Vorlesung IV. Pilze. Molekularbiologie

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1 Vorlesung IV Pilze Molekularbiologie

2 1 Pilze Übersicht 1 Pilze (Funghi) sind Eukaryoten und bilden neben Pflanzen und Tieren ein eigenes Reich. haben einen Zellkern; die DNA wird durch Histone zu Chromosomen komplexiert. Die meisten Pilze besitzen eine Zellwand aus Chitin können keine Photosynthese betreiben und sind daher C-heterotroph. Pilze vermehren sich über Sporen, durch Knospung oder Abspaltung

3 1 Pilze Übersicht 2 Pilze sind vielgestaltig und sind weit verbreitet. Aufgrund ihrer speziellen Stoffwechseleigenschaften sind sie in der Lage viele organische Verbindungen abzubauen und sie der Wiederverwertung zuzuführen.

4 1 Pilze 1.1 Wuchsformen von Pilzen Hyphen (A), septiert oder unseptiert: filamentöse Pilze Myzel (B): Geflecht von Hyphen Pseudohyphen (C): kettenförmig aneinanderhängende Einzelzellen (z.b. Hefen)

5 1 Pilze 1.2 Fortpflanzung von Pilzen Pearson Studium 2009

6 1 Pilze 1.3 Zygomyceten (Jochpilze) Bsp. Rhizopus stolonifer (gem. Brotschimmelpilz)

7 1 Pilze 1.4 Hefepilze Saccharomyces cerevisiae, (Wein-, Bier- oder Bäckerhefe) vermehrt sich durch Knospung.

8 1 Pilze Wuchsformen verschiedener Hefepilze

9 2 Mykosen Übersicht Als Mykosen werden Erkrankungen bezeichnet, die auf Pilze zurückzuführen sind. Endogene Mykosen manifestieren sich z.b. durch opportunistische Erkrankungen des Darmtrakts. Sie treten häufig als Sekundär-Infektion in Folge einer anderen Erkrankung auf. (Folge der Gabe von Antibiotika, Corticoiden oder Immunsuppressiva) Exogene Mykosen: Erkrankungen der Haut durch Hautpilze (Dermatomykose)

10 2 Mykosen 2.1 Aspergillus spec. in Kultur Aspergillus-Konidiophore. Aspergillus fumigatus auf Agar. Tischner

11 2 Mykosen 2.1 Aspergillus verursacht Aspergillosen Auslöser: Schimmelsporen; A. fumigatus, A. niger, A. flavus ua. Morphologie: filamentöse, verzweigte Hyphen; Konidienträger Diagnose: Gewebebiopsie; PCR-Nachweis des Erregers Aspergillose: a) Aspergillom: meist in vorgegebener Höhle b) disseminierte Lungenaspergillose: nekrotisierende Pneumonie, allergische Alveolitis (Farmerlunge) c) invasive Aspergillose (vermehrt bei immungeschwächten Patienten) Therapie: Amphotericin B + 5-Fluorcytosin; Aspergillom: chirurgische Entfernung (Amphotericin B beeinträchtigt die pilzliche Zellmembran durch Bindung an Ergosterin) Aflatoxine: Aflatoxin B1 (A. flavus) ist hochgradig krebserzeugend

12 2 Mykosen 2.1 Aspergillosen Invasive pulmonare Aspergillose Aspergillus sp. im Gewebe Aspergillose in der Lunge Wikimedia commons

13 2 Mykosen 2.2 Candida spec. Candida: Charakteristika und typischer Befall Hefen (Sproßpilze), septiert oder unseptiert, unizelluläre Pilze, Vermehrung durch Knospung - Candida siedeln normalerweise auf der Haut und auf den Schleimhäuten. Sie sind Bestandteil der normalen Flora - Bei einer Beeinträchtigung der Immunabwehr des Wirtes und nach Antibiotikagabe können sie Mykosen auslösen - Befallen werden: Schleimhäute des Mundraumes, Scheide, Nagelbett, Hautfalten. Candida albicans ist der häufigste humanpathogene Pilz. Riskant wird die Infektion bei Patienten, deren Immunsystem geschwächt ist, beispielsweise nach Organtransplantationen oder einer Chemotherapie bei Krebserkrankungen.

14 2 Mykosen 2.2 Candida albicans Wuchsformen Candida albicans auf Agar bei 20 C Zellsprossung bei Candida albicans. Wikimedia commons Candida albicans Pseudohyphen und hefeartige Zellen

15 2 Mykosen 2.2 Candidose - Soor CDC Candida albicans, Soor Ausstrich eines Isolats von der Zunge Auf den Schleimhäuten entstehen rundliche, weißliche Beläge, die fest auf dem Untergrund haften. Sie bestehen aus abgestorbenen Zellen des Wirtes und Pseudomyzel der Candida.

16 2 Mykosen 2.2 Dermatose durch Candida albicans Die virulente Hyphenform von Candida albicans. (Foto: Fraunhofer IGB)

17 2 Mykosen 2.3 Mucor spec. Wachstum in Kultur Mucor spec. Mucormycose bezeichnet eine Endomykosen, die von Pilzen der Ordnung Mucorales hervorgerufen werden. Dazu gehören die Gattungen Rhizopus, Absidia und Mucor. Mucorales kommen auf feuchtem org. Material und Pflanzen vor. CDC/Dr. Lucille K. Georg CDC/Dr. Lucille K. Georg

18 2 Mykosen 2.3 Mucormykosen CDC/Dr. Libero Ajello Mucormycose durch Mucor pusillus an der Herzklappe, Methenamin-Silber-Färbung CDC / Dr. Thomas F. Sellers/Emory University Periorbitale Mucormycose

19 2 Mykosen 2.4 Cryptococcus neoformans Dieser Pilz bildet schleimig aussehende Kolonien und keine Hyphen aus. Er kommt in Vogelmist und deren Stäuben vor. Dr David Ellis Kultur auf Agar (weiß: Candida) Die Erkrankung heißt Kryptokokkose, europäische Blastomykose oder Torulose. Die Erreger werden über die Atmung aufgenommen. In der Lunge vermehren sie sich teilweise ohne äußere Krankheitszeichen. Von dort gelangen sie über das Blut auch ins Gehirn, in die Leber und andere Organe. Besonders gefährlich ist die Entzündung des Hirns und seiner Hirnhäute (Meningoenzephalitis) Wikimedia commons Befallenes Lungengewebe

20 2 Mykosen 2.4 Cryptococcus neoformans CDC / Dr. Leanor Haley Leanor Haley CDC / Dr. Edwin P. Ewing, Jr. Cryptococcus neoformans, Tusche-Färbung Cryptococcose der Lunge eines AIDS Patienten

21 3 nützliche Pilze 3.1 Penicillium spec. Pearson Studium : Konidien, 2: Konidienträger, 3: Mycel P. notatum lieferte das erste Penicillin (A.Fleming, 1928) P. camemberti und P. roquefortii werden als Edelschimmel in der Käseherstellung verwendet

22 3 nützliche Pilze 3.2 Antibiotika produzierende Pilze Pearson Studium 2009 Die meisten Antibiotika stammen ursprünglich aus Pilzen

23 4 Molekularbiologie 4.1 DNA als Träger der Erbinformation Die DNA ist als Doppelstrang organisiert. Die darin enthaltene Erbinformation ist in der Abfolge von vier verschiedenen Nukleotiden kodiert. Pearson Studium 2009

24 4 Molekularbiologie 4.2 Transkription und Translation Prokaryot Transkription und Translation Eukaryot Bei Prokaryoten hemmt Rifampicin die RNA-Polymerase und verhindert die Transkription. Bei Eukaryoten bindet α-amanitin (Gift des Knollenblätterpilzes) an die RNA-Polymerase II und hemmt so die Transkription. Pearson Studium 2009

25 4 Molekularbiologie 4.2 Transkription und Translation Pearson Studium 2009

26 4 Molekularbiologie 4.3 Initiation der Transkription Pearson Studium 2009

27 4 Molekularbiologie 4.3 Transkription codierender Strang codogener Strang Actinomycin hemmt die Transkription durch Einlagerung in die DNA.

28 4 Molekularbiologie 4.4 Prozessierung der prä-mrna Bei Eukaryoten muss die zunächst synthetisierte prä-mrna vor dem Export aus dem Zellkern noch prozessiert werden.

29 4 Molekularbiologie 4.5 Translation (Übersicht) Pearson Studium 2009

30 4 Molekularbiologie Der genetische Code Mit Hilfe des genetischen Codes wird jedem Basentriplett genau eine Aminosäure bzw. ein Stop-Signal zugeordnet. Der Code gilt universell, nur in den Mitochondrien kommt es zu kleinen Abweichungen. Aufgrund der Universalität des genetischen Codes können z.b. Gene des Menschen in Bakterien übertragen werden und führen dort zur Produktion desselben Proteins. So kann z.b. die weltweit benötigte Menge an humanem Insulin nur mit Hilfe gentechnisch veränderter E.coli-Bakterien produziert werden. Pearson Studium 2009

31 4 Molekularbiologie Struktur der trna zweidimensionale Struktur (Kleeblattstruktur) dreidimensionale Struktur Pearson Studium 2009

32 4 Molekularbiologie Beladung der trnas Durch spezifische Enzyme wird jede trna mit der Ihrem Anticodon entsprechenden Aminosäure beladen. Pearson Studium 2009

33 4 Molekularbiologie Aufbau des Ribosoms P-Stelle= Peptidyl-Stelle A-Stelle= Aminoacyl-Stelle Pearson Studium 2009

34 4 Molekularbiologie Initiation der Translation Pearson Studium 2009

35 4 Molekularbiologie Translationszyklus Pearson Studium 2009

36 4 Molekularbiologie Termination der Translation Pearson Studium 2009

37 4 Molekularbiologie 4.6 Synthese von Proteinen ins ER-Lumen Pearson Studium 2009

38 5 Molekulare Diagnostik 5.1 Die PCR Mit Hilfe molekularbiologischer Methoden können viele Untersuchungsergebnis deutlich schneller erhalten werden. Bei Verdacht auf bestimmte bakterielle oder virale Infektionen kann die PCR innerhalb weniger Stunden die Anwesenheit entsprechender DNA in der analysierten Probe bestätigen oder ausschliessen. Bordetella pertussis herkömmlicher Nachweis: 3-4 Tage Nachweis mit Hilfe der PCR innerhalb von 3-4 Stunden möglich Ebenso ermöglicht die PCR z.b. einen deutlich früheren HIV-Nachweis als der Standardtest, der die Antikörper gegen das Virus im Blut nachweist (Serokonversion erst ca. 6 Wochen nach Infektion).

39 Die PCR PCR-Zyklus 1) Denaturierung 30 sec 94 C 2) Annealing 45 sec 52 C (Einbau durch TAQ-Polymerase) 3) Amplifikation 90 sec 60 C Gesamtdauer pro Zyklus: ca. 3 min Nach Wiederholungen des PCR-Zyklus ist die Zielsequenz so häufig vermehrt worden, dass sie angefärbt werden kann. Die verwendeten DNA-Primer sind komplementär zur gesuchten DNA-Sequenz. Die verwendete DNA- Polymerase muss hitzestabil sein und stammt z.b. aus Thermophilus aquaticus (TAQ-Polymerase)

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41 PCR Analyse, Diagnostik Erreger, Nukleinsäure Bordetella pertussis, DNA Keuchhusten Borrelia burgdorferi, DNA Borelliose X X X X X X X Cytomegalie-Virus (CMV), DNA X X X X X X Chlamydia trachomatis, DNA X X Hepatitis B-Virus, DNA (qualitativ) Hepatitis B-Virus, DNA (semiquantitativ) Hepatitis C-Virus, RNA (qualitativ) Hepatitis C-Virus, RNA (quantitativ) Herpes simplex-virus Typ 1,2 (HSV), DNA HIV 1, RNA (quantitativ) X X X X X X X X Mycobacterium tuberculosis, DNA X X X X Papillomaviren (HPV), DNA 1 = 5 ml EDTA Blut Blut (Gerinnung verhindert) 7 = Hautbiopsie 7 = Hautbiopsie 2 verhindert) = 1 ml Urin 8 = Trachealsekret 8 = Trachealsekret 3 2 = 1 ml - 2 Urin ml Liquor 9 = Gelenkpunktat 9 = Gelenkpunktat - 2 ml Liquor 10 = Gehirnbiopsie 4 = Sputum / BBAL 10 = Gehirnbiopsie Sputum / BBAL 11 = 10 ml Fruchtwasser 5 = Abstrich (genital) Abstrich (genital) 12 = Abstrich 11 = 10 ml Fruchtwasser 6 = Gewebebiopsie Gewebebiopsie 12 = Abstrich X X

42 Beispiel für eine erfolgreiche Gentherapie Göttinger Forscher finden ein Verfahren zur Behandlung einer erblich bedingten, tödlichen Stoffwechselkrankheit. Weitere Forschungen sollen die Anwendbarkeit am Menschen klären. Wissenschaftlern der Universitätsmedizin Göttingen ist es erstmals gelungen, in einem Mausmodell eine erblich bedingte tödliche Stoffwechselkrankheit, die sogenannte Molybdän-Cofaktor (MoCo) Defizienz, mit Hilfe von Gentherapie zu heilen. Ursache dieser seltenen Erbkrankheit ist ein Defekt an einem einzigen Gen - dem Gen MOCS1. Sie setzten spezielle Viren ein, die so verändert sind, dass sie als Transport-Vehikel - auch Gen-transfervektoren- dienen können. Diese Viren binden gezielt an spezifische Zellen und transportieren die genetische Information genau dorthin, wo sie im Organismus fehlt. Mit Hilfe der Gentransfervektoren ist es gelungen, die fehlende genetische Information im Organismus der Mäuse zu ersetzen. Alle notwendigen Komponenten für den Stoffwechsel wurden wieder produziert. Die Mäuse entwickelten sich normal. Informationsdienst Wissenschaft,