Elucigene QST*R -Produkte Leitfaden zur Analysesoftware

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1 Elucigene QST*R -Produkte Leitfaden zur Analysesoftware Hersteller: Gen-Probe Life Sciences Ltd. Oaks Business Park Crewe Road Wythenshawe Manchester M23 9HZ, Großbritannien Vertrieb, Kundendienst und Technischer Kundendienst: T: +49 (0) F: +49 (0) E: E: AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 1 von 30

2 GeneMapper-Analyse Einleitung Im folgenden Abschnitt werden die Verfahrensweisen zur Probenanalyse von mit Elucigene QST*R erzielten Ergebnissen mithilfe des Softwarepakets GeneMapper von Applied Biosystems (Version 3.7 oder höher) sowie die Einfügung von Tabellendaten in die QST*R-Berichtsvorlage in Excel beschrieben. Analyseprozess Der Ablauf der Probenanalyse ist im unten abgebildeten Flussdiagramm zusammengefasst: AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 2 von 30

3 GeneMapper Die Programmdatei GeneMapper öffnen und die erforderlichen fsa-dateien durch Klicken auf die Schaltfläche add samples to project (Proben dem Projekt hinzufügen) auswählen. Anhand der Ordnerstruktur links im Fenster zum gewünschten Durchlaufordner navigieren. Den Ordner auswählen und auf die Schaltfläche Add to List >> (Der Liste hinzufügen >>) klicken. Der Durchlaufordner erscheint nun im Fenster Samples to add (Hinzuzufügende Proben). Durch Doppelklicken auf das Durchlaufordner-Symbol in diesem Fenster werden die einzelnen zu importierenden fsa-dateien angezeigt (Abbildung 1). Die Proben werden dann durch Klicken auf die Schaltfläche Add (Hinzufügen) hinzugefügt. Abbildung 1: Proben, die dem Projekt hinzugefügt werden können AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 3 von 30

4 Importieren der QST*R GeneMapper-Analyseeinstellungen in den GeneMapper Manager Die QST*R-Einstellungen für GeneMapper müssen importiert werden. Dieser Prozess wird über die Benutzeroberfläche GeneMapper Manager gesteuert. Die QST*R-Einstellungen für GeneMapper sind auf der Gen-Probe-Webseite verfügbar: 1. Das Programm GeneMapper Manager durch Klicken auf das Symbol öffnen (Abbildungen 2 und 3). Abbildung 2: Öffnen des GeneMapper Manager Abbildung 3: Benutzeroberfläche des GeneMapper Manager 2. Die Registerkarte Analysis Methods (Analysemethoden) auswählen und dann auf die Schaltfläche Import (Importieren) klicken. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 4 von 30

5 3. Zu der/den benötigten Datei(en) für die QST*R-Analyseeinstellungen navigieren und sie importieren: 3130 bzw (Abbildung 4). Abbildung 4: Importieren der Analysemethoden 4. Auf die gleiche Art und Weise die entsprechende Registerkarte für folgende Einstellungen auswählen und die entsprechenden Dateien importieren: Table Settings (Tabelleneinstellungen) Plot Settings (Grafikeinstellungen) Size Standards (Größenstandards) Hinweis: Für Cluster Plot Settings (Clustergrafikeinstellungen), Matrices (Matrizen), SNP Sets (SNP-Sätze) und Report Settings (Berichteinstellungen) müssen keine Dateien importiert werden. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 5 von 30

6 Importieren von QST*R-Paneleinstellungen im Panel Manager Die QST*R-Panel- und Bin-Einstellungen für GeneMapper müssen importiert werden. Dieser Prozess wird über die Benutzeroberfläche Panel Manager gesteuert. QST*R-Panel- und Bin-Einstellungen für GeneMapper sind auf der Gen-Probe-Webseite verfügbar: 1. Das Programm Panel Manager durch Klicken auf das Symbol öffnen. 2. Im linken Navigationsfenster auf Panel Manager klicken. Panel Manager ist nun blau markiert. 3. File/Import Panels (Datei/Panels importieren) auswählen. Zur GeneMapper- Paneldatei anan000 gmbf*.txt navigieren und sie importieren (Abbildung 5). 4. Die Paneldatei wird nun im linken Navigationsfenster angezeigt. Die Paneldatei anklicken, sodass sie blau markiert ist. 5. File/Import Bin Set (Datei/Binsatz importieren) auswählen. Zur GeneMapper- Bindatei anan000 gmbf*.txt navigieren und sie importieren (Abbildung 6). 6. Auf Apply (Anwenden) und dann auf OK klicken. Abbildung 5: Importieren der QST*R-Paneldatei AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 6 von 30

7 Abbildung 6: Importieren der QST*R-Binsatzdatei Ändern der Analyseparameter-Datei Möglicherweise müssen die voreingestellten Analysis Ranges (Analysebereiche) in den QST*R-Analyseeinstellungen auf die jeweiligen Testbedingungen angepasst werden. Der minimale Analysebereich hängt vom während der Datenerfassung verwendeten Kapillarmodul und Polymer ab. Anzeige der aktuellen Analyseeinstellungen: 1. GeneMapper Manager öffnen. 2. Die Registerkarte Analysis Methods (Analysemethoden) auswählen. Die importierte QST*R-Datei ist als QSTR Analysis (QSTR-Analyse) aufgeführt. 3. Auf QSTR Analysis (QSTR-Analyse) klicken. Die Zeile ist nun markiert. 4. Auf die Schaltfläche Open (Öffnen) klicken und die Registerkarte Peak Detector (Peakdetektor) auswählen (Abbildung 7). Standardmäßig sind die Analysebereiche so eingestellt, dass sie bei 2000 beginnen und bei enden. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 7 von 30

8 Abbildung 7: Analysebereiche Bestimmen des korrekten Analysebereichs für das jeweilige Labor: 1. Im GeneMapper-Hauptfenster auf den importierten Durchlaufordner doppelklicken, um die darin enthaltene Liste mit fsa-dateien anzuzeigen. 2. Eine fsa-datei auswählen. 3. Durch Klicken auf die Registerkarte Raw data (Rohdaten) wird das Elektropherogramm der Rohdaten angezeigt. 4. Mit dem ersten Peak des Größenstandards (z. B. 75 bp von GS500LIZ) als Anhaltspunkt einen ungefähr 100 Datenpunkte größeren Datenpunkt auswählen (Abbildung 8). Damit wird der niedrigste Punkt im analysierbaren Bereich festgelegt. 5. Sicherstellen, dass der maximale Analysebereich den größten Peak des Größenstandards umfasst (z. B. 500 bp von GS500LIZ oder 600 bp von GS600LIZv2). 6. Die neuen Werte in die QST*R-Analysedatei eingeben (der Zugriff darauf erfolgt wie oben beschrieben). AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 8 von 30

9 Abbildung 8: Bestimmen des minimalen Bereichs anhand von Probenrohdaten Analysieren der importierten QST*R-Dateien 1. Im GeneMapper-Hauptfenster QST*R-Table Settings (QST*R- Tabelleneinstellungen) auswählen (Abbildung 9). Abbildung 9: Dropdownmenü QST*R-Table Settings (QST*R-Tabelleneinstellungen) 2. Im GeneMapper-Hauptfenster auf die erste Zelle unter Analysis Method (Analysemethode) klicken und aus dem Dropdownmenü entweder QSTR Analysis 3130 (QSTR-Analyse 3130) oder QSTR Analysis 3500 (QSTR-Analyse 3500) auswählen. Auf die gleiche Art und Weise den Größenstandard durch Auswahl von QSTRLIZ500 oder QSTRLIZ600 aus dem Dropdownmenü auswählen. 3. Das Panel QSTR_gm* auswählen und auf das geeignete Unterpanel klicken (Abbildung 10). 4. Alle Spalten ausfüllen, indem die Spaltenüberschrift gewählt und Strg-D getippt wird. 5. Zum Starten der Probenanalyse auf klicken. Bei entsprechender Aufforderung einen Projektnamen zuweisen. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 9 von 30

10 Abbildung 10: QST*R-Paneleinstellungen auswählen QST*R-Daten prüfen 1. Die zu analysierende Probe auswählen (Zeile der Probe markieren). 2. Zur Grafikanzeige Display Plots (Grafiken anzeigen) auf klicken. 3. Die Grafikeinstellungen QST*R Plot settings auswählen (Abbildung 11). Abbildung 11: Dropdownmenü der QST*R-Grafikeinstellungen 4. Das Plot Window (Grafikfenster) zeigt das Probenprofil mit den Tabellendaten an (Abbildung 12). GeneMapper beschriftet automatisch bis zu zwei Peaks für jeden Marker. Falls für einen Marker drei Allele vorhanden sind, sollte der dritte, nicht markierte Peak manuell beschriftet werden (siehe Manuelle Bearbeitung von Profilen ). Hinweis: Die Allel-Größenbereiche für jeden Marker beruhen auf früher beobachteten Daten. Seltene Allele können außerhalb des angegebenen Marker-Größenbereichs fallen, sodass es erforderlich sein kann, den Binsatz entsprechend zu modifizieren. 5. Es wird empfohlen, dass für das Plot Window (Grafikfenster) Single click editing (Einzel-Klickbearbeitung) aktiviert ist. Dazu Alleles/set click editing (Allele/Klickbearbeitung einstellen) auswählen und darauf achten, dass diese Option markiert ist. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 10 von 30

11 Abbildung 12: Beispiele für ein Grafikfenster mit beschrifteten Spurdaten und der zugehörigen Genotyp-Tabelle AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 11 von 30

12 Manuelle Bearbeitung von Profilen WARNUNG! GeneMapper beschriftet nur bis zu 2 Peaks pro Marker. Daher kann eine manuelle Bearbeitung von Profilen erforderlich sein, z. B. um den 3. Peak (sofern vorhanden) zu beschriften oder die Beschriftung von einem Stotter-Peak zu entfernen. Um einen Peak zu beschriften, den unbeschrifteten Peak mit der linken Maustaste anklicken. Es erscheint die Option Add Allele Comment (Allel-Beschriftung hinzufügen). Auf OK klicken. Daraufhin wird der Peak mit seiner Größe (in Basenpaaren) und der Peakfläche beschriftet. Der neu beschriftete Peak wird automatisch in die Tabelle aufgenommen. Um eine Beschriftung von einem Peak zu entfernen, die Beschriftung des Peaks mit der linken Maustaste anklicken. Es erscheint die Option Delete Allele Comment (Allel- Beschriftung löschen). Auf OK klicken. Die Beschriftung des Peaks wird nun entfernt. Die gelöschten Peakdaten werden automatisch aus der Tabelle entfernt. Weitere Informationen zum Scoring von QST*R-Proben finden sich in der Gebrauchsanweisung und dem Leitfaden zur Interpretation für Elucigene QST*R auf der Gen-Probe-Webseite: Kopieren von Tabellendaten 1. Alle Zeilen in der Tabelle unten im Grafikfenster markieren. 2. Die ausgewählten Zeilen mit der Tastenkombination Strg+C kopieren. QST*R-Berichtsvorlage QST*R-Berichtsvorlagen können dazu verwendet werden, die Peak-Verhältnisse für einen Marker zu bestimmen. Die Berichtsvorlage für jedes Produkt aus der QST*R-Reihe steht auf der Gen-Probe-Webseite zur Verfügung: 1. Die entsprechende Berichtsvorlagendatei öffnen. 2. Falls für die Berichtsvorlage eine Sicherheitswarnung angezeigt wird, dass Makros deaktiviert wurden, wie in Abbildung 13 dargestellt die Schaltfläche Options (Optionen) anklicken. 3. Das Fenster Security Options (Sicherheitsoptionen) erscheint (Abbildung 14). Die Option Enable this content (Diese Inhalte aktivieren) auswählen und auf OK klicken. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 12 von 30

13 Abbildung 13: Sicherheitswarnung (Makros deaktiviert) Abbildung 14: Fenster Security Options (Sicherheitsoptionen) zum Aktivieren von Makros 4. Das Blatt Import GM (GM importieren) auswählen und sicherstellen, dass Zelle A1 ausgewählt ist. 5. Die aus GeneMapper kopierten Tabellendaten mit der Tastenkombination Strg+V einfügen und unmittelbar anschließend die Schaltfläche Sort (Sortieren) anklicken (Abbildung 15). Hinweis: Damit die Sortierfunktion ablaufen kann, MÜSSEN alle eingefügten Daten ausgewählt sein. 6. Die Registerkarte QSTR-GM (- gibt an, welches Arbeitsblatt aktuell benutzt wird) auswählen. Der Ergebnisbericht enthält nun alle Peak-Angaben und -Verhältnisse für die Probe (Abbildung 16). AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 13 von 30

14 Abbildung 15: Beispiel für eine importierte GeneMapper-Tabelle für QST*Rplusv2 Abbildung 16: Beispiel für einen Bericht in QST*Rplusv2 AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 14 von 30

15 Scoring des Berichts 1. Eine Trisomie wird durch einen der nachstehenden Fälle bestimmt: a) Zwei Peaks von unterschiedlicher Höhe, da einer der Peaks für zwei Allele steht, die beiden Elternteilen gemeinsam sind. In diesem Fall wird das Verhältnis zwischen den beiden Peaks als 2:1 bzw. 1:2 eingestuft. Hierbei ergibt sich für A1/A2 ein Wert im Bereich von 1,8 bis 2,4, wenn der für das kürzere Allel stehende Peak mehr Fläche hat als der für das längere Allel stehende Peak, bzw. ergibt sich für A1/A2 ein Wert im Bereich von 0,45 bis 0,65, wenn der für das kürzere Allel stehende Peak weniger Fläche hat als der für das längere Allel stehende Peak. In beiden Fällen erscheint Ratio (Verhältnis) in der Spalte Warning (Warnung). b) Vorliegen von drei Peaks ähnlicher Höhe. Das Verhältnis der Peaks wird als 1:1:1 eingestuft und ihre Werte liegen im Normalbereich von 0,8 1,4 (wobei allerdings für mehr als 24 bp auseinander liegende Allele ein Allelverhältnis von bis zu 1,5 annehmbar ist). In diesem Fall erscheint 3 Alleles (3 Allele) in der Spalte Warning (Warnung). 2. Um die Interpretation eines Ergebnisses als abnorm (d. h. Vorliegen einer Trisomie) zu stützen, müssen mindestens zwei für einen Drei-Allel-Genotyp sprechende informative Marker vorhanden sein und alle anderen Marker nicht informativ sein. Ein Ergebnis nur aufgrund der Informationen von einem einzigen Marker als abnorm zu beurteilen, wird nicht empfohlen. 3. Um die Interpretation eines Ergebnisses als normal zu stützen, müssen mindestens zwei für einen Zwei-Allel-Genotyp sprechende informative Marker vorhanden sein und alle anderen Marker nicht informativ sein. Ein normales Ergebnis bedeutet, dass für die getesteten Chromosomen der Normalumfang vorliegt, d. h. zwei Chromosomen. 4. Peakflächen-Verhältnisse, die zwischen dem Normalbereich und dem abnormen Bereich liegen, werden als Inconclusive (Nicht aussagekräftig) eingestuft. Nicht aussagekräftige Ergebnisse können mithilfe der Einzelchromosom-Kits abgeklärt werden. 5. Falls für einen Marker keine Peakdaten vorliegen, wird in der Spalte Warning (Warnung) Absent (Fehlt) angezeigt. Diese Warnung tritt beim Fehlen der Y- Chromosomen-Marker routinemäßig auf. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 15 von 30

16 GeneMarker-Analyse Einleitung Im folgenden Abschnitt werden die Verfahrensweisen zur Probenanalyse von mit Elucigene QST*R erzielten Ergebnissen mithilfe der Softwarepakete GeneMarker von SoftGenetics (Version 1.65 oder höher) beschrieben. Die in diesem Abschnitt verwendeten Abbildungen stammen aus Version 1.85 der GeneMarker-Software. Analyseprozess Der Ablauf der Probenanalyse ist im unten abgebildeten Flussdiagramm zusammengefasst: AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 16 von 30

17 Hinzufügen von Probendateien zu GeneMarker Die Programmdatei GeneMarker öffnen und nach Aufforderung Open Data (Daten öffnen) auswählen. Das Feld Open Data Files (Datendateien öffnen) öffnet sich. Auf die Schaltfläche Add (Hinzufügen) klicken. Das Dialogfeld Open (Öffnen) öffnet sich. Zum Verzeichnis mit den Rohdatendateien navigieren; Mit STRG+A alle Dateien oder mit der STRG-Taste und/oder der Umschalttaste einzelne Proben auswählen. Im Dialogfeld Open (Öffnen) auf die Schaltfläche Open (Öffnen) klicken. Die ausgewählten Dateien erscheinen im Feld Data File List (Datendateienliste) (Abbildung 1). Abbildung 1: Der Data File List (Datendateiliste) hinzugefügte Proben Im Feld Open Data Files (Datendateien öffnen) auf die Schaltfläche OK klicken; die Proben werden in GeneMarker hochgeladen. Die Software öffnet dann automatisch das Fenster Raw Data Analysis (Rohdatenanalyse) (Abb. 2). AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 17 von 30

18 Abbildung 2: Raw Data Analysis Window (Rohdatenanalysefenster) AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 18 von 30

19 Importieren von QST*R-Paneleinstellungen in GeneMarker Die QST*R-Panel-Einstellungen für GeneMarker müssen importiert werden. Dieser Prozess wird über die Benutzeroberfläche Panel Editor gesteuert. QST*R-Panel-Einstellungen für GeneMarker sind auf der Gen-Probe-Webseite verfügbar: Den Panel Editor im Dropdownmenü Tools (Werkzeuge) öffnen. Abbildung 3: Panel Editor auswählen Die Option Import Panels (Panels importieren) im Dropdownmenü File (Datei) auswählen. Abbildung 4: Panels importieren Zum Panel, z. B. anan0pl_gupf***.xml, navigieren und dieses importieren. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 19 von 30

20 (Hinweis: * steht für eine aus drei Ziffern bestehende Versionsnummer (z. B. anan0pl_gupf002.xml) Den Vorgang nach Bedarf für andere relevante Paneldateien wiederholen. Verarbeitung von Daten Sobald die Rohdatendateien in den GeneMarker hochgeladen sind, können sie verarbeitet werden. Zu den Verarbeitungsschritten gehören die Anwendung eines Größenstandards, die Filterung von Rauschpeaks und bei Bedarf der Vergleich mit einem bekannten Allel-Panel. GeneMarker kombiniert all diese Schritte in einem einfachen Werkzeug namens Run Wizard (Durchlauf-Assistent) (Abbildung 5). Der Durchlauf-Assistent wird einfach durch Klicken auf das Symbol Run Project (Projekt ausführen) in der Hauptsymbolleiste aufgerufen. Durchlauf-Assistent Eine Durchlaufvorlage erstellen Bei der ersten Verwendung dieser Software zur Analyse von QST*R-Daten muss eine Durchlaufvorlage erstellt werden. Dazu dient der Durchlauf-Assistent. Der Durchlauf-Assistent wird einfach durch Klicken auf das Symbol Run Project (Projekt ausführen) in der Hauptsymbolleiste aufgerufen. Eine Bezeichnung für die Vorlage bestimmen, z. B. QSTR Wie in der nachstehenden Abbildung 5 dargestellt Panel, Size Standard (Größenstandard), Standard Colour (Standardfarbe) und Analysis Type (Analyseart) auswählen Auf Save (Speichern) klicken, um die Vorlage für künftige Analysen zu speichern Zum Fortfahren auf Next (Weiter) klicken AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 20 von 30

21 Abbildung 5: Run Wizard (Durchlauf-Assistent) Fenster Template Selection (Vorlagenauswahl) AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 21 von 30

22 Run Wizard (Durchlauf-Assistent) Data Process (Datenverarbeitung) Im Fenster Data Process (Datenverarbeitung) des Durchlauf-Assistenten kann der Anwender die Peakfilterparameter auswählen. Wie in der nachstehenden Abbildung dargestellt im Fenster Data Process (Datenverarbeitung) die geeigneten Analyseeinstellungen auswählen. Zum Fortfahren auf Next (Weiter) klicken. Hinweis: Die Einstellung des Analysebereichs im Feld Raw Data Analysis (Rohdatenanalyse) hängt davon ab, welches Polymer während der Datenerhebung verwendet wird. Der Anwender sollte einen Wert für den Start-Datenpunkt auswählen, der den Standardpeak der Größe 75 bp mit einschließt. Abbildung 6: Run Wizard (Durchlauf-Assistent ) Fenster Data Process (Datenverarbeitung) Hinweis: Für 3500-Daten Min Intensity (Mindestintensität) auf 150 erhöhen. Durchlauf-Assistent Additional Settings (Weitere Einstellungen) Bei der Durchführung einer QST*R-Analyse sind keine weiteren Einstellungen erforderlich. Zum Fortfahren auf OK klicken. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 22 von 30

23 Abbildung 7: Run Wizard (Durchlauf-Assistent) Additional Settings (Weitere Einstellungen) Feld Data Processing (Datenverarbeitung) Nach Klicken auf OK im Feld Additional Settings (Weitere Einstellungen) des Durchlauf-Assistenten öffnet sich das Feld Data Processing (Datenverarbeitung) (Abbildung 8). Die Rohdaten werden verarbeitet und vermessen, woraufhin die Filterparameter und das ausgewählte QST*R-Panel angewendet werden. Nach Abschluss der Analyse im Feld Data Processing (Datenverarbeitung) auf OK klicken. Abbildung 8: Feld Data Processing (Datenverarbeitung) Hauptanalysefenster AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 23 von 30

24 Das Hauptanalysefenster (Abbildung 9) von GeneMarker hat ein anwenderfreundliches Layout. Dieses Layout umfasst: Die Liste der Probendateien links im Fenster angezeigt. Das synthetische Gelbild oben im Fenster angezeigt. Datenelektropherogramme unter dem Gelbild. Eine Berichttabelle rechts im Fenster angezeigt. In diesem Fenster muss unbedingt geprüft werden, ob alle Peaks in den einzelnen Profilen jeweils die korrekte Beschriftung tragen. Nacheinander auf jede Probe in der Probendateistruktur links auf dem Bildschirm doppelklicken. Mit der rechten Maustaste auf alle fraglichen Peaks klicken und aus den Optionen im Dialogfeld nach Bedarf z. B. Allel bearbeiten oder löschen, bestätigen oder Bestätigung aufheben auswählen. Im Hauptanalysefenster das Dropdownmenü Applications (Anwendungen) oben auf dem Bildschirm auswählen. Trisomy Analysis (Trisomie-Analyse) auswählen. Daraufhin öffnet sich das Feld Trisomy Analysis Settings (Einstellungen für die Trisomie-Analyse) (Abbildung 10). Abbildung 9: Hauptanalysefenster AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 24 von 30

25 Abbildung 10: Feld Trisomy Analysis Settings (Einstellungen für die Trisomie-Analyse) Hinweis: Für 3500-Daten Minimum Intensity (Mindestintensität) auf 150 erhöhen Einstellungen für die Trisomie-Analyse Im Feld Trisomy Analysis Settings (Einstellungen für die Trisomie-Analyse) stehen zwei Registerkarten zur Verfügung: Registerkarte Analysis (Analyse) Registerkarte Statistics Plot (Statistikdiagramm) Registerkarte Analysis (Analyse) In der Registerkarte Analysis (Analyse) können Schwellwertoptionen für die Trisomie- Analyse gewählt werden. Sicherstellen, dass im Feld Analysis by (Analyse nach) die Option BPG ausgewählt ist und die folgenden Einstellungen angezeigt werden. Peak Height (Peakhöhe) von 50: Mindesthöhe von 50 für die Auszeichnung von Peaks. (150 bei Verwendung von 3500-Daten) Height Ratio (Höhenverhältnis) von 30%: Maximalhöhe des zweiten Peaks im Verhältnis zum Hauptpeak (in Prozent), damit zwei Allele identifiziert werden. Quantification by Peak Area (Quantifizierung nach Peakfläche). Shorter Length/Longer Length (Kürzer/Länger) ausgewählt. Die Verhältnis-Schwellwerte für Trisomie sind 0,80 und 1,40. Apply Linear Correction (Lineare Korrektur anwenden) nicht ausgewählt. Auf OK klicken. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 25 von 30

26 Fenster Trisomy Analysis (Trisomie-Analyse) Im Fenster Trisomy Analysis (Trisomie-Analyse) (Abbildung 11) kann der Anwender QST*R-Probendaten und das Peak-Verhältnis für jeden Marker anzeigen lassen sowie auf den GeneMarker-Bericht zugreifen. Eine Reihe von Anzeigen unterstützen den Anwender bei der Datenanalyse. Diese sind: Probenliste Elektropherogramm Verhältnisdiagramm Berichttabelle Abbildung 11: Fenster Trisomy Analysis (Trisomie-Analyse) Einzelheiten zu den Funktionen der Trisomie-Analyse und ihrer Anwendung finden sich im Handbuch für GeneMarker. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 26 von 30

27 GeneMarker-Bericht GeneMarker enthält eine Berichtsvorlage, die mit den Elucigene QST*R-Kits kompatibel ist. Um zum Bericht zu gelangen, das Symbol Print (Drucken) in der Symbolleiste oben links im Fenster Trisomy Analysis (Trisomie-Analyse) anklicken. Daraufhin öffnet sich das Fenster Trisomy Print Settings (Trisomie-Druckeinstellungen) (Abbildung 12). Fenster Trisomy Print Settings (Trisomie-Druckeinstellungen) Die Trisomie-Druckeinstellungen legen die einzelnen Optionen fest, nach denen Daten im GeneMarker-Bericht aufgeführt und dargestellt werden. Die in Abbildung 12 gezeigten Optionen auswählen. Sicherstellen, dass Custom Size Range (Individueller Größenbereich) auf 98 bp (Start) und 510 bp (Ende) eingestellt ist. Abbildung 12: Fenster Trisomy Print Settings (Trisomie-Druckeinstellungen) AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 27 von 30

28 Vorschau des GeneMarker-Berichts Die Schaltfläche Preview (Vorschau) anklicken, um den GeneMarker-Bericht anzeigen zu lassen (Abbildung 13). Von diesem Fenster aus kann der Anwender die Peakdaten für jede Probe über alle Marker hinweg betrachten und drucken, sodass ein einfacher, ein- bis zweiseitiger Probenbericht entsteht. Abbildung 13: GeneMarker-Bericht Der GeneMarker-Bericht enthält die folgenden Elemente: Berichtüberschrift: Enthält Informationen zu Analyse, Projekt, Probe und Parameter. Signaturfeld: Platz für Datum und Initialen von Berichtprüfern. Elektropherogramm: Ähnlich wie beim Fenster Trisomy Analysis (Trisomie- Analyse) werden alle Farbstofffarben der Probenspur angezeigt. Berichttabelle: Zeigt ausgewählte Peak- und Markerwerte für die aktuelle Probe an. Trisomie-Auszeichnungen sind grau hervorgehoben. Eine zusätzliche Prüfspalte ist für die Initialen des Prüfers vorgesehen. Korrigiertes Verhältnisdiagramm: Enthält die Diagrammpunkte des gesamten Datensatzes für alle Marker des jeweiligen Farbstoffs. Die Symbolformen stehen für verschiedene Marker; die zugehörige Legende ist in der Zeile Symbol der Report Table (Berichtstabelle) zu finden. Gelb ausgefüllte Symbole stehen für die Datenpunkte der aktuellen Probe. Symbole mit roter Umrandung stehen für Trisomie-Auszeichnungen. Hinweis: Das korrigierte Verhältnisdiagramm erscheint auf einer zweiten Seite für jede Probe, jedoch nur, wenn Ratio Plot (Verhältnisdiagramm) im Feld Trisomy Print Report Settings (Trisomiebericht-Druckeinstellungen) ausgewählt wurde. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 28 von 30

29 Peak-Beschriftungen Die Peak-Beschriftungen sind farbcodiert nach der Qualität der Übereinstimmung des nachgewiesenen Peaks mit dargestellten Panel-Bins. Im Elektropherogramm sind die Marker horizontale graue Balken und der Mittelpunkt der Peaks ist mit einem senkrechten grauen Balken markiert. Peaks, die außerhalb der Marker oder Bins des Panels fallen, sind rot als Off Ladder (Ausreißer; OL ) markiert. Hinweis: Abweichungen in Gerätepolymertyp und Größenstandard können eine Optimierung der Marker-Bins erforderlich machen, damit die Software exakt auf die verwendeten Testbedingungen abgestimmt ist. Weitere Informationen zur Modifizierung von Panel-Bins sind dem GeneMarker-Handbuch zu entnehmen, das mit der Software geliefert wurde. Scoring des Berichts Allgemeine Analyserichtlinien werden im Abschnitt Analysis and Interpretation of Results (Analyse und Interpretation der Ergebnisse) der Instructions for Use (Gebrauchsanweisung) näher erläutert; diese ist auf der Gen-Probe-Webseite verfügbar: 1. Eine Trisomie wird durch einen der nachstehenden Fälle bestimmt: a) Zwei Peaks ungleicher Höhe, da ein Peak für zwei Allele steht, die bei einem oder beiden Elternteilen vorhanden sind. In diesem Fall wird das Verhältnis zwischen den beiden Peaks als 2:1 bzw. 1:2 eingestuft. Hierbei ergibt sich für A1/A2 ein Wert im Bereich von 1,8 bis 2,4, wenn der für das kürzere Allel stehende Peak mehr Fläche hat als der für das längere Allel stehende Peak, bzw. ergibt sich für A1/A2 ein Wert im Bereich von 0,45 bis 0,65, wenn der für das kürzere Allel stehende Peak weniger Fläche hat als der für das längere Allel stehende Peak. b) Vorliegen von drei Peaks ähnlicher Höhe. Das Verhältnis der Peaks wird als 1:1:1 eingestuft und ihre Werte liegen im Normalbereich von 0,8 1,4 (wobei allerdings für mehr als 24 bp auseinander liegende Allele ein Allelverhältnis von bis zu 1,5 annehmbar ist). Hinweis: Marker werden im Bericht grau hervorgehoben, wenn: Das Peakverhältnis für einen Marker außerhalb der vorgegebenen Grenzen (0,8 und 1,4) liegt. Drei Allele nachgewiesen werden. 2. Um die Interpretation eines Ergebnisses als abnorm (d. h. Vorliegen einer Trisomie) zu stützen, müssen mindestens zwei für einen Drei-Allel-Genotyp sprechende informative Marker vorhanden sein und alle anderen Marker nicht informativ sein. Ein Ergebnis nur aufgrund der Informationen von einem einzigen Marker als abnorm zu beurteilen, wird nicht empfohlen. 3. Um die Interpretation eines Ergebnisses als normal zu stützen, müssen mindestens zwei für einen Zwei-Allel-Genotyp sprechende informative Marker vorhanden sein und alle anderen Marker nicht informativ sein. Ein normales Ergebnis bedeutet, dass für die getesteten Chromosomen der Normalumfang vorliegt, d. h. zwei Chromosomen. 4. Peakflächen-Verhältnisse, die zwischen dem Normalbereich und dem abnormen Bereich liegen, werden als Inconclusive (Nicht aussagekräftig) eingestuft. Nicht aussagekräftige Ergebnisse können mithilfe der Einzelchromosom-Kits abgeklärt werden. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 29 von 30

30 ELUCIGENE und QST*R sind Marken von Gen-Probe Life Sciences Ltd. GENEMAPPER ist eine Marke der Life Technologies Corporation. GENEMARKER ist eine Marke der SoftGenetics Corporation. Hinweis für den Käufer: Begrenzte Lizenz Mit den Farbstoffen VIC, NED und PET markierte Polynukleotide und/oder ihre Anwendung unterliegen eventuell einem oder mehreren Patenten im Besitz von Applied Biosystems, LLC. Im Kaufpreis für dieses Produkt sind begrenzte, nicht übertragbare Rechte aufgrund bestimmter Ansprüche in bestimmten Patenten im Besitz von Applied Biosystems, LLC enthalten, die die Anwendung nur der betreffenden Produktmenge und ausschließlich zum Zwecke des Target-Nachweises in der Humanmedizin durch den Käufer gestatten. Darüber hinaus werden keine weiteren Rechte gewährt. Weitere Informationen zum Erwerb von Lizenzen bezüglich der oben erwähnten Farbstoffe erteilt der Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. Copyright 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd. AN000GSDE Rev.10/2013 Seite 30 von 30