Research Collection. Doctoral Thesis. ETH Library. Author(s): Weber, Christoph Bruno. Publication Date: 1991

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1 Research Collection Doctoral Thesis Ermittlung der räumlichen Struktur von an Cyclophilin gebundenem Cyclosporin A mittels isotopengefilterter Protonenresonanzspektroskopie in wässriger Lösung Author(s): Weber, Christoph Bruno Publication Date: 1991 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 2?. März 1991 DISS. ETH. Nr Ermittlung der räumlichen Struktur von an Cyclophilin gebundenem Cyclosporin A mittels isotopengefilterter Protonenresonanzspektroskopie in wässriger Lösung ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE vorgelegt von Christoph Bruno Weber dipl. phil. II, Universität Zürich geboren am 2. April 1962 von Spreitenbach, AG Angenommen auf Antrag von: Prof. Dr. K. Wüthrich, Referent Prof. Dr. H. Zuber, Korreferent 1991 ETHICS ETH-BIB XX

3 Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurde das immunsuppressive zyklische Undecapeptid Cyclosporin A im Komplex mit seinem Rezeptorprotein Cyclophilin (= Peptidyl-prolyl-cwrraAW-Isomerase) mit biopysikalischen Methoden untersucht. Als Grundlage für diese Studien wurde für rekombinantes menschliches Cyclophilin eine Reinigungsprozedur entwickelt, welche reproduzierbar Cyclophilin-Präparationen ergibt, die in Bezug auf Reinheit und Stabilität den Anforderungen der Kernresonanzspektroskopie genügen. Ausgehend von der bestehenden Affinitätschromatographie wurde Cyclophilin auf dem starken Kationentauscher MonoS bei ph 6.0 chromatographiert und hernach mit tels Gelfiltration auf Sephaeryl S-100 HR nachgereinigt. Cyclophilin-Präparates beträgt mehr als 14 Monate. Im Hinblick auf spätere ausgedehnte Die Lebensdauer eines solchen NMR-Studien wurde die Stabilität von freiem und mit Cyclosporin A komplexiertem Cyclophilin gegenüber ph, Temperatur und organischen Lö sungsmitteln mit CD- und NMR-Spektroskopie untersucht. Mittels UV- und Fluoreszenz spektroskopie wurde die Titration von Cyclophilin mit Cyclosporin A beobachtet, um qualitative und quantitative Daten zur Bindungsinteraktion zu gewinnen. Die Konformation von Cyclophilin-gebundenem Cyclosporin A wurde mit isotopen-gefilterten 2D NMR-spektrospischen Methodenbestimmt. Dazu wurde vollständig N- oder C-angereichertes Cyclosporin A im Komplex mit unmarkiertem Cyclophilin in wässriger Lösung bei ph 6.0 verwendet. Mit Hilfe von heteronuklearen Halb- und Doppelhalbfiltern wurden die Protonenresonanzspektren vom Komplex vereinfacht, sodass in einer oder bei den Dimensionen nur die Protonresonanzen eines der beiden Moleküle sichtbar waren. Alle yn Protonen-, nahezu alle C- und die vier Amid- N-Resonanzen von gebundenem Cyclosporin A wurden zugeordnet. vier vicinalen ic Aus 108 intramolekularen Kernoverhausereffekten und JnNa-Kopplungskonstanten wurden Distanzeinschränkungen zwischen Cyclosporin-Protonen und Dihedralwinkeleinschränkungen abgeleitet, und mit Distanzgeo metrierechnungen, gefolgt von Energieminimierung, wurden 98 nichtidentische Strukturen von Cyclophilin-gebundenem Cyclosporin A berechnet, die mit den experimentellen Daten konsistent waren. Diese 98 Lösungen aus den Strukturberechnungen repräsentieren zusam men die Konformation von Cyclophilin-gebundenem Cyclosporin A. Sie zeichnet sich aus durch ein völliges Fehlen von Sekundärstrukturelementen und intramolekularen Wasser stoffbrucken. Diese Konformation ist nicht mit der Kristallstruktur und mit der Struktur von Cyclosporin A in Chloroform-Lösung verwandt. Aus ^H^Hj-NOESY-Spektren, welche mit heteronuklearen Halb- und Doppelhalbfiltern gemessen wurden, konnten 201 intermolekulare Kernoverhausereffekte einzelnen Cyclo sporin-protonen zugeordnet werden. Aus diesen Daten lässt sich ableiten, dass hauptsäch lich die Aminosäurereste MeLeu 9, MeLeu 10, MeVal 11, MeBmt 1, Abu 2 und Sar 3 von Cyclosporin A mit Cyclophilin in Kontakt sind. Diese Reste bilden an der Cyclosporin A- Oberfläche einen kontinuierlichen Abschnitt, der eine komplexe Topographie hat und hy-

4 drophob ist. Der Rest der Moleküloberfläche von Cyclophilin-gebundenem Cyclosporin A, welcher mutmasslich der wässrigen Umgebung ausgesetzt ist, ist relativ eben und deutlich hydrophiler.

5 Abstraet In this work the immunosuppressive cyclic undecapeptide cyclosporin A bound to its reeep tor protein cyclophilin (= peptidyl-prolyl-cw-rr-3«5-isomerase) was studied with biophysical methods. As a basis for these studies a purification procedure for recombinant human cyclophilin was developed which reproducibly yields cyclophilin preparations of suitable quality and stabil ity for the requirements of nuelear magnetic resonance spectroscopy. Starting from the es tablished affinity chromatography cyclophilin was chromatographed on the strong cation exchanger MonoS and further purified with gelfütration on Sephaeryl S-100 HR. The life time of such a cyclophilin preparation is better than 14 months. In view of later extensive NMR studies the stability of free and cyclosporin A-complexed cyclophilin towards ph, temperature and organic solvents was investigated with CD and NMR spectroscopy. The titration of cyclophilin with cyclosporin A was monitored using UV and fluorescence spectroscopy in order to obtain qualitative and quantitative data about the binding interaction. The conformation of cyclophilin-bound cyclosporin A was derived with isotope filtered 2D NMR spectroscopic methods. For this purpose, uniformly 15N- or 13C-enriched cyclosporin A in complex with unlabelled cyclophilin in aqueous Solution at ph 6.0 was used. With the aid of heteronuclear half- and double-half-filters the proton nuelear magnetic resonance spectra of the complex were simplified such that only the proton resonance lines of one of the two molecules were visible in one or both dimensions. All proton-, nearly all 13C- and the four amide-15n-resonances of cyclophilin-bound cyclosporin A were as signed. From 108 intramolecular nuelear Overhauser effects and four vicinal Jhnci cou~ pling constants distance constraints between proton pairs and dihedral angle constraints were derived, and with distance geometry calculations followed by energy minimization 98 nonidentical structures of cyclophilin-bound cyclosporin A were generated which were consistent with the experimental data. These 98 solutions of the strueture calculations to gether represent the conformation of cyclophilin-bound cyclosporin A. It is eharaeterized by the complete absenee of regulär secondary strueture and intramolecular hydrogen bonds. This conformation is not related to the structures of cyclosporin A in single crystals Chloroform Solution. and in From [ H, HJ-NOESY spectra recorded with heteronuclear half- and double-half-filters 201 intermolecular nuelear Overhauser effects could be assigned to individual cyclosporin A protons. From these data one can deduce that mainly residues MeLeu 9, MeLeu 10, Me- Val 11, MeBmt 1, Abu 2 and Sar 3 of cyclosporin A are in contact with cyclophilin. These residues make up a continuous region on the surface of cyclosporin A which has a complex topography and which is hydrophobic. The rest of the molecular surface of cyclophilinbound cyclosporin A which is presumably exposed to the aqueous and clearly more hydrophilic. environment is rather flat