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1 ADVANCE TM HRP ENGLISH Code K ml Code K ml Code K ml Ready-to-use Intended use For In Vitro diagnostic use. This system is intended for use with primary antibodies from mouse or rabbit supplied by the user for the qualitative identification of antigens by light microscopy in normal and pathological formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. A list of recommended products available from Dako for optimal use of ADVANCE TM HRP is provided below. Refer to the General Instructions for Immunohistochemical Staining for: (1) Principle of Procedure, (2) Materials Required, Not Supplied, (3) Storage, (4) Specimen Preparation, (5) Staining Procedure, (6) Quality Control, (7) Troubleshooting, (8) Interpretation of Staining, (9) General Limitations. Summary and explanation Principles of procedure Reagents provided The ADVANCE HRP detection system is a super-sensitive IHC staining technique. This system is useful for the detection of antigens present in low concentrations. This system is biotin free, eliminating or significantly reducing nonspecific staining resulting from endogenous avidin-biotin activity in liver, kidney, lymphoid tissues and cryostat sections. All reagents in the ADVANCE HRP system are ready-to-use. This system is an extremely sensitive method and, as a result, optimal dilutions of the primary antibody can be several-fold greater than those used for the traditional EnVision, ABC or LSAB methods. 1-5 Any endogenous peroxidase activity is quenched by incubating the specimen with an appropriate endogenous peroxidase blocking reagent. The specimen is then incubated with an appropriately characterized and diluted mouse or rabbit primary antibody, followed by sequential 30-minute incubations with ADVANCE HRP Link and ADVANCE HRP Enzyme. Staining is completed by a 5 30 minute incubation with a suitable substrate-chromogen. ADVANCE TM HRP Link This reagent contains anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies in a Tris-HCl buffer containing stabilizing protein and an anti-microbial agent. ADVANCE TM HRP Enzyme This reagent contains antibodies polymerized with horseradish peroxidase in a Tris-HCl buffer containing stabilizing protein and an anti-microbial agent. The reagents in the ADVANCE HRP detection system are well suited for immunohistochemistry procedures. Reagents are provided ready-to-use. Further dilution of these reagents or alteration of the reagent incubation temperature may give erroneous results. Materials required, but not supplied Absorbent wipes Control tissue, positive and negative Counterstain; aqueous based, such as Automation Hematoxylin (code S3301), Hematoxylin for IHC (code S3302) and Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (code S3309) Coverslips Distilled Water Ethanol, absolute and 95% Light microscope (20x 800x) Mounting media, such as Glycergel Mounting Medium (code C0563) or Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) or nonaqueous permanent mounting medium, Ultramount (code S1964) Primary antibodies and negative control reagent Slides, poly-l-lysine coated or Silanized Slides (code S3003) Staining jars or baths Timer (capable of 3 40 minute intervals) Wash bottles Wash Buffer Solution Xylene, toluene or xylene substitutes Optional Materials Required but Not Supplied Ammonium hydroxide, 15 mol/l diluted to mol/l PAP Pen (code S2002) ( ) EFG_002 p. 1/14

2 Recommended Dako Products Precautions Storage Dako Code Product Name Product Type S3800 Autostainer Plus Instrument S2001 S2003 Peroxidase Block Dual Endogenous Enzyme Block Peroxidase Block Endogenous Peroxidase Block S3006 K3461/K3469 K3467/K3468 S3301 S3302 S3309 Wash Buffer 10x For Automated and Manual IHC Use. AEC+ Ready-to-use Liquid DAB+ Automation Hematoxylin Hematoxylin for IHC Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin Wash Buffer Substrate System Counterstain 1. For professional users. 2. Do not use reagents beyond expiration date for prescribed storage method. If reagents are stored under any conditions other than those specified in the product insert, they must be validated by the user. 3. Do not substitute reagents from other lot numbers or from kits of other manufacturers. 4. Enzymes and substrate-chromogens may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not store kit components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 5. Incubation times or temperatures other than those specified may give erroneous results; any such changes must be validated by the user. 6. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 7. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 8. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations. Store at 2 8 C. There are no obvious signs to indicate instability of these products. Therefore, positive and negative controls should be tested simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variation in laboratory procedures and a problem with this system is suspected, contact Dako Technical Support. Reagent preparation It is convenient to prepare the following reagents prior to staining. Wash Buffer Solution TBST, 0.05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (code S3006) is the recommended wash buffer for automated and manual IHC detection. TBS, 0.05 mol/l Tris buffered Saline (code S1968) and PBS, 0.02 mol/l Phosphate Buffered Saline (code S3024), are also suitable wash buffer solutions for manual staining. Wash Buffer solutions containing sodium azide are not recommended. Sodium azide will inactivate peroxidase (HRP) resulting in negative staining. Store unused buffer at 2 8 C. Discard buffer if cloudy in appear ance. Distilled water may be used for rinsing the peroxidase block, substrate and counterstain. Primary Antibody Optimization of concentrated antibodies is required by the end user. Dilutions should be prepared using Antibody Diluent (code S0809), or a diluent containing 0.05 mol/l Tris-HCI buffer with 1% bovine serum albumin (BSA). For most primary antibodies used with this system, an incubation time of 30 minutes is sufficient. Negative Control Reagent Ideally, a negative control reagent contains an antibody which exhibits no specific reactivity with human tissues or normal/non-immune serum in the same matrix/solution as the diluted primary antibody. The negative control reagent should be the same subclass and animal species as the primary antibody, diluted to the same immunoglobulin or protein concentration as the diluted primary antibody using the same diluent. The incubation period for the negative control reagent should correspond to the primary antibody. Counterstain DAB chromogen yields an alcohol insoluble end-product and can be used with an alcohol-based hematoxylin. When AEC Substrate-chromogen is used, the colored end-product of the staining reaction is alcohol soluble and should be only be used with aqueous-based counterstains such as Automation Hematoxylin (code S3301), Hematoxylin for IHC (code S3302), Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (code S3309). Follow counterstaining of hematoxylin with a thorough rinse in distilled water, then immerse tissue slides into a bath of mol/l ammonia or similar bluing agent. The mol/l ammonia water is prepared by mixing 2.5 ml of 15 mol/l (concentrated) ammonium hydroxide with 1 liter of water. Unused mol/l ammonia may be stored at room temperature (20 25 C) in a tightly capped bottle for up to 12 months. Consult manufacturers guidelines for alternative counterstaining procedures. ( ) EFG_002 p. 2/14

3 Mounting Media Glycergel Mounting Medium (code C0563) or Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) is recommended for aqueous mounting. Glycergel must be heated to at least 50 C just prior to use. Non-aqueous permanent mounting medium Ultramount (code S1964) may also be used. Specimen preparation For use with formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections as well as frozen tissue sections and cell smears. Prior to IHC staining, tissues must be fixed and processed. Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues, preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissue constituents and increases the resistance of cellular elements to tissue processing. Tissue processing includes dehydration, clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media, embedding and sectioning of tissues. The most common fixatives for IHC tissue preparations are discussed in the General Instructions for Immunohistochemical Staining. These are guidelines only. Optimal procedures must be determined and verified by the user. Performance characteristics Staining procedure The antibodies contained in this product have been solid-phase absorbed to remove cross-reacting antibodies to human immunoglobulin (Ig), but a low degree of cross-reactivity may be found to Ig from other species. The antimouse and the anti-rabbit Ig have been affinity purified on a column with mouse and rabbit Ig respectively. The combined activity is directed towards both mouse and rabbit primary antibodies and includes binding to both IgG, all IgG sub-classes and IgM. The HRP present on the polymer was prepared from HRP of high specific activity. Unconjugated molecules were removed by gel filtration chromatography. Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with the product content prior to use. The reagents and instructions supplied have been designed for optimal performance. Further dilution of the product reagents or alteration of incubation times or temperatures may give erroneous results. All reagents should be equilibrated to room temperature (20 25 C) prior to immunostaining. Likewise, a ll incubations should be performed at room temperature. Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased nonspecific staining. Cover slides exposed to drafts. If prolonged incubations are used, place tissues in a humid environment. Automated Program the Dako Autostainer / Autostainer Plus system as follows: STEP 1: Select Protocol Template Auto Program. STEP 2: Place reagents in the instrument reagent rack and fill the wash buffer and DI water carboys. STEP 3: Load the slides on the instrument. STEP 4: Start the run. STEP 5: Remove the slides from the instrument. Manual (For each step, see list of compatible Dako products above.) STEP 1: STEP 2: STEP 3: STEP 4: STEP 5: STEP 6: ENDOGENOUS ENZYME BLOCK Tap off excess buffer. Using a lintless tissue, carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep the reagent within the prescribed area. Apply enough Dual Endogenous Enzyme Block or Peroxidase Block to cover specimen. Incubate 5 10 minutes for Dual Endogenous Enzyme Block or Peroxidase Block, depending on concentration of endogenous enzyme in the tissue tested. Rinse gently with distilled water or buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath. PRIMARY ANTIBODY OR NEGATIVE CONTROL REAGENT Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough optimally diluted primary antibody or negative control reagent to cover specimen. Incubate 30* (±1) minutes. Rinse gently with buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath for 5 minutes. ADVANCE TM HRP Link Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough ADVANCE TM HRP Link to cover the specimen. Incubate for 30* (±1) minutes. Rinse as in step 2. ADVANCE TM HRP Enzyme Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough ADVANCE TM HRP Enzyme to cover the specimen. Incubate for 30* (±1) minutes. Rinse as in step 2. SUBSTRATE-CHROMOGEN Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough of the substrate-chromogen solution to cover the specimen. Incubate 5 30 minutes (AEC+) or 5 10 minutes (DAB+). Rinse slides gently with DI water. Collect substrate-chromogen waste in a hazardous materials container for proper disposal. Place rinsed slides into a fresh DI water bath. HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (optional) Immerse slides in a bath of hematoxylin. Length of incubation depends on the strength of hematoxylin used. Rinse slides in a bath of distilled or deionized water for 2 5 minutes. * For increased throughput shorter incubation times are recommended with alternative dilution of the primary antibody. The recommended incubation times are 30 minutes for greatest sensitivity. ( ) EFG_002 p. 3/14

4 Quality control Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the following procedures. See the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry and references 6 through 8 for additional information. Refer to the specification sheet of each primary antibody used for details regarding sensitivity and immunoreactivity. Refer to the General Instructions for Immunohistochemical Staining for further information on positive and negative controls. Staining interpretation General limitations Refer to the General Instructions for Immunohistochemical Staining for interpretation guidelines. Refer to the General Instructions for Immunohistochemical Staining for general limitations. Use of old or unbuffered fixatives, or exposure of tissues to excessive heat (greater than 60 C) durin g processing may result in decreased staining sensitivity. Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome, and catalase as well as in eosinophils. 9,10 This activity can be inhibited by incubating specimens with Peroxidase Block for 5 minutes, or Dual Endogenous Enzyme Block for 5 10 minutes prior to the application of the primary antibody. Blood and bone marrow smears and frozen tissues can also be treated with this reagent. However, this procedure does not abolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. Alternately, a solution of methanol-hydrogen peroxide can be used. Some antigens may become denatured with this procedure. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase. 11 Normal/nonimmune sera from the same animal source as the secondary antisera used in blocking steps may cause false-negative or false-positive results due to auto-antibodies or natural antibodies. The reagents supplied in this kit have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen detection. Troubleshooting Observation Comment Signal too strong ADVANCE HRP is a high sensitivity detection system, allowing for higher dilution of primary antibodies. If antibodies are not diluted sufficiently the signal will appear too strong. Make a dilution series of the primary antibody and choose a dilution that is on the plateau before the fall-off point. Background on edge Tissue has dried out. For manual staining, place slides in humidity chamber. Background on positive tests Dilute primary antibody further (see Signal too strong above). Background on negative tests The concentration of the negative control reagent should match the concentration of the optimally titered primary antibody. If not, dilute the negative control further. Non-specific staining Washing is essential. If an appropriate rinse followed by a 5 minute incubation is not sufficient, wash twice by soaking for 5 minutes each time. No signal Assay time too long The sequence of ADVANCE TM HRP Link and ADVANCE TM HRP Enzyme is critical for reaction to occur: check that the correct sequence is used. The primary antibody was too dilute. Make a dilution series of the antibody to determine the correct dilution. ADVANCE HRP allows for either high sensitivity or shorter incubations or a combination of both. If shorter overall assay time is desired the primary antibody must be more concentrated. ( ) EFG_002 p. 4/14

5 FRANÇAIS Réf. K ml Réf. K ml Réf. K ml Prêt à l emploi Utilisation prévue Pour utilisation diagnostique in vitro. Ce kit est conçu pour être utilisé avec des anticorps primaires de souris ou de lapin (fournis par l utilisateur) dans l identification qualitative des antigènes par microscopie optique dans différents tissus fixés au formol et inclus en paraffine, sains et pathologiques. Une liste des produits recommandés disponibles auprès de Dako pour une utilisation optimale du kit ADVANCE TM HRP est fournie ci-après. Consulter le document «General Instructions for Immunohistochemical Staining» («Instructions générales de coloration immunohistochimique») pour : (1) Principe de procédure, (2) Matériels requis mais non fournis, (3) Conservation, (4) Préparation des échantillons, (5) Procédure de coloration, (6) Contrôle qualité, (7) Dépannage, (8) Interprétation de la coloration, (9) Limites générales. Résumé et explication Principes de la procédure Réactifs fournis Le kit de détection ADVANCE HRP est une technique de coloration IHC super sensible. Ce kit permet la détection des antigènes présents à de faibles concentrations. Ce kit ne contient pas de biotine et permet d éliminer ou de réduire de manière significative les colorations non spécifiques issues de l'activité avidine-biotine endogène dans les reins, le foie, les tissus lymphoïdes et les coupes cryostat. Tous les réactifs du kit ADVANCE HRP sont prêts à l emploi. Ce kit est une méthode extrêmement sensible ; par conséquent, les dilutions optimales de l anticorps primaire peuvent être plusieurs fois supérieures à celles utilisées pour les méthodes classiques EnVision, ABC ou LSAB. 1-5 Toute activité de peroxydase endogène est inhibée en incubant l échantillon avec un réactif de blocage approprié de la peroxydase endogène. L échantillon est ensuite incubé avec un anticorps primaire de souris ou de lapin dilué et caractérisé de manière appropriée, puis subit deux incubations successives de 30 minutes dans du ADVANCE HRP Link puis dans du ADVANCE HRP Enzyme. La coloration se termine par une incubation de 5 à 30 minutes avec un substrat chromogène adapté. ADVANCE TM HRP Link Ce réactif contient des anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien. ADVANCE TM HRP Enzyme Ce réactif contient des anticorps polymérisés avec de la peroxydase de raifort dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien. Les réactifs du kit de détection ADVANCE HRP sont parfaitement adaptés aux procédures d immunohistochimie. Ils sont fournis prêt à l emploi. Toute dilution supplémentaire de ces réactifs ainsi que toute modification de la température d incubation peuvent produire des résultats erronés. Matériels requis mais non fournis Lingettes absorbantes Tissu de contrôle, positif et négatif Contre-colorant; à base aqueuse, telle Automation Hematoxylin (réf. S3301), Hematoxylin for IHC (réf. S3302) et Mayer s Hematoxylin ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (réf. S3309) Lamelles de protection Eau distillée Éthanol, absolu et à 95 % Microscope optique (20x 800x) Milieu de montage, de type Glycergel Mounting Medium (réf. C0563) ou Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (réf. S3025) ou milieu de montage permanent non aqueux, Ultramount (réf. S1964) Anticorps primaires et réactif de contrôle négatif Lames, enduites de poly-l-lysine ou Silanized Slides (réf. S3003) Cuves de coloration Chronomètre (pouvant accepter des intervalles de 3 à 40 minutes) Flacons de lavage Solution de tampon de lavage Xylène, toluène ou substituts de xylène Matériels facultatifs requis mais non fournis Hydroxyde d ammonium, 15 mol/l, dilué à 0,037 mol/l PAP Pen (réf. S2002) ( ) EFG_002 p. 5/14

6 Produits Dako recommandés Réf. Dako Nom du produit Type de produit S3800 Autostainer Plus Instrument S2001 S2003 Peroxidase Block Dual Endogenous Enzyme Block Agent bloquant de la peroxydase Agent bloquant de la peroxydase endogène S3006 Wash Buffer 10x Tampon de lavage For Automated and Manual IHC Use. K3461/K3469 AEC+ Ready-to-use Kit de substrat K3467/K3468 S3301 S3302 S3309 Liquid DAB+ Automation Hematoxylin Hematoxylin for IHC Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin Contre-colorant Précautions Conservation 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de leur date de péremption en fonction de la méthode de conservation recommandée. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées dans la notice, celles-ci doivent être validées par l utilisateur. 3. Ne pas utiliser de réactifs portant un autre numéro de lot ou provenant de kits d autres fabricants. 4. Les enzymes et les substrats chromogènes peuvent être endommagés s ils sont exposés à une lumière excessive. Ne pas stocker les composants du kit ni effectuer de coloration sous une lumière vive, telle la lumière directe du soleil. 5. Des temps ou des températures d incubation autres que ceux indiqués peuvent produire des résultats erronés et doivent être validés par l utilisateur. 6. Comme avec tout produit d origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées. 7. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau 8. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales. Conserver entre 2 et 8 C. Il n y a aucun signe indiquant l instabilité de ces produits. Par conséquent, les contrôles positif et négatif doivent être testés en même temps que des échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, ne pouvant être expliquée par un changement des procédures du laboratoire et en cas de suspicion d un problème dans le kit, contacter l assistance technique Dako. Préparation des réactifs Il est recommandé de préparer les réactifs suivants avant la coloration. Solution de tampon de lavage La solution Tris Buffered Saline with Tween à 0,05 mol/l (réf. S3006) est le tampon de lavage recommandé pour les procédures d IHC automatisées et manuelles. La solution Tris Buffered Saline à 0,05 mol/l (réf. S1968), et la solution Phosphate Buffered Saline à 0,02 mol/l (réf. S3024), conviennent également pour le lavage lors de colorations manuelles. L utilisation de solutions de tampon de lavage contenant de l'azide de sodium n est pas recommandée. L azide de sodium inactive la peroxydase de raifort (HRP), ce qui entraîne une coloration négative. Conserver le tampon non utilisé entre 2 et 8 C. Jeter le tampon s il semble trou ble. L eau distillée peut être utilisée pour le rinçage de l agent bloquant de la peroxydase, du substrat et du contre-colorant. Anticorps primaire L utilisateur final est responsable de l'optimisation des anticorps concentrés. Les dilutions doivent être effectuées en utilisant Antibody Diluent (réf. S0809) ou un diluant contenant du tampon Tris-HCl à 0,05 mol/l et 1 % d albumine sérique bovine. Pour la plupart des anticorps primaires utilisés dans ce kit, une durée d incubation de 30 minutes est suffisante. Réactif de contrôle négatif Dans l idéal, un réactif de contrôle négatif contient un anticorps qui ne présente pas de réactivité spécifique aux tissus humains ou au sérum normal/non immun dans la même matrice/solution que l anticorps primaire dilué. Le réactif de contrôle négatif doit provenir de la même espèce et sous-espèce animale que l anticorps primaire et être dilué à la même concentration en immunoglobulines ou protéines que l anticorps primaire dilué, à l'aide du même diluant. La période d'incubation du réactif de contrôle négatif doit correspondre à celle de l'anticorps primaire. ( ) EFG_002 p. 6/14

7 Contre-colorant Le chromogène DAB génère un produit final insoluble dans l alcool et peut être utilisé avec de l hématoxyline à base d alcool. En cas d utilisation du substrat chromogène AEC, le produit final coloré de la réaction de coloration est soluble dans l alcool et ne doit être utilisé qu avec des contre-colorants à base aqueuse telles Automation Hematoxylin (réf. S3301), Hematoxylin for IHC (réf. S3302), Mayer s Hematoxylin ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (réf. S3309). Après contre-coloration à l'hématoxyline, rincer abondamment à l eau distillée, puis immerger les lames dans un bain d ammoniaque à 0,037 mol/l ou d un agent de bleuissement similaire. L ammoniaque à 0,037 mol/l est préparée en mélangeant 2,5 ml d hydroxyde d ammonium à 15 mol/l (concentré) et 1 litre d eau. L ammoniaque à 0,037 mol/l non utilisée peut être conservée à température ambiante (20 25 C) dans un flacon fermé hermétiquement pendant 12 mois maximum. Consulter les instructions du fabricant pour connaître d autres procédures de contre-coloration. Milieu de montage Les Glycergel Mounting Medium (réf. C0563) ou Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (réf. S3025) sont recommandés pour le montage aqueux. Le Glycergel doit être chauffé à 50 C minimum j uste avant utilisation. Un milieu de montage permanent non aqueux Ultramount (réf. S1964) peut également être utilisé. Préparation des échantillons Pour utilisation sur des tissus fixés au formol et inclus en paraffine, ainsi que sur des tissus congelés et des frottis cellulaires. Avant la coloration IHC, les tissus doivent être fixés et traités. Leur fixation évite l autolyse et la putréfaction des tissus excisés, préserve l antigénicité, améliore l indice de réfraction des composants tissulaires et accroît la résistance des éléments cellulaires au traitement des tissus. Le traitement des tissus inclut la déshydratation, l élimination des agents déshydratants, l infiltration du milieu d inclusion, l inclusion et la coupe des tissus. Les fixateurs les plus courants pour la préparation IHC des tissus sont présentés dans les «General Instructions for Immunohistochemical Staining» («Instructions générales de coloration immunohistochimique»). Il ne s agit là que de conseils. Les procédures optimales doivent être déterminées et vérifiées par l utilisateur. Caractéristiques de performance Procédure de coloration Les anticorps contenus dans ce produit ont été absorbés en phase solide pour éliminer les anticorps présentant une réaction croisée à l immunoglobuline humaine (Ig) mais un faible niveau de réactivité croisée peut être observé envers les Ig d autres espèces. Les Ig anti-souris et anti-lapin ont été purifiés par affinité sur une colonne avec des Ig de souris et de lapin, respectivement. L activité combinée est dirigée vers les anticorps primaires de souris et de lapin et comporte une phase de liaison aux deux types d IgG, à tous les sous-types d'igg et aux IgM. La HRP présente sur le polymère a été préparée à partir de HRP présentant une activité hautement spécifique. Les molécules non conjuguées ont été éliminées par chromatographie de filtration sur gel. Remarques sur la procédure L utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec le contenu du kit avant utilisation. Les réactifs et instructions fournis dans ce kit ont été conçus pour des performances optimales. Toute dilution supplémentaire des réactifs ainsi que toute modification des temps et températures d incubation peuvent produire des résultats erronés. Tous les réactifs doivent être portés à température ambiante (20 25 C) avant la coloration immunologi que. De même, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Ne pas laisser les lames sécher pendant la procédure de coloration. Les coupes de tissus séchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. Couvrir les lames exposées aux courants d'air. Si la durée d incubation est prolongée, placer les tissus dans un environnement humide. Automatisée Programmer l appareil Dako Autostainer / Autostainer Plus comme suit : ÉTAPE 1 Sélectionner le programme Protocol Template Auto (Protocole maître auto). ÉTAPE 2 Placer les réactifs dans le portoir de l instrument et remplir les flacons de tampon de lavage et d eau déionisée. ÉTAPE 3 Charger les lames sur l instrument. ÉTAPE 4 Lancer le cycle. ÉTAPE 5 Retirer les lames de l instrument. ( ) EFG_002 p. 7/14

8 Manuelle (Pour chaque étape, voir la liste des produits Dako compatibles ci-avant.) ÉTAPE 1 AGENT BLOQUANT DES ENZYMES ENDOGÈNES Secouer pour enlever l excès de tampon. À l aide d un tissu non pelucheux, essuyer avec précaution autour de l échantillon pour enlever tout liquide restant et maintenir le réactif dans la zone indiquée. Appliquer suffisamment de Dual Endogenous Enzyme Block ou de Peroxidase Block pour couvrir l échantillon. Incuber pendant 5 à 10 minutes avec le Dual Endogenous Enzyme Block ou le Peroxidase Block, en fonction de la concentration d enzymes endogènes dans le tissu testé. Rincer doucement avec de l eau distillée ou une solution tampon contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus) et placer dans un bain de tampon renouvelé. ÉTAPE 2 ANTICORPS PRIMAIRE OU RÉACTIF DE CONTRÔLE NÉGATIF Tapoter pour enlever l excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment d anticorps primaire ou de réactif de contrôle négatif à dilution optimale pour recouvrir l échantillon. Incuber pendant 30 minutes ± 1 minute. Rincer doucement à l aide d une solution tampon contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus) et placer dans un bain de tampon renouvelé pendant 5 minutes. ÉTAPE 3 ADVANCE TM HRP Link Tapoter pour enlever l excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de ADVANCE TM HRP Link pour recouvrir l échantillon. Incuber pendant 30 minutes ± 1 minute*. Rincer comme indiqué à l étape 2. ÉTAPE 4 ADVANCE TM HRP Enzyme Tapoter pour enlever l excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de ADVANCE TM HRP Enzyme pour recouvrir l échantillon. Incuber pendant 30 minutes ± 1 minute*. Rincer comme indiqué à l étape 2. ÉTAPE 5 SUBSTRAT CHROMOGÈNE Tapoter pour enlever l excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de solution substrat chromogène pour recouvrir l échantillon. Incuber pendant 5 à 30 minutes (AEC+) ou 5 à 10 minutes (DAB+). Rincer doucement les lames à l eau déionisée. Recueillir les déchets du substrat chromogène dans un conteneur pour déchets biologiques pour les éliminer de manière appropriée. Placer les lames rincées dans un bain renouvelé d eau déionisée. ÉTAPE 6 CONTRE-COLORATION À L HÉMATOXYLINE (facultatif) Immerger les lames dans un bain d'hématoxyline. La durée d incubation dépend de la puissance de l hématoxyline utilisée. Rincer les lames dans un bain d eau distillée ou déionisée pendant 2 à 5 minutes. * Pour un meilleur rendement, il est recommandé de réduire les temps d incubation avec une autre dilution de l anticorps primaire. Les temps d incubation recommandés sont de 30 minutes pour une sensibilité accrue. Contrôle qualité Des différences dans les procédures techniques et le traitement des tissus du laboratoire peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers, en complément des consignes suivantes. Voir les consignes de contrôle qualité du Certification Program for Immunohistochemistry du College of American Pathologists (CAP) et les références 6 à 8 pour plus d informations. Consulter la fiche technique de chaque anticorps primaire utilisé pour plus de détails concernant la sensibilité et l immunoréactivité. Consulter les «Instructions for Immunohistochemical Staining» («Instructions générales de coloration immunohistochimique») pour plus d informations sur les contrôles positifs et négatifs. Interprétation de la coloration Limites générales Consulter les «Instructions for Immunohistochemical Staining» («Instructions générales de coloration immunohistochimique») pour les consignes d interprétation. Consulter les «Instructions for Immunohistochemical Staining» («Instructions générales de coloration immunohistochimique») pour les limites générales. L utilisation de fixateurs périmés ou non tamponnés, ou l exposition des tissus à une température excessive (supérieure à 60 C) au cours du traitement peut ré duire la sensibilité de coloration. Une activité endogène peroxydasique ou pseudoperoxydasique peut se manifester dans les hémoprotéines comme l'hémoglobine, la myoglobine, les cytochromes et la catalase, ainsi que dans les éosinophiles. 9,10 Cette activité peut être inhibée en incubant les échantillons avec du Peroxydase Block pendant 5 minutes, ou avec du Dual Endogenous Enzyme Block pendant 5 à 10 minutes, avant application de l anticorps primaire. Les frottis sanguins et médullaires, ainsi que les coupes de tissus congelés, peuvent également être traités en utilisant ce réactif. Cependant, cette procédure n'élimine pas la pigmentation rouge brunâtre des hémoprotéines. Il est également possible d utiliser une solution de méthanol-peroxyde d hydrogène. Certains antigènes peuvent être dénaturés au cours de cette procédure. Les tissus de patients infectés par le virus de l hépatite B et porteurs de l antigène de surface de l hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort. 11 ( ) EFG_002 p. 8/14

9 Des sérums normaux/non immuns provenant du même animal que les antisérums secondaires utilisés dans les étapes de blocage peuvent générer des faux négatifs ou des faux positifs du fait des auto-anticorps ou des anticorps naturels. Les réactifs fournis dans ce kit sont dilués de manière optimale Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de détection des antigènes. Dépannage Observation Commentaire Signal trop fort Le kit ADVANCE HRP est un kit de détection haute sensibilité qui permet des dilutions élevées d anticorps primaires. Si les anticorps ne sont pas suffisamment dilués, le signal sera trop fort. Refaire une série de dilution de l anticorps primaire et choisir une dilution située sur un plateau avant le «point de chute». Coloration de fond sur les bords Les tissus ont séché. Pour une coloration manuelle, placer les lames dans une chambre humide. Coloration de fond sur les tests positifs Diluer de nouveau l anticorps primaire (voir «Signal trop fort» plus haut). Coloration de fond sur les tests négatifs La concentration du réactif de contrôle négatif doit correspondre à la concentration d anticorps primaire titré de manière optimale. Si tel n est pas le cas, diluer de nouveau le contrôle négatif. Coloration non spécifique L étape de lavage est essentielle. Si un rinçage approprié suivi d une incubation de 5 minutes ne suffit pas, laver deux fois en laissant tremper pendant 5 minutes à chaque fois. Pas de signal Durée du test trop longue La séquence ADVANCE TM HRP Link et ADVANCE TM HRP Enzyme est essentielle pour que la réaction puisse se produire : vérifier que la bonne séquence est utilisée. L anticorps primaire est trop dilué. Procéder à une série de dilutions de l anticorps pour déterminer la bonne dilution. Le kit ADVANCE HRP offre une meilleure sensibilité ou une incubation plus courte, ou une association des deux. Pour réduire la durée totale du test, utiliser un anticorps primaire plus concentré. ( ) EFG_002 p. 9/14

10 DEUTSCH Code K ml Code K ml Code K ml Gebrauchsfertig Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. Dieses System dient zur qualitativen Identifizierung von Antigenen in normalen und pathologischen formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben durch Lichtmikroskopie unter Verwendung vom Anwender bereitgestellter primärer Maus- oder Kaninchen-Antikörper. Eine Aufstellung empfohlener, über Dako erhältlicher Produkte für die optimale Nutzung von ADVANCE TM HRP finden Sie weiter unten. Die General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung ) geben Aufschluss über: (1) Verfahrensprinzip, (2) Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien, (3) Aufbewahrung (4) Vorbereitung der Probe, (5) Färbeverfahren, (6) Qualitätskontrolle, (7) Fehlersuche und - behebung, (8) Auswertung der Färbung, (9) Allgemeine Einschränkungen. Zusammenfassung und Erklärung Verfahrensprinzip Mitgelieferte Reagenzien Das ADVANCE HRP Detektionssystem verwendet ein hochempfindliches IHC-Färbeverfahren. Dieses System wird zum Nachweis niedriger Konzentrationen vorhandener Antigene eingesetzt. Es ist biotinfrei, daher werden unspezifische Färbungen aus endogenen Avidin-Biotin-Aktivitäten in Leber, Niere, Lymphgewebe und Gefrierschnitten eliminiert oder erheblich abgeschwächt. Alle im ADVANCE HRP-System enthaltenen Reagenzien sind gebrauchsfertig. Dieses System ist äußerst empfindlich, daher können optimale Verdünnungen des primären Antikörpers um mehrere Male höher sein als Verdünnungen für die herkömmlichen EnVision-, ABC -oder LSAB-Verfahren. 1-5 Durch Inkubation der Probe mit einem geeigneten Endogene-Peroxidase-Hemmer wird jegliche Aktivität endogener Peroxidase unterdrückt. Anschließend wird die Probe zunächst mit einem gekennzeichneten und verdünnten primären Maus- oder Kaninchen-Antikörper, dann nacheinander je 30 Minuten mit ADVANCE HRP Link und ADVANCE HRP Enzyme inkubiert. Die Färbung wird mit einer Inkubation von 5 30 Minuten Dauer mit einem geeigneten Substrat-Chromogen abgeschlossen. ADVANCE TM HRP Link Dieses Reagenz enthält sekundäre Anti-Maus und Anti-Kaninchen-Antikörper in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisierungsproteinen und einem antimikrobiellen Wirkstoff. ADVANCE TM HRP Enzyme Dieses Reagenz enthält mit Meerrettichperoxidase polymerisierte Antikörper in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisierungsproteinen und einem antimikrobiellen Wirkstoff. Die Reagenzien im ADVANCE HRP Detektionssystem sind für immunhistochemische Verfahren sehr gut geeignet. Alle Reagenzien werden gebrauchsfertig geliefert. Weitere Verdünnung der Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationstemperaturen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Erforderliches, aber nicht mitgeliefertes Material Absorbierende Tücher Kontrollgewebe, positiv und negativ Gegenfärbung, wässrig, wie Automation Hematoxylin (Code S3301), Hematoxylin for IHC (Code S3302) und Mayer s Hematoxylin oder Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (Code S3309) Deckgläser Destilliertes Wasser Ethanol, absolut und 95 % Lichtmikroskop (20x 800x) Fixiermittel, wie Glycergel Mounting Medium (Code C0563) oder Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (Code S3025) bzw. nichtwässriges permanentes Fixiermittel Ultramount (Code S1964) Primäre Antikörper und negatives Kontrollreagenz Objektträger, Poly-L-Lysin beschichtet oder Silanized Slides (Code S3003) Färbeschalen oder Bäder Zeitmesser (muss Intervalle von 3 40 Minuten anzeigen können) Waschflaschen Waschpufferlösung Xylol, Toluol oder Xylolersatz Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien (optional) Ammoniakhydroxid, 15 mol/l, verdünnt auf 0,037 mol/l PAP Pen (Code S2002) ( ) EFG_002 p. 10/14

11 Empfohlene Dako- Produkte Vorsichtsmaßnahmen Aufbewahrung Dako Code Produktname Produkttyp S3800 Autostainer Plus Gerät S2001 S2003 Peroxidase-Block Dual Endogenous Enzyme Block Peroxidase-Hemmer Endogene-Peroxidase-Hemmer S3006 K3461/K3469 K3467/K3468 S3301 S3302 S3309 Wash Buffer 10x For Automated and Manual IHC Use. AEC+ Ready-to-use Liquid DAB+ Automation Hematoxylin Hematoxylin for IHC Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin Waschpuffer Substratsystem Gegenfärbung 1. Nur für Fachpersonal bestimmt. 2. Reagenzien nach Ablauf des für diese Aufbewahrungsmethode angegebenen Verfalldatums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien nicht gemäß den in der Packungsbeilage angegebenen Bedingungen aufbewahrt, muss deren Verwendung vom Anwender validiert werden. 3. Keine Reagenzien aus anderen Chargen oder aus Kits anderer Hersteller verwenden. 4. Zu starke Lichteinstrahlung kann für Enzyme und Substrat-Chromogene schädlich sein. Keine Komponenten des Kits bei starker Lichteinwirkung lagern und keine Färbungen bei hellem Licht, wie z.b. direktem Sonnenlicht, vornehmen. 5. Andere als die angegebenen Inkubationszeiten und -temperaturen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen; solche Abänderungen müssen vom Anwender bestätigt werden. 6. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs muss auch dieses entsprechend gehandhabt werden. 7. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 8. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen. Bei 2 8 C aufbewahren. Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Positiv- und Negativkontrollen sollten daher zum gleichen Zeitpunkt wie die Patientenproben getestet werden. Falls es zu einer unerwarteten Färbung kommt, die sich nicht durch Unterschiede bei Laborverfahren erklären lässt und auf ein Problem mit dem System hindeutet, ist der technische Kundendienst von Dako zu verständigen. Vorbereitung der Reagenzien Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen. Waschpufferlösung TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (Code S3006) wird als Waschpuffer für den automatischen und manuellen IHC-Nachweis empfohlen. TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (Code S1968) und PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (Code S3024) eignen sich ebenfalls als Waschpufferlösungen für manuelles Färben. Waschpufferlösungen mit Natriumazid werden nicht empfohlen. Natriumazid inaktiviert die Peroxidase (HRP) und führt zu einer negativen Färbung. Nicht verwendeten Puffer bei 2 8 C aufbewahren. Getrübten Puffer verwerfen. Peroxidase-Hemmer, Substrat und Gegenfarbstoff können mit destilliertem Wasser gespült werden. Primäre Antikörper Die konzentrierten Antikörper müssen im jeweiligen Labor optimiert werden. Verdünnungen sollten mit Antibody Diluent (Code S0809) oder einem Verdünnungsmittel mit 0,05 mol/l Tris-HCI-Puffer mit 1 % Rinderserum- Albumin (BSA) zubereitet werden. Für die meisten der mit diesem System verwendeten primären Antikörper ist eine Inkubationszeit von 30 Minuten ausreichend. Negativkontrolle Ein negatives Kontrollreagenz enthält im Idealfall entweder einen Antikörper, der keine spezifische Reaktivität mit menschlichen Geweben aufweist, oder normales/nichtimmunes Serum in der gleichen Grundsubstanz/Lösung wie der verdünnte primäre Antikörper. Das negative Kontrollreagenz sollte der gleichen Unterklasse und Tierart entstammen wie der primäre Antikörper und mit demselben Lösungsmittel auf dieselbe Immunglobulin- oder Proteinkonzentration wie dieser verdünnt sein. Die Inkubationszeit für das negative Kontrollreagenz sollte mit der für den primären Antikörper übereinstimmen. ( ) EFG_002 p. 11/14

12 Gegenfärbung DAB-Chromogen ergibt ein in Alkohol unlösliches Endprodukt und kann mit einem Hämatoxylinprodukt auf Alkoholbasis verwendet werden. Bei Verwendung von AEC Substrat-Chromogen ist das gefärbte Endprodukt der Färbereaktion alkohollöslich und sollte nur mit wässrigen Gegenfarbstoffen wie Automation Hematoxylin (Code S3301), Hematoxylin for IHC (Code S3302), Mayer s Hematoxylin oder Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (Code S3309) verwendet werden. Objektträger nach der Gegenfärbung mit Hämatoxylin gründlich in destilliertem Wasser spülen, dann in ein Bad mit 0,037 mol/l Ammoniak oder ähnlichem Bläuungsmittel tauchen. 0,037 mol/l Ammoniakwasser wird durch Mischen von 2,5 ml konzentriertem (15 mol/l) Ammoniumhydroxid mit einem (1) Liter Wasser zubereitet. Nicht verwendete 0,037 mol/l Ammoniaklösung kann bei Raumtemperatur (20 25 C) in einer dichtverschlossenen Flasche bis zu 12 Monate aufbewahrt werden. Für alternative Färbeverfahren die Herstellerrichtlinien zu Rate ziehen. Fixiermittel Zur wässrigen Fixierung werden Glycergel Mounting Medium (Code C0563) oder Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (Code S3025) empfohlen. Glycergel muss vor Verwendung auf mindestens 50 C erhitzt werden. Es kann auch das nicht-wässrige permanente Fixiermittel Ultramount (Code S1964) verwendet werden. Vorbereitung der Probe Leistungsmerkmale Färbeverfahren Zur Verwendung mit formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeschnitten sowie gefrorenen Gewebeschnitten und Zellabstrichen. Vor der IHC-Färbung muss das Gewebe fixiert und verarbeitet werden. Eine Fixierung schützt vor Autolyse und Zerfall des exzidierten Gewebes, erhält die Antigenität, verstärkt den Refraktionsindex der Gewebeteile und steigert die Resistenz der Zellelemente gegen Gewebeverarbeitung. Die Gewebeverarbeitung umfasst Dehydrierung, Abscheidung von Dehydrierungsmitteln, Infiltration des Einbettungsmediums, Einbetten und Schneiden des Gewebes. Die am häufigsten verwendeten Fixiermittel für IHC-Gewebepräparate sind unter General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung ) aufgeführt. Diese Angaben sind nur Richtlinien. Optimale Verfahren müssen vom Anwender bestimmt und überprüft werden. Die in diesem Produkt enthaltenen Antikörper wurden festphasengebunden, um Antikörper-Kreuzreaktivität auf Human-Immunglobulin (Ig) auszuschließen, allerdings kann eine geringfügige Kreuzreaktivität auf Ig anderer Spezies auftreten. Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Ig wurden jeweils auf einer Säule mit Maus- bzw. Kaninchen- Ig affinitätsgereinigt. Die kombinierte Aktivität richtet sich sowohl gegen Maus- und Kaninchen-Antikörper und umfasst die Bindung an IgG, alle IgG-Sub-Klassen und IgM. Die auf dem Polymer vorhandene HRP wurde aus HRP von hoher spezifischer Aktivität gewonnen. Unkonjugierte Moleküle wurden durch Gelfiltrationschromatographie entfernt. Hinweise Vor der Verwendung sollte der Anwender diese Anweisungen sorgfältig durchlesen und sich mit dem Inhalt des Produkts vertraut machen. Die in diesem System enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Produkt-Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationszeiten und -temperaturen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Vor Beginn der Immunfärbung alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20 25 C) bringen. Alle Inkubationen sollten ebenfalls bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Gewebeschnitte dürfen während der Färbung nicht austrocknen. Trockene Gewebeschnitte können unspezifische Färbungen aufweisen. Dem Luftzug ausgesetzte Objektträger abdecken. Falls längere Inkubationszeiten erforderlich sind, die Gewebe in eine feuchte Umgebung stellen. Automatisiert Den Dako Autostainer / Autostainer Plus wie folgt programmieren: SCHRITT 1 Programm Protocol Template Auto wählen SCHRITT 2 Die Reagenzien in den Reagenzienständer des Geräts stellen und die Glasballons mit Waschpuffer und destilliertem Wasser füllen. SCHRITT 3 Das Gerät mit den Objektträgern beladen. SCHRITT 4 Den Durchlauf starten. SCHRITT 5 Die Objektträger aus dem Gerät nehmen. Handbuch (Für jeden Schritt sind geeignete Dako Produkte in der obenstehenden Aufstellung genannt.) SCHRITT 1 ENDOGENES-ENZYM-HEMMER Überschüssigen Puffer abschütteln. Den Bereich um die Probe herum mit einem flusenfreien Tuch sorgfältig abtupfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen und das Reagenz an der vorgesehenen Stelle zu behalten. Eine ausreichende Menge zugeben, um die Probe zu bedecken. Je nach Konzentration des endogenen Enzyms im getesteten Gewebe 5 10 Minuten mit Dual Endogenous Enzyme Block oder Peroxidase Block inkubieren. Mit destilliertem Wasser oder Pufferlösung aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) gründlich spülen und in ein frisches Pufferbad legen. ( ) EFG_002 p. 12/14

13 SCHRITT 2 PRIMÄRE ANTIKÖRPER ODER NEGATIVKONTROLLE Überschüssigen Puffer abschütteln und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend optimal verdünnte primäre Antikörper oder Negativkontrolle zugeben, um die Probe abzudecken. 30 (±1) Minuten inkubieren. Mit Pufferlösung aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) gründlich spülen und 5 Minuten in ein frisches Pufferbad legen. SCHRITT 3 ADVANCE TM HRP Link Überschüssigen Puffer abschütteln und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend ADVANCE TM HRP Link zugeben, um die Probe zu bedecken. 30 (±1) Minuten inkubieren. Wie in Schritt 2 spülen. SCHRITT 4 ADVANCE TM HRP Enzyme Überschüssigen Puffer abschütteln und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend ADVANCE TM HRP Enzyme zugeben, um die Probe zu bedecken. 30 (±1) Minuten inkubieren. Wie in Schritt 2 spülen. SCHRITT 5 SUBSTRAT-CHROMOGEN Überschüssigen Puffer abschütteln und Objektträger wie zuvor abwischen. Eine genügende Menge Substrat-Chromogen-Lösung zugeben, um die Probe zu bedecken Minuten (AEC+) or 5 10 Minuten (DAB+) inkubieren. Mit destilliertem Wasser sorgfältig spülen. Abfallprodukte des Substrat-Chromogens in einem Sondermüllbehälter auffangen und entsprechend entsorgen. Abgespülte Objektträger in ein frisches Wasserbad mit destilliertem Wasser geben. SCHRITT 6 GEGENFÄRBUNG MIT HÄMATOXYLIN (optional) Objektträger in ein Hämatoxylin-Bad eintauchen. Inkubationsdauer hängt von der Stärke der verwendeten Hämatoxylinlösung ab. Objektträger 2 5 Minuten in einem Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen. * Für eine höhere Durchlaufleistung werden kürzere Inkubationszeiten mit alternativen Verdünnungen der primären Antikörper empfohlen. Mit der empfohlenen Inkubationsdauer von 30 Minuten wird die größte Sensitivität erzielt. Qualitätskontrolle Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und bei technischen Verfahren im Labor des Anwenders können zu stark unterschiedlichen Ergebnissen führen, daher sind zusätzlich zu den folgenden Verfahren regelmäßige Leistungskontrollen im Labor durchzuführen. Weitere Informationen siehe Richtlinien zur Qualitätskontrolle des College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry und Literaturhinweise 6 bis 8. Weitere Angaben zu Sicherheit und Immunreaktivität sind dem Sicherheitsdatenblatt jedes verwendeten primären Antikörpers zu entnehmen. Weitere Informationen über Positiv- und Negativkontrollen siehe General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung ). Auswertung der Färbung Allgemeine Beschränkungen Richtlinien zur Auswertung siehe General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung ). Allgemeine Beschränkungen siehe General Instructions for Immunohistochemical Staining ( Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung ). Alte oder nicht gepufferte Fixiermittel oder die Einwirkung hoher Temperaturen auf das Gewebe (höher als 60 C) während des Verfahrens können zu einer verri ngerten Sensitivität der Färbung führen. In Hämoproteinen wie Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrom und Katalase sowie in eosinophilen Zellen kann endogene Peroxidase-Aktivität oder Pseudoperoxidase-Aktivität auftreten. 9, 10 Dieses kann durch Inkubation der Proben vor Zugabe des primären Antikörpers (fünf Minuten mit Peroxidase-Block oder 5 10 Minuten mit Dual Endogenous Enzyme Block) vermieden werden. Blut- und Knochenmarkabstriche und gefrorenes Gewebe können ebenfalls mit diesem Reagenz behandelt werden. Dieses Verfahren hebt jedoch die rot-braune Pigmentierung der Hämoproteine nicht auf. Als Alternative kann eine Methanol-Wasserstoffperoxidlösung verwendet werden. Einige Antigene können bei diesem Verfahren denaturiert werden. Gewebe von mit dem Hepatitis-B-Virus infizierten Personen und Gewebe mit Hepatitis-B-Virus- Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettichperoxidase eine unspezifische Färbung aufweisen. 11 Normale/nichtimmune Sera desselben tierischen Ursprungs wie die in den Blockierungsschritten verwendeten sekundären Antisera können durch Auto-Antikörper oder natürliche Antikörper zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen. Die in diesem Kit gelieferten Reagenzien wurden optimal verdünnt. Weitere Verdünnung kann zu vermindertem Antigennachweis führen. ( ) EFG_002 p. 13/14

14 Fehlersuche und - behebung Beobachtung Zu starkes Signal Hintergrund am Saum Hintergrund bei positiven Tests Hintergrund bei negativen Tests Unspezifische Färbung Kein Signal Assaydauer zu lang Kommentar Als hochempfindliches Detektionssystem gestattet ADVANCE HRP eine höhere Verdünnung der primären Antikörper. Bei unzureichender Verdünnung tritt ein zu starkes Signal auf. In diesem Fall eine Verdünnungsserie der primären Antikörper zubereiten und eine Verdünnung auf dem Plateau vor dem Falloff-Punkt auswählen. Gewebe ist ausgetrocknet. Die Objektträger zur manuellen Färbung in eine Feuchtkammer stellen. Primäre Antikörper weiter verdünnen (siehe oben: zu starkes Signal ). Die Konzentration von Negativkontrolle und optimal titrierten primären Antikörpern sollte übereinstimmen. Andernfalls die Negativkontrolle weiter verdünnen. Das Waschen ist wichtig. Wenn das korrekte Abspülen, gefolgt von 5 Minuten Inkubation, nicht ausreicht, zweimal durch jeweils fünfminütiges Einweichen waschen. Die Abfolge von ADVANCE TM HRP Link und ADVANCE TM HRP Enzyme ist für eine Reaktion von entscheidender Bedeutung: Überprüfen, ob die korrekte Reihenfolge eingehalten wurde. Primäre Antikörper waren zu stark verdünnt. In diesem Fall eine Verdünnungsserie zum Ermitteln der korrekten Verdünnung zubereiten. Mit ADVANCE HRP sind höhere Sensitivität, kürzere Inkubationszeiten oder eine Kombination von beidem möglich. Wird eine insgesamt kürzere Assaydauer gewünscht, primäre Antikörper in höheren Konzentrationen verwenden. References Bibliographie Literaturangaben 1. Guesdon JL, et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27: Warnke R and Levy R. Detection of T and B cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies. A biotin-avidin-horseradish peroxidase method. J Histochem Cytochem 1980; 28: Petrusz P and Ordronneau P. Immunohistochemistry of pituitary hormones. Polak MT and van Noorden S, eds. Immunocytochemistry: Practical applications in pathology and biology. Bristol-Wright-PSG 1983; Nagle RB, et al. Immunohistochemical demonstration of keratins in human ovarian neoplasms. A comparison of methods. J Histochem Cytochem 1983; 31: Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984; 2: Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilber DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standard. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 8. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribo LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1990; Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 Edition 06/10 ( ) EFG_002 p. 14/14

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