Eine modulare Assemblierungsmaschinerie für die Biogenese der äußeren Membran von Mitochondrien

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1 Aus dem Institut für Biochemie und Molekularbiologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Eine modulare Assemblierungsmaschinerie für die Biogenese der äußeren Membran von Mitochondrien INAUGURAL-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i.br. Vorgelegt 2010 von Nicolas Thornton geboren in Baden-Baden

2 Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. mult. H. E. Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. N. Pfanner 2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. K. Aktories Jahr der Promotion: 2012

3 Veröffentlichungen: Thornton N., Stroud D.A., Milenkovic D., Guiard B., Pfanner N., Becker T. (2010) Two modular forms of the mitochondrial sorting and assembly machinery are involved in biogenesis of alpha-helical outer membrane proteins. J Mol Biol 396 (3): Epub 2009 Dec 22. Becker T., Guiard B., Thornton N., Zufall N., Stroud D.A., Wiedemann N., Pfanner N. (2010) Assembly of the mitochondrial protein import channel: role of Tom5 in two-stage interaction of Tom40 with the SAM complex. Mol Biol Cell 21 (18): Epub 2010 Jul 28. Becker T., Wenz L.S., Thornton N., Stroud D.A., Meisinger C., Wiedemann N., Pfanner N. (2011) Biogenesis of mitochondria: dual role of Tom7 in modulating assembly of the preprotein translocase of the outer membrane. J Mol Biol 405 (1): Epub 2010 Nov 6. Poster: Thornton, N., Stroud, D.A., Wiedemann, N., Pfanner, N., Becker, T. Different SAM-forms mediate TOM complex assembly. International Symposium Protein Coupling in Cellular Networks: Signaling and Sorting. June 3 5, Freiburg/Germany.

4 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis... I Abkürzungen... IV 1 Einleitung Mitochondrien als Kompartimente der eukaryotischen Zelle Relevanz mitochondrialer Forschung für die Klinische Medizin Proteinimport in Mitochondrien Transport nukleär kodierter Proteine in Mitochondrien Proteinimport in die Matrix Proteinimport in den Intermembranraum Proteinimport in die Innenmembran Biogenese von Außenmembranproteinen Fragestellung und Zielsetzung Materialien und Methoden Materialien Chemikalien und Radiochemikalien Biotechnologische Kits Enzyme und Enzyminhibitoren Chromatographische Materialien Kommerzielle Antikörper Marker Plasmide Filme, Membranen und kommerzielle Elektrophoresesysteme Puffer, Nährmedien und andere Lösungen Saccharomyces cerevisiae- und Escherichia coli-stämme Geräte Molekularbiologische Methoden Isolation genomischer DNA Polymerasekettenreaktion zur in vitro Transkription Aufreinigung des PCR-Produkts Isolation von Plasmid-DNA DNA-Gelelektrophorese Bestimmung der DNA-Konzentration... 34

5 II Inhaltsverzeichnis In vitro Transkription In vitro Translation Gekoppelte in vitro Transkription und Translation In vitro Synthese chemischer Mengen an Vorstufenprotein Zellbiologische Methoden Anzucht von Saccharomyces cerevisiae Mitochondrienisolation Allgemeine proteinchemische Methoden Bestimmung von Proteinkonzentrationen mittels Bradford-Test SDS-Gelelektrophorese Tricin-SDS-Gelelektrophorese NuPAGE MES Gelelektrophorese Blaue Nativgelelektrophorese Färben, Entfärben und Trocknen von Gelen Autoradiographie Western Blot Immunologische Methoden Immunodekoration Affinitätsreinigung von Antikörpern Antikörper-Shift-Experimente Kopplung von Antikörpern an Protein A-beschichtete Sepharose Koimmunpräzipitation Biochemische Methoden In vitro Import von Vorstufenproteinen in isolierte Hefemitochondrien In vitro Import von Vorstufenproteinen in Mitochondrien hitzesensitiver Mutanten Schrittweiser in vitro Import von chemischen Mengen Vorstufenprotein und 35 S Vorstufenprotein Natriumcarbonatextraktion His-Aufreinigung von Proteinen Ergebnisse Biogenese von Tom Membranintegration von Tom Charakterisierung von Tom6-Importintermediaten... 53

6 III Inhaltsverzeichnis Identifikation einer endogenen SAM-Tom-Assoziation Tom5 fördert die Biogenese von Tom Analyse der Membranintegration von Tom Bedeutung von Tom5 für die Assemblierung von Tom Mim1 ist an der Membranintegration der kleinen TOM-Proteine beteiligt Eine neue Funktion von Mdm10 in der Assemblierung des TOM- Komplexes Die Deletion von Mdm10 führt zu einem Arrest der TOM- Komplex-Biogenese Der SAM holo -Komplex assembliert Tom Diskussion Biogenese mitochondrialer Außenmembranproteine Mim1 als Insertionsmaschinerie für die kleinen TOM-Proteine Eine modulare SAM-Assemblierungsmaschinerie für die Biogenese des TOM-Komplexes Der SAM core -Komplex assembliert Tom Funktion von Mim1 für die Biogenese des TOM-Komplexes Bedeutung der Assemblierungsstufe II Eine SAM-Tom-Assoziation fungiert in der Biogenese von Tom Der SAM holo -Komplex assembliert Tom Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Lebenslauf Danksagung

7 IV Abkürzungen Abkürzungen A Ampère Abb. Abbildung ADP Adenosin-5 -diphosphat Alb3 ALBINO3-like protein Amp. Ampicillin APS Ammoniumperoxidsulfat ATP Adenosin-5 -triphosphat Bak Bcl-2 antagonist/killer Bax Bcl-2-associated X protein bc ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase complex Bcl-2 B-cell lymphoma-2 Bcl-XL B-cell lymphoma-extra large Bis-Tris Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan bp Basenpaar(e) BSA bovine serum albumin C carboxy Ci Curie (1 Ci = 3,7 x Bequerel) Cox Cytochrom c Oxidase d destilliert; Desoxy- Da Dalton Membranpotential über der mitochondrialen Innenmembran DHFR Dihydrofolatreduktase DNA desoxyribonucleic acid DTT 1,4-Dithiothreitol ECL enhanced chemiluminescence E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat ER Endoplasmatisches Retikulum Erv essential for respiration and viability Fis fission Fzo fuzzy onions homolog

8 V Abkürzungen g Get GIP GTP HEPES His Hsc Hsp IASD IgG IM L LB M Mba Mcl Mcr Mdm MELAS MERRF MES Mfb Mge Mia Mim MISS Mmm MOPS MPP mt M.W. N Gravitationskonstante; Gramm Golgi ER trafficking Generelle Importpore Guanosin-5 -triphosphat N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure Histidin heat shock cognate protein heat shock protein 4-acetamido-4'-[(iodoacetyl)amino]stilbene-2,2'- disulfonic acid Immunglobuline der Klasse G inner membrane Levo Luria-Bertani-Medium Mol pro Liter multi-copy bypass of AFG3 myeloid cell leukemia sequence mitochondrial NADH-cytochrome b5 reductase mitochondrial distribution and morphology myopathy encephalopathy lactic acidosis and stroke-like episodes myoclonic epilepsy and ragged red fibers 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure mitochondria-associated F-box protein mitochondrial GrpE mitochondrial intermembrane space assembly machinery mitochondrial import mitochondrial intermembrane space sorting signal maintenance of mitochondrial morphology 3-Morpholinopropansulfonsäure mitochondriale Prozessierungspeptidase mitochondrial molecular weight amino

9 VI Abkürzungen NADH Nikotinamidadenindinukleotid in reduzierter Form N. crassa Neurospora crassa Ni-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure NTP Nucleosidtriphosphat OD x optische Dichte bei x nm OM outer membrane Omp outer membrane protein Oxa Oxidase assembly protein PAM presequence translocase associated motor PamX PAM-Untereinheit von circa X kda PCR polymerase chain reaction PhoE outer membrane phosphoporin protein E PiS Präimmunserum PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid POTRA polypeptide transport associated PVDF Polyvinylidendifluorid Qcr ubiquinol-cytochrome C oxidoreductase RNA ribonucleic acid 35 S radioaktives Schwefelisotop SAM sorting and assembly machinery SamX SAM-Untereinheit von circa X kda S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDS sodium dodecylsulfate Smac second mitochondria-derived activator of caspase SRP signal recognition particle Ssc stress-seventy subfamily c Su subunit Tab. Tabelle TBS Tris buffered saline TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin TIM translocase of the inner membrane TimX TIM-Untereinheit von circa X kda TOM translocase of the outer membrane TomX TOM-Untereinheit von circa X kda

10 VII Abkürzungen TPR Tricin Tris Tween 20 U Upm V VAMP-1B (v/v) WT (w/v) x tetratricopeptide repeat N-Tris(hydroxymethyl)methylglycin Tris(hydroxymethyl)aminomethan Polyoxyethylensorbitmonolaurat unit Umdrehungen pro Minute Volt vessicel associated membrane protein-1b volume per volume Wildtyp weight per volume fach, mal

11 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Mitochondrien als Kompartimente der eukaryotischen Zelle Ein wesentliches Merkmal eukaryotischer Zellen ist ihre Kompartimentierung. Zellkompartimente werden durch eine oder zwei Lipidmembranen vom Zytosol abgegrenzt. Sie ermöglichen der Zelle die Schaffung unterschiedlicher Reaktionsbedingungen für bestimmte biochemische Prozesse und eine einfache Regulation des Zellstoffwechsels. Kompartimente können auch als Speicher für Ionen wie Ca 2+ fungieren. Mitochondrien wurden bereits im Jahr 1857 durch Albert von Kölliker in Präparaten von Muskelzellen lichtmikroskopisch identifiziert und beschrieben (von Kölliker, 1857). Fast 100 Jahre später gelang es George E. Palade, die Ultrastruktur der Mitochondrien mittels Elektronenmikroskopie zu lösen (Palade, 1952). In den folgenden Jahren nahm das Wissen um die physiologische Bedeutung von Mitochondrien rasch zu: So wurden sie als Ort der oxidativen Phosphorylierung erkannt und im gleichen Zeitraum die mitochondriale DNA (mtdna) entdeckt (Nass und Nass, 1963). Heute weiß man, dass Mitochondrien an zahlreichen zellulären Prozessen beteiligt sind: Zu diesen zählen der Zitratzyklus, der Harnstoffzyklus, die Synthese von Steroidhormonen, die -Oxidation von Fettsäuren, der Aminosäuremetabolismus, die Hämsynthese, die Ketonkörpersynthese in Hepatozyten und der intrinsische Weg der Apoptose. Darüber hinaus übernehmen sie wichtige Aufgaben in der Ca 2+ -Homöostase und in Ca 2+ -abhängigen Signalkaskaden, wozu sie eng mit dem Endoplasmatischen Retikulum kooperieren (de Brito und Scorrano, 2008; Rizzuto et al., 2000). Essentiell für die Lebensfähigkeit der Zelle sind Mitochondrien durch ihre Beteiligung an der Synthese von Fe-S-Clustern. Diese sind Bestandteile der Atmungskettenkomplexe I, II und III und essentiell für die Prozessierung ribosomaler RNA (Lill und Mühlenhoff, 2005). Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die in der Zelle ein tubuläres Netzwerk bilden und sich permanent teilen oder miteinander fusionieren (Chen und Chan, 2005; Hoppins et al., 2007; Scheffler, 2001; Yaffe, 1999). Sie selbst besitzen vier Kompartimente: Die Außenmembran (OM), der Intermembranraum, die Innenmembran (IM) und die Matrix. Der wässrige Intermembranraum trennt die hydrophobe Außenmembran von der hydrophoben Innenmembran. Die Innenmembran

12 2 Einleitung bildet zwei unterschiedliche Strukturen aus: Die sogenannte Boundary Membrane und die Cristae. Mit Boundary Membrane werden Bereiche der Innenmembran bezeichnet, die in besonders engem Kontakt zur Außenmembran stehen. Bei den Cristae handelt es sich um ein von der Innenmembran gebildetes tubuläres Netzwerk, das in der Matrix liegt und der Oberflächenvergrößerung dient. Über schmale, flaschenhalsähnliche Strukturen, die sogenannten Cristae Junctions, gehen beide Fraktionen der Innenmembran ineinander über (Scheffler, 2001). Die Organisation in diese vier Kompartimente stellt ein Relikt der Endosymbiose dar: Die mitochondriale Matrix entspricht dabei dem bakteriellen Zytosol und der Intermembranraum dem periplasmatischen Raum. Der Endosymbiontentheorie folgend geht man davon aus, dass eine primitive Eukaryotenzelle mit anaerobem Metabolismus ein zur Atmung fähiges -Proteobakterium durch Phagozytose aufnahm, woraus eine symbiotische Beziehung entstand (Embley und Martin, 2006; Gray et al., 1999). Es ist allerdings nach wie vor Gegenstand von Diskussionen, ob die primitive Eukaryotenzelle bereits einen Nukleus besaß (Embley und Martin, 2006). Ein Relikt dieser Endosymbiose stellt auch die Anwesenheit mitochondrialer DNA dar, deren Replikation unabhängig vom Zellzyklus erfolgt (Scheffler, 2001). Die meisten ursprünglich prokaryotischen Gene wurden nach der Endosymbiose vom mitochondrialen ins nukleäre Genom transferiert. Das mitochondriale Proteom von S. cerevisiae umfasst schätzungsweise Proteine, das des Menschen in etwa Proteine (Pagliarini et al., 2008; Reinders et al., 2006; Sickmann et al., 2003; Taylor et al., 2003). Als Folge des oben beschriebenen DNA-Transfers sind 99 % aller mitochondrialen Proteine nukleär kodiert, werden an zytosolischen Ribosomen synthetisiert und müssen an ihren Bestimmungsort in den Mitochondrien transportiert werden (Bolender et al., 2008). Dies macht die Präsenz hochspezialisierter Proteinimportmaschinerien in den Mitochondrien erforderlich, deren Untersuchung Gegenstand dieser Arbeit ist. Die hier präsentierten Daten basieren auf Experimenten an S. cerevisiae, dem am besten analysierten eukaryotischen Modellorganismus zur Untersuchung der Proteintranslokation. Die beschriebenen Mechanismen sind in Grundzügen auch auf andere eukaryotische Organismen wie den Menschen übertragbar.

13 3 Einleitung 1.2 Relevanz mitochondrialer Forschung für die Klinische Medizin Mitochondrien spielen eine bedeutende Rolle bei der Entstehung von Krankheiten. Ihre Relevanz beschränkt sich nicht nur auf die klassischen mitochondrialen Enzephalomyopathien, vielmehr wurden Mitochondrien inzwischen auch als wichtige Spieler in der Pathogenese von Volksleiden wie Malignomen erkannt. Aufgrund der immensen Bedeutung von Mitochondrien für den Energiestoffwechsel werden bei mitochondrialen Defekten und Störungen vor allem Gewebe hohen Energiebedarfs wie Herz, Skelettmuskel, Nierentubuli, Neurone und endokrine Drüsen in Mitleidenschaft gezogen (Wallace, 1999). Mitochondrial bedingte Erkrankungen manifestieren sich nur selten bereits in jungen Jahren, was im Wesentlichen durch die Besonderheiten der mtdna bedingt ist: Jedes Mitochondrium enthält circa fünf Kopien an mtdna und jede Zelle hunderte bis tausende Mitochondrien (DiMauro und Schon, 2003). Dies hat zur Folge, dass intakte mtdna und eventuell mutierte mtdna nebeneinander in einer Zelle vorliegen können, was als Heteroplasmie bezeichnet wird. Erst wenn der Gehalt an mutierter DNA einen bestimmten, gewebeabhängigen Schwellenwert überschreitet, kommt es zur Ausbildung von Krankheitszeichen (DiMauro und Schon, 2003). Gleichzeitig befindet sich die mtdna in räumlicher Nähe zur Atmungskette (Reeve et al., 2008), wo bereits physiologisch die Radikale O 2 und in der Folge H 2 O 2 und OH entstehen. Diese radikalen Sauerstoffspezies schädigen mitochondriale und zelluläre Proteine sowie Lipide und Nukleinsäuren (Wallace, 1999). Die mtdna ist auch deshalb anfälliger gegenüber Mutationen als die nukleäre DNA, da sie beispielsweise über keinen Mechanismus zur Nukleotid-Exzisionsreparatur oder protektive Histone verfügt (Chan, 2006; Reeve et al., 2008). Die Mutationsanfälligkeit der mtdna und ihre Exposition gegenüber O 2 - Radikalen der Atmungskette sorgen dafür, dass mtdna-mutationen mit dem Alter akkumulieren und die Mitochondrienfunktion beeinträchtigen. Da die mtdna für Proteine der Atmungskette kodiert, führen Mutationen der mtdna zu einer gesteigerten Produktion radikaler Sauerstoffspezies und somit zu weiteren Mutationen der mtdna (Chan, 2006). Die Akkumulation von mtdna-mutationen trägt zur Alterung des Organismus und zur Ausbildung von Krankheiten wie den mitochondrialen Enzephalomyopathien bei (Chan, 2006). Zu diesen gehören die chronisch progrediente externe Ophthalmoplegie, MELAS (myopathy encephalopathy lactic acidosis and stroke-like episodes), MERRF (myoclonic

14 4 Einleitung epilepsy and ragged red fibers), die Lebersche hereditäre optische Neuropathie, die mit akuter oder subakuter Erblindung durch den Untergang der retinalen Ganglienzellen einhergeht, und das Kearns-Sayre-Syndrom, das zu Ophtalmoplegie, Ptosis und bisweilen Diabetes Mellitus sowie kardialen und renalen Defekten führt (Schapira, 2006; Wallace, 1999). Mitochondrien sind als zentrale Komponenten des intrinsischen Wegs der Apoptose ebenfalls an der Tumorigenese beteiligt: So können Defekte der Atmungskette die Aktivierung der pro-apoptotischen Proteine Bax und Bak verhindern, was zur Tumorbildung führt (Brunelle und Letai, 2009; Kroemer und Pouyssegur, 2008). Die erwähnten Krankheiten unterstreichen die Wichtigkeit einer korrekten Mitochondrienfunktion. Um diese zu gewährleisten, müssen Proteine als Funktionsträger für die verschiedenen mitochondrialen Aufgaben in die Mitochondrien importiert werden. Interessanterweise sind nur wenige Defekte der mitochondrialen Importmaschinerie bekannt. Man vermutet, dass derartige Defekte bereits frühzeitig letal sind (DiMauro und Schon, 2003). Dennoch konnte mit dem X-chromosomal vererbten Mohr-Tranebjaerg Syndrom eine solche Krankheit identifiziert werden, die zu Taubheit, Dystonie, psychiatrischen Symptomen und Blindheit führt. Ursächlich sind Mutationen im Gen TIMM8A, das für ein Homolog des Hefeproteins Tim8 kodiert, einer Komponente der mitochondrialen Importmaschinerie (DiMauro und Schon, 2003). Es wird ferner diskutiert, dass bei Morbus Alzheimer das Amyloid-Vorläufer-Protein die mitochondriale Importmaschinerie regelrecht verstopfen kann (Lin und Beal, 2006). 1.3 Proteinimport in Mitochondrien Transport nukleär kodierter Proteine in Mitochondrien Mitochondriale Proteine werden post-translational importiert (Neupert und Herrmann, 2007). Sie besitzen spezifische Zielsequenzen, die den korrekten Import in das jeweilige mitochondriale Subkompartiment gewährleisten (Bolender et al., 2008). Die bekannteste Zielsequenz ist die N-terminale Signalsequenz der Matrixproteine und einiger Innenmembranproteine. Diese besteht aus meist 20 bis 40 Aminosäuren, die eine amphiphile -Helix bilden können, in der hydrophobe und positiv geladene Aminosäuren einander gegenüber liegen (Heijne, 1986; Roise et al., 1986). Sie wird nach Import in die Matrix von der Mitochondrialen Prozessierungspeptidase (MPP)

15 5 Einleitung abgeschnitten (Bolender et al., 2008). Transporterproteine der Innenmembran enthalten dagegen keine N-terminale Signalsequenz sondern mehrere interne und nicht spaltbare Zielsequenzen. Bisher wurde für diese Signale kein Konsensus-Motiv gefunden (Brix et al., 1999). Erst vor kurzem wurden hingegen mit dem -Signal und dem MISS-Signal Motive identifiziert, die für die Sortierung von -Barrel-Proteinen in die Außenmembran beziehungsweise für die Sortierung der kleinen TIM-Proteine in den Intermembranraum von großer Relevanz sind (Kutik et al., 2008; Milenkovic et al., 2009). Weit weniger klar ist bisher der Sortierungsmechanismus für die - helikalen Proteine der Außenmembran, jedoch scheinen Transmembrandomänen von mäßiger Hydrophobizität sowie geladene flankierende Aminosäuren von Bedeutung zu sein (Borgese et al., 2007; Waizenegger et al., 2003). Der Import mitochondrialer Proteine erfolgt in ungefalteter Konformation. Verschiedene zytosolische Chaperone wie Hsp70 und Hsp90 verhindern eine Aggregation vor allem hydrophober Vorstufenproteine im Zytoplasma, halten die Vorstufenproteine im ungefalteten Zustand und vermitteln ihren Transport zu Zellorganellen (Neupert und Herrmann, 2007). In Hefe spielt Hsp70 eine zentrale Rolle bei dem Transport von zytosolisch synthetisierten Vorstufenproteinen zur Mitochondrienoberfläche (Neupert und Herrmann, 2007; Young et al., 2003). Vorstufenprotein und Chaperon werden dort spezifisch von Außenmembranrezeptorproteinen erkannt (Young et al., 2003; Young et al., 2004). Es wird ferner spekuliert, dass Hsp90 nicht nur an der Anbindung des Vorstufenproteins an Außenmembranrezeptoren beteiligt ist, sondern aktiv unter Hydrolyse von ATP an der initialen Translokation des Vorstufenproteins mitwirkt (Fan et al., 2006). Der TOM-Komplex (translocase of the outer membrane) der Außenmembran stellt die Eintrittspforte für nahezu alle mitochondrialen Proteine dar. Elektronenmikroskopische und kryo-elektronenmikroskopische Experimente weisen auf eine dreifach symmetrische Struktur hin (Künkele et al., 1998; Model et al., 2002; Model et al., 2008). Der TOM-Komplex wird von sieben verschiedenen Untereinheiten gebildet (Abb. 1.1): dem -Barrel-Protein Tom40 (Hill et al., 1998), den kleinen - helikalen Proteinen Tom5, Tom6 und Tom7 mit C-terminalem Membrananker (Allen et al., 2002; Dietmeier et al., 1997; Hönlinger et al., 1996; Kassenbrock et al., 1993) sowie den ebenfalls -helikalen Rezeptoren Tom22, Tom20 und Tom70. Während Tom20 und Tom70 mit einer N-terminalen -Helix in der Membran verankert sind

16 6 Einleitung (Söllner et al., 1989; Söllner et al., 1990; van Wilpe et al., 1999), weist Tom22 eine interne Transmembrandomäne auf (Nakai et al., 1995). Tom40, Tom22 und die drei kleinen TOM-Proteine bilden den stabilen TOM core -Komplex, auch Generelle Importpore (GIP) genannt, mit einer Größe von circa 450 kda. Dagegen sind die beiden Rezeptoren Tom20 und Tom70 nur lose mit dem TOM-Komplex assoziiert (Ahting et al., 1999; Dekker et al., 1998; Meisinger et al., 2001). Tom20 ist der Hauptimportrezeptor des TOM-Komplexes und erkennt Vorstufenproteine mit einer N-terminalen Zielsequenz (Moczko et al., 1994; Söllner et al., 1989) über hydrophobe Wechselwirkungen (Abe et al., 2000; Saitoh et al., 2007). Teilweise überlappt seine Substratspezifität mit derjenigen von Tom70, wenn auch mit reduzierter Effizienz (Söllner et al., 1992; Steger et al., 1990). Tom70 fungiert als Rezeptor für Vorstufenproteine mit internen Signalsequenzen wie beispielsweise die Transporterproteine der mitochondrialen Innenmembran, die durch zytosolische Chaperone wie Hsp70 oder Hsp90 an Tom70 rekrutiert werden (Söllner et al., 1990; Young et al., 2003). Tom70 interagiert mit den erwähnten Chaperonen über TPR- Motive vom Clamp-Typ, die spezifisch die C-Termini dieser Chaperone binden. Das transportierte Vorstufenprotein bindet darauf an eine hydrophobe Grube des Rezeptors. Die Freisetzung des Chaperons aus dem Rezeptor/Chaperon/Protein- Komplex erfordert die Hydrolyse von ATP (Chan et al., 2006; Fan et al., 2006; Wu und Sha, 2006; Young et al., 2003). Es wird vermutet, dass bis zu drei Tom70- Dimere für die Bindung eines Vorstufenproteins kooperieren (Wiedemann et al., 2001). Weder Tom20 noch Tom70 sind jedoch essentiell für die Überlebensfähigkeit der Zelle (Krimmer et al., 2001; Moczko et al., 1994). Tom22 wirkt als zentraler Rezeptor der Importkette nach Tom20 und Tom70 und ist als Hauptorganisator des TOM-Komplexes essentiell für dessen Stabilität (van Wilpe et al., 1999). Außerdem bildet Tom22 die Dockingstelle für Tom20 im TOM-Komplex und vermittelt die Insertion von Vorstufenproteinen in die Translokationspore (Kiebler et al., 1993; Moczko et al., 1997; van Wilpe et al., 1999). Das -Barrel-Protein Tom40 bildet die zentrale Pore des TOM-Komplexes, durch die die Vorstufenproteine passieren (Becker et al., 2005; Hill et al., 1998; Künkele et al., 1998). Im TOM-Komplex liegt Tom40 in Form von drei Dimeren vor, die drei Poren bilden (Dekker et al., 1998; Künkele et al., 1998; Rapaport et al., 1998). Diese Poren sind keine rein passiven Gebilde: Vielmehr gibt es Hinweise, dass Tom40 an der Sortierung von Vorstufen-

17 7 Einleitung Abb. 1.1 Übersicht zu den mitochondrialen Proteinimportwegen Der TOM-Komplex stellt die zentrale Eintrittspforte für die meisten zytosolisch synthetisierten mitochondrialen Vorstufenproteine dar. Nach Translokation über die Außenmembran erfolgt deren Sortierung zu einem der vier mitochondrialen Kompartimente: Der SAM-Komplex sortiert Vorstufenproteine in die Außenmembran, die MIA-Maschinerie in den Intermembranraum. Der TIM22-Komplex fungiert in der Biogenese von Transporterproteinen der Innenmembran. Der TIM23-Komplex vermittelt den Import von Proteinen in die Innenmembran und zusammen mit der PAM-Maschinerie in die Matrix. Für Abkürzungen siehe Abkürzungsverzeichnis. Ziffern stehen für die Molekulargewichte der entsprechenden TOM-Untereinheiten. proteinen zu dem korrekten mitochondrialen Subkompartiment beteiligt ist und für einige Proteine als eine Art Chaperon wirken kann (Esaki et al., 2003; Gabriel et al., 2003; Sherman et al., 2006). So können N-terminale Präsequenzen von Matrix- oder

18 8 Einleitung Innenmembranproteinen die elektrophysiologischen Eigenschaften des Kanals modulieren (Hill et al., 1998). Über die Funktion der drei kleinen TOM-Proteine ist wenig bekannt. Alle drei kleinen TOM-Proteine können mit Tom40 chemisch quervernetzt werden, was darauf hindeutet, dass sie im TOM-Komplex in unmittelbarer Nähe zu Tom40 sitzen (Dembowski et al., 2001; Schmitt et al., 2005). Der Proteinimport in Mitochondrien zeigt auch nach dem proteolytischen Verdau aller Außenmembranrezeptoren eine starke Abhängigkeit von Tom5, was auf eine Funktion von Tom5 für die Insertion von Vorstufenproteinen in die Pore hindeutet (Dietmeier et al., 1997). Alternativ wurde eine Funktion von Tom5 für die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des TOM-Komplexes beschrieben (Schmitt et al., 2005). Auch für die anderen beiden kleinen TOM-Proteine wurde eine Rolle in der Regulation der Stabilität des TOM-Komplexes beobachtet: Tom6 stabilisiert den TOM-Komplex, während Tom7 den TOM-Komplex destabilisiert (Alconada et al., 1995; Hönlinger et al., 1996). Nach der Passage durch den TOM- Komplex trennen sich die Importwege entsprechend den jeweiligen mitochondrialen Subkompartimenten auf (Abb. 1.1): Der Import von Vorstufenproteinen in die Matrix verläuft über den TIM23-Komplex (translocase of the inner membrane) und die PAM- Maschinerie (presequence translocase associated motor). In der PAM-freien Form sortiert die TIM23-Translokase Vorstufenproteine mit Präsequenzen in die Innenmembran. Der TIM22-Komplex vermittelt die Biogenese von Transporterproteinen der Innenmembran. Intermembranraumproteine werden von der MIA- Maschinerie (mitochondrial intermembrane space assembly) assembliert. Der am besten untersuchte Importmechanismus für Außenmembranproteine involviert den SAM-Komplex (sorting and assembly machinery) Proteinimport in die Matrix Nach Passage durch den TOM-Komplex werden Matrixproteine mit N-terminalen, amphiphilen -Helices direkt an den TIM23-Komplex der Innenmembran weitergereicht (Endo et al., 2003; Koehler, 2004; Neupert und Herrmann, 2007). Dieser wird von Tim23, Tim17, Tim50 und Tim21 gebildet. Er interagiert via Tim21 mit der Intermembranraumdomäne von Tom22 (Chacinska et al., 2005). Tim21 und die Intermembranraumdomänen von Tim50 und Tim23 sind an der Bindung und dem Transfer des Vorstufenproteins zu der Translokationspore der Innenmembran beteiligt (Mokranjac et al., 2009; Tamura et al., 2009). Tim23 ist die zentrale

19 9 Einleitung Untereinheit des Komplexes und bildet einen spannungsabhängigen Kanal, der im inaktiven Zustand geschlossen ist (Truscott et al., 2001). Man geht davon aus, dass Tim50 die Öffnung des Kanals im inaktiven Zustand verschließt (Meinecke et al., 2006). Für die Stabilität der Translokase und die Regulation des Kanals wird Tim17 benötigt (Martinez-Caballero et al., 2007). Der TIM23-Komplex transloziert die N- terminale Signalsequenz in Abhängigkeit des Membranpotentials über die Innenmembran. Zur vollständigen Translokation des Vorstufenproteins benötigt der TIM23-Komplex zusätzlich die ATP-abhängige Aktivität der PAM-Maschinerie, mit der er nach Dissoziation von Tim21 zum TIM23 motor -Komplex assoziiert (Abb. 1.1 und Abb. 1.2 B, mitte). Die PAM-Maschinerie besteht aus der zentralen Untereinheit mthsp70/ssc1 sowie den regulatorischen Co-Chaperonen Tim44, Tim14/Pam18, Tim16/Pam16, Pam17 und Mge1 (Neupert und Herrmann, 2007). Tim44 bindet das translozierende Vorstufenprotein und präsentiert es assoziiertem mthsp70, das ATP gebunden hat. Pam18 stimuliert über seine J-Domäne das mthsp70, das ATP zu ADP hydrolisiert (Mokranjac et al., 2003). Im ADP-gebundenen Zustand bindet mthsp70 fest an das Vorstufenprotein. Die Aktivität von Pam18 wird durch Pam16 reguliert (D'Silva et al., 2005; Frazier et al., 2004; Truscott et al., 2003). Beide Proteine formen eine stabile Einheit, die über Pam17 an den TIM23-Komplex gebunden ist (Mokranjac et al., 2006). Der exakte Mechanismus der gerichteten Translokation durch den TIM23-Komplex ist nach wie vor umstritten: Dem Modell der Brownschen Ratsche folgend, verhindert die feste Bindung des mthsp70 an das Vorstufenprotein dessen Zurückgleiten durch die Translokationspore. Auf diese Weise können spontane Bewegungen des Vorstufenproteins in der Translokationspore in eine gerichtete Bewegung zur Matrix umgewandelt werden (Neupert et al., 1990). Nach dem sogenannten Pulling-Modell dagegen durchläuft an der Translokase fixiertes mthsp70 bei der ATP-Hydrolyse Konformationsänderungen und zieht so das Vorstufenprotein durch die Translokationspore (Matouschek et al., 2000). Der Nukleotid-Austauschfaktor Mge1 sorgt schließlich für einen Austausch von ADP gegen ATP an mthsp70 und damit für eine Ablösung des Chaperons vom Vorstufenprotein. Zur vollständigen Translokation des Vorstufenproteins sind mehrere der beschriebenen ATP-Hydrolyse-Zyklen notwendig. In der Matrix wird die Signalsequenz von der MPP abgeschnitten und das Vorstufenprotein steht für Faltungs- und Assemblierungsprozesse zur Verfügung.

20 10 Einleitung Proteinimport in den Intermembranraum Zwei Importwege in den Intermembranraum sind beschrieben worden: Einige Proteine, wie das apoptotische Smac, besitzen eine N-terminale Signalsequenz und eine benachbarte hydrophobe Transmembrandomäne. Vorstufenproteine dieser Art werden mit Hilfe des TIM23-Komplexes durch laterale Freisetzung in die Innenmembran integriert. Dieser Prozess ist - und ATP-abhängig. Das lösliche reife Protein wird durch Proteolyse des membranintegrierten Vorstufenproteins in den Intermembranraum freigesetzt. Dieser Prozess kann mehrere konsekutive Schritte und die Beteiligung verschiedener Proteasen wie beispielsweise der Innenmembranpeptidase 1 umfassen (Burri et al., 2005; Neupert und Herrmann, 2007; Nunnari et al., 1993). Vorwiegend kleine Proteine von weniger als 22 kda Größe, die Cystein-Motive tragen, assemblieren mit Hilfe der MIA-Maschinerie (Abb. 1.1). Bekannte Vertreter sind Cox17, Cox19 sowie die kleinen TIM-Proteine (Tim9/10, Tim8/13). Mia40, das drei Cystein-Paare enthält, und die Sulfhydryl-Oxidase Erv1 stellen die zentralen Komponenten der MIA-Maschinerie dar. Kernaufgabe der MIA-Maschinerie im oxidierenden Milieu des Intermembranraums ist die Ausbildung von Disulfidbrücken in den entsprechenden Vorstufenproteinen und damit deren korrekte Faltung (Stojanovski et al., 2008a). Dabei bindet Mia40 in einem Zwischenschritt selbst das Vorstufenprotein über Disulfidbrücken. Neuere Untersuchungen zeigen, dass Mia40, Erv1 und das entsprechende Vorstufenprotein während dieses Prozesses in einem ternären Komplex vorliegen (Stojanovski et al., 2008b). Erv1 kommt die Aufgabe zu, reduziertes Mia40 zu reoxidieren und damit die Übertragung weiterer Disulfidbrücken zu ermöglichen. Die dabei freiwerdenden Elektronen werden auf Cytochrom c transferiert und anschließend in die Atmungskette eingespeist (Chacinska et al., 2004; Diekert et al., 2001; Neupert und Herrmann, 2007; Stojanovski et al., 2008b) (Abb. 1.1) Proteinimport in die Innenmembran Mit 60 bis 70 Gewichtsprozent gehört die mitochondriale Innenmembran zu den proteinreichsten biologischen Membranen überhaupt (Becker et al., 2009). Prinzipiell existieren vier Wege, wie Proteine dorthin gelangen können: Der TIM22-Weg, der Sortierungsweg, der Weg der konservativen Sortierung und der Export mitochondrial synthetisierter Proteine (Neupert und Herrmann, 2007).

21 11 Einleitung Der TIM22-Weg Proteine, die diesen Importweg nehmen können, verfügen über interne Signalsequenzen sowie mehrere Transmembrandomänen und gehören zu der Gruppe der Transporterproteine oder verwandter Proteine wie Tim17, Tim22 und Tim23. Sie alle besitzen eine gerade Anzahl an Transmembrandomänen (Endo et al., 2003; Neupert und Herrmann, 2007). Sie passieren zunächst den TOM-Komplex in einer haarnadelartigen Konformation (Abb. 1.2 A), wobei beide Termini in das Zytosol ragen (Wiedemann et al., 2001). Der Import dieser Proteine ist von der Anwesenheit der kleinen Intermembranraumproteine Tim9 und Tim10 und im Falle von Tim23 von Tim8 und Tim13 abhängig (Curran et al., 2002; Kaldi et al., 1998; Neupert und Herrmann, 2007). Die kleinen TIM-Proteine sind die zentralen Chaperone des Intermembranraums und geleiten Vorstufenproteine vom TOM- Komplex zur TIM22-Translokase (Neupert und Herrmann, 2007). Sie besitzen eine charakteristische Helix-Schleife-Helix-Struktur. Die Schleife enthält zwei Motive der Art Cys-X 3 -Cys. Je drei Tim9 und drei Tim10-Moleküle, beziehungsweise drei Tim8 und drei Tim13-Moleküle lagern sich alternierend zu ringförmigen Hexameren von etwa 70 kda Größe zusammen. Während die Schleifen im Zentrum zu liegen kommen und die Cystein-Reste intramolekular durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind, weisen die -Helices propellerartig nach außen (Baker et al., 2009; Davis et al., 2007; Vergnolle et al., 2005; Webb et al., 2006). Es wird spekuliert, dass die kleinen TIM-Proteine während der Passage durch das wässrige Milieu des Intermembranraums mit Hilfe ihrer Arme die hydrophoben Bereiche der Transporterproteine abschirmen (Neupert und Herrmann, 2007). Zur Anbindung an den TIM22-Komplex wird zusätzlich das periphere Protein Tim12 benötigt (Gebert et al., 2008) (Abb. 1.2 A). Der TIM22-Komplex umfasst die peripheren Untereinheiten Tim9, Tim10 und Tim12 sowie die membranintegrierten Untereinheiten Tim18, Tim54 und Tim22 (Rehling et al., 2004). Tim54 ist für die Stabilität des Komplexes wichtig und vermittelt eventuell die Anbindung der peripheren Untereinheiten Tim9, Tim10 und Tim12. Tim18 soll die Assemblierung von Tim54 in den TIM22-Komplex fördern (Becker et al., 2009). Das essentielle Protein Tim22 stellt die zentrale Untereinheit des Komplexes dar. Es bildet die beiden spannungsabhängigen und substratsensitiven Kanäle des Komplexes (Koehler, 2004; Neupert und Herrmann, 2007; Rehling et al., 2003). In diese inserieren die Transportervorstufenproteine

22 12 Einleitung 1.2 Biogenese von Innenmembran- und Matrixproteinen (A) Transporterproteine der Innenmembran werden mit Hilfe des TIM22-Komplexes importiert. (B) Der TIM23-Komplex assoziiert mit der PAM-Maschinerie zum Import von Matrixproteinen und einigen Innenmembranproteinen (mitte). Von der Matrix aus werden die Innenmembranproteine mit Hilfe von Oxa1 in die Membran integriert (rechts). Zur Biogenese von Innenmembranproteinen des Sortierungswegs assoziiert der TIM23-Komplex mit Tim21 (links). Mitochondrial kodierte Innenmembranproteine werdend ko-translational mit Hilfe von Oxa1 in die Innenmembran integriert (rechts). Für Einzelheiten und Abkürzungen siehe Text und Abkürzungsverzeichnis. Ziffern bezeichnen die Molekulargewichte der jeweiligen TOM-, TIM- oder PAM-Untereinheiten.

23 13 Einleitung wie auch in den TOM-Komplex in einer haarnadelartigen Konformation (Rehling et al., 2004). Nach der -abhängigen Insertion der Vorstufenproteine in die Innenmembran werden diese vermutlich durch laterale Diffusion aus dem TIM22-Komplex freigesetzt und bilden ihre natürliche oligomere Form aus (Becker et al., 2009; Neupert und Herrmann, 2007; Rehling et al., 2004). Der Sortierungsweg Die zentrale Komponente des Sortierungswegs ist der TIM23-Komplex in der PAMfreien Form, der mit Tim21 zum TIM23 sort -Komplex assoziiert. Vorstufenproteine, die über den Sortierungsweg assembliert werden, besitzen eine N-terminale Signalsequenz und eine -helikale Transmembrandomäne. Im assemblierten Zustand liegt ihr N-Terminus in der Matrix und der C-Terminus dementsprechend im Intermembranraum. Typische Vertreter dieser Kategorie sind Cox5a, Cox11 und Tim50 (Neupert und Herrmann, 2007). Ähnlich den Matrixproteinen wird das Vorstufenprotein nach Passage durch den TOM-Komplex direkt an den TIM23- Komplex weitergereicht (Neupert und Herrmann, 2007) (Abb. 1.2 B, links). Die PAMfreie TIM23-Translokase vermittelt die laterale Insertion des Vorstufenproteins in die mitochondriale Innenmembran. Diese sogenannte Sortierungsform des TIM23- Komplexes kann mit Atmungskettenkomplexen assoziieren, was vermutlich der Aufrechterhaltung des Membranpotentials in der Nähe des Komplexes dient, da das Membranpotential für die Translokation des Vorstufenproteins über die Innenmembran benötigt wird (Becker et al., 2009; van der Laan et al., 2007). Allerdings werden die Vorstufenproteine nicht komplett über die Innenmembran transloziert. Vielmehr kommt es in Anwesenheit eines spezifischen Stopsignals im Laufe der Translokation zu einem Arrest, gefolgt von der Freisetzung des Vorstufenproteins in die Innenmembran. Im Wesentlichen sind es drei Charakteristika des jeweiligen Vorstufenproteins, die als Stopsignal für die Translokation wirken können: Eine Ansammlung geladener Aminosäuren C-terminal der Transmembrandomäne, eine hohe Hydrophobizität der Transmembrandomäne sowie das Fehlen von Prolin-Resten in der Transmembrandomäne (Meier et al., 2005). Die N-terminale Signalsequenz liegt nach abgeschlossener Membranintegration in der Matrix und kann von der MPP abgeschnitten werden (Neupert und Herrmann, 2007).

24 14 Einleitung Der Weg der konservativen Sortierung Der Importweg von Innenmembranproteinen mit N-terminaler Signalsequenz und mehreren -helikalen Transmembrandomänen führt über die Matrix und wird auch als konservative Sortierung bezeichnet. Der Import des Vorstufenproteins in die Matrix entspricht dabei dem unter beschriebenen Importmechanismus für Matrixproteine: Nach Passage des Vorstufenproteins durch den TOM-Komplex und Bindung an den TIM23-Komplex, dissoziiert Tim21 ab und ermöglicht somit die Assoziation des TIM23-Komplexes mit der PAM-Maschinerie zum TIM23 motor - Komplex, der das Vorstufenprotein in die Matrix transloziert (Abb. 1.2 B, mitte). Von der Matrix aus wird die Insertion in die Innenmembran durch eine Oxa1-enthaltende Exportmaschine initiiert (Becker et al., 2009; Koehler, 2004; Neupert et al., 1990; Neupert und Herrmann, 2007) (Abb. 1.2 B, rechts). Mitochondrial kodierte Innenmembranproteine Das mitochondriale Genom kodiert in S. cerevisiae für acht Proteine (Rehling et al., 2004), die Untereinheiten von Atmungskettenkomplexen sind. Ihre Membranintegration erfolgt ko-translational. Dazu werden die mitochondrialen Ribosomen mit Hilfe von Mdm38 und Mba1 an die Innenmembran rekrutiert und die Insertion dieser Proteine durch Oxa1 vermittelt (Abb. 1.2 B, rechts). Oxa1 gehört zu einer Proteinfamilie mit Homologen in Bakterien (YidC) und Chloroplasten (Alb3), die an der Biogenese von -helikalen Proteinen beteiligt sind. Der genaue Mechanismus der Membranintegration ist allerdings nicht bekannt (Becker et al., 2009; Koehler, 2004; Nargang et al., 2002) Biogenese von Außenmembranproteinen Die mitochondriale Außenmembran beherbergt drei Proteinklassen: Peripher assoziierte Proteine sowie die membranintegralen -Barrel- und -helikalen Proteine. Sie alle sind nukleär kodiert und werden an zytosolischen Ribosomen translatiert (Becker et al., 2009). Zu der Gruppe der peripher assoziierten Proteine gehören Mfb1 sowie mit Sam35 und Sam37 zwei Komponenten des SAM-Komplexes (Gratzer et al., 1995; Kondo- Okamoto et al., 2006; Milenkovic et al., 2004). Diese Proteine werden im Zuge ihrer Biogenese nicht über die mitochondriale Außenmembran transloziert: Während für

25 15 Einleitung Sam37 keinerlei Abhängigkeit der Assemblierung von Komponenten des TOM- Komplexes nachgewiesen werden konnte (Habib et al., 2005), scheinen Tom70 und dessen Paralog Tom71 an die Anbindung und Assoziation von Mfb1 an die Außenmembran involviert zu sein (Kondo-Okamoto et al., 2008). -Barrel-Proteine verdanken ihren Namen ihrer fassartigen Struktur, mit der sie in die Membran eingebettet sind. Diese Proteine kommen nur in den Außenmembranen von Organellen endosymbiotischen Ursprungs und Gramnegativer Bakterien vor (Dolezal et al., 2006). Mitochondriale Vertreter dieser Gruppe sind in S. cerevisiae Tom40, Sam50, Mdm10 und Porin. Ihre prokaryotische Herkunft spiegelt sich auch in ihrer konservierten Biogenese wieder: So konnte gezeigt werden, dass PhoE, ein -Barrel-Protein aus E. coli, bei Expression in S. cerevisiae nicht nur in dessen mitochondriale Außenmembran assemblieren kann, sondern dabei sogar denselben Importweg nutzt wie endogene -Barrel-Proteine (Walther et al., 2009). Der erste Schritt der Biogenese von -Barrel-Proteinen besteht in der Translokation des Vorstufenproteins über die mitochondriale Außenmembran mit Hilfe des TOM-Komplexes (Pfanner et al., 2004) (Abb. 1.3 A). Dies impliziert, dass weitere Assemblierungsschritte vom Intermembranraum aus erfolgen müssen. Dies ist vermutlich ein Relikt der Endosymbiose: Auch bakterielle -Barrel-Proteine werden vom periplasmatischen Raum aus assembliert (Knowles et al., 2009; Schleiff und Soll, 2005). Im Intermembranraum werden die -Barrel- Vorstufenproteine mit Hilfe der kleinen TIM-Proteine zum SAM-Komplex sortiert (Hoppins und Nargang, 2004; Wiedemann et al., 2004). Der SAM core -Komplex besteht aus den Komponenten Sam35, Sam37 und Sam50. Sam35, Sam50 sowie Tom40 sind die einzigen Außenmembranproteine, die essentiell für die Lebensfähigkeit der Zelle sind (Baker et al., 1990; Gentle et al., 2004; Kozjak et al., 2003; Milenkovic et al., 2004; Niedenthal et al., 1999; Paschen et al., 2003; Waizenegger et al., 2004). Sam50 gehört zu der Familie der Omp85-Proteine, die für die Biogenese von -Barrel-Proteinen benötigt werden, hochkonserviert sind und in Gram-negativen Bakterien und Chloroplasten vorkommen (Becker et al., 2008b; Voulhoux et al., 2003; Wu et al., 2005). Der C-Terminus von Sam50 formt selbst eine -Barrel-Struktur, während der N-Terminus eine im Intermembranraum gelegene POTRA-Domäne (polypeptide transport associated) bildet (Clantin et al., 2007; Paschen et al., 2003; Sanchez-Pulido et al., 2003). Lange Zeit ging man

26 16 Einleitung davon aus, dass die POTRA-Domäne von Sam50, ähnlich den fünf POTRA- Domänen in Omp85, als Rezeptor die -Barrel-Vorstufenproteine im Intermembranraum binden könne (Bos et al., 2007; Habib et al., 2007). Erst vor kurzem konnte jedoch gezeigt werden, dass die POTRA-Domäne für die Bindung des Vorstufenproteins verzichtbar ist. Vielmehr erfolgt die Erkennung des im letzten Strang des Vorstufenproteins gelegenen -Signals durch Sam35 (Kutik et al., 2008). Der Mechanismus der Membranintegration von -Barrel-Proteinen wird bis heute kontrovers diskutiert. Im Wesentlichen stehen zwei Modelle zur Disposition: Nach dem ersten Modell fungiert Sam50 als Gerüst. An der Grenzfläche zwischen Sam50 und der Lipidphase werden vorgeformte -Haarnadel-Strukturen nacheinander in die Membran inseriert (Paschen et al., 2005). Ein Alternativmodell schlägt die Bildung eines hydrophilen Kanals aus fünf Sam50-Molekülen vor. Dieser ermöglicht dem - Signal, vom Intermembranraum an das zytosolisch gelegene Sam35 zu binden, was eine Konformationsänderung und vollständige Öffnung des Kanals induziert. Somit können vorgeformte -Stränge in die Pore inseriert werden (Abb. 1.3 A), aus der das vollständig gefaltete -Barrel-Protein durch ein Rearrangement der Sam50-Untereinheiten lateral entlassen wird (Kutik et al., 2008). Sam37, der dritten Komponente des SAM, wird eine Funktion für die Freisetzung des Vorstufenproteins vom SAM- Komplex zugeschrieben (Chan und Lithgow, 2008). Eine Reihe weiterer Proteine ist in die Biogenese von Tom40 involviert: Zu diesen Proteinen gehört Mdm10 (mitochondrial distribution and morphology), für das eine duale Lokalisation beschrieben wurde. So ist Mdm10 einerseits Bestandteil des SAM holo -Komplexes, der neben den Komponenten des SAM core -Komplexes als zusätzliche Untereinheit Mdm10 enthält und von Bedeutung für die Biogenese des TOM-Komplexes ist (Meisinger et al., 2004). Es wurde vorgeschlagen, dass Mdm10 die Anbindung der Vorstufenproteine von Tom6, Tom7 und Tom22 an ein Tom40- und Tom5-enthaltendes Assemblierungsintermediat vermittelt (Meisinger et al., 2004). Die vollständige Klärung der Funktion steht aber noch aus. Andererseits konnte Mdm10 auch als Bestandteil des MDM-Komplexes identifiziert werden. Dieser umfasst als weitere Komponenten die Proteine Mdm12 und Mmm1 (Becker et al., 2008b). Für diesen Proteinkomplex wurden mehrere Funktionen beschrieben: Zum einen ist er für eine korrekte Mitochondrienmorphologie essentiell und soll eine Rolle bei der Verknüpfung von Mitochondrien mit dem Zytoskelett spie-

27 17 Einleitung Abb. 1.3 Biogenese von Außenmembranproteinen (A) β-barrel-vorstufenproteine werden nach Passage durch den TOM-Komplex mit Hilfe des SAM- Komplexes vom Intermembranraum aus in die Außenmembran inseriert. (B) Einzelne TOM-Rezeptoren, der SAM-Komplex sowie Mim1-Oligomere sind auf noch nicht vollständig geklärte Art und Weise in die Biogenese von -helikalen Proteinen der Außenmembran involviert. Für weitere Einzelheiten und Abkürzungen siehe Text und Abkürzungsverzeichnis. Ziffern stehen für die Molekulargewichte der entsprechenden TOM-Untereinheiten. len (Boldogh et al., 2003; Okamoto und Shaw, 2005). Zum anderen wurde ein Defekt der Biogenese von -Barrel-Proteinen in Mutanten von Mdm12 und Mmm1 beobachtet (Meisinger et al., 2007). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der

28 18 Einleitung MDM-Komplex Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum räumlich eng miteinander verknüpft und auf diese Weise eine wichtige Rolle für den Austausch von Phospholipiden zwischen beiden Kompartimenten spielt (Kornmann et al., 2009). Da es sich hierbei um Beschreibungen von MDM-Deletionsmutanten handelt, bleibt offen, welche der Beobachtungen sekundäre Effekte darstellen oder welche Effekte direkt vom MDM-Komplex vermittelt werden. Ebenfalls in die Tom40- Biogenese involviert ist Mim1, das spezifisch in der Assemblierung des TOM- Komplexes wirkt: Mim1 scheint in einem Stadium nach dem SAM-Komplex an der Tom40-Assemblierung beteiligt zu sein. Proteine mit -helikalen Transmembrandomänen sind über eine oder mehrere - Helices in der mitochondrialen Außenmembran verankert: Unter diesen lassen sich die Proteine mit einer einzigen -helikalen Transmembrandomäne in drei größere topologische Gruppen gliedern: Die sogenannten C-terminal verankerten Proteine (C-tail-anchored Proteine) besitzen einen C-Terminus von maximal 30 Aminosäuren Länge und sind mittels einer -Helix im Anschluß an den C-Terminus in der Membran verankert (Borgese et al., 2003). Ihre Membranintegration erfolgt posttranslational (Kutay et al., 1995; Stefanovic und Hegde, 2007). Vertreter dieser Gruppe sind Fis1 (Shaw und Nunnari, 2002), Omp25 (Nemoto und De Camilli, 1999), die mitochondriale Form von Cytochrom b5 (D'Arrigo et al., 1993), eine Spleißvariante von VAMP-1B (Isenmann et al., 1998), Mitglieder der Bcl-2 Familie wie Bak, Bcl-XL, Mcl-1 (Cory und Adams, 2002) und Bcl-2 (Borgese et al., 2003) sowie die kleinen TOM-Proteine Tom5, Tom6 und Tom7 (Allen et al., 2002; Kassenbrock et al., 1993). Tom20, Tom70, Mcr1 und OM45 gehören zur Gruppe der sogenannten N-terminal verankerten Proteine (signal-anchored Proteine), die mittels einer N-terminalen -Helix in der Außenmembran verankert sind (Ahting et al., 2005; McBride et al., 1992; Meineke et al., 2008; Schneider et al., 1991; Setoguchi et al., 2006). Die dritte Gruppe umfasst Proteine mit internen Transmembrandomänen wie Tom22 (Lithgow et al., 1994; Moczko et al., 1997). Die polytopen Proteine besitzen dagegen mehrere -helikale Transmembrandomänen. Zu dieser Gruppe zählen Fzo1, OM14 und der Periphere Benzodiazepinrezeptor (Burri et al., 2006; Fritz et al., 2001; Otera et al., 2007). Für keine Gruppe der -helikalen Proteine der mitochondrialen Außenmembran konnte ein einheitlicher Importweg identifiziert werden. So sind zahlreiche Aspekte der Biogenese, wie beispielsweise die Membran-

29 19 Einleitung integration der verschiedenen Proteine, nach wie vor weitgehend unverstanden: Während die Insertion des polytopen Benzodiazepinrezeptors eine Abhängigkeit von Tom70 zeigt (Otera et al., 2007), ist die Membranintegration des N-terminal verankerten Proteins Mcr1 dagegen unabhängig von TOM-Komponenten (Meineke et al., 2008). Wie man am Beispiel der Biogenese des Peripheren Benzodiazepinrezeptors sieht, scheinen damit aber auch einzelne TOM-Rezeptoren unabhängig vom TOM-Komplex wirken zu können. Auch über die Membraninsertion der C-terminal verankerten Proteine herrscht nach wie vor Unklarheit: Sie scheinen über einen gemeinsamen Weg in die Membran zu inserieren, der unabhängig von zytosolischen Faktoren und TOM- oder SAM-Komponenten ist (Borgese et al., 2007; Kemper et al., 2008; Setoguchi et al., 2006). Für Cytochrom b5 und Fis1 wurde außerdem ein Einfluss des Cholesterol- beziehungsweise Ergosterolgehalts der Zielmembran auf die Insertion gefunden (Brambillasca et al., 2005; Kemper et al., 2008). Die Biogenese der -helikalen TOM-Proteine ist weit besser analysiert: Die N-terminal verankerten Proteine Tom20 und Tom70 benötigen weder SAM-Komponenten noch TOM-Rezeptoren für ihre Membraninsertion (Ahting et al., 2005; Nargang et al., 1995; Schlossmann und Neupert, 1995). Das Protein Mim1 ist der einzige beschriebene Faktor, der für ihre Membranintegration und Assemblierung benötigt wird (Becker et al., 2008a; Hulett et al., 2008; Popov-Celeketic et al., 2008) (Abb. 1.3 B). Mim1 bildet dabei Homooligomere aus, die für die Tom20-Biogenese gebraucht werden (Popov-Celeketic et al., 2008). Tom22 wird durch Tom20 und eventuell Tom70 an die Außenmembran rekrutiert (Keil und Pfanner, 1993; Nakamura et al., 2004). Neuere Ergebnisse zeigen außerdem eine Funktion von SAM-Komponenten sowohl für die Membraninsertion als auch für die Assemblierung (Stojanovski et al., 2007b) (Abb. 1.3 B). Darüber hinaus konnte in einer Deletionsmutante von Mdm10 ein Assemblierungsdefekt beobachtet werden (Meisinger et al., 2004). Es ist allerdings weitgehend unklar, ob es sich um direkte oder indirekte Interaktionen handelt. Der SAM-Komplex spielt auch eine wichtige Rolle für die Assemblierung der kleinen TOM-Proteine (Stojanovski et al., 2007b). Außerdem wurde ein Sam35-enthaltendes Assemblierungsintermediat der Tom6-Biogenese identifiziert (Becker et al., 2008a). Mit Mim1 gelang die Identifikation eines an der Insertion von Tom6 beteiligten Proteins. Für Mim1 konnte zwar keine Funktion bei der Membraninsertion der beiden