Entwicklung eines vaskularisierten Lebermodells

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1 Entwicklung eines vaskularisierten Lebermodells Dr. Johanna Schanz Fraunhofer IGB 26. Oktober 2009

2 Zellsysteme und Tissue Engineering Biomaterialien Bioreaktorentwicklung Avaskuläre Gewebemodelle Vaskularisierte Gewebemodelle GMP Produktion von Advanced Therapeutical Medicinal Products (ATMP)

3 Funktionen der Leber Energiequelle des Körpers Biotransformation von Xenobiotika Entgiftung von Stoffwechselprodukten Bildung von Gerinnungsfaktoren Regelung des Hormongleichgewichts Beeinflussung des Immunsystems

4 Ausgangssituation Durch die Metabolisierung von Medikamenten in der Leber können Abbauprodukte entstehen, die andere Eigenschaften als der Ursprungstoff haben Hepatotoxizität ist der häufigste Grund dafür, dass Medikamente vom Markt genommen werden oder in den klinischen Studien versagen Probleme in präklinischen Bewertung von Medikamenten: Ergebnisse von Tierversuchen nicht uneingeschränkt auf den Menschen übertragbar Bisherige humane in vitro Testsysteme meist nur über Stunden oder Tage einsetzbar

5 Humane in vitro Lebermodelle/Testsysteme Humane CYP und UGT Supersomen Humane Lebermikrosomen Humanes Leber Cytosol Humane Leber S9 Fraktion Humane Leberzelllinien Transgene Zelllinien Primäre Hepatozyten Leberschnitte Isolierte perfundierte Leber Komplexität Gut für Studien von Metabolismusmechanismen Schneller Vitalitätsund Funktionsverlust der Hepatozyten Aber: Kein komplexes organoides Testsystem für Langzeitstudien

6 Mikroumgebung der Hepatozyten in vivo Optimale Versorgung durch direkte Assoziation mit Sinusoiden Co-Kultur mit nichtparenchymalen Zellen der Leber Extrazelluläre Matrix Komponenten Polarisierung/ 3D Kultur Mechanische Stimuli Siegenthaler, Blum: Klinische Pathophysiologie (2006), p. 860, Georg Thieme Verlag KG

7 Mikroumgebung der Hepatozyten in vivo Optimale Versorgung durch direkte Assoziation mit Sinusoiden Co-Kultur mit nichtparenchymalen Zellen der Leber Extrazelluläre Matrix Komponenten Polarisierung/ 3D Kultur Mechanische Stimuli Ladewigfärbung- Zellkerne braun, Plasma rosa, Bindegewebe blau

8 Perfusionsbioreaktoren Hohlfaserreaktoren (z.b. Modular Extracorporeal Liver Support MELS von der Charité Berlin) Membranreaktoren Perfundierte Trägerstrukturen Suspensionskulturen eingekapselter Zellen Optimierte Zellversorgung Verlängerung der Kultivierungszeit Weniger komplex als Blutgefäßsystem

9 Idee der Biologischen Vaskularisierten Trägerstruktur (BioVaSc) Verwendung einer natürlichen Matrix mit Blutgefäßsystem aus porcinen Jejunum für den Aufbau von vaskularisierten Gewebemodellen

10 Herstellung der BioVaSc (Biological Vascularised Scaffold) Kollagen I, III Elastin, Fibronektin Proteoglykane Perfusion mit Tensidlösung über das Gefäßsystem und durch das Darmlumen Behandlung mit DNase Spülung mit Kochsalzlösung γ - Bestrahlung

11 Histologische Überprüfung der Azellularisierung Histologische Analyse Hämalaun-Eosin und Feulgen Färbung Verifikation durch Bestimmung der Rest-DNS

12 Histologische Überprüfung der Azellularisierung Histologische Analyse Hämalaun-Eosin und Feulgen Färbung Verifikation durch Bestimmung der Rest-DNS

13 Bioreakorsystem für die Kultivierung vaskularisierter Gewebe Jan Hansmann Hugo Geiger Preis 2006 Lewa Preis 2006

14 Regelung Bioreakorsystem Bioreaktor Messkarte Drucksensor Schlauchpumpe Arterieller Druck [mmhg] Given value PC für Steuerung und Überwachung 10 Measured pressure Zeit [s]

15 Hepatozyten Aufbau des Lebermodell mit Blutgefäßsystem Primäre Zellen Biologische vaskularisierte Trägerstruktur PC-gesteuertes Bioreaktorsystem Endothelzellen Isolation + 2 D Kultur Besiedelung Dynamische 3 D Co-Kultur

16 Prinzip der vaskularisierten 3D Gewebemodelle A B vascularised matrix C Scaffold lumen venous pedicle arterial pedicle venous pedicle return arterial pedicle inflow mec seeded capillary tissue specific cells culture media + mec Fraunhofer Technik für den Menschen Preis 2009

17 Besiedelung der vaskulären Strukturen FLK-1 x100 Life-dead Färbung eines Blutgefäßquerschnittes Verifikation RT-PCR Western Blot FDG PET CD 31 Biomaterials 2005; 26:

18 Besiedelung des Darmlumens Pan Cadherin Anti-CKLP34 Anti VEGF X630 Amplification X 630 Amplification X 630 Amplification Anti-Ki67 (MIB-1) Anti-Hepatozyte Anti-ZO-1 X400 Amplification X1000 Amplification X630 Amplification

19 Funktionsnachweise Harnstoffsynthese Harnstoffsynthese Konzentration [mg/ml] 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 Medienwechsel Medienwechsel BR 2 BR 3 BR 4 Konzentration [mg/ml] 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 Medienwechsel Medienwechsel BR 12 BR 13 BR 14 BR 15 0, Zeit [d] 0, Zeit [d] Schweinemodell Humanmodell

20 Funktionsnachweise Laktatbildung Albuminsynthese 0,40 4,0 Konzentration (mg/ml) 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 Medienwechsel Medienwechsel BR 3 BR 1 BR 2 BR 5 Konzentration [µg/ml] 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Medienwechsel Medienwechsel BR 12 BR 13 BR 14 0, Zeit (d) 0, Zeit [d] Schweinemodell Humanmodell Linke K, Schanz J, Hansmann J, Walles T, Brunner H, Mertsching H: Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research - Tissue Engineering 2007; 13, 1-9

21 Stoffwechselaktivität des Lebermodells Albuminsynthese Bioreaktor Dextrorphan Dextrorphan-Glucuronidid 3-Hydroxymorphinan 10 BR BR17 Getestete Parameter: Laktatdehydrogenase Konzentration mg/ml Zeit [d] Konzentration pmol/ml Zeit [d] AST/ALT Laktatbildung Harnstoffsynthese Albuminsynthese Gallensäureproduktion VEGF Expression Dextrometorphan Metabolismus

22 Lebermodell Vaskularisierung mit Endothel ausgekleidete Blutgefäße CFDA x400 Pan-Cadherin x 1000 Physiologische Kultur Simulation des natürlichen Blutflusses Funktionalität Harnstoff, Albumin, Gallensäuren und Laktat Synthese über drei Wochen Phase I und II Metabolismus von Dextrometorphan über drei Wochen Potential Substanzapplikation über das Gefäßsystem Mehrfachapplikationen Langzeitstudien Na-Ca-ATPase

23 Ausblick Testung verschiedener relevanter Arzneimittel (z.b. Cyclosporin, Valproinsäure, Acetaminophen,? Troglitazon) und Vergleich mit Tiermodell Verlängerung der Kulturzeit Testung kryokonservierter Hepatozyten

24 Danksagung Prof. Dr. Heike Walles Dipl. Ing. (FH) Kirstin Linke Prof. Dr. Thomas Hirth Prof. Dr. Herwig Brunner Prof. Dr. Andreas Nüssler und AG Technische Universität München Dr. Martin Schenk Eberhard Karls Universität Tübingen Prof. Dr. Armin Wolf Prof. Dr. Peter End Novartis Pharma AG dem ZS Team