Bewerbung auf den Förderpreis der Stiftung Zahnärztliche Wissenschaften des Freien Verbandes Deutscher Zahnärzte e. V.
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- Albert Kranz
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1 Bewerbung auf den Förderpreis der Stiftung Zahnärztliche Wissenschaften des Freien Verbandes Deutscher Zahnärzte e. V. Dr. Rüdiger Zimmerer Klinik und Poliklinik für Mund,- Kiefer- und Gesichtschirurgie Medizinische Hochschule Hannover Carl-Neuberg-Str Hannover Telefon: Fax: Zimmerer.Ruediger@mh-hannover.de
2 Erstellung eines biomechanischen Profils vaskularisierter, präfabrizierter, bioartifizieller Konstrukte unter Berücksichtigung der Mikrostruktur Einleitung Die Hauptursachen für knöcherne Defekte in der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie sind Tumorerkrankungen, Entzündungen und vor allem posttraumatische Deformitäten. Das Problem des knöchernen Defekts im Gesichtsschädel ist immer ein kombiniertes Problem aus einem Hartgewebedefekt und einem Weichgewebedefizit. Im klinischen Alltag stellt die Rekonstruktion solcher Defekte nach wie vor eine Herausforderung dar. Grundvoraussetzung für eine suffiziente Rekonstruktion ist eine adäquate Vaskularisierung des zu rekonstruierenden Defektareals. Autologe Knochentransplantate, die entweder mikrochirurgisch-anastomosiert oder avaskulär eingebracht werden, sind weltweiter Goldstandard. Allerdings sind diese Techniken, insbesondere in der kraniofazialen Chirurgie, mit funktionellen und ästhetischen Kompromissen behaftet. Um die Nachteile der autologen Transplantate zu umgehen, wird im Bereich des Tissue Engineerings seit Jahrzehnten an porösen resorbierbaren und nicht resorbierbaren Knochenersatzmaterialien geforscht. Als mögliche Alternative werden bioartifizielle Knochentransplantate vorgeschlagen, die als bereits präfabriziertes Konstrukt entsprechend der Defektsituation im Empfängerorganismus mit einem arterio-venösen Gefäßbündel vaskularisiert werden können. Grundsätzlich sind präfabrizierte, vaskularisierte, bioartifizielle Konstrukte für jeden ausgedehnten knöchernen Defekt herstellbar. Der Grundbauplan ist bei allen Konstrukten identisch und umfasst Matrix (3D-Gerüst, Scaffold), Gefäßstiel und autogenes, spongiöses Knochenmaterial zur Vitalisierung [1]. Die so generierten Konstrukte überzeugen auch durch eine klinisch ausreichende und mechanische Stabilität [2]. Eine dezidierte biomechanische Untersuchung stand allerdings noch aus. Ziele Ziel dieser Arbeit war es, ein erstes biomechanisches Profil der bioartifiziellen Konstrukte zu erstellen, um deren Einsatz im klinischen Alltag zu ermöglichen. Dazu wurden in einem bereits etablierten Verfahren [3] zunächst vaskularisierte, präfabrizierte, bioartifizielle Konstrukte generiert, nach 6 Monaten explantiert, und für die biomechanischen Kompressionsprüfungen im Rahmen dieser Studie aufgearbeitet. Methodik In dieser Studie wurden 6 weibliche Schwarzkopf Schafe mit einem durchschnittlichen Gewicht von 69,3 kg verwendet. Alle Tierexperimente wurden unter Intubationsnarkose unter sterilen Bedingungen in den Operationssälen der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt. Die Intubationsnarkosen und die postoperative Überwachung der Tiere erfolgten in fachtierärztlicher Obhut. Die Tierversuche wurden im Einklang mit 8 des Deutschen Tierschutzgesetzes und den Vorgaben der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt und unter der Tierversuchsnummer /1621 vom Landesamt für Verbraucherschutz (LAVES) in Oldenburg genehmigt. 2
3 Nach Rasur und Lagerung der Tiere in Linksseitenlage, wurde das Operationsgebiet steril abgewaschen und abgedeckt. Nach Inzision der Haut im Verlauf der Medioaxillar- Linie erfolgte die schrittweise Präparation in die Tiefe bis zum Vorderrand des Musculus Latissimus dorsi. Anschließend wurde das thorakodorsale Gefäßbündel aufgesucht und langstreckig freigelegt. Nun wurden zwei ßTCP Zylinder (chronos, Synthes, West Chester, USA) der Länge nach mit einem piezoelektrischen Gerät aufgesägt, um später dort das Gefäßbündel einlegen zu können [3]. Die Hohlräume wurden mit autologer Spongiosa verfugt und das Konstrukt in einen Titankäfig eingeschlagen (Abbildung 1). Abbildung 1: Schema zum Aufbau eines vaskularisierten, präfabrizierten bioartifiziellen Konstrukts. Zwei ßTCP-Zylinder sind im Winkel von 30 zueinander angeordnet. Im Zentrum verläuft der axiale Gefäßstiel mit Arterie und Vene. Die Hohlräume des Konstrukts sind mit Spongiosa verfugt und das Konstrukt wird von einem individualisierten Titankäfig umgeben. Im Zentrum des Konstrukts treffen zwei Zylinder aufeinander (conjunction). Die äußeren Bereiche werden als Peripherie bezeichnet. Direkt nach Explantation wurden alle Konstrukte in einem Mikro-Computertomographen untersucht und anschließend für biomechanische Kompressionsversuche in Zylinder von ca. 8 mm Höhe zerlegt. Das Restmaterial wurde für ergänzende histologische und histomorphometrische Untersuchungen verwendet. Anschließend wurden die Grundflächen aller Prüfkörper laser-gestützt vermessen und diese einer uniaxialen Kompression in einer Mini Bionox 858 Materialtestmaschine (MTS Systems, Minneapolis, USA) mit einer Auslenkungsgeschwindigkeit von 10 µm/s ausgesetzt. Bei Erreichen einer Kraft von 1 kn oder bei Materialversagen wurde der Test abgebrochen. Analog wurde mit autologen kortikalen und spongiösen Referenzknochen verfahren. Um eine Vergleichbarkeit aller Prüfkörper zu gewährleisten, wurden hier Proben ausgewählt, die eine ähnliche Geometrie wie die Konstrukte aufwiesen. Hierzu zählten kortikale Knochenscheiben aus Radius und Mittelhand und spongiöse Scheiben aus Tibia- und Femurkopf. Aus der Spannungs-Dehnungskurve aller komprimierten Prüfköper wurden die Elastizitätsmoduln errechnet und diese untereinander verglichen. Ergebnisse Die biomechanische Kompressionstestung ergab, dass die Konstrukte 1/5 der mechanischen Stabilität von spongiösem Knochen aus Tibia- und Femurkopf aufwiesen. Die intrinsische Steifigkeit der bioartifiziellen Konstrukte konnte somit mit 20 % des E-Moduls von spongiösem Knochen angegeben werden kann. Die Steifigkeit von autologem, kortikalem Knochen war allerdings um ein Vielfaches höher. Im Vergleich zu kortikalem Knochen aus Radius und Mittelhand lag die intrinsische Steifigkeit bei nur 1,5 % (Abbildung 2 A). 3
4 Abbildung 2: Elastizitätsmoduln im Vergleich. (A) Gegenüberstellung der E-Moduln der Konstrukte, Spongiosa und Kortikalis. (B) Vergleich der E-Moduln von Peripherie und Zentrum der Konstrukte. (*) Statistisch signifikante Unterschiede mit p < 0,05 Der Vergleich der Elastizitätsmoduln zeigte eine ortspezifische Verteilung in den Konstrukten. Die Zone des Konstrukts (conjunction), in der die ßTCP-Zylinder im Winkel von 30 aufeinander treffen, zeigte einen signifikant höheren Elastizitätsmodul als die Proben aus der Peripherie des Konstrukts. Es ließ sich ein statistisch signifikanter (p < 0,05) Anstieg der intrinsischen Steifigkeit von der Konstrukt-Peripherie zum Zentrum hin feststellen. Genauer gesagt war die intrinsische Steifigkeit der Peripherie nur 30 % derer vom Konstrukt-Zentrum (Abbildung 2 B). Dieses Phänomen macht deutlich, dass Bereiche des Konstrukts mit höherem Verknöcherungsanteil und fortgeschrittener Matrixdegradation stabiler sind als Zonen in denen Scaffold-Residuen vermehrt nachweisbar sind. Die Konstrukte selbst zeigten eine knöcherne Durchsetzung, die CT-morphologisch (Abbildung 3) und histomorphometrisch (Abbildung 4) bestätigt werden konnte. Die genauere Analyse der Konstrukte im µ- CT ergab im Vergleich zu einem einzelnen, unveränderten Rohzylinder eine Abnahme des Scaffold- Volumens, des Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnisses und der Scaffold-Dichte. Folglich nahm die Oberfläche der Konstrukte im Verhältnis zu ihrem Volumen ab. Nach Abzug des Weichgewebeanteils vom Gesamtvolumen ergab sich ein durchschnittlicher Knochenanteil in den Konstrukten von 20,86 %. Abbildung 3: Konstrukte im μ-ct nach Explantation. (A) Längsansichten (B) Queransichten. Es kommen Lakunen mit Verknöcherung (Pfeile), das Gefäßbündel (*) und Matrix-Residuen (#) zur Darstellung. 4
5 Die ortsspezifische Verteilung der Steifigkeitswerte in den Konstrukten konnte durch histologische und histomorphometrische Untersuchungen bestätigt werden. Hier ergab sich ein höherer Knochenanteil im Zentrum des Konstrukts, der von einer vermehrten Degradation des Scaffolds und einem geringeren Bindegewebeanteil begleitet wurde (Abbildung 4). Abbildung 4: Histomorphometrie. Querschnitte der Konstrukte aus (A) Peripherie und (B) Zentrum. Es kommen Verknöcherungen (Pfeil), Matrix-Residuen (#) und das Gefäßbündel (*) zur Darstellung. (C) Balkendiagramm der Vergleich der Histomorphometrie von Peripherie (P) und Zentrum (Z). Statistisch signifikante Unterschiede (p< 0,05) sind mit (*) gekennzeichnet. Diskussion In der rekonstruktiven Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie ist die Beckenkammregion eines der wichtigsten Spenderareale für autogene Knochentransplantate. Diese dienen zur Rekonstruktion knöcherner Defekte nach ablativer Tumorchirurgie, bei ausgeprägter Atrophie der Kiefer oder bei Lippen- Kiefer-Gaumenspalten. Je nach Defektgröße kommen partikuläres Knochenmaterial, Knochenersatzmaterial, oder mono- bzw. bikortikale Knochenblöcke zum Einsatz. Mit zunehmender Größe und Komplexität der Knochentransplantate nimmt die Bedeutung der Vaskularisation deutlich zu. Dann kann auf vaskularisierte, mikrovaskulär-anastomosierte Knochentransplantate zurückgegriffen werden, die allerdings häufig mit einer erheblichen Entnahmemorbidität vergesellschaftet sind. Als mögliche Alternative werden bioartifizielle Knochentransplantate diskutiert, die als bereits präfabriziertes, vaskularisiertes Konstrukt entsprechend der Defektsituation computer-assistiert generiert werden können. Vorversuche unserer Arbeitsgruppe zum Vergleich verschiedener Vitalisierungsstrategien der ßTCP-Zylinder mit autologer Spongiosa, peripherem Blut und ex vivo kultivierten mesenchymalen Stammzellen bewiesen die Überlegenheit der osteogenetischen Spongiosa bei der ektopen Knochenneubildung [1-4]. Der Schlüssel zum Erfolg bei bioartifiziellen Knochenformationen in 3D-Gerüsten ist sicherlich einerseits eine hohe Anzahl potenter, osteogener Zellen und andererseits eine suffiziente Vaskularisierung, die Sauerstoff und Nährstoffe bereitstellt. Unter diesem Aspekt ist die chirurgische Implementierung einer Gefäßversorgung, die den Prinzipien der intrinsischen Vaskularisierung folgt, ein vielversprechender Ansatz, 5
6 der in zahlreichen tierexperimentellen Studien bereits vorgestellt wurde. Im Laufe der letzten Jahre hat unsere Arbeitsgruppe mehrere Großtierversuche an Schafen zu präfabrizierten, bioartifiziellen Konstrukten durchgeführt. Dabei wurde an ßTCP-Zylindern die intrinsisch axiale Prävaskularisation mit der extrinsisch randomisierten verglichen. Hierbei zeigte sich die axiale Prävaskularisierung bezüglich Knochenneubildung und Matrixdegradation überlegen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass durch die axiale Prävaskularisierung und Vitalisierung der ßTCP-Zylinder mit osteogenetischem Material bioartifizieller Knochen entsteht, der die intrinsische Steifigkeit von spongiösem Knochen aufweist. Ausblick Um die Steifigkeit bioartifizieller Konstrukte weiter zu verbessern, könnte in zukünftigen Untersuchungen der Einfluss einer adäquaten physiologischen Belastung Berücksichtigung finden. Wie bei der Frakturheilung oder Knochenregeneration auch, reift unreifer Geflechtknochen über verschiedene Zwischenstufen der Kallusbildung unter Belastung zu reifem Lamellenknochen. Ähnlich wie nach der Transplantation von autologen Knochentransplantaten, die nach einer Phase der Ruhigstellung kontinuierlicher Belastung ausgesetzt werden müssen, um einer Atrophie entgegen zu wirken, könnte die physiologische mechanische Belastung von präfabrizierten, bioartifiziellen Konstrukten deren mechanische Eigenschaften weiter verbessern. Da die in dieser Studie gezeigt werden konnte, dass die Konstrukte ähnliche Steifigkeitswerte wie spongiöser Knochen aufweisen, der standardmäßig zur Rekonstruktion und präimplantologischen Augmentation im Mund-, Kiefer- und Gesichtsbereich angewandt wird, liegt die Vermutung nahe, dass sich dieses innovative Knochenersatzmaterial aufgrund seiner Eigenschaften für eine zeitnahe Anwendung in der Klinik eignet. Schlussfolgerung Abschließend lässt sich feststellen, dass axial vaskularisierte, bioartifizielle Knochentransplantate von ausreichender Stabilität anhand eines in vivo Präfabrikationsprozesses generieren werden können. Diese eignen sich möglicherweise als defektorientierte, individuelle, bioartifizielle Knochentransplantate zur Rekonstruktion ausgedehnter Defekte in der kraniofazialen Chirurgie. Der in dieser Pilotstudie erstmals vorgestellte Arbeitsablauf stellt ein adäquates Verfahren dar, um die biomechanischen Eigenschaften bioartifizieller Konstrukte evaluieren zu können. Danksagung Die Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Dr. Kokemüller und Herrn Prof. Dr. Dr. Gellrich bedankt sich bei der CORTISS und Wille Stiftung für die finanzielle Unterstützung des Projekts und der Synthes GmbH für die Versorgung mit chirurgischen Verbrauchsmaterialien. 6
7 Literaturverzeichnis 1. Kokemueller, H., et al., Prefabrication of vascularized bioartificial bone grafts in vivo for segmental mandibular reconstruction: experimental pilot study in sheep and first clinical application. Int J Oral Maxillofac Surg, (4): p Zimmerer, R., et al., [Prefabrication of vascularized facial bones]. Chirurg, (3): p Kokemueller, H., et al., En bloc prefabrication of vascularized bioartificial bone grafts in sheep and complete workflow for custom-made transplants. Int J Oral Maxillofac Surg, (2): p Spalthoff, S., et al., Heterotopic bone formation in the musculus latissimus dorsi of sheep using beta-tricalcium phosphate scaffolds: evaluation of an extended prefabrication time on bone formation and matrix degeneration. Int J Oral Maxillofac Surg, (6): p
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