Allgemeine Pathologie. Definitionen Zell- und Gewebsreaktionen

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1 Allgemeine Pathologie Definitionen Zell- und Gewebsreaktionen

2 Ätiologie Def.: auslösende Faktoren, Ursachen v. Erkrankungen - Vererbte, genetisch bedingte - Erworbene - Somatische Mutationen - Umweltfaktoren: - Mangel- oder Fehlernährung, - physikalische Ursachen (Trauma, Temperatur, Strahlung), - Chemikalien, Medikamente - Infektionen: Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten - Psychogene Faktoren

3 Mutation Faktor V Leiden Häufigste genetisch bedingte Ursache für venöse Thrombosen (Blutgerinnsel) 5-7% der Normalbevölkerung Punktmutation: G1691A => Arg561Gln Veränderung der Proteinsequenz=>APC Resistenz Gerinnungsungleichgewicht=>erhöhte Thromboseneigung

4 MnlI Faktor V Leiden RFLP DNA aus Blut, PCR Restriktionsenzym erkennt durch Mutation Ansatzstelle nicht Verschiedene lange Nukleinsäuresequenzen Zusätzlich Bande in Gelelektrophorese

5 Mögliche Folgen

6 Prädisposition Vererbte genetische Veränderungen, die zu erhöhtem Erkrankungsrisiko führen: - Reduzierte Anpassungsfähigkeit gegenüber entsprechenden Pathogenen - Enzymdefekt mit vermindertem Einbau von Jod in Schilddrüsenhormon in Kombination mit Jodmangel - Reduzierte Resistenz gegenüber Erregern - Angeborene Immundefekte

7 Pathogenese Entstehung und Entwicklung einer Erkrankung Ablauf der Reaktion des Organismus auf Schädigung Dauer der Reaktion auf Schaden - Akut: Tage bis Wochen - Chronisch Ausgang - Heilung - Defektheilung - Remission - Rezidiv - Tod

8 Aufbau einer Zelle

9 Zellorganellen Endoplasmatisches Retikulum Mitochondrien Golgi-Komplex Lysosomen Peroxisomen

10 Endoplasmatisches Retikulum Kontinuierliches intrazytoplasmatisches Membransystem Rauhes (granuläres) ER - Proteinbiosynthese - Membranproduktion Glattes (agranuläres) ER - Hormonsynthese - Kohlenhydratspeicherung - Entgiftung - Calciumspeicher, Signaltransduktion

11 Plasmozytom: Basophile Färbung des Zytoplasmas-> Hinweis auf starke Proteinproduktion

12 Mitochondrien Zentrale Organellen des Energiestoffwechsels, Kraftwerk - Oxidation von KH und Fettsäuren zu H 2 O, CO 2 Innere Membran: gefaltet Äußere Membran Matrix Eigene DNA: maternal, kodiert nicht für alle mitochondrialen Enzyme Vermehrt in Zellen mit großem Energiebedarf - Muskulatur: Kontraktion - Drüsen: Pumpfunktion - HE: eosinophil, feingranuläres Zytoplasma

13 Oxyphile Zellen PathoPic

14 Vermehrung von Mitochondrien

15 Golgi-Komplex Membranöse Zisternen Besonders ausgeprägt in sekretorisch aktiven Zellen - Becherzellen Modifikation von Proteinen - Glykosylierung Targeting durch Adressierungsmoleküle

16 Lysosomen Einfache Membran Zahlreiche hydrolytische Enzyme mit saurem ph- Optimum - Nucleasen, Proteasen, Glykosidasen, Lipasen, Phosphatasen Abbau des durch Pinozytose, Phagozytose aufgenommenen Materials - z.b. Makrophagen

17 Peroxisomen Einfache Zellmembran Entstehen durch Teilung Enzyme für Fettsäureoxidation, zahlreiche katabole Funktionen Katalase Vermehrung: - Lipidsenker - Fettreiche Ernährung, Alkohol Verminderung: - Fettleber, Bakterientoxine Störungen - Biogenesestörung: Zellweger-Syndrom (Cerebro-hepatorenales Syndrom, AR)

18 Zell- und Gewebsreaktionen Adaption Zellschädigung Zelltod

19 Adaptation Reaktion auf physiologische oder pathologische Reize Vermehrte oder verminderte Belastungen Organe Zellen Zellorganellen

20 Zellschädigung Funktionsstörungen - Vorübergehende (reversible) - Permanente (irreversible) Interaktion zwischen Noxe und Zelle Störung: - Zellmembranen, Energiehaushalt, Syntheseleistungen Morphologische und funktionelle Folgen Reparatur: - Biotransformation, Phagozytose

21 Mechanismen der Zellschädigung Sauerstoffmangel (Ischämie, Hypoxie) Viren - wenn irreversibel Nekrose - Zytopathischer Effekt - Induktion einer Immunantwort - Zytoskelettschäden - Riesenzellen Chemische Substanzen und Medikamente Physikalische Faktoren Mangel an essentiellen Faktoren

22 Zelltod Irreversibles Endstadium einer Zellschädigung Folge hypoxischer, toxischer, physikalischer, immunologischer oder mikrobieller Ursachen Physiologischer Vorgang im Rahmen der Embryonalentwicklung und des normalen Gewebeumsatzes Apoptose: programmierter Zelltod Nekrose: Denaturierung (Koagulation) von Proteinen und/oder enzymatische Auflösung/Verflüssigung (Kolliquation) Autophagie: Abbau von Bestandteilen und Organellen

23 Apoptose: a) Normaler Zellverband b) Lösung der Zellverbindungen und Kondensation des Chromatins c) Fragmentierung und Pyknose des Zellkerns in der apoptotischen Zelle d) Entzündungsfreie Elimination der apoptotischen Zellteile durch Phagozytose

24 Frischer Myokardinfarkt Koagluationsnekrose a) lehmfarbene Abblassung des Myokards im Infarktgebiet und rötliches, resorptives Granulationsgewebe im Randbereich (Pfeile) b) eosinophile Nekrosen (N) des Infarkts

25 Hirninfarkt Kolliquationsnekrose: - Enzephalomalacia alba/rubra - Pseudozyste PathoPic

26 Diagnostische Techniken Immunhistochemie Immunfluoreszenz Elektronenmikroskopie

27 Immunhistochemie Lokalisation v. Epitopen (Aminosäuresequenz) gesuchter Antigene - Zellbestandteile - Zytoskelett - Zelladhäsionsmoleküle - Hormone - Rezeptoren - Erreger Detektion und Phänotypisierung von Tumoren Primärer u. sekundärer Ak, Signalverstärkung

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30 Detektionsmethoden

31 Epitope Antigene Determinanten Oftmals art- bzw. individualspezifisch Zelltypspezifische Epitope - Sehr selten CD3: Ausnahme - T-Zell Rezeptor assoziierter Proteinkomplex (4 Peptidketten) spezifisch für T-Lymphozyten Expressionsunterschiede zur Identifizierung von verschiedenen Zelltypen

32 CD 3

33 CD71 mrna Expression - Verteilungsmuster Transferrin Rezeptor Zahlreich an der Zellmembran eisenverwendender Zellen Expression in jeder Zelle je nach Bedarf

34 CD 71 Vorstufen der Erythropoese

35 CD34 Marker für hämatopoetische Vorstufen (Stammzellmarker) Endothelmarker

36 CD34

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38 Mammakarzinom: HER2 +++

39 Welcher Antikörper? Gute Quellen? - Kataloge - Internet (zb NordiQC) - Firmenvertreter - Mundpropaganda/Erfahrung Aussagen über Verwendbarkeit zu unterschiedlichen Zwecken - Immunoblot, Gefriermaterial, Paraffinmaterial etc. Oft nur sehr bedingt zu verwenden

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41 Polyklonale (vs. monoklonale) Antikörper Vorteile - Erkennen mehrere Epitope - Weniger anfällig auf Fixierungsunterschiede, ph - Meist billiger Nachteile - Häufiger unspezifische Reaktionen - Begrenzte Reproduzierbarkeit - Begrenzte Liefermöglichkeit - Oft nicht aufgereinigt (Gelfiltration), häufiger Hintergrund - Ascitesflüssigkeit: hoher Anteil an unspezifischen Proteinen

42 IHC Durchführung, Interpretation Gewebeasservierung Gewebeaufarbeitung - Tissue arrays IHC Durchführung, Detektionsmethoden - Pitfalls, Qualitätskontrollen - Geräte, Automatisation Reaktionsmuster Spezielle Anwendungen

43 Zu wenig Formalin Empfehlung 1:10

44 Resultat Dickdarmschleimhaut

45 Gute Fixierung

46 Gewebeaufarbeitung Einer der entscheidensten Schritte der IHC Fixierung Antigen/Target retrieval - Proteincrosslinking durch Formalinfixierung - Enzyme, Hitze, Buffer Gefrierschnitte - Schlechtere Qualität der Morphologie - Höherer Aufwand - Teure Aufbewahrung - Für einige Epitope trotzdem notwendig

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51 Gewebe-Mikroarray Vorteile: - Mehrere hundert Gewebeproben in einem Paraffinblock - Gute Vergleichbarkeit in technischer Hinsicht - Geringere Kosten für IHC Nachteile: - Hoher Aufwand in der Herstellung - Wesentlich kleinerer Gewebsausschnitt zur Beurteilung

52 Gewebe Mikroarray Gewebe-Mikroarray

53 Gewebe-Mikroarray

54 Gewebe-Mikroarray

55 Antigen Demaskierung (antigen retrieval) Hitzeverfahren - Mikrowelle: 20-30min - Druckkochtopf - Citratpuffer ph TRIS-EDTA ph 9.0 Proteolytischer Verdau - Proteinase K, Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Pronase etc. Kombinationsverfahren Hexenzauber

56 IHC Durchführung Blockieren AK Bindung Waschen Visualisierung der Immunreaktion

57 Visualisierung der AG-AK Reaktion Enzym Farbstoffumsetzung - Peroxidase (1966) - Alkalische Phosphatase (1978) Fluoreszenzfarbstoff Colloidales Gold Radioaktive Markierung

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59 Häufige Fehler Fixierung Schnittqualität - Dicke, Falten etc. Unzureichende oder zu aggressive Antigendemaskierung Antrocknen während der Immunreaktion Zeitdauer der Inkubation Unzureichende Hemmung endogener Enzyme - Peroxidase, alkalische Phosphatase etc. Substratlösungen zu alt

60 Unzureichende Fixierung Knochenmark IG Leichtkette kappa

61 Zu intensive Mikrowellenbehandlung

62 Unzureichende Enzymhemmung Knochenmark

63 Substrat zu alt Knochenmark

64 CD 66

65 Automatisierung Vorteile - Hoher Durchsatz - Arbeitsersparnis - Konstante Qualität - Exaktes Einhalten der Inkubationszeiten - Reproduzierbarkeit - Horizontal vs. vertikal Nachteile - Kosten - Keine individuelle Behandlung von Schnittpräparaten und Antikörpern - Kein manueller Stopp der Farbreaktion

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68 Reaktionsmuster Nukleär Zytoplasmatisch Membranständig Golgi Endoplasmatisches Retikulum Kombinationen

69 Nukleäres Reaktionsmuster Ki-67 (MIB-1) Proliferation

70 Endoplasmatisches Retikulum RPS6K Ribosomal protein S6 kinase

71 Membranständig Her2 Wachstums -faktorrezeptor

72 Membran und Golgi CD30 TNFR Familie Induktion von Apoptose via CD95/CD95L

73 Verteilungsmuster (CD10) Lymphknoten CD10 Marker für Keimzentrumszellen Leber

74 CRTH2 (Prostaglandinrezeptor) braun; EPX (Eosinophile) rot

75 Immunfluoreszenz UV Licht Fluoreszenz-markierte Antikörper Direkt/indirekte Methoden Sensitiver, teurer Co-Lokalisation unterschiedlicher Ag - Hohe Auflösung notwendig - Geeignete Farbkombinationen in der Visualisierung - IHC, Immunfluoreszenz Bsp: Autoimmunerkrankungen (Niere, Haut)

76 Leber CK Co-lokalisation Keratin 18

77 Leber CK Co-lokalisation Caspase 3

78 Leber CK Co-lokalisation

79 Bad things looking pretty CCC cell line CK 8/18, CK 7 D. Pabst

80 Elektronenmikroskopie x (Lichtmikroskopie bis 1000x) Ultrastruktur von Zellen Transmissions-EM: - 2D schwarz-weiß Bild - Gewebe gibt Elektronen ab (hell) od lenkt sie ab (dunkel) Scanning EM - 3D schwarz-weiß Bild - Elektronenstrahl über Gewebsoberfläche, sek. Elektronenabgabe - Niedrigere Auflösung, Forschung

81 Elektronenmikroskopie Technik Glutaraldehyd u/o Paraformaldehyd Fixierung Osmiumtetroxid Nachfixierung Kunststoffeinbettung (Epon, Lowicryl) Schnittdicke 60-80nm (Diamantmesser) Kontrastierung: Uranylacetat, Bleicitrat

82 Elektronenmikroskopie Anwendungen Zellorganellen - Mitochondrien, Peroxisomen, Endoplasmatisches Retikulum, Golgi, Lysosomen Zellmembranen, -verbindungen Zytoskelett Einschlusskörper Anwendungsbeispiele: - Biopsien von Niere, Haut, Herz, Nerven, Muskel - (Lysosomale) Speichererkrankungen - Erreger: Viren

83 Gattuso, Diff. Diagn. Surg. Path.

84 Vermehrung von Mitochondrien

85 Kristalline Einschlüsse in Mitochondrien

86 Viruseinschlußkörper (Zellkern)