Abhandlung zur Erlangung des Titels. vorgelegt von. Dipl. Chem. ETH. geboren. Angenommen auf Antrag von MARQUARD IMFELD. Diss. ETH 6565 VIT.

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1 Diss. ETH 6565 ZUR KENNTNIS DER METHYLIERUNGSPROZESSE IN DER BIOSYNTHESE VON VIT. B12 UND VON METHYLCOBALAMIN Abhandlung zur Erlangung des Titels eines Doktors der Naturwissenschaften der EIDGENOESSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZUERICH vorgelegt von MARQUARD IMFELD Dipl. Chem. ETH geboren am 28. Mai 1950 von Samen (OW) und Winterthur (ZH) Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. D. Arigoni, Referent Prof. Dr. A. Eschenmoser, Korreferent Juris Druck + Verlag Zürich 1980

2 Brücke 0 ZUSAMMENFASSUNG 1. Im Zusammenhang mit einer biosynthetischen Untersuchung wurde eine Abbaumethode für Cobester (7) ausgearbeitet, die es erlaubt, neben den bereits bekannten Ring B und Ring CBruchstücken 2J5 und 126 auch AD Derivat 27, sowie die C5 des CorrinRinges als Essigsäure zu fassen. Ausgehend von ADDerivat 27 gelang es, durch chemischen Abbau Ring ABruchstücke 43 und 25_ zu erhalten. 2. Unter der Verwendung der Tatsache, dass eine reduzierte Form von Fak tor I aus C. tetanomorphum leicht in Sirohydrochlorin (58) und Cobyrinsäure (4) eingebaut wird, gelang mit der in (1.) erwähnten Abbaumetho dik der Nachweis, dass in Faktor I die aus SAdenosylmethionin stam mende Methylgruppe an die C2 Position des Ringes gebunden ist, und dass diese Methylgruppe im Verlaufe der Biosynthese von Cobyrinsäure an diesem KohlenstoffAtom haften bleibt Einbau von [ C H Methyl]Methionin in wachsenden Kulturen von P. shermanii ergab eine in sieben Methylgruppen indizierte Probe von 13 Vit. B1?. Durch Anwendung der CNMRSpektroskopie gelang mit die ser Probe der Nachweis, dass im Verlaufe der Biosynthese von Vit. B, alle sieben von SAdenosylmethionin stammenden Methylgruppen intakt, d.h. ohne Austausch von WasserstoffAtomen in Cobyrinsäure eingebaut werden. 4. In der Methylgruppe chiral markiertes [(R), bzw. (S)Methyl]Methionin wurde wachsenden Kulturen von P. shermanii verfüttert. Unter Anwen dung der in (1.) erwähnten Abbaumethode konnten aus den beiden isolier ten Vit. Bj Proben Acetate gewonnen werden, die den CorrinRing Positionen 5, 7 und 12 entsprechen. Die AcetatProben wurden der Ana lyse zur Bestimmung der Konfiguration unterworfen, und es konnte ge zeigt werden, dass die Uebertragung der Methylgruppen von SAdenosyl methionin auf die RingPositionen 5, 7 und 12 mit Inversion abläuft.

3 1 5. Uebertragung der chiral markierten Methylgruppe von Methyls ulfoniummethionintetrafluoroborat auf B«ergab Methylcobalamin (3), welches nach Inkubation mit einem Enzympräparat aus C. thermoaceticum racemisches Acetat lieferte. Es konnte gezeigt werden, dass die Synthese von Methylcobalamin bei Anwesenheit von [CoMethyl CjMethyl cobalaminmonocarbonsäure E (72) Cindiziertes Methylcobalamin ergab. Dies beweist ein sehr schnell ablaufender MethylgruppenTrans fer von [CoMethyl] Corrin auf B., der die Racemisierung der Methylgruppe bewirkte.

4 2 SUMMARY 1. In connection with studies on the biosynthesis of vitamin B1?, cobester (7) has been degraded with ozone to yield next to the ring B and ring C fragments 25 and 26 a fragment 27 containing rings A and D as well as acetic acid containing C5 of the original molecule. Further degradation of the ADderivative 27 yielded the ring A fragments 3 and J25 which were identified by comparison with authentic synthetic specimens. 2. Making use of the fact that a reduced form of a Cmethyl labelled factor I from C. tetanomorphum can act as a precursor of "both sirohydrochlorin (58) and cobyrinic acid (4) and with the help of the degradation method referred to in (1), it was demonstrated that in factor I the methyl group derived from Sadenosylmethionine is bound to the C2 position in the ring, and that it remains at this carbon during the conversion of factor I into cobyrinic acid Ihcorporation of [ C H methyl]methionine in growing cultures of P. shermanii produced a specimen of vitamin B19 labelled in seven 13 methyl groups. Using CNMRspectroscopy, it was possible to demonstrate with this specimen that during biosynthesis of vitamin B12 all seven methyl groups derived from Sadenosylmethionine are incorporated in cobyrinic acid intact, i.e. without exchange of hydrogen atoms. 4. Chiral samples of L(R) or (S)methyl]methionine were added to growing cultures of P. shermanii. Using the degradation method mentioned in (1), samples of acetates corresponding to the corrin ring positions 5, 7 and 12 were obtained from the two specimens of the vitamin. Analysis of the configuration of these samples indicated that the transfer of the methyl groups from Sadenosylmethionine to the ring positions 5, 7 and 12 occures with inversion.

5 3 5. Transfer of the chiral methyl group of methylsulfoniummethioninetetrafluoroborate to B19 yielded methylcobalamin (3_), which provided racemic acetate after incubation with an enzyme preparation from C. thermoaceticum. It could be demonstrated that, in the presence of [Comethyl C] methylcobalamin monocarbonic acid E0 (72), the synthesis of methylcobalamin yielded Clabelled methylcobalamin. Thus there occurred a very rapid transfer of methyl groups from [Comethyl]corrin to B.,, which is responsable for the observed racemization.