese Verbindungen im Prozess der Radikal-Reduzierung schnell verbrauchen, müssen sie entweder fortlaufend neu gebildet oder durch eine geeignete Ernährung bzw. Supplementierung dem Körper zugeführt werden. Die antioxidative Kapazität des Plasmas wird also sowohl durch die Bildung freier Radikale als auch durch die ernährungsbedingte Aufnahme von Antioxidanzien verändert. Sie kann daher als weitaus repräsentativer für das körpereigene Gleichgewicht von oxidierenden und antioxidierenden Verbindungen (bekannte und unbekannte, messbare und nichtmessbare) angesehen werden als die Konzentration einer einzigen ausgewählten antioxidativen Verbindung. Ein schnelles und einfaches Testverfahren, welches in der Lage ist, den kombinierten Effekt der Antioxidanzien im Blut zu bestimmen, kann einen wichtigen Beitrag zur Bestimmung der Abwehrkräfte gegen eine Schädigung durch freie Radikale leisten. Die verschiedenen Testansätze zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität im Blutplasma unterscheiden sich in Bezug auf ihr Oxidationsmittel, ihrer Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Antioxidanzien und in ihrer Messmethode. In den vergangenen Jahren wurden etliche Analyseverfahren zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität entwickelt. Dies zeigt das große Interesse an Antioxidanzien 2/13

3 als bioaktive Verbindungen in der Nahrung und als wichtige Komponenten in der Aufrechterhaltung der körperlichen Gesundheit bzw. bei der Abwehr von Krankheiten. Diese Testverfahren wurden jedoch ausschließlich für den Einsatz im Labor entwickelt. Tests zur Bestimmung der totalen antioxidativen Kapazität messen die Fähigkeit eines exogenen oxidierbaren Substrats, ein Pro-Oxidanz (Radikal-Induzierer) zu reduzieren, oder sie nutzen verschiedene vorab hergestellte Radikale oder Metallionen. In die erste Kategorie gehören der Total Radical Trapping Antioxidant Parameter (TRAP)-Test, der Dichlorofluorescein-Diacetate (DCFH-DA)-Test, Phycoerythrin (R-Pe)- und Crocin-basierte Verfahren. In die zweite Kategorie fallen Testverfahren, die die antioxidative Kapazität im Blutplasma anhand der Reduktion eines vorab gebildeten stabilen Radikals bestimmen, das nicht als Pro-Oxidanz reagiert. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)-Test, Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)-Test, das zyklisch-volumetrische Verfahren und unser Free Oxygen Radical Defense (FORD)-Test gehören in diese Kategorie. Der TEAC-Test basiert darauf, dass Antioxidanzien die Absorption des Radikalkations der 2,2 -azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) vermindern. Der Test wird von Randox Laboratories als TAS (Total Antioxidant Status)-Test kommerziell angeboten und kann nur im Labor eingesetzt werden. Da der TAS-Test eine weite Verbreitung gefunden hat, wurden Vergleichmessungen zwischen diesem und dem FORD Test durchgeführt. Messprinzip des FORD Tests 1,2 Das Messprinzip des FORD Tests beruht darauf, dass das Chromogen in der Anwesenheit eines sauren Puffers (ph 5.2) und eines geeigneten Oxidationsmittels (Fe 3+ ) ein stabiles farbiges Radikalkation bildet, das fotometrisch bei 505 nm erfasst werden kann. 3/13

4 Das Ultraviolett-Spektrum des FORD Chromogenradikals zeigt eine maximale Absorption bei 505 nm (Abb. 1). Der Maximalwert der Absorption wird nach 3 4 Minuten erreicht, wenn sich eine stabile farbige Lösung gebildet hat. Der Zeitverlauf bei der Bildung des FORD Chromogenradikals wird in Abb. 2 dargestellt. Bei 37 C geht die Absorption nach 3 4 Minuten in einen Maximalwert über, ein Plateau bildet sich. Der Test basiert also auf dem Ausmaß der Reduktion des Chromogenradikals, nicht auf deren Rate. Dieser Ansatz vermeidet eine komplizierte Messung der Zeitverläufe, wie sie für andere Testverfahren wie z. B. den Crocin-basierten Test 3,4 oder den ABTSbasierten Test 5 notwendig sind. Wird eine Probe mit Antioxidanzien zum Testansatz hinzu gegeben, wird das Chromogenradikal (farbig) reduziert (farblos), das heißt, die ursprünglich farbige Lösung wird nach und nach entfärbt, proportional zur Menge der Antioxidanzien, die hinzu gegeben wurde. Der FORD Test nutzt die vorab hergestellte Chromogenradikal-Lösung und bestimmt die Abnahme der Absorption, die proportional zur Antioxidanzien-Konzentration in der Blutprobe ist. Chromogen (uncolord) + oxidant (Fe 3+ ) + H + Chromogen + (purple) Chromogen + (purple) + AOH Chromogen (uncolored) + AO Messprinzip des TAS/Randox-Tests (gemäß Beipackzettel) Der Randox-TEAC-Test gebraucht ABTS und H 2 O 2, um ABTS-Radikalkationen zu generieren, in Gegenwart von Metmyoglobin (HX-Fe III ) als Peroxidase. Das ABTS- Radikalkation mit blau-grüner Farbe verfügt über eine relativ stabile Absorption bei 600 nm. Antioxidanzien in der Lösung vermindern die Bildung des farbigen Radikals in einem Ausmaß, das direkt proportional zu deren Konzentration in der Lösung ist. 4/13

5 HX-Fe III + H 2 O 2 X-[Fe IV =0] + H 2 O ABTS + X ABTS + (blu-green) + HX-Fe III 2,50 2, ,5 Abs 1, ,5 0,08 300, ,0 nm Abb. 1: Ultraviolett-Spektrum des FORD Chromogenradikals Abs A 1 0,8 0,6 0,4 0, Tempo/min Zeit/Minuten Abb. 2: Zeitverlauf des FORD Chromogenradikals bei 37 C, 505 nm. 5/13

6 Antioxidanzien-Messung Das Entfärben der Chromogenradikal-Lösung beim FORD Test wird besonders beeinflusst durch Antioxidanzien wie Albumin, reduziertes Glutathion, Vitamin C, Trolox (wasserlösliches Analogon des Vitamin E). Diese Antioxidanzien gehören zu den wichtigsten Substanzen in der plasmatischen antioxidativen Barriere. Den Einfluss verschiedener Antioxidanzien auf die Inhibierung des FORD- Chromogens zeigt Abb. 3. Die Dosis-Wirkungskurven, die man aus der Analyse verschiedener Antioxidanzien und -Konzentrationen (Vitamin C, Albumin, Glutathion, Harnsäure, Trolox-Standard) erhalten hat, wurden als Absorption der FORD- Chromogen-Lösung bei 505 nm gegen die Konzentration des Antioxidanz s aufgetragen. Das Ergebnis zeigt einen bedeutenden Einfluss von Ascorbinsäure, Trolox, Albumin und Glutathion auf den FORD Test, aber nicht von Harnsäure. Diejenige Antioxidanzien-Konzentration, die zur selben Absorption des Chromogen- Radikals führt wie eine Standardkonzentration Trolox, kann als Trolox-equivalente antioxidative Kapazität berechnet werden. In gleicher Weise kann mit einer Probe verfahren werden. Das Ergebnis des FORD Tests bezeichnet die Kapazität der plasmatischen Antioxidanzien, das Chromogen-Radikal zu reduzieren, in Bezug zu Trolox. Wie bei vielen anderen Methoden auch (u. a. der TAS-Test ) wird das Ergebnis des FORD Tests gemäß Miller et al.6 in Trolox-Equivalenten (mmol/l) angegeben. Dazu wird eine Kalibrationskurve benutzt, die in jedem Gerät gespeichert vorliegt. Ein Beispiel für eine Dosis-Wirkungskurve bei Einsatz von Trolox zeigt Abb. 4. Jeder Datenpunkt bezeichnet den Mittelwert aus vier Messungen, durchgeführt an vier verschiedenen Tagen. Die Hemmung der Absorption bei 505 nm verhält sich linear im Konzentrationsbereich von mmol/l Trolox. Der Wert der 6/13

7 Standardabweichung liegt sehr niedrig und der Kurvenverlauf ist gut reproduzierbar (CV < 5%). 0,8 0,7 0,6 Absorption 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Albumin Vitamin C Trolox GSH Antioxidanz/µm Abb. 3: Einfluss verschiedener Antioxidanzien auf die Inhibierung des FORD Chromogens 0,45 0,4 0,35 0,3 Abs 0,25 0,2 0,15 0,1 0, ,5 1 1,5 2 2,5 3 Trolox mmol/l Abb. 4: Einfluss der Inhibierung des FORD Chromogens bei Einsatz von Trolox 7/13

8 Biologisches Probenmaterial Der FORD Test wurde mit unterschiedlichen Arten biologischen Probenmaterials durchgeführt: Serum, menschliches Plasma, Vollblut. Die Proben wurden seriell verdünnt und dreimal getestet (Mittelwerte dargestellt in Abb. 5A, 5B, 5C). Die Dosis-Wirkungskurven des biologischen Probenmaterials sind in Abb. 5 dargestellt. Gute lineare Korrelation besteht zwischen der gemessenen Absorptionsabnahme und dem eingesetzten Probenvolumen. Das Ergebnis zeigt, dass eine Verdünnung des Probenmaterials das Endergebnis nicht beeinflusst. Beim Randox-Test hingegen führt eine Verdünnung der Probe zu einem bis zu 20%-igen Anstieg des TAS-Werts (gemäß beiliegender Testanleitung). Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die antioxidative Kapazität biologischen Probenmaterials im FORD Test bestimmt werden kann. 0,40 0,35 0,30 0,25 A 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 5A Abb. 5A Serum/µl Siero/ l Abb. 5A 8/13

9 0,16 0,14 0,12 A 0,10 0,08 0,06 0,04 5B Plasma/ l Abb. 5B 0,14 0,12 0,1 0,08 A 0,06 0,04 0,02 0 5C 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 Vollblut/µl Surnatante/ l Abb. 5C Abb. 5A, B, C: Einfluss der Inhibierung bei unterschiedlichen Arten von biologischem Probenmaterial Wiederholbarkeit Zur Bestimmung des testinternen Variationskoeffizienten wurden drei verschiedene Trolox-Konzentrationen (0.25, 9.125, mmol/l) jeweils zehnmal untersucht. Es wurde ein CV < 5% ermittelt. 9/13

10 Übereinstimmung FORD / TAS Der TAS-Test der Firma Randox gilt als eine der angesehensten Methoden zur Bestimmung der plasmatischen antioxidativen Kapazität im weltweiten Markt für Labortests. Er basiert auf der TEAC-Methode, die zuerst von Miller & Rice- Evans6,7,8 beschrieben wurde. Ein Vergleichstest zwischen dem FORD Test (Free Oxygen Radicals Defense, Callegari S.p.A., Italy) und dem TAS-Test (Randox Laboratories) wurde durchgeführt. Untersucht wurden 21 Proben Humanplasma in dreifacher Wiederholung. In die Studie wurden 21 gesunde Personen im Alter von Jahre (Mittelwert: 32 Jahre) einbezogen. Das Geschlechterverhältnis männlich/weiblich betrug 6/15. Alle Personen ernährten sich normal, 3 Personen waren Raucher. Der TAS-Test kann nur mit Serum- oder Plasmaproben durchgeführt werden. Daher wurden sowohl der TAS-Test als auch der FORD Test mit Plasmaproben durchgeführt. Die Analyse erfolgte bei 37 C mit einem Spektrofotometer (Perkin Elmer). Die gewonnenen Blutproben wurden in heparinisierten Röhrchen aufgefangen und anschließend für 5 Minuten zentrifugiert. Eine Plasmaprobe wurde entnommen und umgehend mit beiden Testverfahren analysiert. Das Ergebnis des TAS-Tests wurde gemäß der Testanleitung ermittelt und in mmol/l Trolox ausgedrückt (Referenzbereich: mmol/l). Das Ergebnis des FORD Tests wurde anhand einer Trolox-Kalibrierungskurve ermittelt und in mmol/l Trolox ausgedrückt. Zur statistischen Analyse der Resultate wurde Pearson s Korrelationskoeffizient (r) berechnet. 10/13

11 Wie Abb. 6 zeigt, wurde mit Ausnahme von 2 Werten eine gute Korrelation zwischen beiden Testverfahren gefunden (r=0.6587, p<0.01). Der beobachtete Achsenversatz von mmol/l zeigt allerdings, dass bei niedriger Konzentration die aus dem FORD Test gewonnenen Ergebnisse etwas höher liegen als die aus dem TAS-Test. Der Koeffizient der linearen Anpassung hingegen beträgt Die Ursache könnte darin liegen, dass beide Tests eine etwas unterschiedliche Zahl der in der Probe zirkulierenden Antioxidanzien messen, da beide Tests auf der Oxidation verschiedener Testsubstanzen beruhen. So hat Harnsäure keinen Einfluss auf das Ergebnis des FORD Tests. Deren Konzentration kann mit einem separaten Test auf dem FORMplus-System bestimmt werden. Basierend auf der Untersuchung der Blutproben von 21 Personen und den Angaben in der Literatur6,9,10,11,12, liegt der Referenzbereich des FORD Tests derzeit bei mmol/l Trolox. 1,8 1,6 FORD Callegari mmol/l 1,4 1,2 1,0 0,8 FORD = 0,5546 * TAS + 0,4021 r = 0,6587 p < 0,01 0,6 0,4 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 TAS Randox mmol/l Abb 6: Korrelation zwischen FORD Test und TAS-Test 11/13

12 Zusammenfassung Die totale antioxidative Kapazität ist ein empfindlicher und verlässlicher Indikator für Änderungen des in vitro-oxidativen Stresses, die mit Messungen einzelner Parameter möglicherweise nicht erfasst werden können. Daher präsentieren wir einen neuen Point of Care Test zur Erfassung des oxidativen Stresses, insbesondere in Verbindung mit dem FORT Test. Hervorzuheben ist, dass der FORD Test im Gegensatz zum TAS-Test über einen sehr stabilen Endpunkt der Messung verfügt. Daher ist der Zeitfaktor beim FORD Test vernachlässigbar (während er beim TAS-Test eine entscheidende Rolle spielt) und erlaubt eine hohe testinterne Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist der TAS- Test empfindlich gegenüber verdünnten Proben. Der FORD Test ist der erste echte Point of Care Test in Bezug auf die antioxidative Kapazität. Er ist einfach und schnell durchzuführen (weniger als 10 Minuten), benötigt keine temperaturempfindlichen Reagenzien und ist geeignet für die Untersuchung biologischer Proben. Es konnten verlässliche Ergebnisse erzielt werden: Die Messergebnisse von 21 Humanplasma-Proben waren vergleichbar mit den Ergebnissen des TAS-Tests. Die Absolutwerte waren sehr ähnlich (Mittelwert FORD Test: mmol/l Trolox; Mittelwert TAS-Test: mmol/l Trolox). Daher ist der FORD Test geeignet zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität des Blutes im Rahmen des Point of Care. Derzeit werden Studien durchgeführt, die Methode weiter zu validieren. Zusätzlich kann der FORD Test dazu benutzt werden, den Einfluss verschiedener Behandlungsmethoden auf den Redox-Status des Blutes in gesunden Personen zu untersuchen, insbesondere wenn die Werte als Veränderung gegenüber einem Ausgangswert dargestellt werden. Allerdings können die verschiedenen klinischen, metabolischen oder physiologischen Einflussgrößen zu unterschiedlichen Werten bei der antioxidativen Kapazität führen. 12/13

13 Literatur 1. Free Rad Res 2002, 36(2): J Agric Food Chem 1999, 47: J Org Chem 1993, 58: JAOCS 1996, 73: Free Radical Res 1997, 26: Clin Sci 1993, 84: Meth Enzimol 1994, 234: Free Rad Biol Med 1999, 26: Biochim Biophysi Acta 1987, 924; Arch Biochem Biophys 2004, 430: Clin Chem 1998, 44(6): Clin Pathol 2002, 2(3): /13