PRRSV-Fleischsaft-ELISA als Methode für Prävalenzstudien

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1 PRRSV-Fleischsaft-ELISA als Methode für Prävalenzstudien Jens Böttcher und Armin Gangl Dr. Jens Böttcher Zentralinstitutsleiter Tiergesundheitsdienst Bayern e.v. Senator-Gerauer-Straße Poing 1 Material und Methode ELISA: PRRS-ELISA (Idexx) Serumtest: gemäß Herstellerangaben Fleischsaft-ELISA: Fleischsaft-Verdünnung 1/5 in Probenverdünner Nachtinkubation ansonsten Durchführung gemäß Herstellerangaben Probenmaterial: 49 Serum/Fleischsaftpaare aus einem positiven Mastbestand Fleischsaftproben aus 1462 Beständen 2 1

2 Vergleich Serum-Fleischsaft Serum vs Fleischsaft 1/5 Fleischsaft 1/5 OD%PK y =,4264x Serum OD% PK 3 Proben und Betriebe Untersuchte Proben und Bestände pro Regierungsbezirk und Bayern Probenzahl Bestände Anzahl Schwaben Unterfranken Mittelfranken Oberfranken Oberpfalz Niederbayern Oberbayern 4 2

3 Proben und Betriebe Verteilung der Proben und Betriebe auf die Reaktionsklassen. Für die Betriebe wurde der maximale Wert zu Grunde gelegt Prozent 2 15 Betriebe % Proben% ELISA-Reaktionsklassen 5 Herdenprävalenzen Häufigkeitsverteilung der Seroprävalenzen Prozent Herdenprävalenzen (%) 6 3

4 Zwei Regierungsbezirke im Vergleich Prozentuale Verteilung der ELISA-Reaktionen in zwei Regierungsbezirken 6 Schwaben Oberpfalz 5 Prozent pro Regierungsbezirk ELISA-Reaktionsklassen 7 Regierungsbezirke auf Probenebene Häufigkeitsverteilung der ELISA-Reaktionsklassen pro Regierungsbezirke 6 5 ativ 1+ bis 2+ >2+ Prozent pro Regierungsbezirk Schwaben Unterfranken Mittelfranken Oberfranken Oberpfalz Niederbayern Oberbayern 8 4

5 Regierungsbezirke auf Betriebsebene Häufigkeitsverteilung der kategorisierten Betriebe pro Regierungsbezirk ativ max 1+ bis 2+ max >2+ Prozent pro Regierungsbezirk Schwaben Unterfranken Mittelfranken Oberfranken Oberpfalz Niederbayern Oberbayern 9 Zusammenfassung Die Untersuchung von Fleischsaft ist für Prävalenzstudien geeignet. 32% der Proben waren ativ, die übrigen Proben verteilten sich gleichmäßig über die ELISA-Reaktionsklassen. 22% der Betriebe waren ativ und 37% zeigten maximale (6+) Reaktionen. Somit kann von einer hohen Durchseuchung der Mastbestände ausgegangen werden. Es bestanden deutliche Unterschiede zwischen den Regierungsbezirken. Gemäß einer Schätzung des Schweiesundheitsdienstes werden weniger als 5% der Mastschweine gegen PRRSV geimpft, so dass die ermittelten Prävalenzen auf Feldinfektionen zurückzuführen sind. 1 5

6 PRRSV-Neutralisationstest Methodik und erste Erfahrungen Jens Böttcher, Mathias Ritzmann und Armin Gangl Dr. Jens Böttcher Zentralinstitutsleiter Tiergesundheitsdienst Bayern e.v. Senator-Gerauer-Straße Poing 11 Bedeutung neutralisierender Antikörper Neutralisationsrelevante Virusproteine: gp5, gp4 und M (Weiland et al., 1999; Yang et al., 2) Verhinderung der homologen Virusvermehrung Transfer definierter Mengen nak (Osorio et al., 22) maternale nak (Yoon et al., 1996) Aber: persistent-infizierte Tiere hatten auch nak (Wills et al., 1997) Kreuzneutralisation innerhalb des EU- bzw. US-Genotyps (mak Yang et al., 2) aber: unterschiedliche Titer und keine Kreuzneutralisation zwischen Genotypen. höhere Titer nach Komplementzugabe (Yoon et al., 1995) nak lange nachweisbar (Nelson et al (262 d p.i.); Yoon et al., 1995 (356 d p.i.)) Hypothese: Mutation neutralisationsrelevanter Epitope des gp5 Persistenz Fragestellung: Lässt sich der Schutz nach Impfung mit dem NT definieren? 12 6

7 ELISA Seroprävalenzen in Sauenbeständen relative Häufigkeit (%) Lebendimpfstoff inaktivierter Impfstoff ungeimpfte Kontrollbestände prozentuale Herdenprävalenz Bestandshistorie? Feldinfektion? Impfindikation? Melzig, C., R. Götz, H. Niemeyer, J. Böttcher unveröffentlicht 13 ELISA Antikörperverlauf nach Impfung PRRS-Antikörper-Verlauf bei 11 Schweinen nach einmaliger Vakzination mit Porcilis-PRRS gemessen mit zwei kommerziellen Testkits. Dargestellt wurde der Mittelwert +/- einfacher Standardabweichung 3 % Reaktion IDEXX Bommeli Spiegelt sich diese Reaktion in nak wider? Tag 1. Mon 2. Mon 3. Mon 4. Mon 5. Mon 6. Mon Zeit nach Vakzination Gangl, A., M. Ritzmann und J. Böttcher (24) 14 7

8 Methodik Zellen: Marc 145 (Quelle: FLI; Danke!) Medium für Zellkultur: EMEM mit 5% FKS Virus: US-Virus (Boehringer Ingelheim); EU-Virus (Intervet); Virusdosis: 1 KID 5 Medium für Virusverdünnung: EMEM mit 4% Meerschweinchenkomplement (Sigma) Medium für Serumverdünnung: EMEM Serumverdünnung: 1/2 bis 1/16 (Doppelansatz); Hitzeinaktivierung 3 Min. bei 6 C Serum/Virus-Inkubation: über Nacht bei 2-8 C in feuchter Kammer Adsorption: 1 Stunde, 37 C (Monolayer 8% konfluent); Alternative: Verbleib auf Zellen! Entfernen des Serum/Virus-Gemisches und Zugabe von EMEM mit 3% FKS Ablesen nach 5/6 Tagen Kontrollen: Serum/Zellkontrolle: einmal pro Serumverdünnung Positives Kontrollserum Rücktitration Viruskontrolle Zellkontrolle 15 Probenmaterial 317 Serumproben (Diagnostikproben) Proben aus einem Bestand (Diss. Kümmerlen) PRRSV-Nachweis (EU-Genotyp) aus Feten Sauengruppe A (n = 1): zweimal grundimmunisiert - zweimalige Impfung der Sauen im Abstand von 4 Wochen mit Porcilis PRRS ; Revakzination in der 16. Woche Sauengruppe B (n = 7): einmal grundimmunisiert einmalige Impfung der Sauen mit Porcilis PRRS ; Revakzination in der 16. Woche Impfung der Ferkel (n = 13) in der 4. Lebenswoche mit Porcilis PRRS Entnahmezeitpunkte: Sauen: Zum Zeitpunkt der 1. Impfung, dann 4., 8., 16., 2., und 24. Woche p.v. und kurz vor der Geburt (ca. 12. Woche) Ferkel: 4. Lebenswoche (Vakzination), 3. Monat, 5. Monat 16 8

9 Einfluss Komplement 11 Seren mit und ohne Komplementzusatz (4%) getestet ,26 2,28 4% C' ohne C' Prozent positiv Titer (geom. Mittel))* )* 1,4 = ativ 17 Vergleich von ELISA und NT)* (n = 317) 14 Anzahl (ELISA) bzw. NT + pro Reaktionsklasse ELISA n NT+ n NT+ EU/US n NT+ EU n NT+ US n gbw )* einstündige Adsorption! ELISA-Reaktionen 18 9

10 Vergleich von ELISA und NT)* (n = 317) Anzahl (n) bzw. Prozent NT+ pro ELISA-Klasse ELISA n NT+ % gbw ELISA-Reaktionsklassen )* einstündige Adsorption! 19 Vergleich ELISA und NT mit 317 Seren 33% der ELISA-ativen Proben waren im NT positiv. 58% bzw. 59% der grenzbereichswertigen bzw. positiven Proben hatten nak. 85% bzw. 86% der 5+- bzw. 6+-ELISA-Reaktionen wiesen nak auf. 9x US- und EU-nAk 7x EU-nAk 1x US-nAk 2 1

11 ELISA-Reaktionen der Sauen Häufigkeitsverteilung der ELISA-Reaktionen 6 Anzahl gbw Wo 8. Wo a.p. 16. Wo 2. Wo 24. Wo Entnahmezeitpunkt und Probenzahl 21 Neutralisationstiterverläufe der Sauen Untersuchung von 1 Sauen (doppelt grundimmunisiert) auf nak: Verlauf der Neutralisationstiter (geometrisches Mittel) 6, 5, Neutralisationstiter 4, 3, 2, 1, EU (1 h Adsorption) US (1 h Adsorption) EU (6 d Adsorption), Wo 1. Vakz. 4 Wo 8 Wo a.p. 16 Wo 2. Vakz 2 Wo 24 Wo Entnahmezeitpunkt und Anzahl Proben 22 11

12 Neutralisationstiterverläufe der Sauen Untersuchung von 7 Sauen (einfach grundimmunisiert) auf nak: Verlauf der Neutralisationstiter (geometrisches Mittel) 6, 5, Neutralisationstiter 4, 3, 2, 1, EU (1 h Adsorption) US (1 h Adsorption) EU (6 d Adsorption), Wo 1. Vakz. 4 Wo 8 Wo a.p. 16 Wo 2. Vakz 2 Wo 24 Wo Entnahmezeitpunkt und Anzahl Proben 23 Anteile NT-positiver Sauen Untersuchung von 1 Sauen (doppelt grundimmunisiert) auf nak: prozentuale Anteile der Reagenten pro Entnahmezeitpunkt Prozent Wo 1. Vakz. 4 Wo 8 Wo a.p. 16 Wo 2. Vakz 2 Wo 24 Wo EU (1 h Adsorption) US (1 h Adsorption) EU (6 d Adsorption) Entnahmezeitpunkt, Vakzination und Anzahl Proben 24 12

13 Anteile NT-positiver Sauen Untersuchung von 7 Sauen (einfach grundimmunisiert) auf nak: prozentuale Anteile der Reagenten pro Entnahmezeitpunkt Prozent EU (1 h Adsorption) US (1 h Adsorption) EU (6 d Adsorption) Wo 1. Vakz. 4 Wo 8 Wo a.p. 16 Wo 2. Vakz 2 Wo 24 Wo Entnahmezeitpunkt, Vakzination und Anzahl Proben 25 Anteile NT-positiver Sauen Anteil positiver Nachweise in Abhängigkeit von der Adsorptionszeit (EU-Virus) 1 Stunde (h) 6 Tage (d) NT+ 52% 74% 26 13

14 ... und die Ferkel? Untersuchung von 1 Sauen und 13 Ferkeln auf nak: Verlauf der Neutralisationstiter (geometrisches Mittel) 9, 8, 7, Neutralisationstiter 6, 5, 4, 3, EU (1 h Adsorption) US (1 h Adsorption) 2, 1,, W o 1. Vakz. 4 W o 8 W o a.p. 16 W o 2. Vakz Entnahmezeitpunkt 2 W o 24 W o 4. LW Vakz 3. Mon 5. Mon 27 ELISA und NT)* Vakzination (EU) in 4. LW Sau Ferkel 4. LW 3. Monat 5. Monat SNT EU SNT US ELISA SNT EU SNT US ELISA ELISA SNT EU SNT US ELISA 48 y x + 16, + 37 y 2, 4, 1 z ++ 5,7 + 5 x 2, , x 2, + 2, 36 z 2, + 22, x 2, y + 16, 36 y 2, , y gbw 11,3 + 16, z 15,9 + 22, x 16, + Böttcher et al. (25) unveröffentlicht Kümmerlen (24) )* einstündige Adsorption 28 14

15 Zusammenfassung 1. Der Neutralisationstest ist einfach in der Handhabung und sehr gut reproduzierbar.er wird den ELISA in der Massenserologie aber nicht ersetzen. 2. Komplement und der Verbleib des Serum/Virus-Gemisches auf den Zellkulturen führte zu deutlich höheren Neutralisationstitern. Mit den vorhandenen Seren hatte dies keinen nachteiligen Effekt auf die Serum/Zellkontrolle. 3. ELISA-ative Proben waren zu 33% im NT positiv (weitere Abklärungen sind notwendig!). Es ist zu erwarten, dass eine längere Adsorption und eine korrekte Einstellung der Virusdosis diesen Wert erhöhen wird! 4. Ein Anstieg der nak nach Vakzination konnte gezeigt werden. Die Vakzination mit EU-Virus hatte auch einen Effekt auf die US-nAk. 5. Eine doppelte Grundimmunisierung hatte einen positiven Effekt. Eine einfache Grundimmunisierung in bestehende nak hatte einen ativen Effekt. 6. Ferkel mit maternalen Antikörpern zeigten 2 Monate nach Impfung keinen Anstieg der neutralisierenden Antikörper, während dies bei zwei Ferkeln ohne maternale Antikörper (wahrscheinlich!) der Fall war. 29 Zusammenfassung 7. Die Ferkel serokonvertierten wahrscheinlich nach Feldinfektion und zeigten sehr hohe Neutralisationstiter, eine Neutralisation des US-Virus wurde nicht beobachtet. 8. Eine partielle Neutralisation konnte am 4. Tag des Tests beobachtet werden. 9. Der Neutralisationstest ist eine geeignete Methode, um verschiedene Impfschemata zu prüfen. 1. Wir suchen definierte Seren aus Infektionsversuchen, um den Zeitpunkt der Serokonversion für nak zu bestimmen. 11. Kreuzneutralisation innerhalb des EU-Genotyps? Serotypen Impfstoffentwicklung 3 15

16 Danksagung Diese Präsentation enthält Daten aus Projekten, die mit Mitteln des Freistaates Bayern und der Bayerischen Tierseuchenkasse gefördert wurden. Die Autoren bedanken sich bei Christa Franke, Pia Herzog, Gabriele Russwurm, Annette Vossen und Claudia Weikel für die exzellente technische Durchführung der Untersuchungen. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! 31 16