Die Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben (FLA)

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1 J Lab Med 2005;29(6): by Walter de Gruyter Berlin New York. DOI /JLM /61 Parasitologie Redaktion: K. Janitschke Die Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben (FLA) Diagnostics of Infections with free-living amoebae (FLA) Julia Walochnik und Horst Aspöck Abteilung für medizinische Parasitologie, Klinisches Institut für Hygiene und medizinische Mikrobiologie, Medizinische Universität Wien, Österreich Zusammenfassung Die Bezeichnung Freilebende Amöben (FLA) wurde ursprünglich etabliert, um diese Amöben von den parasitischen Entamöben abzutrennen. Es zeigte sich aber, dass auch einige Vertreter der FLA als Krankheitserreger beim Menschen auftreten können. Amöben der Gattung Acanthamoeba sind die Erreger der Acanthamoeba- Keratitis (AK), einer hauptsächlich bei Kontaktlinsenträgern auftretenden Entzündung der Hornhaut des Auges. Außerdem können sie, ebenso wie Balamuthia mandrillaris, vor allem bei Immunsupprimierten, Hautläsionen, Pneumonie und die Granulomatöse Amöbenenzephalitis (GAE) hervorrufen. Die zur Geißelbildung befähigte Naegleria fowleri schließlich ist der Erreger der Primären Amöbenmeningoenzephalitits (PAME). Während für die Diagnostik der AK zumeist ein mikroskopischer Nachweis mit anschließender Kultur ausreichend ist, sollte bei Infektionen des ZNS wie grundsätzlich bei systemischen Infektionen ein molekularbiologischer Nachweis angestrebt werden; hierzu stehen verschiedene PCR-Protokolle und für Infektionen mit N. fowleri zusätzlich ein kommerziell erhältlicher Antigen- Nachweis zur Verfügung. Serologische Tests sind zum Nachweis einer Acanthamoeba-Infektion nahezu ohne diagnostischen Wert, da aufgrund der Ubiquität der FLA nahezu 100% der Normalbevölkerung Antikörper haben. Bei der foudroyant verlaufenden PAME sind serologische Tests vollkommen unbrauchbar, weil wegen der kurzen Inkubationszeit zum Zeitpunkt der akuten Erkrankung (noch) keine Antikörper nachweisbar sind. *Korrespondenz: Julia Walochnik, Abteilung für medizinische Parasitologie, Klinisches Institut für Hygiene und medizinische Mikrobiologie, Medizinische Universität Wien, Kinderspitalgasse 15, 1095 Wien, Österreich Tel.: q Fax: q julia.walochnik@meduniwien.ac.at Schlüsselwörter: Acanthamoeba-Keratitis; Diagnostik; Freilebende Amöben; Granulomatöse Amöbenenzephalitis (GAE); Primäre Amöbenmeningoenzephalitits (PAME). Abstract The term free-living amoebae was originally established in order to discriminate these organisms from the obligatorily parasitic entamoebae. However, meanwhile it became apparent that several representatives of this group can cause seriously progressing infections in man. Amoebae of the genus Acanthamoeba are the causative agents of Acanthamoeba keratitis (AK), an infection of the cornea occurring predominantly in contact lens wearers. Moreover, predominantly in the immunocompromised host acanthamoebae as well as Balamuthia mandrillaris can cause skin lesions, pneumonia and granulomatous amoebic encephalitis (GAE). The amoeboflagellate Naegleria fowleri, finally, is the causative agent of the primary amoebic meningoencephalitis (PAME). While microscopical detection with subsequent culture of the organisms is usually sufficient for the diagnosis of AK, in GAE as generally in systemic infections molecularbiological methods should be preferred. Several PCR protocols and in the case of N. fowleri also a commercially available antigen test have been established. Serological tests are in the diagnostics of Acanthamoeba infections practically of no value as almost 100% of normal healthy individuals have antibodies. In Naegleria infections serological tests are entirely insignificant, as in the acute stage of the infection antibodies are not (yet) detectable due to the short incubation time. Keywords: diagnostics; free-living amoebae; granulomatous amoebic encephalitis (GAE); Acanthamoeba keratitis; primary amoebic meningoencephalitis (PAME). Einleitung Infektionen mit Freilebenden Amöben Unter dem Begriff Freilebende Amöben (FLA) wurden zunächst all jene amöboiden Organismen vereint, welche nicht obligatorisch parasitär, d.h. auf ein Leben im Wirt tatsächlich angewiesen sind. Heute wird er primär für die

2 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben 447 Tabelle 1 Infektionen mit Freilebenden Amöben: Krankheit, Erreger, Infektionsweg, Inkubationszeit, Probenmaterial und wichtigste Nachweisverfahren. Krankheit Erreger Infektionsweg Inkubationszeit Probenmaterial Nachweisverfahren Keratitis Acanthamoeba (Mikro-) Läsionen in mehrere Tage bis Cornea-Epithel, Kultur, PCR, spp. der Cornea, z.b. bei Wochen Cornea- Mikroskopie Kontaktlinsenträgern Abkratzpräparat Kontaktlinsen, Mikroskopie, Kultur Kontaktlinsen- Behälter Infektionen von Acanthamoeba kontaminiertes Wochen bis Monate Hautstanze, BAL, PCR, Kultur, Haut, Lunge und spp., Balamuthia Wasser, Luft Sputum Mikroskopie anderen mandrillaris Organen* GAE* Acanthamoeba Läsionen in der Wochen bis Monate Liquor PCR, Kultur, spp., Balamuthia Haut, Lunge (Mikroskopie) mandrillaris Hirn-Biopsat Histologie, PCR, Kultur PAME Naegleria fowleri Nasenschleimhaut, 1 15 Tage Liquor Kultur, Antigenz.B. beim Schwimmen Nachweis, PCR *fast ausschließlich bei Immunsupprimierten fakultativ pathogenen Amöben, also für Vertreter der Gattungen Acanthamoeba, Balamuthia und Naegleria verwendet. Der Terminus ist allerdings rein ökologisch zu verstehen, es kommt ihm keinerlei systematische Bedeutung zu w1x. Tatsächlich sind die FLA eine systematisch gesehen ausgesprochen heterogene Gruppe. Während die Gattungen Acanthamoeba und Balamuthia der Gruppe der Amoebozoa zugerechnet werden, jener Gruppe zu der auch die Ruhramöbe Entamoeba histolytica oder der Schleimpilz Dictyostelium discoideum gehören, werden die Naeglerien heute zu den Percolozoa gestellt und damit in den Verwandtschaftskreis der Discicristata, also jener Gruppe, zu der auch das früher als Alge angesehene Augentierchen Euglena gracilis und bekannte Krankheitserreger wie die Trypanosomen und die Leishmanien gezählt werden. Die von FLA hervorgerufenen Krankheiten lassen sich in drei Gruppen gliedern, in die durch verschiedene Vertreter der Gattung Acanthamoeba hervorgerufene Acanthamoeba-Keratitis (AK), in die FLA-Hautläsionen und -Pneumonie und in die ZNS-Infektionen, die Granulomatöse Amöbenenzephalitis (GAE) und die Primäre Amöbenmeningoenzephalitits (PAME). Während die PAME mit N. fowleri als einzigem bekannten Erreger in der Regel nach Kontakt des Nasopharynx und Epipharynx mit kontaminiertem Wasser und die Acanthamoeba-Keratitis meist posttraumatisch und assoziiert mit dem Tragen von Kontaktlinsen beide jedenfalls unabhängig vom Immunstatus des jeweiligen Patienten auftreten, kommt die GAE, verursacht durch Balamuthia mandrillaris und verschiedene Vertreter der Gattung Acanthamoeba, vor allem bei immungeschwächten Individuen vor. Hier gelangen die Erreger nicht von außen, wie bei der PAME, sondern nach Eintritt an sogenannten Primärfoci (meist Haut oder Lunge) über den Blutweg in das ZNS. Bei schwer Immunsupprimierten können auch bereits an diesen Primärfoci Entzündungen auftreten, die FLA-Hautläsionen und die FLA-Pneumonie. Infektionen mit FLA gelten als ausgesprochen selten derzeit sind weltweit rund 3000 Fälle von AK, etwa 250 Fälle von GAE (und zwar sind davon ungefähr 150 auf Akanthamöben und 100 auf Balamuthien zurückzuführen) und ebenso viele PAME Fälle dokumentiert, die Dunkelziffer ist aber gewiss sehr hoch, und es kann kein Zweifel daran bestehen, dass mit der wachsenden Anzahl der Kontaktlinsenträger einerseits und der Immunsupprimierten andererseits, diese Erkrankungen im Zunehmen begriffen sind. Schwere Verlaufsformen stehen nicht selten in Zusammenhang mit der schwierigen Diagnostik und der deshalb oft verzögerten Diagnose (Übersicht: Tabelle 1). Acanthamoeba-Keratitis (AK) Der erste dokumentierte Fall einer Acanthamoeba-Keratitis (AK) stammt aus dem Jahre 1974 w2x, aber erst Mitte der 1980er Jahre wurde die Assoziation zwischen dem Auftreten von AK und dem Tragen von weichen Kontaktlinsen offensichtlich w3x. Die AK ist eine oft schwer verlaufende Entzündung der Hornhaut des Auges. Verschiedene Vertreter der Gattung Acanthamoeba sind als Erreger beschrieben: A. castellanii, A. polyphaga, A. hatchetti, A. culbertsoni, A. rhysodes, A. lugdunensis, A. quina und A. griffini w4x, allerdings sind die tatsächliche Anzahl und die Validität der Acanthamoeba-Arten äußerst umstritten. Fest steht, dass man keine dieser Arten als grundsätzlich pathogen einstufen kann, weil jede sowohl pathogene als auch apathogene Vertreter enthält. Heute werden die Akanthamöben in 15 Sequenztypen (Genotypen) eingeteilt (T1-T15); nahezu alle Keratitis-Erreger fallen in den Sequenztyp T4, allerdings enthält dieser Sequenztyp auch zahlreiche apathogene Stämme.

3 448 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben Das Tragen von Kontaktlinsen und Mikroläsionen in der Cornea, wie sie durch das Reiben der Kontaktlinse an der Hornhautoberfläche verursacht werden können, gelten als prädisponierende Faktoren für das Zustandekommen einer AK. In den meisten Fällen gelangen die Amöben zunächst mit dem Leitungswasser, beispielsweise bei Verwendung von selbst hergestellter Kochsalzlösung, oder über die Luft in die Kontaktlinsenbehälter. Dort können sie sich bei schlechter Reinigung der Behälter ansiedeln und vermehren und gelangen dann schließlich mit der Kontaktlinse in das Auge. Insbesondere an weichen Kontaktlinsen können sich die Amöben sehr gut anheften und, da bei diesen Linsen weder manuelle Reinigung noch aggressive Reiniger eingesetzt werden dürfen, dann auch nur noch schlecht entfernt werden. Grundsätzlich kommt die AK weltweit vor, jedoch stammen die allermeisten dokumentierten Fälle aus den USA und Europa. Dies hängt nicht nur damit zusammen, dass es hier auch die meisten Kontaktlinsenträger gibt, sondern auch damit, dass in vielen anderen Ländern gar nicht auf Akanthamöben untersucht wird. Die Prävalenz der AK wird auf etwa 1,2 Fälle/ Million Einwohner und etwa 20 Fälle/ Million Kontaktlinsenträger geschätzt w5x. Auch aus dem deutschsprachigen Raum sind zahlreiche Fälle bekannt w6 8x. FLA-Hautläsionen und FLA-Pneumonie Insbesondere bei AIDS-Patienten treten, wenn Akanthamöben oder B. mandrillaris über kontaminiertes Wasser in Läsionen der Haut oder über die Luft in die Lunge gelangen, relativ häufig bereits an diesen sogenannten Primärfoci schwere Entzündungen auf, die FLA-Hautläsionen und die FLA-Pneumonie. Wenn die Amöben dann in den Blutkreislauf gelangen, kann es in der Folge zu einer Infektion des Gehirns (GAE), aber auch anderer Organe kommen. Infektionen der Bauchspeicheldrüse, des Genitale und der Niere, sowie Endophthalmitis, Osteomyelitis, Otitis und Sinusitis sind beschrieben w9x. GAE Bei der GAE handelt es sich um eine chronisch oder subakut verlaufende Entzündung des Gehirns mit einer Inkubationszeit von mehreren Wochen bis zu einigen Monaten, die in den allermeisten Fällen tödlich endet. Dass Akanthamöben beim Menschen Enzephalitis hervorrufen können, wurde erstmals 1972 von Jager und Stamm bestätigt. Inzwischen wurden A. astronyxis, A. castellanii, A. culbertsoni, A. divionensis, A. griffini, A. healyi, A. jacobsi, A. lenticulata, A. mauritaniensis, A. palestinensis, A. polyphaga, A. rhysodes, A. royreba und A. terricola als potentielle Erreger einer GAE beschrieben w9x. Aber auch hier kann grundsätzlich nicht von pathogenen oder apathogenen Arten gesprochen werden. Auch bei GAE-Fällen ist T4 der vorherrschende Sequenztyp, jedoch wurden auch Infektionen verursacht durch Akanthamöben der Genotypen T1, T10 und T12 beschrieben w10x. Seit 1990 ist bekannt, dass auch die allerdings erst später so benannte Balamuthia mandrillaris beim Menschen eine GAE hervorrufen kann. Die GAE tritt vorwiegend bei immungeschwächten Individuen auf. Als prädisponierende Faktoren gelten Organtransplantationen, Alkoholismus, Leberkrankheiten, Nieren-Fehlfunktionen, Diabetes mellitus, Splenektomie, Tuberkulose, Steroid-Behandlung, Chemotherapie bei malignen Geschwüren, Störungen der Blutbildung und AIDS. Immerhin sind aber einige Fälle von Balamuthia-GAE bei offensichtlich Immungesunden und zwar hauptsächlich bei Kindern bekannt. Die Infektion erfolgt vermutlich bei Kontakt mit kontaminiertem Wasser oder durch Einatmen von Amöben-Zysten, wobei Läsionen in der Haut bzw. der untere Respirationstrakt den Amöben als Eintrittspforte dienen. Die Amöben gelangen dann über den Blutweg in das ZNS. Die Ausbreitung der Amöben im Gehirn ist zentrifugal, d.h. sie dringen von den tieferen Schichten an die Oberfläche vor und zerstören dabei das ZNS-Gewebe. Post mortem kann oft eine Einbeziehung anderer Organe, wie Haut, Lunge, Leber, Niere, Nebenniere, Pankreas, Prostata, Lymphknoten und Myometrium festgestellt werden w9x. Grundsätzlich kommt sowohl die Acanthamoeba- als auch die Balamuthia-GAE weltweit vor, allerdings stammen auch bei der GAE die meisten dokumentierten Fälle aus den USA trat der erste Fall einer Acanthamoeba-GAE in Europa auf, und zwar in Italien bei einem AIDS-Patienten w11x, und 1998 wurde der erste europäische Fall einer Balamuthia-GAE bekannt w12x. Aus dem deutschsprachigen Raum ist bisher kein echter GAE-Fall dokumentiert, allerdings wurde in der jüngsten Vergangenheit in Deutschland ein Acanthamoeba-Stamm aus dem Liquor einer Meningitis-Patientin isoliert und in Österreich ein Fall einer systemischen Mycobacterium- Acanthamoeba-Koinfektion bekannt w13x. Primäre Amöbenmeningoenzephalitis (PAME) Die Primäre Amöbenmeningoenzephalitis (PAME) ist eine akut verlaufende Entzündung des Gehirns, die sehr häufig schon innerhalb weniger Tage zum Tod führt. Da die Erreger direkt über den Nasopharyngealtrakt das Gehirn invadieren, wurde diese Erkrankung zum Unterschied von der bei Infektionen durch E. histolytica sekundär auftretenden Amöbenenzephalitis PAME genannt. Als Erreger konnte bisher ausschließlich N. fowleri nachgewiesen werden. Ein prädisponierender Faktor für die Anfälligkeit gegenüber einer Infektion mit N. fowleri ist derzeit nicht bekannt. Die meisten dokumentierten PAME-Fälle betrafen Kinder, allerdings ist dies vermutlich vor allem auf das Badeverhalten von Kindern zurückzuführen. Die Hauptinfektionsquelle sind Schwimmbäder und warme Badeteiche. N. fowleri ist ausgesprochen thermotolerant und kommt verstärkt in warmen oder künstlich erwärmten Gewässern vor. Die Amöben gelangen beim Baden in die Nase und nach Eindringen in das olfaktorische Neuro-

4 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben 449 epithel entlang des Riechnervs direkt ins Gehirn. Die Invasion des Gehirns erfolgt zentripetal, d.h. die Amöben dringen von der Oberfläche in die tieferen Regionen des Gehirns vor. Die PAME tritt weltweit auf. Zwischen 1962 und 1965 traten in Tschechien 16 Fälle von tödlicher PAME bei Kindern, welche alle in demselben Schwimmbad gebadet hatten, auf w14x wurde der erste Fall einer PAME in Italien bekannt w15x. Auch eine PAME ist bisher im deutschsprachigen Raum nicht diagnostiziert worden. Diagnostisches Prozedere Die Diagnose der Infektionen mit FLA ergibt sich aus dem klinischen Bild einerseits und dem Nachweis der Amöben im Patientenmaterial andererseits. Da es für keine der Infektionen ein echtes pathognomonisches Profil gibt, kann in keinem Fall auf einen direkten Erregernachweis verzichtet werden. Der indirekte Erregernachweis ist bei allen Infektionen mit FLA aufgrund der Ubiquität der FLA und der sich daraus ergebenden hohen Seropositivität in der Normalbevölkerung nur von sehr geringem diagnostischem Wert. Bei der GAE ist ein serologischer Nachweis außerdem wegen der Immundefizienz der Patienten nicht sinnvoll. Wichtig ist grundsätzlich, dass das Material steril verpackt, möglichst rasch und möglichst bei Raumtemperatur in das Labor transportiert wird. Es darf auf keinen Fall tiefgefroren werden und sollte auch nicht gekühlt werden. Um eine Austrocknung zu vermeiden, sollten 1-2 Tropfen physiologischer Kochsalzlösung zugefügt werden. Dies ist insbesondere bei Verdacht auf eine PAME wichtig, da hier nur Trophozoiten im klinischen Material vorkommen und diese gegenüber Kälte und Austrocknung wesentlich empfindlicher sind als die Zysten. Da es sich bei den FLA um potentielle Krankheitserreger handelt, sollte stets mit Handschuhen (und gegebenenfalls mit Maske) gearbeitet werden und jeder Kontakt (v.a. Haut, offene Wunden etc.) mit dem Material vermieden werden. Diagnostik der AK Das klinische Bild einer AK ist nur schwer von einer bakteriellen oder einer Herpes simplex-keratitis zu unterscheiden. Sehr oft wird sogar eine anfängliche leichte Besserung nach antibakterieller, antiviraler oder antifungaler Therapie beobachtet, wodurch die tatsächliche Diagnose erschwert wird. Erste Anzeichen einer Infektion sind hohe Lichtempfindlichkeit, heftiger Tränenfluss, eine starke Rötung und schwere, meist im Vergleich zum klinischen Bild überproportionale okuläre Schmerzen. Auch ein Fremdkörpergefühl und Lidschwellungen sind sehr häufig. Die Infektion ist in vielen Fällen nur einseitig und ist durch eine diffuse Entzündung der Cornea charakterisiert. In der Spätphase der Infektion können Hornhautulcera, Perineuritis und oft auch ein Hornhaut-Ödem beobachtet werden. Charakteristisch ist ein 3608 Ringinfiltrat, welches allerdings nur in etwa 60% der Fälle auftritt w16x. Als Untersuchungsmaterial kommen hauptsächlich Hornhautgeschabsel oder unter Lokalanästhesie entnommene Hornhautepithel-Proben in Frage, da die Amöben tief im kornealen Stroma sitzen in manchen Fällen sind bis zur Descemet-Membran Zysten nachweisbar. Eine zusätzliche Untersuchung der Kontaktlinsen und des Kontaktlinsenbehälters kann die Diagnose erhärten, allerdings nicht ersetzen, da mitunter auch aus Kontaktlinsenbehältern von vollkommen asymptomatischen Kontaktlinsenträgern Amöben isoliert werden können w8x. Zumeist ist ein mikroskopischer Nachweis mit anschließender Kultur ausreichend; auch ein Immunoperoxidase-Test steht zur Verfügung w17x. Bei Material, in dem die zu erwartende Erregerdichte gering ist, sollte ein molekularbiologischer Nachweis (PCR, FISH) angestrebt werden. Grundsätzlich sollte bei einer Antibiotika-resistenten Keratitis immer, auch bei Nicht-Kontaktlinsenträgern (etwa 10 20% der AK-Fälle sind ohne Assoziation mit Kontaktlinsen), an eine AK gedacht werden. Durch Diagnose und darauf folgende Behandlung innerhalb der ersten 18 Tage nach Einsetzen der Symptome kann eine Hornhauttransplantation vermieden werden w18, 19x. Diagnostik der FLA-Hautläsionen und der FLA Pneumonie In vielen Fällen gelingt die Kultivierung der Amöben aus einer Hautbiopsie bzw. aus BAL oder Lungengewebe. Zu achten ist insbesondere bei den Hautläsionen auf etwaige Sekundärinfektionen, es sollten deshalb stets Antibiotika der Kultur zugefügt werden. Auch ein histologischer Nachweis in Gewebsschnitten (z.b. H&E- oder Calcofluor-Färbung) ist möglich, jedoch sind immunhistologische Techniken (z.b. ein indirekter Immunfluoreszenz- Test) oder Elektronenmikroskopie nötig, um B. mandrillaris eindeutig zu identifizieren. Im Gewebe sind meist Trophozoiten und Zysten nachweisbar. Bei einer Akanthamöben-Infektion kann außerdem ein molekularbiologischer Nachweis mittels PCR oder RFLP durchgeführt werden. Diagnostik der ZNS-Infektionen Grundsätzlich gibt es bei den ZNS-Infektionen keinerlei pathognomonisches Profil die Symptomatik und das klinische Bild sind durchwegs unspezifisch. Die GAE manifestiert sich in multiplen, nekrotischen Läsionen im Gehirn, wobei primär die Großhirnlappen, aber auch das Kleinhirn oder der Hirnstamm betroffen sind. Die Patienten klagen über ausgesprochen schwere Kopfschmerzen, Schwindelgefühl, Müdigkeit, Übelkeit und Appetitlosigkeit. In der Folge kann es zu hohem Fieber, Hemiparese oder auch Koma kommen. In den kleinen Gefäßen in periventrikulären Zonen können Thrombosen auftreten, außerdem ist der intrakraniale Druck oft erhöht. Zu beachten ist, dass die Balamuthia-GAE mitunter auch

5 450 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben bei Immungesunden vorkommt, während die Acanthamoeba-GAE in den allermeisten Fällen mit einer Immunsuppression assoziiert ist. Die PAME ähnelt, zumindest in der Anfangsphase, einer bakteriellen Meningitis. Nach einer Inkubationszeit von 1-7 Tagen treten die ersten Symptome auf. Der Beginn ist abrupt, mit heftigen Kopfschmerzen, Fieber, Übelkeit, Erbrechen und Entzündung der Atemwege. Andere Symptome sind Geruchs- und Geschmacksverwirrungen und Lichtempfindlichkeit. Relativ bald schon treten Lethargie, Verwirrung und Halsstarre ein. Schließlich kommt es zum Koma und nach etwa 1-14 Tagen zum Tod. Im Durchschnitt vergehen zwischen den ersten Anzeichen der Krankheit und dem Tod nicht mehr als 7 Tage. Das klinische Bild ist das einer diffusen Meningitis und einer hauptsächlich peripheren Enzephalitis. Die zerebralen Hemisphären sind meist stark geschwollen. Es kommt zu zahlreichen, örtlich begrenzten Hirnblutungen, vor allem in der Hirnrinde, mitunter sind aber auch tiefere Schichten betroffen. Außerdem werden ein erhöhter intrakranialer Druck und kardiale Probleme beobachtet. Grundsätzlich sollte eine PAME bei jeder eitrigen Meningoenzephalitis, bei der kein Bakteriennachweis erbracht werden kann, in Betracht gezogen werden. Als einzig zuverlässiges diagnostisches Mittel gilt sowohl bei der GAE als auch bei der PAME der direkte Erregernachweis. Zu beachten ist, dass Naeglerien im Gewebe keine Zysten bilden, man findet bei der PAME also ausschließlich Trophozoitenstadien, während bei der GAE typischerweise Trophozoiten und Zysten nachweisbar sind. Allerdings sind Akanthamöben und Balamuthien nur selten, und wenn, dann in sehr geringer Dichte, im Liquor zu finden w20x, außerdem kann eine Lumbalpunktion aufgrund des erhöhten intrakranialen Druckes kontraindiziert sein. Bei der GAE sitzen die Amöben hauptsächlich perivaskulär im Gewebe. Es sollte also, wenn nur Liquor als Untersuchungsmaterial zur Verfügung steht, wegen der geringen Erregerdichte grundsätzlich ein molekularbiologischer Nachweis angestrebt werden, verschiedene PCR-Protokolle sind etabliert (siehe unten). Falls Gewebsmaterial entnommen werden kann, so ist eine H&E-Färbung oder wenn möglich vorzugsweise ein Immunfluoreszenztest durchzuführen. Naeglerien lassen sich in der Regel gut aus dem Liquor isolieren. Der Liquor ist zumeist trüb und leicht hämorrhagisch, mit vermehrten Erythrozyten und Leukozyten. Darüber hinaus kann N. fowleri auch aus Hirngewebe nachgewiesen werden, vor allem aus den olfaktorischen Lappen (bei Biopsie oder Autopsie). Es stehen auch eine PCR und ein kommerziell erhältlicher Antigen-Nachweis zur Verfügung. Diagnostische Techniken Mikroskopie Im Phasenkontrast kann man mitunter schon in der Initialprobe die sehr beweglichen Trophozoiten und/ oder Flagellaten ausmachen (vorzugsweise in 200x 400x Vergrößerung). Zu beachten ist, dass Trophozoiten sehr leicht mit Makrophagen oder anderen mononukleären Zellen verwechselt werden können. Ein kreisrunder Kern mit großem zentralen Nukleolus ist charakteristisch für FLA! Vor allem zum Nachweis von Zysten und zur Untersuchung von Gewebsschnitten stehen auch verschiedene Färbungen zur Verfügung. Für die Färbung von Liquorproben oder Proben aus Kontaktlinsenbehältern sollte das Material abzentrifugiert (250 g/7 min) und das Sediment anschließend auf einen Objektträger aufgebracht werden. Eine einfache und schnelle Färbung ist die Laktophenol-Cottonblue-Färbung w21x, aber auch die Calcofluor-White-Färbung oder die Acridinorange-Färbung liefert gute Ergebnisse. Zu beachten ist, dass bei diesen Färbungen auch andere Erreger, beispielsweise Pilze, angefärbt werden, was die Diagnostik mitunter erschwert. Für histologische Schnitte ist die Haematoxylin-Eosin-Färbung sehr gut geeignet w22x und zudem in den meisten Laboratorien leicht verfügbar. Die sogenannte Warmimprägnierung (Silberfärbung) ermöglicht ein genaues Studium der Zysten-Struktur. Hierfür sollten die Amöben jedoch zuvor angezüchtet werden. Lactophenol-Cottonblue (LPCB) Das Material wird auf einem Objektträger mit einem Tropfen LPCB (20 g Phenol-Kristalle, 20 ml Milchsäure, 40 ml Glycerol, 0,05 g Cotton-Blue-Färbung und 20 ml dh 2 O) vermischt, mit einem Deckglas bedeckt und direkt mikroskopiert. Die Zystenhüllen und der Kern sind dunkelblau und gut vom hellblauen Zytoplasma unterscheidbar. Acridin-Orange Die Proben werden in 95%igem Methanol für 2 min fixiert und dann luftgetrocknet. Die Objektträger werden mit Acridin-Orange-Färbelösung (ph 4) überschichtet, für 2 min gefärbt, mit Wasser gespült und luftgetrocknet. Für das Mikroskopieren wird ein Fluoreszenz-Filter verwendet. Die Zysten erscheinen orange. Calcofluor Die Probe wird auf einen Objektträger aufgebracht und luftgetrocknet. Anschließend wird 3 min mit Methanol fixiert, kurz mit PBS abgespült, und dann werden 2-3 Tropfen Calcofluor -Weiss (z.b. Sigma) auf das Präparat aufgebracht. Nach 5 min wird mit PBS gespült und einige Sekunden mit Evans Blue gegengefärbt. Das Präparat wird mit einem nichtfluoreszierenden Einschlußmittel und einem Deckglas verschlossen und im Fluoreszenzmikroskop untersucht. In dieser Färbung erscheinen die Zysten apfelgrün und die Trophozoiten rötlich-braun. Haematoxylin-Eosin (HE) Die Gewebsprobe wird in 10%igem gepufferten Formalin fixiert, und es werden serielle Schnitte von 6 mm Dicke hergestellt. Die Schnitte werden 1 2 min in Xylen deparaffinisiert, in einer Alkoholreihe entwässert und mit dh 2 O gespült. Anschließend

6 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben 451 wird mit Haematoxylin und Eosin gefärbt, mit einem Deckglas geschlossen und im Mikroskop untersucht. Silber Die Amöbenzysten werden mit einem sterilen Wattetupfer von der Agaroberfläche geerntet, in 2 ml Amöbensaline (siehe Anhang) suspendiert und dreimal durch Zentrifugation (500 g/10 min) in Amöbensaline gewaschen. Anschließend wird ca. 20 min in 2% igem Formalin fixiert, dreimal in Amöbensaline gespült, der Überstand abgesaugt und das Pellet mit einer Impföse auf einen Objektträger aufgebracht und mit Mayers Eiweißglyzerin vermischt. Dann werden die Zysten mit Clarkes Fixativ (95% iger Alkohol und Eisessig, 9:1) 2 h auf dem Objektträger fixiert. Das Fixativ wird anschließend mit dh 2 O abgespült. Die Objektträger werden in einer Färbeküvette in eine 0,5% ige Silber-Proteinlösung und die Färbeküvette in ein 608C Wasserbad gestellt. Nach 2 h werden die Objektträger in das Reduktionsmittel (1% iges Hydrochinon in 5% igem Na 2 SO 3 ) transferiert und hier unter leichtem Schütteln einige Sekunden bis zu 5 min zur Einwirkung belassen. Die Präparate werden nach Waschen in destilliertem Wasser in einer Alkoholreihe entwässert, mit Xylol aufgehellt, eingeschlossen und im Mikroskop untersucht. Kultur Der Goldstandard für den Nachweis von FLA bleibt nach wie vor die Kultur auf Nonnutrient (NN)-Agarplatten. Es werden 90 mm 1,5%ige NN-Agarplatten hergestellt und mit nicht-mukoiden Bakterien (z.b. Escherichia coli) beschichtet, indem 100 ml einer 24h alten Bakterienkultur mit Hilfe eines Drigalskispatels gleichmäßig auf der Agaroberfläche verteilt werden. Die klinische Probe wird möglichst zentral auf die Platte aufgebracht und die Platte mit Parafilm versiegelt. Anschließend wird die Platte bei 308C inkubiert und über den Zeitraum von einer Woche täglich auf Amöben hin untersucht. Meist sind bereits nach 24h die Trophozoitenstadien der Amöben unter dem Invertmikroskop sichtbar. Alternativ können FLA auch in Zellkulturflaschen mit einer bodendeckenden Suspension von Bakterien in Amöbensaline kultiviert werden. B. mandrillaris wächst nicht auf mit Bakterien beschichteten NN-Agarplatten, sondern muss entweder auf einer Säuger-Zelllinie (z.b. Vero monkey kidney) oder in axenischen Medien (z.b. BM-3-Medium) gezüchtet werden. Die Gattung Naegleria kann durch die Fähigkeit zur Geißelbildung meist eindeutig von den anderen humanmedizinisch relevanten FLA abgegrenzt werden, und die Spezies N. fowleri ist gekennzeichnet durch ausgesprochene Thermophilie. Die Fähigkeit von N. fowleri, sich auch bei Temperaturen von über 408C, wie sie bei Fieber vorkommen, noch vermehren zu können, ist eine Grundvoraussetzung für den akuten Verlauf der PAME. Zwar konnte bei den FLA insgesamt noch kein tatsächlicher Virulenzfaktor gefunden werden, eine ganze Reihe von physiologischen Eigenschaften, wie Wachstumsrate, Thermophilie und Pathogenität im Mäuseinokulationstest können aber auf eine Pathogenität des jeweiligen Isolates hindeuten w23 26x. Subkultur Wenn die Amöben für weitere Studien benötigt werden, sollten Subkulturen angelegt werden, da sich auch mitisolierte Pilze und Ciliaten sehr gut unter den gegebenen Bedingungen vermehren und in den Amöbenkulturen störend sind. Das Umsetzen der Amöben erfolgt durch Ausschneiden eines etwa 1 cm 2 großen Agarstücks aus der Platte und Überführen dieses Stücks auf eine frische, mit E. coli beschichtete Platte, indem es dort mit der Unterseite nach oben zentral aufgebracht wird. Mit Parafilm versiegelte Plattenkulturen können über mehrere Monate bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Enflagellationstest Um das Vorhandensein eines Flagellatenstadiums (N. fowleri) zu überprüfen, wird eine 48 h alte Platten-Kultur mit 1 ml Amöbensaline überschichtet und in den darauffolgenden Stunden bis Tagen unter dem Mikroskop auf das Vorkommen von begeißelten Amöben untersucht. Meist können schon etwa 1 h nach Überflutung der Agarplatte stark bewegliche Flagellaten beobachtet werden. Temperaturtoleranz-Test Bei den ZNS-Infektionen ist im Gegensatz zur AK die Thermotoleranz der Erreger von entscheidender Bedeutung, da ja die Amöben, um das Gehirn zu befallen, zumindest bei 378C wachsen können müssen, während das menschliche Auge nur etwa 348C aufweist. Für einen Temperaturtoleranz-Test werden Parallelkulturen angelegt, bei 308C, 378C, 428C bzw. 458C bebrütet und täglich auf Amöbenwachstum hin untersucht. Mäuseinokulation Hierzu wird eine axenische Amöbenkultur durch Zentrifugation geerntet, in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und entweder intranasal oder intrazerebral inokuliert. Junge Mäuse sind grundsätzlich anfälliger gegenüber einer Infektion. Im Fall eines pathogenen Stammes tritt innerhalb weniger Tage bis zu 4 Wochen p.i. der Tod ein. Zu beachten gilt, dass Amöben in der Labor-Dauerkultur ihre Pathogenität verlieren können. Axenisierung Für etwaige weitere Untersuchungen können zusätzlich axenische Kulturen hergestellt werden. Flüssigmedien eignen sich allerdings nicht für Initialkulturen, da im klinische Material vorhandene Bakterien oder Pilze die Kulturen überwachsen. Man legt drei Parallelkulturen auf Agarplatten an und wartet die Zystenbildung ab, was normalerweise etwa 2 Wochen dauert. Die reifen Zysten werden von den Platten abgeerntet und in 3% HCl überführt. Durch Inkubation über Nacht werden die extrazellulären Bakterien abgetötet, während die Amöben-Zysten gegen 3% HCl resistent sind. Die Zysten werden abzentrifugiert

7 452 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben (500 g/7 min), in Amöbensaline gewaschen und in das jeweilige Medium (siehe Anhang) überführt. Zur Erhaltung der axenischen Kulturen wird das Medium fortwährend (bei Akanthamöben alle 4 Wochen, bei Balmuthien und Näglerien alle 2 Wochen) gewechselt und die Überstände regelmäßig in BHI (Brain-Heart-Infusion) und auf Blutagarplatten auf Bakterienfreiheit überprüft. Vorbeugend können Antibiotika (200 IU Penicillin und 200 mg/ml Streptomycin) zugesetzt werden. Falls Pilzwachstum besteht, sollte außerdem Amphotericin B beigefügt werden, allerdings -1 mg/ml, da v.a. Näglerien, etwas weniger auch Bealamuthien sensitiv gegenüber Amphotericin B sind. Molekularbiologie Verschiedene molekularbiologische Techniken stehen zum Nachweis von FLA zur Verfügung, allerdings gibt es bis heute mit Ausnahme eines ELISA zum Nachweis von N. fowleri-antigen (Indicia Biotechnology, Oullins, Frankreich) keine kommerziellen Testkits. Besonders bewährt hat sich die PCR, wobei grundsätzlich 3 Ansätze mit variierender DNA-Konzentration hergestellt werden sollten. Akanthamöben können außerdem mit einem sehr spezifischen und hochsensitiven Test, basierend auf der FISH-Technik, nachgewiesen werden w27x. Zur Unterscheidung zwischen den Naegleria-Arten können auch Verfahren zur Bestimmung der Isoenzymmuster oder RFLPs eingesetzt werden w28x. DNA-Isolierung Folgende Methode hat sich bei FLA bewährt: Die Probe wird abzentrifugiert (500 g/7 min), das Pellet in 500 ml UNSET-Lysepuffer (siehe Anhang) resuspendiert, in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, mit der aliquoten Menge an Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCI) überschichtet und 5 Stunden geschüttelt. Dann wird bei RT zentrifugiert (3000 g/10 min), die obere, wässrige Phase mit der DNA abgenommen und erneut mit PCI überschichtet. Die Extraktion wird 3-4-mal mit 15 min Inkubationszeit wiederholt, bis keine Interphase mehr sichtbar ist. Anschließend wird die DNA über Nacht in 0,3 M Natrium-Azetat und 1 ml 100% Ethanol bei y208c präzipitiert, abzentrifugiert (12000 g/30 min/48c), mit 700 ml 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in ml sterilem Wasser aufgenommen. Alternativ kann selbstverständlich auch ein käuflicher DNA-Isolierungskit verwendet werden, wodurch Zeit gespart wird, wenngleich mitunter die DNA-Ausbeute etwas geringer ist. Acanthamoeba-PCR Für die Acanthamoeba-PCR wird häufig das Primerpaar JPD1 und JPD2 w29x verwendet, welches je nach Sequenztyp ein bp langes Fragment des 18S rrna-gens amplifiziert. Die PCR wird mit 45 Zyklen (958C/1 min, 608C/1 min, 728C/2 min) durchgeführt und das Amplifikat auf einem 2% Agarosegel überprüft. Das JPD-Amplifikat eignet sich zur Sequenztypbestimmung. Alternativ kann eine einfache Multiplex-PCR w30x durchgeführt werden. Naegleria-PCR Zum Nachweis von N. fowleri steht eine hochsensitive Nested-PCR zur Verfügung, mit welcher 5 pg N. fowleri-dna oder 5 Amöben nachgewiesen werden können. Verwendet werden der Mp2Cl5for- und der Mp2Cl5rev-Primer, welche ein 166 bp langes Fragment amplifizieren, gefolgt von einem zweiten Amplifikationsschritt mit den Primern Mp2Cl5for-in und Mp2Cl5rev-in w31x, wodurch schließlich ein 110 bp langes Fragment entsteht. Das PCR-Programm besteht aus 35 Zyklen (958C/1 min, 558C/1 min, 728C/1 min). Anhang Überblick zur Morphologie der FLA Die Unterscheidung und Identifizierung von FLA erfolgt üblicherweise auf der Basis morphologischer und physiologischer Merkmale, wobei vor allem die Zystengröße und die durchschnittliche Porenzahl der Zysten sowie das Wachstumsverhalten und die Fortbewegungsgeschwindigkeit der Trophozoiten zur Differenzierung herangezogen werden. Viele der FLA haben eine Limax - artige Fortbewegung, also so wie Nacktschnecken der Gattung Limax, weshalb alle FLA früher auch unter dem Begriff Limax-Amöben zusammengefasst wurden. Man bezeichnet das Vorderende, welches von hyalinem Plasma gebildet wird, als hyaline Kappe und das Hinterende, wenn es besonders differenziert ist, als Uroid (Abbildung 1). Eines der markantesten Merkmale der Amöben ist die Ausbildung von Pseudopodien. Diese entstehen spontan an der Zelloberfläche und dienen sowohl der Nahrungsaufnahme als auch der Fortbewegung. Die Fortbewegungsgeschwindigkeit stellt bei den FLA sowohl für die Gattungs- als auch für die Artzuweisung ein differentialdiagnostisches Merkmal dar. Akanthamöben und Balamuthien bewegen sich im Allgemeinen eher langsam fort, während Näglerien in der Minute eine Strecke von mehr als der vierfachen Körperlänge zurücklegen können w32x. Abbildung 1 Schematische Darstellung einer Amöbe (modifiziert aus Walochnik & Aspöck 2002, Denisia 6, ).

8 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben 453 Abbildung 2 Acanthamoeba, Trophozoit (A) und Zysten; Gruppe I (B), Gruppe II (C) und Gruppe III (D). Messbarren: 10 mm (Orig.) (aus Walochnik & Aspöck 2002, Denisia 6, ). Allerdings können abhängig von der Osmolarität des jeweiligen Mediums sowohl die Trophozoiten als auch die Zysten der FLA in ihren morphologischen Eigenschaften stark variieren. Acanthamoeba VOLKONSKY, 1931 Akanthamöben weisen zwei verschiedene Stadien auf, ein Trophozoitenund ein Zystenstadium (Abbildung 2). Acanthamoeba- Trophozoiten sind typischerweise flach und ohne klar definierbare Gestalt. Sie sind etwa mm groß und haben an der Zelloberfläche charakteristische hyaline Fortsätze, die sogenannten Akanthopodien. Die Zysten sind doppelwandig, mit einer äußeren, gefalteten Ektozyste und einer inneren, sternförmigen, polygonalen oder runden Endozyste. An einigen Stellen trifft die Endozyste mit sogenannten Endozystenarmen auf die Ektozyste. Hier sind charakteristische Poren ausgebildet, welche mit einem Operculum verschlossen sind. Die Akanthamöben wurden von Pussard & Pons w33x aufgrund ihrer Zystenmorphologie in drei Gruppen, Gruppe I-III, unterteilt, und diese Gruppen halten, im Gegensatz zur Speziesdifferenzierung, auch modernen, molekularbiologischen Untersuchungen stand. Gruppe I ist durch sehr große Trophozoiten und Zysten ausgezeichnet. Der mittlere Durchmesser der Zysten beträgt mehr als 18 mm. Die Ektozyste ist deutlich von der Endozyste getrennt und hat eine glatte Struktur, während die Endozyste mehr oder weniger sternförmig ist. Für Vertreter der Gruppe I konnte bis jetzt noch keine Pathogenität nachgewiesen werden. Vertreter der Gruppe II, zu der die große Mehrheit aller Acanthamoeba-Isolate gehört, weisen einen Zystendurchmesser von meist weniger als 18 mm auf. Die Ektozyste ist dick oder dünn ausgebildet, zumeist aber faltig und oft weit von der Endozyste getrennt. Die Endozyste kann sternförmig, dreieckig, rund oder oval sein, bildet aber meist keine deutlichen Arme aus. Die Zysten der Gruppe III messen durchschnittlich unter 18 mm im Durchmesser, und Ektozyste und Endozyste sind meist rundlich und liegen nah beieinander. Traditionellerweise werden diesen Gruppen verschiedene, auf der Basis morphologischer Merkmale errichtete Spezies zugeordnet. Da aber gerade Akanthamöben-Zysten ausgesprochen polymorph sind die Größe der Zysten und auch die Anzahl der Zystenarme ist innerhalb eines Klons nicht konstant und da biochemische und molekularbiologische Untersuchungen diese Spezieseinteilung nicht unterstützen, wird heute meist auf eine Artbestimmung verzichtet. Zudem hat die Zuweisung zu einer der beschiebenen Arten keinerlei Aussagekraft über die Pathogenität eines Isolates, da von den meisten Arten bereits sowohl pathogene als auch apathogene Vertreter (Stämme) beschrieben wurden. Akanthamöben sind ubiquitär verbreitet und können aus geradezu jedem nur denkbaren Habitat isoliert werden. Auch apathogene Stämme können immer wieder von der nasalen Mukosa oder aus Stuhlproben isoliert werden.

9 454 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben Abbildung 3 Balamuthia, Trophozoit (A) und Zyste (B). Messbarren: 10 mm (Orig.). Balamuthia mandrillaris VISVESVARA & SCHUSTER & MARTINEZ, 1993 B. mandrillaris, die bis jetzt einzige bekannte Art dieser Gattung, verfügt über ein Trophozoiten- und ein Zystenstadium (Abbildung 3). Die Trophozoiten von B. mandrillaris sind mm lang. Sie sind in der Gestalt eher langgestreckt und verzweigt und besitzen einen Kern mit einem großen, sphärischen und stark anfärbbaren Nucleolus. In einigen Fällen kann der Kern zwei Nucleoli aufweisen, was die Balamuthien ganz eindeutig von den Akanthamöben unterscheidet. Die Zysten messen etwa 6 30 mm im Durchmesser und sind kugelförmig. Sie weisen eine granuläre Schicht unterhalb der inneren Zystenwand und eine faltige Ektozyste auf. Charakteristisch ist die Dreischichtigkeit der Zystenwand die drei Zystenwände sind allerdings nur elektronenoptisch unterscheidbar. Das Verbreitungsgebiet von B. mandrillaris ist weitgehend unbekannt, da diese Amöbe bisher nur selten aus natürlichen Habitaten isoliert werden konnte. Naegleria fowleri CARTER, 1970 Alle Näglerien weisen zusätzlich zum Trophozoiten- und Zystenstadium auch noch ein charakteristisches zweigeißeliges Flagellatenstadium auf, welches hauptsächlich der Verbreitung dient (Abbildung 4). Die amöboiden Formen der Näglerien sind immer zylindrisch und zeigen eine Länge: Breite-Verhältnis von weniger als 3. Für Näglerien charakteristisch ist das bruchsackartige Herausquellen der Pseudopodien. Abbildung 4 Naegleria, Trophozoit (A), Zyste (B) und Flagellat (C). Messbarren: 10 mm (Orig.).

10 J. Walochnik und H. Aspöck: Diagnostik von Infektionen mit freilebenden Amöben 455 Die Näglerien teilen sich, im Gegensatz zu den anderen beiden Genera, durch eine promitotische Zellteilung, außerdem haben sie im Gegensatz zu diesen scheibenförmigen Cristae in den Mitochondrien. Die Näglerien sind normalerweise einkernig, neigen aber zu einem bis mehreren überzähligen Kernen. Sowohl bei den Trophozoiten als auch bei den Zysten ist meist deutlich eine perinukleäre Schicht grober Körnchen sichtbar. Die Zysten sind rundlich bis oval und haben typischerweise zugepfropfte Poren. Obwohl die Gattung Naegleria über 20 beschriebene Arten umfasst, scheint nur N. fowleri tatsächlich humanpathogen zu sein. Für N. australiensis und N. italica konnte immerhin Mauspathogenität nachgewiesen werden. Die Trophozoiten von N. fowleri sind 12,5 25 mm groß. Die Zysten sind rund und glatt und haben einen Durchmesser von etwa 7 15 mm. Die Gattung Naegleria kommt weltweit vor, vor allem im Erdboden und im Süßwasser. Viele Vertreter und insbesondere die pathogene N. fowleri sind thermophil und lassen sich gehäuft aus künstlich erwärmten Gewässern, wie etwa Schwimmbädern oder Kühlwasserauslässen von Kraftwerken, isolieren. Nährmedien und Puffer Neffs Amöben-Saline (AS) w32x Stock (10=), je in 100 ml ddh 2 Olösen: Substanz Gramm NaCl 1,20 MgSO 4 Ø7H 2 O 0,04 CaCl 2 Ø2H 2 O 0,04 Na 2 HPO 4 1,42 KH 2 PO 4 1,36 zur Fertigstellung 10 ml jeder Lösung zu 950 ml dh 2 O geben, sterilfiltrieren PPG w32x (v.a. für Akanthamöben) Substanz Gramm Proteose-Pepton 10,0 Glukose 18,0 auf 1 L mit AS auffüllen, sterilfiltrieren Chang (SKGHEM) w34x (v.a. für Näglerien) Substanz Gramm Isoelektrisches Casein 10,0 Na 2 HPO 4 1,325 KH 2 PO 4 0,8 Glukose 2,5 Hefe 5,0 Penicillin 0,2 Streptomycin 0,2 auf 900 ml mit dh 2 O auffüllen, 100 ml foetales Kälberserum hinzufügen, ph 6,5 einstellen, sterilfiltrieren BM-3 w35x (v.a. für Balamuthien) Substanz Menge Biosate Peptone (BBL) 2,0 g Hefe-Extrakt (Difco) 2,0 Torula-Hefe (Sigma) 0,5 Hank s balanced salts, 10= (Gibco) 34,0 ml 5% Ox Liver Digest (Panmede) 100,0 MEM vitamin-mix, 100= (Sigma) 5,0 Lipid-Mix, 1000= (Sigma) 0,5 MEM nichtessentielle Aminosäuren, 100= (Sigma) 5,0 10% Glukose 5,0 Hemin (2 mg/ml) (Mann Research) 0,5 0,5% Taurin (Sigma) 5,0 zunächst Pepton und Hefe-Extrakte in 345,0 ml dh 2 O lösen und autoklavieren, anschließend andere Reagentien hinzufügen, ph auf 7,2 einstellen, sterilfiltrieren und 10% Newborn -Kälberserum (Gibco) hinzufügen UNSET-Lysepuffer w36x Substanz Menge SDS 2% NaCl 0,15 M EDTA 0,001 M Tris ph 7,5 0,1 M auf 10 ml mit dh 2 O auffüllen, 8 M Urea frisch dazugeben References 1. Aspöck H. Protozoen als Erreger von Krankheiten des Menschen: Übersicht und aktuelle Probleme in Mitteleuropa. In: Die Urtiere. Eine verborgene Welt. Linz (Österreich): Katalog OÖ Landesmuseum 1994: Nagington F, Watson PG, Playfair TJ, McGill J, Hones BR, Steele ADM. Amoebic infection of the eye. Lancet 1974;2: Moore MB, McCulley JP, Luckenbach M, Gelender H, Newton C, McDonald MB, et al. Acanthamoeba keratitis associated with soft contact lenses. Am J Ophthalmol 1985;100: Schaumberg DA, Snow KK, Dana MR. The epidemic of Acanthamoeba keratitis: where do we stand? Cornea 1998;17: Radford CF, Minassian DC, Dart JK. Acanthamoeba keratitis in England and Wales: incidence, outcome, and risk factors. Br J Ophthalmol 2002;86: Reinhard T, Schilgen G, Steinert M, Hacker J, Sundmacher R. Nummular infiltrates in Acanthamoeba keratitis. Acta Ophthalmol Scand 2003;81: Roters S, Aisenbrey S, Severin M, Konen W, Seitz HM, Krieglstein GK. Painless Acanthamoeba keratitis. Klin Monatsbl Augenheilkd 2001;218: Walochnik J, Haller-Schober E, Kolli H, Picher O, Obwaller A, Aspöck H. Discrimination between clinically relevant and nonrelevant Acanthamoeba strains isolated from contact lens-wearing keratitis patients in Austria. J Clin Microbiol 2000a;38: Martinez AJ, Visvesvara GS. Free-living, amphizoic and opportunistic amebas. Brain Pathol 1997;7: Booton GC, Visvesvara GS, Byers TJ, Kelly DJ, Fuerst PA. Identification and distribution of Acanthamoeba species

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