TISSUE ENGINEERING EINE WICHTIGE METHODE ZUR ENTWICKLUNG ZUR UMSETZUNG DES 3R-PRINZIPS
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- Ute Fischer
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1 TISSUE ENGINEERING EINE WICHTIGE METHODE ZUR ENTWICKLUNG ZUR UMSETZUNG DES 3R-PRINZIPS 6. tierexperimentellen Fortbildung, 24. Februar, Gießen Groeber F., Rossi A., Schmid F., und Walles H.
2 Die Fraunhofer-Gesellschaft im Profil 66 Institute und selbstständige Forschungseinrichtungen Rund Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter ca. 1,9 Mrd Euro Budget Sieben Institutsverbünde IUK-Technologie Life Sciences Mikroelektronik Light & Surfaces Produktion Werkstoffe, Bauteile MATERIALS Verteidigungs- und Sicherheitsforschung VVS
3 Unsere Innovationskette von den Grundlagen bis zur industriellen Anwendung Grundlagenforschung Angewandte Forschung Industrielle Industrie Umsetzung 1 Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik IGB 2 Fraunhofer-Zentrum für Chemisch- Biotechnologische Prozesse CBP 3 4 Projektgruppe: Katalytische Verfahren für eine nachhaltige Rohstoff- und Energieversorgung auf Basis nachwachsender Rohstoffe BioCat Projektgruppe: Regenerative Technologien für die Onkologie BioEconomy Cluster
4 Tissue Engineering Nur für den klinischen Einsatz? Eine kleine Maus mit Menschen-Ohr, (1995) Cao Y, Vacanti JP, Paige KT, Upton J, Vacanti CA. Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear. Plast Reconstr Surg 1997;100: Rummel um die "Maus mit Ohr, (1995) Herz nach Maß, Ohr vom Band, (1997)
5 3D Gewebemodelle als Alternative zum Tierversuch 6a Im plantate Dermagraft 6b Testsysteme
6 3D Gewebemodelle als Alternative zum Tierversuch 6a Im plantate Dermagraft 6b Testsysteme
7 Entwicklungskosten für neue Therapeutika Munoas: Cost of development of a new drug: 1-2 Mil. $ Bernard Munoas, Lessons from 60 years of pharmaceutical innovation, Nature Reviews Drug Discovery, 8, 2009
8 Entwicklungskosten für neue Therapeutika Challenge and Opportunity on the Critical Path to new Medical Products, FDA, 2004
9 Entwicklungskosten für neue Therapeutica? Challenge and Opportunity on the Critical Path to new Medical Products, FDA, 2004
10 Alternativen zum Tierversuch Das 3R Prinzip nach Russel und Burch 1959 Replacement -Xenograft-II.jpg
11 Bausteine des Tissue Engineerings Zellen/ Zellinteraktionen Trägerstrukturen/ Biom aterialien Trägerstrukturen/ Biom aterialien Bioreaktoren
12 Zellquellen Zelllinie primäre Zellen adulte Stammzellen embryonale Stammzellen reprogrammierte Zellen (ips-zellen) Votteler M et al. Macromol Biosci 2010
13 Trägerstrukturen Welche Trägerstrukturen eignen sich künstliche Matrix biologische Matrix Welche Trägerstruktur ist für meine Zellen geeignet und muss ich sie ggf. vorher behandeln? Votteler M et al. Macromol Biosci 2010;10:
14 Bioreaktoren Physiologische Bedingungen für verschiedene Gewebe Aufprägen von verschiedenen physikalischen Reizen Druck Fluss etc. I: Elektrische Reize II: Elektromagnetische Reize III: Lösliche Faktoren IV: Zell-Zell Interaktion V: Mechanische Stimuli VI: Zell-Matrix Interaktion
15 Gewebeherstellung Zellexpansion Zellisolation 3D Hautmodell Herstellungsprozess Biops ie Keratinozy ten Fibroblas ten Tag 0 Tag 1 Tag 7 Tag 21 Kollagen + Fibroblasten Aussaat von Keratinozyten air-lift Kultur
16 In vitro Hautmodelle Vollhautmodelle Keratinozyten Keratinozyten Epidermis Fibroblasten Fibroblasten Dermis In vivo Haut In vitro Vollhautmodell
17 In vitro Hautmodelle Epidermismodelle Keratinozyten Epidermis Fibroblasten Dermis Keratinozyten In vivo Haut In vitro Epidermismodell
18 Treiber und Hemmnisse für Alternativmethoden 7. Zusatz zur Europäischen Kosmetikverordnung REACH Bessere Wissenschaft : refinement, reduction, replacement Treiber Ethische Bedenken/ Öffentliche Meinung Hemmnisse Regulatorische Barrieren Verfügbarkeit der Gewebemodelle Qualität der verfügbaren Gewebemodelle Hoher Preis für Alternativmethoden Fehlen wichtiger Komponenten
19 Treiber und Hemmnisse für Alternativmethoden 7. Zusatz zur Europäischen Kosmetikverordnung REACH Bessere Wissenschaft : refinement, reduction, replacement Treiber Ethische Bedenken/ Öffentliche Meinung Hemmnisse Regulatorische Barrieren Verfügbarkeit der Gewebemodelle Qualität der verfügbaren Gewebemodelle Hoher Preis für Alternativmethoden Fehlen wichtiger Komponenten Autom atis ierung der Produktion
20 Este Konzeption in 2007 Cell Extraction Cell Expansion Tissue Cultivation Storage Handling
21 Design Freeze in 2009
22 Ester Produktionsprototyp Gewebe Kultur Zell Expansion Zell Extraktion
23 Automatischer Prozess zur Herstellung von epidermalen Modellen Zellaussaat Entfernen des Deckels Einbringen der MTP Zellaussaat Transfer zurück auf 37 C
24 Vergleich der automatisch produzierten Modelle mit manuell generierten Max. Produktionsleistung: Modelle Zerstörungsfreie Qualitätskontrolle durch die Optical coherence tomography (OCT) Kein histologischer Unterschied zwischen automatisch produzierten Modelle und manuell generierten
25 Treiber und Hemmnisse für Alternativmethoden 7. Zusatz zur Europäischen Kosmetikverordnung REACH Bessere Wissenschaft : refinement, reduction, replacement Treiber Ethische Bedenken/ Öffentliche Meinung Hemmnisse Regulatorische Barrieren Verfügbarkeit der Gewebemodelle Qualität der verfügbaren Gewebemodelle Hoher Preis für Alternativmethoden Fehlen wichtiger Komponenten
26 Treiber und Hemmnisse für Alternativmethoden 7. Zusatz zur Europäischen Kosmetikverordnung REACH Bessere Wissenschaft : refinement, reduction, replacement Treiber Ethische Bedenken/ Öffentliche Meinung Hemmnisse Regulatorische Barrieren Verfügbarkeit der Gewebemodelle Qualität der verfügbaren Gewebemodelle Hoher Preis für Alternativmethoden Fehlen wichtiger Komponenten
27 Voraussetzungen für eine regulatorische Akzeptanz Wie erreicht man eine regulatorische Akzeptanz? ESAC Aufnahme der Testmethode in eine OECD Testrichtlinie Validation der Testmethode 27
28 Der EURL-ECVAM Validationsprozess Neue Testmethode Ähnliche Tetmethode Prävalidation Formale Validation Definierte Performancestandarts und Kriterien Me-too Validation Wissenschaftlich * validierte Testmethode * Modified: Worth and Balls (2004), ATLA 32, Supplement 1, Hartung, T. et al. (2004). ATLA 32:
29 Anwendung des Hautmodells als Testsystem Validierung von Testmethoden 20 Test Chemikalien + NK + PK Labor (Testentwickler) Lauf 1 Labor 2 Lauf 1 Labor 3 Lauf 1 Lauf 2 x22 Lauf 2 x22 Lauf 2 x22 Lauf 3 Lauf 3 Lauf 3 Einreichung bei Mind. 736 Modelle
30 Me-too Validation der automatisch produzierten Modelle In vivo Draize Test In vitro Tests on reconstructed human epidermis (RHE) Alternative Methode (OECD TG 404) (OECD TG 439) OECD. 2010/2002. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No No. 404
31 Me-too Validation der automatisch produzierten Modelle für die Abschätzung der Hautirritation A 1-bromo-4-chlorobutane methyl-thio-benzaldehyde allyl phenoxy-acetate 100 cinnamaldehyde 100 diethyl phthalate Testung nach OECD TG-439 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd heptyl butyrate hexyl salicylate isopropanol methyl stearate naphtalene acetic acid Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] B 1 st 2 nd 3 rd 1-bromohexane 1 st 2 nd 3 rd 1-decanol 1 st 2 nd 3 rd 1-methyl-3-phenyl-1- piperazine 1 st 2 nd 3 rd 2-chloromethyl-3.5-dimethyl-4- methoxypyridine HCL 1 st 2 nd 3 rd benzenethiol-5- (1.1-dimethylethyl)-2-methyl Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd cyclamen aldehyde di-n-propyl disulphide heptanal potassium hydroxide (5% aq) tetrachloroethylene Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] 50 Viability [%] st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd 1 st 2 nd 3 rd
32 Me-too Validation der automatisch produzierten Modelle für die Abschätzung der Hautirritation Ergebnisse Me-too Validation Parameter Validation FhG OECD TG- 439 Sensitivität [%] Spezifität [%] Genauigkeit [%] Reproduzierbarkeit [%] 90 90
33 Probleme bei der Validierung Auswahl der Testsubstanzen S ubs tanz GHS Kategorie (in vivo Tiers tudien) RHE in vitro Klas s ifizierung 1-Bromohexan Cat. 2 I/NI 16/30 Di-n-Dipropyl disulfide Cat. 2 I/NI 6/30 1-Bromo-4-Chlorobutan No Cat. I 0/30 *Jirova, 2007 Humane in vivo Daten *
34 Treiber und Hemmnisse für Alternativmethoden 7. Zusatz zur Europäischen Kosmetikverordnung REACH Bessere Wissenschaft : refinement, reduction, replacement Treiber Ethische Bedenken/ Öffentliche Meinung Hemmnisse Regulatorische Barrieren Verfügbarkeit der Gewebemodelle Qualität der verfügbaren Gewebemodelle Hoher Preis für Alternativmethoden Fehlen wichtiger Komponenten
35 Treiber und Hemmnisse für Alternativmethoden 7. Zusatz zur Europäischen Kosmetikverordnung REACH Bessere Wissenschaft : refinement, reduction, replacement Treiber Ethische Bedenken/ Öffentliche Meinung Hemmnisse Regulatorische Barrieren Verfügbarkeit der Gewebemodelle Qualität der verfügbaren Gewebemodelle Hoher Preis für Alternativmethoden Fehlen wichtiger Komponenten
36 Versorgung von Geweben über das Blutgefäßsystem kidney Kritische Distanz: 800 µm brain Mertsching, Biomaterials 2003; 24:
37 Das Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc) Dezellularisiertes Segment eines porcinen Jejunums Matrix aus Kollagen Typ I/III porcine jejunum acellularization porcine cells collagene scaffold Erhaltene Strukturen des Gefäßsystems Anastomose zu äußeren Fluidik möglich A V Biological vascularized scaffold (BioVaSc) vascular structures Plattformtechnologie zur Herstellung verschiedener vaskularisierter Gewebeäquivalente Linke K, Schanz J, Hansmann J, Walles T, Brunner H, Mertsching H. Engineered Liver-Like Tissue on a Capillarized Matrix for Applied Research. Tissue Eng (11):
38 Das Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc) BioVaSc besiedelt mit Endothelzellen Based on an acellular part of a porcine jejunum Scaffold of collagen I/III porcine jejunum acellularization porcine cells collagene scaffold Embedded structures of vascular system Enables connection with outer blood stream A V Biological vascularized scaffold (BioVaSc) Vitale Zellen vascular structures Previous used for the generation of a liver test system and a tracheal Nekrotische graft Zellen Linke K, Schanz J, Hansmann J, Walles T, Brunner H, Mertsching H. Engineered Liver-Like Tissue on a Capillarized Matrix for Applied Research. Tissue Eng (11):
39 Herstellung komplexer Gewebemodelle Besiedlung der BioVaSc Besiedlung der BioVaSc mit 8,0 * 10 6 Zellen Einwöchige Kultivierung unter dynamischen Bedingungen 39
40 Herstellung komplexer Gewebemodelle Gefäßäquivalent der BioVaSc nach einer Woche dynamischer Kultivierung 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Färbung. 40
41 Herstellung komplexer Gewebemodelle Besiedlung der BioVaSc A B vascularized matrix C Scaffold lumen venous pedicle arterial pedicle venous pedicle return arterial pedicle inflow mec seeded capillary tissue specific culture media + microvascular Endothelial Cells (mec) cells Schanz J, Pusch J, Hansmann J, Walles H.; Vascularised human tissue models: A new approach for the refinement of biomedical research, J Biotechnology 2010, 148(1):56-63, 2010, DOI: /j.jbiotec
42 Herstellung komplexer Gewebemodelle BioVaSc Plattform Technology OncoVaSc *EP *EP *EP *EP *WO
43 Herstellung komplexer Gewebemodelle Technische Voraussetzungen Modellierung Simulierung multi-physikalischer Prozesse Parameterabschätzung und Validierung der Ergebnisse Design und Konstruktion Testen durch biologische Teams In-House Optimierung über mehrerer Iterationen Kahlig A., Hansmann J., Groeber F., Schwarz T., Weyhmüller J., Illig A., Kleinhans C., Walles H; In silico approaches for the identification of optimal culture condition for tissue engineered bone substitutes, Current Analytical Chemistry, 9, 16-28,
44 Herstellung komplexer Gewebemodelle Technische Voraussetzungen System Analyse und Kontrolle Mathematische Untersuchung verschiedener Prozesse Entwicklung von spezifischen Steuerungs- Algorithmen System Entwicklung Flexibel und Nutzer orientiert Voll- oder Semiautomatisierung Mertsching H, Schanz J, Steger V, Schandar M, Schenk M, Hansmann J, Dally I, Friedel G, Walles T. Generation and transplantation of an outologous vascularized bioartificial human tissue. Transplantation Jul 27;88(2): Groeber F, Kahlig A, Loff, S., Walles H; Hansmann J, A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents; Biotechnology Journal Special issue "Strategies in Tissue Engineering, 8, 3, 2013, DOI: /biot
45 Herstellung komplexer Gewebemodelle Vaskularisierte Haut: SkinVaSc
46 Herstellung eines vaskularisierten Hautäuvivalentes Bioreaktorsystem Set value Actual value +/- Micro control unit Pressure sensor Peristaltic pump
47 Histologische Analyse der SkinVaSc Maßstabsbalken entsprechen 500 µm (A) und 50 µm (B-E) Hämatoxylin & Eosin (H&E) Färbung ED: Epidermis D: Dermis GL: Gefäßlumen SC: Stratum corneum SG: S. granulosum SS: S. spinosum SB: S. basale hek: Epidermale Keratinozyten hdf: Dermale Fibroblasten ddmec: Dermale Mikrovaskuläreendothelzellen : Gefäße Charakterisierung der SkinVaSc
48 Charakterisierung der Epidermale Differenzierung Im m unhis tofluores zenz Färbungen DAPI: Zellkerne ZK-14: Zytokeratin 14 ZK-10: Zytokeratin 10 Filagg.:Filaggrin Invol.: Involocrin Maßstabsbalken entsprechen 50 µm N=25 Charakterisierung der SkinVaSc
49 Charakterisierung des Gefäßsystems Immunhistofluoreszenz Färbungen DAPI: Zellkerne ZK-14: Zytokeratin 14 PECAM-1: Thrombozyten-Endothelzellen- Adhäsionsmolekül vwf.: : Gefäße * : Erythrozyten Von-Willebrand-Faktor Maßstabsbalken entsprechen 50 µm
50 Probleme bei der Validierung Reproduzierbarkeit Schmid F., Schwarz T., Schuberthan W., Klos M., Walles H., Hansmann J., Groeber F.; Automated assessment of the barrier function of in vitro epidermal models using a dual-arm robotic system; Journal of Visualized Experiments; submitted
51 6. Tierexperimentellen Fortbildung DANKE FÜR IHRE AUFMERKSAMKEIT!
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