Immunreaktion im Kalb auf das rekombinante Major Sperm Protein von Dictyocaulus viviparus als Glutathion-S-Transferase Fusionsprotein

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1 Aus dem Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover Immunreaktion im Kalb auf das rekombinante Major Sperm Protein von Dictyocaulus viviparus als Glutathion-S-Transferase Fusionsprotein INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Christian von Holtum aus Krefeld Hannover 2006

2 Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna 1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. G. von Samson-Himmelstjerna 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. T. Blaha Tag der mündlichen Prüfung:

3 meiner Familie

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5 Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt: C. von Holtum, G. von Samson-Himmelstjerna, T. Schnieder (2005) Diagnostik der bovinen Dictyokaulose-ELISA auf der Grundlage eines rekombinanten Major Sperm Proteins DVG-Tagung Veterinärparasitologie: Diagnostik, Epidemiologie und Bekämpfung von Parasitosen bei Nutz-, Haus- und Heimtieren Potsdam, T. Schnieder, G. von Samson-Himmelstjerna, C. Strube, C. von Holtum (2005) Immunization of cattle with recombinant Major Sperm Protein (MSP) against Dictyocaulus viviparus Molecular and cellular biology of helminth parasites Hydra, Griechenland,

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7 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Schrifttum Die Dictyokaulose des Rindes Erreger Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung Biologie und Entwicklungszyklus Klinik und Pathogenese Immunität Diagnose Bekämpfung Weidetechnik Biologische Bekämpfung Anthelminthika Immunisierung Immunisierungsversuche gegen Helminthen Adjuvantien partikuläre Adjuvantien nicht partikuläre Adjuvantien Immunisierungsversuche mit nativen/rekombinanten Proteinen Trematoden und Zestoden Nematoden Dictyocaulus viviparus Das Major Sperm Protein (MSP) MSP-Domänen Proteine (MDPs) Vorkommen Funktionen Spermienmotilität Oozytenreifung und Ovulation Material und Methoden Puffer und Lösungen Medien und Platten Reagentien, Enzyme, Reaktionsgefäße, Reaktionskits und Geräte Bakterien und Vektoren Versuchsplan Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) Primer Reaktionsbedingungen und Reaktionsansätze PCR-Temperaturprofile PCR-Ansätze Darstellung von Nukleinsäuren durch Agarosegel-Elektrophorese... 64

8 3.8 Klonierung von PCR-Amplifikaten Isolierung von PCR-Amplifikaten aus Agarosegelen Klonierungsvektor Ligation Transformation Klonierung in Expressionsvektoren Expressionsvektoren Restriktionsenzymverdau Ligation Transformation Plasmidpräparation und Darstellung der Inserts Plasmidpräparation mittels Miniprep Plasmidpräparation mittels Midiprep Kontrolle und Darstellung der Inserts Restriktionsenzymverdau Polymerase-Kettenreaktion Sequenzierung der Inserts und Sequenzidentitätsvergleich Proteinexpression Small-scale-Expression der rekombinanten Proteine Large-scale-Expession der rekombinanten Proteine Aufreinigung der rekombinanten Proteine Lyse der Zellen Aufreinigung über MagneGST -Partikel Aufreinigung über Glutathione Sepharose High Performance Schneiden des Fusionsproteins mittels Thrombin Darstellung der Proteine SDS-PAGE Färbung der Proteine mittels Coomassie Blue Färbung des Proteins mittels des Lumio Green Detection Kits Western Blot Elektro-Elution des geschnittenen MSP Identifizierung des rekombinanten Major Sperm Proteins Quantifizierung des Major Sperm Proteins Messung der Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay Messung der Konzentration mittels Agilent Bioanalyzer Immunisierungsversuche Versuchstiere und Haltungsbedingungen Impfstoffe Lungenwurm-Stammhaltung Impfschema und Untersuchungsplan Klinische und pathologische Auswertung der Vakzinierungsversuche Klinische Untersuchungen Pathologische Untersuchungen... 92

9 3.20 Labordiagnostische Auswertung der Vakzinierungsversuche Differentialblutbild Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Vorversuche ELISA auf der Grundlage des rekombinanten Fusionsproteins ELISA auf der Grundlage des geschnittenen MSP und der GST Ceditest Lungworm Western Blot mit nativem Lungenwurmantigen Parasitologische Auswertung der Vakzinierungsversuche Bestimmung der Larvenzahlen Bestimmung der Anzahl und des Geschlechts der adulten Würmer Messung der Wurmlänge und breite Validierung eines ELISAs zur Diagnostik einer Lungenwurminfektion Quantitative Real-time PCR Probenmaterial Adulte Lungenwürmer Larvenstadien Isolierung der Gesamt-RNA Bestimmung von Quantität und Reinheit der isolierten RNA Synthese der Erststrang-cDNA Quantitative Real-time PCR mittels TaqMan -Sonden Absolute Quantifizierung Relative Quantifizierung Statistische Auswertung Ergebnisse Amplifikation und Klonierung Amplifikate aus cdna und genomischer DNA Klonierung in pcr4 -TOPO (INVITROGEN) Klonierung in Expressionsvektoren Proteinexpression Small-scale-Expression Aufreinigung und Darstellung der GST-Fusionsproteine Darstellung des Lumio -Fusionsproteins Large-scale-Expression Aufreinigung Thrombinverdau und Elektro-Elution des geschnittenen MSP Identifizierung und Quantifizierung des MSP und der GST Immunisierungsversuche Stammhaltung Klinik und Pathologie Labordiagnostische Auswertung Differentialblutbild ELISA auf der Grundlage des rekombinanten Fusionsproteins ELISA auf der Grundlage des MSP und der GST Ceditest Lungworm Western Blot mit nativem Lungenwurmantigen Parasitologische Auswertung Larvenausscheidung Bestimmung der Anzahl und des Geschlechts der adulten Würmer Messung der Würmer

10 4.4 Validierung des ELISA Quantitative Real-time PCR Gesamt-RNA-Isolierung und Synthese der Erststrang-cDNA Quantitative Real-time PCR mittels TaqMan-Sonden Absolute Quantifizierung Relative Quantifizierung Diskussion Major Sperm Protein Immunisierungsversuche humorale und zelluläre Immunantwort Einfluss der Adjuvantien auf die Effizienz einer Vakzine Einfluss des rekombinanten Antigens auf die Effizienz einer Vakzine Klinik und Pathologie ELISA quantitative Real-time PCR zusammenfassende Beurteilung und Ausblick Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Alignment der genomischen DNA Aminosäure-Alignments Aminosäure-Alignment der translatierten genomischen DNA-Sequenzen Aminosäure-Alignment der translatierten cdna-sequenzen cdna-alignment Körpergewichte der Rinder (kg) Leukozyten (G/l) absolute Anzahl eosinophiler Granulozyten (G/l) relative Anzahl eosinophiler Granulozyten (%) Anzahl und Geschlecht der adulten Lungenwürmer, Larven pro weiblichem Wurm und Geschlechtsverhältnis Wurmgrößen positive Seren (Index) negative Seren (Index) potentiell kreuzreaktive Seren (Index) Konzentrationen und Reinheiten der isolierten Gesamt-RNA Abkürzungsverzeichnis Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

11 Einleitung 11 1 Einleitung Der Lungenwurm Dictyocaulus viviparus ist innerhalb der gemäßigten Klimazonen einer der wirtschaftlich bedeutsamsten Parasiten in der Weidehaltung von Rindern. Als Auslöser der parasitären Bronchopneumonie kann er zu Krankheitserscheinungen unterschiedlichen Grades und in schweren Fällen zum Tod der Tiere führen. Zur Bekämpfung einer Lungenwurminfektion dienen weidetechnische Maßnahmen und Anthelminthika sowie eine aus röntgenattenuierten Larven bestehende Lebendvakzine, die aber in Deutschland vom Markt genommen worden ist. Mit diesem Impfstoff kann eine belastbare Immunität der Rinder über einige Monate hervorgerufen werden. Allerdings ist diese Form der Vakzinierung mit verschiedenen Nachteilen verbunden, wie den relativ hohen Produktionskosten und einer begrenzten Haltbarkeit. Des Weiteren müssen zur Gewinnung der Larven Spendertiere zur Verfügung stehen. Aufgrund der Möglichkeit, rekombinante Antigene in großer Menge und hoher Reinheit herzustellen, kann der Einsatz dieser biotechnologisch produzierten Proteine als Vakzine bei entsprechender Effizienz an Stelle der bisherigen Immunisierungsmöglichkeit treten. Die Diagnose einer Dictyocaulus-Infektion erfolgt sowohl parasitologisch mittels Kotuntersuchungen als auch mit Hilfe serologischer Methoden wie dem ELISA. Kommerzielle Nachweisverfahren in Form von ELISAs dienen besonders zur Herdendiagnostik und beruhen bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt auf nativen Antigenen, die aus Lungenwürmern isoliert werden. Die Verwendung rekombinanter Proteine kann auch in diesem Fall die aufwändige, mit der Haltung und der Sektion von Spendertieren einhergehende Gewinnung von Antigenmaterial ersetzen. Die geschlechts- und stadienspezifische Expression von Proteinen konnte bei Helminthen mehrfach nachgewiesen werden. Eines dieser Proteine ist das Major Sperm Protein (MSP), dessen mrna auschließlich in männlichen Nematoden und in schon geschlechtlich differenzierten, männlichen Larvenstadien gefunden werden konnte.

12 Einleitung 12 Im Rahmen dieser Arbeit wird die Expression, Identifikation und Aufreinigung eines rekombinanten MSP von D. viviparus beschrieben. In anschließenden Immunisierungsversuchen an Rindern wurde das immunogene Potential dieses Proteins in Verbindung mit unterschiedlichen Adjuvantien getestet. Der Einsatz des MSP erfolgte dabei als einzelnes Protein oder aber in Kombination mit anderen rekombinanten Proteinen. Eine Belastungsinfektion der Tiere mit Lungenwurmlarven diente schließlich zur Überprüfung einer eventuellen protektiven Wirkung der Impfstoffe. Ein weiteres Ziel war die Entwicklung und Validierung eines auf dem rekombinanten MSP basierenden ELISA zur Diagnose von Lungenwurminfektionen. Zudem konnten Unterschiede in der Transkription des MSP in verschiedenen Larvenstadien und in männlichen und weiblichen adulten D. viviparus dargestellt werden.

13 Schrifttum 13 2 Schrifttum 2.1 Die Dictyokaulose des Rindes Erreger Der 1782 erstmals von Bloch beschriebene große Lungenwurm des Rindes, Dictyocaulus viviparus, ist als Nematode in der Ordnung Rhabditina der Familie Trichostrongylidae mit der Unterfamilie Dictyocaulinae zuzuordnen. Er parasitiert als adulter Wurm in den Bronchien und der Trachea von Rindern und einigen Wildwiederkäuern und ist der Verursacher der parasitären Bronchopneumonie (ENIGK u. HILDEBRANDT 1969; PRESIDENTE et al. 1972; PRESIDENTE u. KNAPP 1973; SCHNIEDER 2006). Neben D. viviparus gehören als weitere Arten D. filaria, D. arnfieldi, D. eckerti und D. capreolus der Unterfamilie Dictyocaulinae an, wobei diese ein jeweils anderes Wirtsspektrum besitzen. Auf die kleinen Wiederkäuer als Wirte beschränkt ist D. filaria, während D. arnfieldi bei Pferd und Esel beschrieben wurde (GOTHE 1983; GOTHE u. KANDELS 1984; HASSLINGER 1989). D. eckerti wurde bei einer größeren Anzahl an Wildwiederkäuerarten aufgefunden, demgegenüber konnte D. capreolus erst kürzlich ausschließlich bei Elchen und Rotwild nachgewiesen werden (DIVINA et al. 2002; ENIGK u. HILDEBRANDT 1969; HÖGLUND et al. 1999; HÖGLUND et al. 2003b). Die Bestätigung der beiden letztgenannten Spezies als eigenständige Arten gelang durch die Etablierung molekularbiologischer Methoden (EPE et al. 1997; GIBBONS u. HÖGLUND 2002; HÖGLUND et al. 1999; SCHNIEDER et al. 1996a; VON SAMSON-HIMMELSTJERNA et al. 1997) Lungenwurmspezies, die bei mehreren Wirtstierarten vorkommen können, zeigen eine unterschiedlich ausgeprägte Anpassungsfähigkeit an ihre Wirte. Die Ausbildung einer patenten Infektion durch D. arnfieldi findet häufiger beim Esel als beim Pferd statt (HASSLINGER 1989; URQUHART et al. 1996), ebenso ist das Rind empfänglicher für D. viviparus als Wildwiederkäuer (KUTZER 1988).

14 Schrifttum Verbreitung und wirtschaftliche Bedeutung Dictyocaulus viviparus ist ein weltweit verbreiteter Nematode, der in Regionen mit Rinderhaltung und zumindest periodisch auftretenden gemäßigten Temperaturen von C zu finden ist (SCHNIEDER 2006). In Österreich konnte eine endemische Durchseuchung feuchter Weiden entlang von Flussläufen festgestellt werden. Über 1200 Meter hoch gelegene Weiden dagegen wiesen einen geringen Befall mit Lungenwurmlarven auf (PFEIFFER 1971). In Schweden wurde in den Jahren 1997 und 1998 bei einer Untersuchung von 15 ökologisch betriebenen Milchviehbeständen bei 5 bzw. 9 Betrieben serologisch eine Lungenwurminfektion bei mindestens einem Tier der Herde nachgewiesen, wobei nur in zwei Beständen klinische Symptome einer Dictyokaulose beobachtet wurden (HÖGLUND et al. 2001). Nachfolgende serologische Studien in Schweden zeigten eine Prävalenz von ca. 40 % bei erstsömmrigen Rindern, die unabhängig von der geographischen Region und vom Management der Betriebe war. Allerdings wurde hier im Gegensatz zu der 2001 durchgeführten Erhebung bei keinem der untersuchten ökologisch gehaltenen Tiere eine Infektion mit D. viviparus diagnostiziert (HÖGLUND et al. 2004). In den Niederlanden entsprach die Seroprävalenz bei ein- und zweijährigen Rindern mit etwa 40 % der in Schweden bestimmten (PLOEGER et al. 2000), im Jahr 1992 konnte sogar eine Prävalenz von 77 % ermittelt werden (EYSKER et al. 1994). Bei Untersuchungen an 121 Rindern, die im Verlauf eines Jahres an einem Schlachthof in Belgien durchgeführt wurden, fanden sich bei 7 % der Tiere Antikörper gegen Lungenwürmer (AGNEESSENS et al. 2000). In Niedersachsen erwiesen sich 103 von 258 beprobten Herden als serologisch positiv, was einer Prävalenz von knapp 40 % entsprach (SCHNIEDER et al. 1993). Der nach der Schlachtung von 15 Bullen eines Betriebes in Schleswig-Holstein vorgenommene Nachweis adulter Helminthen ergab bei 73 % der Tiere eine Infektion mit D. viviparus (REHBEIN et al. 2003). Aus England und Wales wurde seit 1993 ein vermehrtes Auftreten von Dictyokaulose gemeldet, wobei im Jahr 1997 mit über 500 Fällen einer Herdenerkrankung ein vorläufiger Höhepunkt erreicht wurde. Hierbei waren vorwiegend adulte Kühe und nicht erstsömmrige Rinder betroffen (DAVID 1993; MCKEAND 2000).

15 Schrifttum 15 Ein Fallbericht aus Australien beschrieb erstmals den Ausbruch von parasitärer Bronchopneumonie in der tropischen Klimazone in Nord-Queensland (TOWNSEND et al. 1992). Hier kam es in einer Herde von über 1200 Rindern innerhalb eines Monats zu 48 Todesfällen infolge einer Lungenwurminfektion. Von den verbliebenen 1190 Tieren zeigten ca. 25 % klinische Symptome. Der wirtschaftliche Schaden eines Betriebes mit 100 Milchkühen, in welchem eine Dictyokaulose mit mildem Verlauf auftritt, wurde Ende der neunziger Jahre in Großbritannien mit ca bis 6000 angegeben. Bei erschwerten Krankheitssymptomen innerhalb einer Herde steigerte sich der Ausfall nach Hochrechnungen auf ca (WOOLLEY 1997) Biologie und Entwicklungszyklus Der Entwicklungszyklus von D. viviparus ist homoxen. Die in den größeren Bronchialgefäßen lebenden adulten Weibchen legen embryonierte Eier ab, die über das Flimmerepithel der Trachea in den Kehlkopfbereich transportiert werden. Während ein kleiner Teil der Eier oder der schon geschlüpften Larven ausgehustet werden kann, wird die größere Menge abgeschluckt. Über die Passage des Magen-Darmtrakts gelangen die dann geschlüpften Larven mit dem Kot der Rinder in die Außenwelt (SCHNIEDER 2006; TAYLOR 1951; URQUHART et al. 1996). Hier wird die Entwicklung der mit dem Kot ausgeschiedenen ersten Larven (L 1 ) in die dritten, für das Rind infektiösen Larven (L 3 ) vollzogen. Die unbescheideten L 1 können sich bei günstigen klimatischen Voraussetzungen innerhalb von fünf Tagen in zweifach bescheidete L 3 entwickeln, wobei die Scheiden aus den nicht abgestreiften Kutikula der vorangegangenen Häutungen bestehen (SCHNIEDER 2006; TAYLOR 1951; URQUHART et al. 1996). Über die gesamte Zeitdauer außerhalb des Wirtstieres wird von den bescheideten Larven keine Nahrung zu sich genommen, der Stoffwechsel wird über die in Granula eingeschlossenen Energiereserven der L 1 betrieben (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; TAYLOR 1951; URQUHART et al. 1996). Da Rinder nicht in unmittelbarer Nähe der Kothaufen weiden, müssen sich die infektiösen L 3 von diesen fortbewegen, wobei sie aufgrund ihres mangelnden aktiven Wanderungsvermögens auf passive Translokation angewiesen sind. Diese kann entweder über die Verbreitung des Kotes durch Vögel, Käfer oder Wild erfolgen, oder aber durch koprophile Pilze der Gattung Pilobolus (DONCASTER 1981; JORGENSEN et al. 1982; SCHNIEDER et

16 Schrifttum 16 al. 1989). Diese keimen erst nach Passage des Darmes von Herbivoren aus. In die sich entwickelnden Sporangien dringen die L 3 von basal ein und werden durch das explosive Aufplatzen der reifen Fruchtkörper mehrere Dezimeter vom Kothaufen weggeschleudert (DONCASTER 1981). Nach oraler Aufnahme der Larven werden diese im Dünndarm der Wirte durch Gallenflüssigkeit aktiviert (JORGENSEN 1973) und dringen unter Verlust der Scheiden durch die Schleimhaut. Über die Lymphe erreichen sie die Mesenteriallymphknoten, in denen sich die L 3 durch Häutung in vierte Larven umwandeln (JARRETT et al. 1957; SOLIMAN 1953). Über den Ductus thoracicus und die Vena cava cranialis gelangen die Larven in die rechte Herzkammer, von der sie über die Arteria pulmonalis in die Kapillargebiete der Lunge geschwemmt werden. Nach Überwinden der arterio-alveolären Schranke findet in den Alveolen eine letzte Häutung zu geschlechtlich differenzierten, präadulten fünften Larven statt. Diese sind ungefähr eine Woche post infectionem (p.i.) in den Bronchioli und Bronchien zu finden, in denen sie in den folgenden zwei bis drei Wochen zu geschlechtsreifen Würmern heranreifen (TAYLOR 1951). Diese besitzen als weibliche Würmer eine Länge von bis zu 8 cm, wohingegen männliche Würmer mit 3-5 cm meistens deutlich kleiner sind (PFEIFFER u. SUPPERER 1980; SCHNIEDER 2006). Die Präpatenz beträgt Tage, während die Patenz eine maximale Dauer von zwei Monaten einnehmen kann (JARRETT et al. 1957; SCHNIEDER 2006; URQUHART et al. 1996). Werden in der Außenwelt befindliche dritte Larven von D. viviparus Temperaturen unter 8 C ausgesetzt, wird die Entwicklung zum geschlechtsreifen Wurm im Wirtstier vorübergehend im frühen präadulten Stadium unterbrochen (BARTH u. PRESTON 1987; PFEIFFER 1976). Dieses auch von anderen Nematoden bekannte Phänomen wird als Hypobiose bezeichnet und dient zur Überwinterung der Larven bzw. Präadulten. Eine weitere Möglichkeit zur Fortsetzung des Infektionsgeschehens über mehrere Jahre besteht in der Überwinterung von Larven auf der Weide, wie sie mehmals unter geeigneten klimatischen Bedingungen nachgewiesen werden konnte (JARRETT et al. 1955; PFEIFFER u. SUPPERER 1980; SCHNIEDER et al. 1989).

17 Schrifttum Klinik und Pathogenese URQUHART et al. (1996) teilen den Krankheitsverlauf der Dictyokaulose in vier Phasen ein. Diese Gliederung beinhaltet zu Beginn der Erkrankung eine Penetrationsphase, an die sich die Phasen der Präpatenz, Patenz und Postpatenz mit unterschiedlichen klinischen und pathologischen Befunden anschließen. Die auf die orale Aufnahme der Larven folgende Penetrationsphase wird über die Dauer von einer Woche beobachtet. Hier findet die Wanderung der Larven im Körper des Wirtes vom Darm in die Lunge statt. Zu diesem Zeitpunkt zeigen die Tiere keine klinischen Symptome, zudem werden keine pathologischen Veränderungen an den Lungen festgestellt. Die Penetration der Darmschleimhaut durch das Eindringen der Larven äußert sich nur in einer subklinischen, katarrhalischen Enteritis (JARRETT et al. 1957). Mit dem Beginn der Larvenentwicklung in den Alveoli beginnt die Phase der Präpatenz, die bis ungefähr zum 25. Tag p.i. andauert. Die zu Anfang dieser Phase vorliegende Bronchiolitis wird mit den Wanderungsbewegungen der Präadulten zu einer Bronchitis. Beide Entzündungsreaktionen sind gekennzeichnet durch die Bildung zellulärer Infiltrate von Eosinophilen, Neutrophilen und Makrophagen in der Wand und im Lumen der luftführenden Wege, die später noch zusätzlich durch gebildeten Mukus verlegt werden (JARRETT et al. 1957; URQUHART et al. 1996). Diese Veränderungen verursachen das erste Auftreten klinischer Symptome, die als Tachypnoe, Husten und einzelne Fieberschüben beobachtet werden können (PFEIFFER 1971). In der Patenz von Tag 26 bis Tag 60 p.i. wird das Krankheitsgeschehen durch die adulten Lungenwürmer beherrscht, die jetzt das Bild der parasitären Bronchopneumonie in voller Ausprägung hervorrufen. Die durch die Anatomie der Rinderlunge vorgegebene Trennung der Lungenläppchen bewirkt eine Beschränkung der entzündeten Bereiche auf die Regionen der Lunge, die mit adulten Würmern besiedelt sind. Dort sind ein hyperplastisches Bronchialepithel mit Verlust des Zilienbesatzes und eine weiterhin starke zelluläre Infiltration festzustellen. Durch den Verlust des Flimmerepithels und die Bildung von undifferenzierten Zellen als Ersatz wird die sogenannte mukoziliäre Clearance als Reinigungsmechanismus der Lunge eingeschränkt, worauf leichter eine Infektion mit bakteriellen Sekundärerregern folgen kann. Eine vermehrte Schleimproduktion durch funktionell veränderte sekretorische Zellen äußert sich klinisch durch Nasenausfluss (SCHNIEDER et al. 1989; SHOO et al. 1990).

18 Schrifttum 18 Makroskopisch sind diese veränderten, scharf umschriebenen Bezirke als emphysematös, oedematös oder atelektatisch zu beschreiben (JARRETT et al. 1957; MICHEL u. SHAND 1955; URQUHART et al. 1996). Bei der Untersuchung der erkrankten Rinder kann je nach Krankheitsgrad Husten, Tachypnoe und Fieber festgestellt werden. Auskultatorisch sind Atemgeräusche unterschiedlicher Ausprägung wahrzunehmen (DÜWEL 1971; JARRETT et al. 1957; MICHEL u. SHAND 1955). Die Dyspnoe als prägendes Merkmal der Erkrankung wird auch durch einen Anstieg der alveolo-arteriellen Sauerstoffdifferenz sowie einer verkleinerten Compliance der Lunge charakterisiert. Damit steigt der für die Atmung erforderliche Energieaufwand an, der Erhaltungsbedarf des Tieres ist dem entsprechend trotz einer krankheitsbedingten verminderten Futteraufnahme ebenfalls erhöht. Die Tiere zeigen einen deutlichen Gewichtsverlust, bei Milchkühen tritt eine Verringerung der Milchleistung auf (LEKEUX et al. 1985; MICHEL u. SHAND 1955). Schwer erkrankte Tiere können im Verlauf der Präpatenz oder der Patenz verenden (PFEIFFER 1971; URQUHART et al. 1996). Der Beginn der Postpatenz ab Tag 61 p.i. ist durch das Absterben der adulten Lungenwürmer gekennzeichnet. In dieser bis Tag 90 p.i. andauernden Phase steht die Regeneration der Lungen und eine Verbesserung des Kranheitsbildes im Vordergrund, wobei bei bis zu 25 % der schwer erkrankten Tiere eine Verschlechterung eintreten kann. Diese wird zum einen auf die als Epithelialisation beschriebene, ätiologisch ungeklärte Proliferation der Typ-II Pneumozyten der Lunge zurückgeführt, die bei einem Teil der Rinder vorliegt. Zum anderen kann eine durch bakterielle Sekundärinfektionen verursachte Bronchopneumonie zu weiteren Komplikationen führen (URQUHART et al. 1996) Immunität Die durch Parasiten ausgelösten Immunreaktionen im Wirt umfassen sowohl zelluläre als auch humorale Komponenten des Abwehrsystems. Die gebildeten Antikörper der Klassen IgM, IgG, IgA und IgE erfüllen dazu unterschiedliche Funktionen, wobei als vorherrschender Mechanismus zum Schutz vor Helminthen die zellvermittelte Zytotoxizität auftritt. Eine Aktivierung des mittels Fc-Rezeptoren an Mastzellen der Schleimhäute gebundenen IgE durch Antigene der Parasiten bewirkt dabei eine Freisetzung von Histamin. Dieses verursacht eine erhöhte Permeabilität der Mukosa, womit die durch gleichzeitig ausgeschüttete

19 Schrifttum 19 chemotaktische Mediatoren angelockten Zellen des Immunsystems und Immunglobuline leichter in das Lumen von Atmungs- und Gastro-Intestinaltrakt gelangen können (JARRETT 1973; SOULSBY 1985). Dort greifen dann vorwiegend eosinophile Granulozyten im Rahmen der komplement-abhängigen und der antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität die Parasiten an, in dem sie aus ihren Granula oxidierende Substanzen freisetzen (CALLAHAN et al. 1988; SOULSBY 1985). Immunreaktionen im Verlauf der Dictyokaulose der Rinder führen nach einer Erstinfektion zu einer protektiven Immunität, wie sie von JARRETT et al. (1957) beschrieben wurde. Daher sind vorwiegend junge, erstsömmrige Tiere von einer Lungenwurminfektion betroffen. Ohne wiederholte, kontinuierliche Reinfektionen mit D. viviparus werden die Tiere nach einiger Zeit allerdings wieder empfänglich, worauf erneut eine patente Erkrankung mit klinischen Symptomen bei den dann adulten Rindern auftreten kann (MICHEL 1958). Verschiedene Abwehrmechanismen und daran beteiligte Bestandteile des Immunsystems wurden bereits bei der durch D. viviparus ausgelösten parasitären Bronchopneumonie beschrieben. Die Beteiligung von Immunglobulinen an der Abwehr von Lungenwürmern wurde schon im Jahr 1955 von JARRETT et al. vermutet. Spätere Studien zeigten die Präsenz von lokalen und systemischen Antikörpern der Klassen IgA, IgM, IgG und der Subklassen IgG1 und IgG2, die spezifisch für Antigene von D. viviparus waren (COLLIE et al. 2001; MCKEAND et al. 1996; SCOTT et al. 1996). Nach einer ersten Infektion konnte ein starker Anstieg des IgM im Serum der Tiere nachgewiesen werden, welcher im weiteren Verlauf der Krankheit und bei immunen Tieren durch einen erhöhten IgG-Spiegel im Blut ersetzt wurde (MCKEAND et al. 1996). In der Lunge wurden hohe Antikörpertiter der Ig-Isotypen A, M und G sowie der Subklassen G1 und G2 nach einer Infektion festgestellt, wobei nach Reinfektionen die höchsten Werte gefunden wurden (SCOTT et al. 1996). Als antigene Strukturen dienen bei der Lungenwurminfektion stadienspezifisch unterschiedliche Bestandteile der Nematoden. Bei den dritten Larven konnte eine Bindung der Immunglobuline sowohl an die Scheide als auch an die nach der Entscheidung der Larven vorhandene Kutikula beobachtet werden (GILLEARD et al. 1995; MCKEAND et al. 1996). Die adulten Würmer besitzen zum einen ebenfalls auf ihrer Oberfläche Epitope, zum anderen erweisen sich die von ihnen sezernierten sogenannten exkretorisch-sekretorischen Produkte als stark immunogen (BRITTON et al. 1992a; MCKEAND et al. 1996).

20 Schrifttum 20 Bestimmungen des gesamten IgE im Serum infizierter Kälber zeigten eine signifikante Korrelation von hohen Titern dieses Antikörpers zur Protektion gegen D. viviparus. Es konnte allerdings kein Zusammenhang zwischen für Lungenwurmantigene spezifischem IgE und dem Schutz vor Dictyokaulose erstellt werden (KOOYMAN et al. 2002). Eine individuelle Antigenerkennung nach Infektion mit Lungenwürmern und eine darauffolgende heterogene Antikörperbildung wurden bei Rindern unter gleichen Versuchsbedingungen aufgefunden. Bei entsprechend durchgeführten Studien an Meerschweinchen konnte eine genetische Kontrolle der Immunreaktionen nachgewiesen werden (BRITTON et al. 1992b). Die in der Lunge von Rindern nach einer experimentellen Infektion gemessene Expression einiger Zytokine wies an Tag 15 p.i. die höchsten Werte auf und sank bis Tag 42 p.i. wieder auf die Basiswerte nicht infizierter Tiere ab. Der Anstieg der Interleukine -4, -5, -10 und -13 sowie des Interferon γ in Verbindung mit einer negativen Korrelation des IgG1-Titers im Serum deuten nach Ansicht der Autoren auf eine Th2-dominierte Immunantwort bei der Dictyokaulose der Rinder hin (JOHNSON et al. 2005). Im Verlauf einer Lungenwurminfektion wird bei Rindern in einer frühen Phase der entstehenden Entzündungsreaktionen die Bildung von Proteinen der akuten Phase induziert (GANHEIM et al. 2004). Ein Anstieg von Haptoglobin, Fibrinogen und Serumamyloid A konnte in der Präpatenz ebenso gemessen werden wie eine erhöhte Menge eosinophiler Granulozyten im Serum der Tiere. Diese absolute Eosinophilie zeigte 14 bis 21 Tage p.i. eine signifikante Differenz zum Zeitpunkt vor der Infektion. Im Anschluss an eine D. viviparus-infektion entsteht wie bereits geschildert eine belastbare Immunität. Von besonderem Interesse war daher die Frage, ob sich diese Immunität auch unter einer Anthelminthika-Behandlung der erstsömmrigen Rinder bilden konnte. Mit Hilfe verschiedene Studien wurde belegt, dass sowohl nach Verabreichung von makrozyklischen Laktonen als auch nach Gabe von Benzimidazolen eine Immunantwort stimuliert wird, die allerdings teilweise schwächer war oder keine protektive Wirkung zeigte. Dieses konnte zum einen im Anschluss an eine Behandlung mit Boli, die den Wirksoff Ivermectin oder Fenbendazol über die gesamte Weidesaison freisetzten, nachgewiesen werden (SCHNIEDER et al. 1998; SCHNIEDER et al. 1996b). Zum anderen wurde nach einmaliger Therapie mit Doramectin oder Eprinomectin in der frühen patenten Phase der Krankheit eine Stimulierung

21 Schrifttum 21 des Abwehrsystems beobachtet (HÖGLUND et al. 2003a; TAYLOR et al. 2000). Es zeigte sich zudem, dass bei einer Behandlung mit Ivermectin drei, acht und 13 Wochen nach Austrieb der Rinder auf eine mit Larven kontaminierte Weide ein ausreichender Schutz vor einer Reinfektion mit klinischen Symptomen entstehen kann (TAYLOR et al. 1988). Auch nach der Eingabe von Oxfendazol- und Ivermectin-Boli vier Wochen nach der letzten Vakzinierung konnte in mit röntgenattenuierten Larven immunisierten Tieren eine protektive Immunität hervorgerufen werden (GRIMSHAW et al. 1996). Im Rahmen der Parasit-Wirt-Interaktionen konnten verschiedene Schutzmechanismen des Parasiten gegen Immunreaktionen des Wirtes gefunden werden. Um sich gegen die von Zellen des Immunsystems freigesetzten oxidativen Substanzen zur Wehr setzen zu können, entwickelten Nematoden anti-oxidative Enzyme wie die Superoxid Dismutase oder die Glutathion Peroxidase (CALLAHAN et al. 1988). Adulte Lungenwürmer besitzen im Gegensatz zu dritten Larven die Fähigkeit, an ihre Oberfläche gebundene Antikörper zu entfernen (MCKEAND u. KENNEDY 1995). Dabei scheinen exkretorisch-sekretorische Produkte, die über proteolytische Aktivität Immunglobuline spalten können, eine Rolle zu spielen, wie es auch bei anderen Helminthen beschrieben wurde (FAGBEMI u. HILLYER 1991) Diagnose Der Nachweis einer Infektion mit D. viviparus kann am lebenden Tier über die Erhebung klinischer Befunde, über die parasitologische Untersuchung des Kotes oder über serologische Verfahren erfolgen. Treten in einer Herde erstsömmriger Rinder Krankheitssymptome wie Husten oder Tachypnoe mehrere Wochen nach dem Austrieb auf und ist zudem vorberichtlich die Region als ein mit Lungenwürmern befallenes Gebiet bekannt, so kann zumindest die Verdachtsdiagnose Dictyokaulose gestellt werden (JARRETT et al. 1957; PFEIFFER u. SUPPERER 1980; TAYLOR 1951). Auch wenn diese Beobachtungen nur bei einigen Kälbern der Gruppe gemacht werden können und andere als gesund bzw. nicht infiziert erscheinen, spricht JARRETT et al. (1957) von einem pathognomonischen Krankheitsbild. Diese Ansicht wird allerdings von SCHNIEDER et al. (1989) nicht geteilt, die die erhobenen Befunde auch mit anderen ätiologischen Faktoren in Zusammenhang bringen.

22 Schrifttum 22 Die Bestätigung einer patenten Lungenwurminfektion ist mittels des Auswanderungsverfahrens möglich, bei dem mit dem Kot ausgeschiedene erste Larven nachgewiesen werden können (BAERMANN 1917). Dieser direkte Infektionsnachweis kann nicht in den Phasen der Prä- und Postpatenz durchgeführt werden, da in diesen Zeiträumen keine Larven ausgeschieden werden. Ein weiterer Nachteil der Technik besteht in der geringen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Wird das Auswanderungsverfahren innerhalb von drei Stunden nach Kotentnahme angesetzt, kann die Präsenz eines einzelnen weiblichen patenten Lungenwurmes 5-7 Wochen p.i. nachgewiesen werden (EYSKER 1997). Eine Lagerung der Proben für 24 Stunden bei 4 C oder 16 C bewirkt eine Reduktion der ausgewanderten Larven um 20 %, während eine Aufbewahrung bei 20 C schon in einer um 60 % reduzierten Larvenzahl resultierte (RODE u. JORGENSEN 1989). Wurde die Lagerungsdauer auf zwei Tage erhöht, konnten unabhängig von der Temperatut nur noch 20 % der Larven aufgefunden werden. Auch die Dauer des Auswanderungsverfahrens nimmt Einfluss auf das Ergebnis, da der größte Teil der D. viviparus-larven erst nach 10 Stunden auswandert und anschließend innerhalb mehrerer Stunden sedimentiert (RODE u. JORGENSEN 1989). Das Auffinden von Larven im Anschluss an eine schwache Infektion gelingt bei Kälbern zuverlässiger als bei adulten Tieren, da sich die Larven bei diesen in einem größeren Kotvolumen verteilen können (EYSKER 1997). Eine Kontamination mit verschiedenen Stadien von Erdnematoden kann besonders bei vom Boden gewonnenen Kotproben Schwierigkeiten bereiten, da die mikroskopische Differenzierung von Lungenwurmlarven notwendig wird (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Eine modifizierte Form des Auswanderungsverfahrens wurde von BUCHWALDER (1963) entwickelt, der an Stelle des Trichters Spitzgläser verwendete. In vergleichenden Studien zwischen diesen beiden Techniken konnten mit Hilfe der nach Buchwalder veränderten Methode 137 % mehr Larven von D. viviparus nachgewiesen werden (MCKENNA 1999). Als serologische Untersuchungsmethoden wurden seit Beginn der fünfziger Jahre eine Komplement-Bindungsreaktion (KBR), ein indirekter Hämagglutinationsassay (IHA) und mehrere Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA) routinemäßig in der Diagnostik von Lungenwurminfektionen eingesetzt. Die KBR basierte auf einem Rohantigen, das aus adulten Würmern gewonnen worden war (CORNWELL u. MICHEL 1960). Mit diesem Test gelang die Detektion von komplementbindenden Antikörpern im Rahmen einer natürlichen oder

23 Schrifttum 23 experimentellen Infektion ab der fünften Woche p.i.. Die Möglichkeit einer Unterscheidung zwischen vakzinierten und nicht vakzinierten Tieren bestand hier aber nicht, da ebenfalls die im Anschluss an eine Immunisierung mit röntgenattenuierten Larven gebildeten Antikörper detektiert wurden (CORNWELL 1960). Der Nachweis einer Lungenwurminfektion mittels des IHA auf der Grundlage von Antigen, welches aus adulten Lungenwürmern extrahiert worden war, wurde von BOKHOUT et al. (1979) eingeführt. Der Test zeigte die Existenz von systemischen Antikörpern ab der sechsten Woche nach dem Austrieb an, wobei auch hier keine Differenzierung zwischen immunisierten und nicht immunisierten Tieren möglich war. Aufgrund fehlender Kreuzreaktionen mit anderen, bei Rindern relevanten Nematoden und wegen der positiven Korrelation zwischen klinischen Symptomen und IHA-Ergebnissen wurde diese Technik nach der Evaluierung im Tiergesundheitsdienst der Niederlande als Routinediagnostik angewendet (CORNELISSEN et al. 1997). MARIUS et al. (1979) beschrieben erstmals die Verwendung eines ELISA zur Diagnose einer Dictyocaulus-Infektion. Dieser wies die gegen Antigene aus adulten D. viviparus reagierenden Immunglobuline ab der fünften Woche p.i. in Seren, Nasenausfluss oder Lungenspülungen nach. Hierbei wurde ein Anstieg von IgA nur lokal in den Lungenspülproben sowie im Nasenausfluss beobachtet, im Serum dagegen konnte spezifisches IgA nicht gefunden werden. Ein ebenfalls auf dem Antigen von adulten Lungenwürmern basierender ELISA zeigte einen Titeranstieg von spezifischen, systemischen IgG bei nicht vakzinierten Kälbern ab der vierten Woche p.i. (BOON et al. 1982). Kreuzreaktionen mit Antikörpern gegen Ostertagia spp.und Cooperia spp. wurden auf einem niedrigen Level gefunden. Trotz dieser Tatsache konnte eine für die Herdendiagnostik ausreichende Spezifität und Sensitivität der Methode erreicht werden. Darüberhinaus wurde eine positive Korrelation zwischen den mit diesem Test gewonnenen Ergebnissen und der IHA-Technik, parasitologischen Befunden und klinischen Beobachtungen festgestellt. Neben dem Antigen aus adulten D. vivparus setzte WASSALL (1991) in vergleichenden ELISA-Untersuchungen auch Antigen aus vierten Larven ein. Mit beiden ELISA war ein Anstieg der Antikörpertiter in natürlich und experimentell infizierten Rindern ab sechs

24 Schrifttum 24 Wochen p.i. zu beobachten. Vakzinierte Tiere dagegen zeigten keine bzw. nur eine leichte Erhöhung des Titers bei larvalem respektive adultem Antigen nach Immunisierung. Ein weiterer ELISA mit somatischem Antigen von adulten Lungenwürmern wurde von TENTER et al. (1993) mit Seren von experimentell und natürlich infizierten Tieren etabliert. Hier konnten über die Detektion von spezifischem IgG eine Spezifität, Sensitivität sowie positive und negative prediktive Werte von über 90 % zwischen der 13. und 17. Woche nach Austrieb der Rinder auf mit Larven kontaminierte Weiden erreicht werden. Die Entwicklung eines indirekten ELISA auf der Grundlage eines aus den somatischen Proteinen adulter Lungenwürmer aufgereinigten Proteins wurde von DE LEEUW u. CORNELISSEN (1991) beschrieben. Diese isolierten ein 17 kda großes Antigen adulter Würmer, welches nicht mit Immunglobulinen gegen Fasciola hepatica, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora und Ascaris suum kreuzreagierte. Die mit diesem putativen MSP durchgeführten ELISA korrelierten positiv mit den ELISA, die auf der Basis von nicht aufgereinigtem adulten Antigen durchgeführt wurden, wobei diese aber Kreuzreaktionen gegen die oben genannten Nematoden aufwiesen. Ein weiterer Vergleich dieser beiden Methoden mit einem kompetitiven ELISA, dessen Durchführung mit dem isolierten Protein in Kombination mit monoklonalen Antikörpern gegen D. viviparus erfolgte, verdeutlichte die Vorteile des indirekten ELISA unter Verwendung des aufgereinigten Proteins (DE LEEUW u. CORNELISSEN 1993). Mit diesem konnte sowohl eine Sensitivität als auch eine Spezifität von 97 % erreicht werden. Die erstmalige Detektion der Antikörper im Verlauf einer Infektion war zwischen der vierten und sechsten Woche p.i. möglich. Keines der vakzinierten Kälber wurde als positiv erkannt, so daß nach nachfolgenden umfangreichen Studien und gewissen Modifikationen 1995 der ELISA in der Routinediagnostik der Tiergesundheitsdienste der Niederlande die bis dahin verwendeten IHA und Kotuntersuchungen auf Lungenwürmer ersetzte (CORNELISSEN et al. 1997). Die Diagnose einer Dictyocaulus-Infektion mit dem ELISA erfolgte ab diesem Zeitpunkt über den Nachweis spezifischer IgG1-Antikörper. Dadurch gelang es, die Spezifität des ELISA auf 99,2 % und die Sensitivität auf 100 % zu erhöhen, womit eine signifikante Verbesserung gegenüber dem IHA mit 99,6 % bzw. 78,1 % erzielt werden konnte. Ein zweiter Vorteil im Vergleich des ELISA zum IHA bestand in der fehlenden Erkennung von vakzinierten Tieren. Zusammen mit der bis zum 168. Tag p.i. anhaltenden Nachweisbarkeit der Infektion im

25 Schrifttum 25 ELISA trugen diese Eigenschaften zu dessen Evaluierung als Routinediagnostikum bei. Zugleich wurde der ELISA als kommerzieller Testkit zur Diagnose einer Lungenwurminfektion auf dem europäischen Markt eingeführt (Ceditest Lungworm, CEDI- DIAGNOSTICS, Lelystad, Niederlande). Der erste mittels eines rekombinanten Antigens durchgeführte Nachweis lungenwurmspezifischer Immunglobuline fand zu Beginn der neunziger Jahre statt (SCHNIEDER 1992). Ein ca. 18 kda großes Protein adulter Lungenwürmer wurde als ein Major Sperm Protein (MSP) von D. viviparus identifiziert und als rekombinantes Glutathion- S-Transferase Fusionsprotein exprimiert (SCHNIEDER 1993b). Im ELISA diente zum einen das Fusionsprotein und zum anderern das mit Thrombin vom GST-Tag geschnittene und anschließend aufgereinigte rekombinante MSP als Antigen. Mit beiden Präparationen lag die Spezifität nach experimentellen Infektionen bei über 99 % und die Sensitivität bei über 90 %. Im Anschluss an eine natürliche Exposition sank die Spezifität des ELISA basierend auf dem Fusionsprotein auf 90 % bei gleichbleibendem Wert für das geschnittene MSP, die Sensitivität betrug 85 % bzw. 70 %. Als weitere Einsatzmöglichkeit des rekombinanten Proteins wurde ein Immunoblot entwickelt, der mit dem puren MSP als Antigen in Form eines Schnelltestes - des Dipstick Immunoassays - eine Spezifität und eine Sensitivität von über 99 % bei experimentell infizierten Tieren aufwies (SCHNIEDER 1993a). Beide Techniken beruhten auf dem Nachweis spezifischer Antikörper des Isotyps G im Serum. Nach Evaluierung wurde der Immunoblot zur Diagnose von Serokonversionen gegen Lungenwürmer im Institut für Parasitologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover eingesetzt Bekämpfung Die Bekämpfung der Dictyokaulose kann prophylaktisch über weidetechnische Maßnahmen, biologische Kontrolle der Parasiten und Vakzinierung erfolgen. Als Therapie und Metaphylaxe sind Anthelminthika verschiedener Wirkstoffklassen das Mittel der Wahl.

26 Schrifttum Weidetechnik Als eine strategische Methode zur Vorbeugung von Lungenwurminfektionen wurden unterschiedliche Weidetechniken mit oder ohne zusätzlicher Anthelminthikabehandlung entwickelt. SELMAN (1984) bewertete die ganzjährige Aufstallung erstsömmriger Rinder als ungeeeignet, da infolge fehlender Exposition der Kälber zu infektiösen Larven keine protektive Immunität ausgebildet wird. Damit sind die Tiere im zweiten Jahr voll empfänglich für eine Infektion mit D. viviparus. Bei regelmäßigem Weideumtrieb gelangen die Rinder nach mehreren Tagen auf eine neue, nicht kontaminierte Fläche (POUPLARD 1968; ROMMEL u. SCHNIEDER 1989). Gleichzeitig soll ein gemeinsamer Weidegang von jungen und adulten Tieren vermieden werden, da letztere als unerkannte Ausscheider fungieren können (JARRETT et al. 1955; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Aus diesem Grund werden bei dieser Weidetechnik erstsömmrige Kälber auch erst nach Ablauf von einem Jahr auf Weiden getrieben, die vorher von älteren Rindern beweidet worden sind (PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Trotz dieser Vorsorgemaßnahmen wird aber aufgrund der zahlreichen Eintragungsmöglichkeiten der Lungenwurmlarven nur eine Minimierung der Infektionsdosis erreicht, nicht aber eine völlige Befreiung der Weiden von den infektiösen Stadien (ROMMEL u. SCHNIEDER 1989). Des Weiteren kann dieses Weidemanagement nur bei den Betrieben angewendet werden, die eine ausreichende Anzahl an Ausweichflächen zur Beweidung besitzen. Das Weybridger Dose and Move System, bei dem vor dem einmaligem Umtrieb im Sommer eine Anthelminthikabehandlung der Tiere durchgeführt wird, bietet über einen langen Zeitraum der Weidesaison Schutz; allerdings kann es im Spätsommer oder Herbst noch zu vereinzelten Ausbrüchen der Dictyokaulose kommen (ROMMEL u. SCHNIEDER 1989) Biologische Bekämpfung Um eine Aufnahme infektiöser Larven beim Weiden und deren Ausbreitung auf der beweideten Fläche zu verringern, setzten FERNANDEZ et al. (1999) Isolate des Pilzes Duddingtonia flagrans ein. Dieser im Kot von Wiederkäuern und Pferden nachgewiesene Organismus ist in der Lage, mit Hilfe eines Hyphennetzes Nematodenlarven zu immobilisieren und anschließend zu zerstören. Nach Zusatz von 6250 Chlamydosporen/ g Kot konnte im Labor eine signifikante Reduktion der Larvenzahl im Kot erreicht werden, die in

27 Schrifttum 27 Freilandversuchen bestätigt wurde. Eine Supplementierung von Pilzsporen zum Futter soll nach LARSEN (1999) in einer verminderten Larvenexposition auf der Weide resultieren, womit klinische Erkrankungen verhindert werden. Inwieweit sich diese Technik zur Praxisreife entwickelt, bleibt abzuwarten. Eine Inhibierung der Motilität von ersten und dritten Lungenwurmlarven konnte in vitro durch bestimmte Inhaltsstoffe von Pflanzen erzielt werden (MOLAN et al. 2000). Die in den Versuchen verwendeten Tannine und Lactone entstammen Pflanzen, die weidendem Rotwild als Futter dienen können. Eine bei diesen Tieren beobachtete verminderte Parasitenproblematik wird daher durch die Autoren auf die Aufnahme der anthelminthisch wirksamen Substanzen zurückgeführt Anthelminthika Zur Behandlung einer Infektion mit D. viviparus steht ein breites Spektrum an anthelminthisch wirksamen Substanzen zur Verfügung. Neben dem zur Gruppe der Imidazothiazole gehörenden Levamisol werden makrozyklische Laktone und Benzimidazole eingesetzt. Im Rahmen der nachfolgenden Tabelle 1 soll nur auf die in den zurückliegenden Jahren neu entwickelten bzw. verwendeten Anthelminthika eingegangen werden. Bezüglich des davorliegenden Zeitraums soll auf die Arbeit von KOHLER-BELLMER (1991) verwiesen werden. Eine strategische Bekämpfung der Dictyokaulose ist durch mehrmalige Applikation von Doramectin und Ivermectin im Verlauf der Weidesaison möglich (SCHNIEDER u. WHEELER 1991; VERCRUYSSE et al. 1998). Das wie diese beiden Wirkstoffe zur Gruppe der Avermectine zugehörige Eprinomectin wird aufgrund einer Wartezeit von null Tagen auf Milch vorwiegend zur Therapie von Helminthosen der Milchkühe genutzt. Ein Einsatz bei der strategischen Kontrolle von Weideparasiten der Rinder zeigte allerdings keinen Erfolg hinsichtlich der Prophylaxe von Lungenwurmerkrankungen (EPE et al. 1999).

28 - : keine Angaben Tabelle 1: Exemplarische Auswahl neuerer Anthelminthika zur Behandlung einer Lungenwurminfektion Klasse der Anthelminthika - Gruppe Makrozyklische Laktone - Milbemycine Makrozyklische Laktone -Avermectine Cyclooctadepsipeptide Wirkstoff Moxidectin Abamectin Doramectin PF1022A / Emodepsid Art der Applikation Pour-on Injektion Long-acting Injektion Injektion Injektion Pour-on Oral / Injektion Effizienz gegen Dictyocaulus viviparus Larven > 99 % > 99 % > 99 % - Präadulte > 99 % > 99 % > 99 % - Adulte > 99 % > 99 % 100 % 100 % > 99,9 % % > 99,9 % 100 % 100 % Persistenz der Effizienz 6 Wochen mit > 90 % 6 Wochen mit > 90 % 6 Wochen mit > 90 % Wochen 6 Wochen mit > 80 % - Referenz EYSKER et al. (1996) VERCRUYSSE et al. (1997) HUBERT et al. (1997) RANJAN u. DELAY (2004) VERCRUYSSE et al. (1997) WILLIAMS et al. (1992) YAZWINSKI et al. (2006) YAZWINSKI et al. (1994) EDDI et al. (1993) GOUDIE et al. (1993) WHELAN et al. (1995) WEATHERLEY et al. (1993) STROMBERG et al. (1999) STROMBERG et al. (1999) VON SAMSON- HIMMELSTJERNA et al (2000) HARDER et al. (2003) Schrifttum 28

29 Schrifttum Immunisierung Die passive Immunisierung empfänglicher Kälber gelang durch die Übertragung von Hyperimmunseren infizierter Rinder. Hierbei wurde aber ein Schutz vor einer Infektion nur für einen Zeitraum von 8-10 Tagen erreicht. Die Immunität schwankte in ihrer Ausbildung zudem stark mit dem Antikörpertiter des Spendertieres, so dass diese Methode nicht weiter verfolgt wurde (JARRETT et al. 1957; POUPLARD 1968). Eine aktive Impfung gegen D. viviparus wurde erstmals von JARRETT et al. (1957) vorgestellt. Diese impften Kälber mit lebenden dritten Larven, deren Infektiösität vorher durch eine Röntgenbestrahlung von 400 Gy herabgesetzt worden war. Die sogenannten attenuierten Larven wandern nach peroraler Applikation in die Lunge, wo der überwiegende Teil als immature Stadien abstirbt. Während dieser verkürzten Entwicklung stimulieren die Larven das Immunsystem, so dass bei einem korrekt befolgten Impfschema eine belastbare Resistenz gegenüber Lungenwürmern entsteht (DÜWEL 1963; JARRETT et al. 1958; PFEIFFER u. SUPPERER 1980; POUPLARD 1968). Dazu sollte vor Beginn der Weideperiode eine zweimalige Immunisierung der erstsömmrigen Rinder mit jeweils 1000 attenuierten Larven in einem Abstand von vier Wochen erfolgen. Nach weiteren zwei bis vier Wochen können die Tiere dann ausgetrieben werden, da sich bis zu diesem Zeitpunkt eine Grundimmunität gebildet hat (DÜWEL 1971; JARRETT et al. 1958; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Diese muss durch eine bald darauffolgende natürliche Infektion geboostert werden, um auch in stark durchseuchten Beständen wirksam zu sein (DÜWEL 1971; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Die erzielte Resistenz äußert sich in einem Schutz der Rinder vor klinischer Dictyokaulose. Eine Larvenausscheidung, die epizootiologisch keine Rolle spielt, kann dagegen nicht bei allen Tieren verhindert werden. Die Ausbildung einer patenten Infektion kann dabei sowohl ohne als auch mit einer natürlichen Boosterung im Anschluss an die Vakzinierung stattfinden (DÜWEL 1971; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Klinisch manifeste Impfdurchbrüche wurden bei gleichzeitigem starkem Befall mit anderen Parasiten beobachtet (DÜWEL 1963). Die Entwicklung der Immunität wird bei Durchführung des oben beschriebenen Impfschemas nicht durch den Gebrauch von Anthelminthika gefährdet, wenn diese bei Austrieb oder während der Weidesaison appliziert werden. Dieses konnte für Doramectin (JACOBS et al. 1996; TAYLOR et al. 2000), welches ein- oder zweimalig injiziert wurde, ebenso

30 Schrifttum 30 nachgewiesen werden wie für Ivermectin und Oxfendazol, welche einmalig als Boli verabreicht wurden (GRIMSHAW et al. 1996). Die Applikation der röntgenattenuierten Larven bei tragenden und bei laktierenden Färsen zeigt keine Auswirkungen auf Trächtigkeit oder Milchproduktion (HOLZHAUER et al. 2005). Eine Anwendung bei Färsen vor der Integration in die Gruppe der Milchkühe kann daher mit der gleichen Sicherheit und Wirkung erfolgen wie bei erstsömmrigen Rindern. Der Erfolg dieser Vakzine äußert sich in der Tatsache, dass sie nach ihrer Markteinführung Anfang der sechziger Jahre für nahezu vierzig Jahre der einzige gegen D. viviparus wirksame kommerzielle Impfstoff blieb. Der Einsatz dieser protektiven Immunisierung ging allerdings mit der Durchführung strategischer Kontrollprogramme gegen Nematoden auf der Basis von Anthelminthika stark zurück (BAIN 1999; MAWHINNEY 1997). Auch in Norddeutschland wurde die Vakzine 1987 nur vereinzelt verwendet, wohingegen Ende der neunziger Jahre in einer Erhebung in der gleichen Region kein Einsatz des Impfstoffes mehr festgestellt werden konnte (SCHNIEDER et al. 1999). In den Niederlanden dagegen nutzten 33,8 % der befragten Betriebe die Möglichkeit einer Vakzinierung der erstsömmrigen Kälber (BORGSTEEDE et al. 1998). In einigen Ländern, inklusive Deutschland, ist die Vakzine zurzeit vom Markt genommen worden (SCHNIEDER 2006). Mit der erwünschten Wirksamkeit der Impfung waren aber auch verschiedene Nachteile verbunden, wie beispielsweise die Möglichkeit der Larvenausscheidung nach der Immunisierung. Zudem nahm der Impfschutz nach wenigen Monaten wieder ab, so dass auch bei vakzinierten Tieren Erkrankungen auftreten konnten (DÜWEL 1971; PFEIFFER u. SUPPERER 1980). Ein Auftreten der Dictyokaulose nach einer Challenge-Infektion wurde auch bei Kälbern beobachtet, die in einem Alter von unter zwei Monaten geimpft worden waren (DÜWEL 1971). Die als Impfstoff dienenden attenuierten, lebenden Larven führten zu einer auf eine kurze Zeit begrenzten Haltbarkeit und hohen Kosten der Vakzine. Die Produktion der Larven kann zudem nur mit Hilfe von infizierten Spendertieren geschehen, da eine in vitro-kultur zur Gewinnung der Larven nicht möglich ist (BAIN 1999; MCKEAND 2000). Die Verwendung von nativen und rekombinanten Proteinen in Impfversuchen gegen D. vivparus wird in Kapitel dargestellt.

31 Schrifttum Immunisierungsversuche gegen Helminthen Immunisierungsversuche gegen Parasiten werden seit mehreren Jahrzehnten trotz der erfolgreichen Behandlungsmöglichkeiten mit Antiparasitika durchgeführt. Dieses geschieht aufgrund des Verbraucherbewusstseins, das sich in einer vermehrten Nachfrage nach Lebensmitteln von unbehandelten Tieren und in einer vorbeugenden Erhaltung der Tiergesundheit äußert. Des Weiteren werden im Bereich der Helminthologie verstärkt Resistenzen gegenüber Anthelminthika beobachtet, deren Verbreitung und Neubildung sich durch Vakzinierungen als Prophylaxe verhindern lassen. Hierbei werden bevorzugt Vakzineoptionen entwickelt und getestet, die mittels biotechnologischer Verfahren hergestellt werden (DALTON u. MULCAHY 2001; SMITH 1999). Diese besitzen im Vergleich zu herkömmlichen (Lebend-) Vakzinen den Vorteil, kostengünstiger und stabiler zu sein. Darüberhinaus werden keine Spendertiere zur Gewinnung der Larven benötigt (MCKEAND 2000). Zur Steigerung der Immunogenität dieser rekombinanten Impfstoffe und zur Immunomodulation müssen allerdings zusätzlich Adjuvantien eingesetzt werden, da Peptide oder Proteine in der Regel nicht ausreichende antigene Eigenschaften entfalten und alleine keine oder nur schwache zelluläre Immunreaktionen hervorrufen können. Aufgrund der nicht stattfindenden Aufnahme von Peptiden in das Zytosol der Zellen und einer damit einhergehenden fehlenden Präsentation der Antigene über MHC-I-Moleküle sind diese Substanzen ineffektiv in der Stimulierung einer Th1-abhängigen Immunantwort (JANEWAY u. TRAVERS 1997; SINGH u. O'HAGAN 2003). Weitere Faktoren, die die immunologischen Aspekte einer Vakzine beeinflussen können, sind die Dosis des Antigens und die Anzahl der Immunisierungen, das ausgewählte Adjuvans und die Applikationsart (DALTON u. MULCAHY 2001). Neben diesen Impfstoffen auf Basis von Proteinen werden verstärkt Glykane als antigen wirksame Strukturen untersucht. Die im Verlauf der posttranslationalen Modifikationen entstehenden Zuckermoleküle konnten dazu schon bei vielen Trematoden, Zestoden und Nematoden nachgewiesen und charakterisiert werden (HEIN u. HARRISON 2005). Bei D. viviparus konnten dabei erstmals bei Nematoden sogenannte Lewis x -Epitope gefunden werden, die von N-Glykanen der adulten Würmer gebildet werden (HASLAM 2000).

32 Schrifttum Adjuvantien Die in der Human- und Veterinärmedizin seit über 60 Jahren meistgenutzten Adjuvantien sind Mineralsalze auf der Basis von Aluminium (LINDBLAD 2004). In kommerziellen Impfstoffen zur Immunisierung von Tieren dienten bzw. dienen zudem das unvollständige Freundsche Adjuvans, welches wegen aufgetretener Nebenwirkungen zunehmend kritisch beurteilt wird, sowie Saponine zur Stimulation der Immunantwort (SINGH u. O'HAGAN 2003). Im Folgenden werden nach Einteilung der Adjuvantien in das Schema von COX u. COULTER (1997) wichtige Aspekte der einzelnen Substanzen kurz geschildert partikuläre Adjuvantien Als wichtigster Vertreter dieser Klasse sind die Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxid oder Kalium-Aluminiumsulfat (Alum) zu nennen. Nach Bindung der Antigene an diese nm großen Partikel werden die Komplexe von antigenpräsentierenden Zellen über Phagozytose aufgenommen, worauf im Anschluss an eine Präsentation über MHC II- Moleküle durch eine vermehrte Produktion von IL-4 eine Aktivierung der humoralen Immunität erfolgt. Die starke Modulation des Immunsystems in Richtung einer Th2-Antwort wird durch eine IL-4 vermittelte Hemmung der Differenzierung von Vorläuferzellen zu Th1- Zellen erzielt. Diese Induktion antikörperbildender Immunmechanismen ist ein Kennzeichen der Aluminiumverbindungen (COX u. COULTER 1997; LINDBLAD 2004; SINGH u. O'HAGAN 2003). Im Rahmen dieser Abwehrreaktionen wird auch eine Stimulierung der IgE- Produktion durch Aluminiumsalze erreicht, womit diese Adjuvantien interessante Kandidaten für Vakzinen gegen Helminthen sein können. Für alle Impfstoffe mit Aluminiumkomplexen werden eine niedrige Toxizität und damit geringe Nebenwirkungen gefunden (LINDBLAD 2004). Weitere Adjuvantien dieser Gruppe sind die Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das vollständige oder das unvollständige Freundsche Adjuvans. Auch hier beruht die Wirkung auf einer Komplexbildung und folgender Phagozytose. Wie bei den Aluminiumverbindungen führt eine langsame Freisetzung des Antigens zu einer verzögerten Resorption von der Applikationsstelle, womit sich die Dauer des antigenen Stimulus erhöht. Die dem vollständigem Freundschen Adjuvans zugefügten abgetöteten Mykobakterien (Mycobakterium tuberculosis) aktivieren zusätzlich über ihren Inhaltsstoff Muramyldipeptid

33 Schrifttum 33 die Zytokinproduktion von Makrophagen. Dadurch wird die Reaktion von beiden Arten der Th-Zellen direkt stimuliert. Mit Hilfe beider Freundschen Adjuvantien kann eine Aktivierung der Th1- und Th2-Antwort provoziert werden, allerdings verstärken sich sowohl die immunstimulatorischen als auch die toxischen Wirkungen des unvollständigen Freundschen Adjuvans bei Gebrauch des vollständigen Freundschen Adjuvans (COX u. COULTER 1997; LINDBLAD 2004; TIZARD 2000). Aufgrund der Toxizität und der Kontamination des Fleisches mit Mineralölen werden beide Substanzen nicht mehr in lebensmittelliefernden Tieren angewendet. Demgegenüber werden die in vielen Vakzinen eingesetzten Aluminiumsalze über die Niere ausgeschieden (LINDBLAD 2004; TIZARD 2000). Die ebenfalls dieser Gruppe zugeordneten immunstimulatorischen Komplexe (ISCOMs) werden aus einer Gitterstruktur von Cholesterol und Phospholipiden gebildet, in die Saponine eingelagert sind. Nach Inkorporation der Antigene und Immunisierung wird eine starke Th1- und Th2-Antwort hervorgerufen, wobei die zelluläre Immunität über die Induktion von IL-12 und Interferon γ (IFN-γ) erzielt wird (COX u. COULTER 1997; SINGH u. O'HAGAN 2003). Eine ähnliche Struktur besitzen die bis zu 100 µm großen Mikropartikel, die aus synthetischen, biokompatiblen Polymeren wie Polylactid-co-glyklolid zusammengesetzt sind. Durch die Komplexbildung des Antigens mit den Partikeln kann sowohl eine zelluläre als auch eine humorale Immunantwort induziert werden. Zusätzlich kann über die Einlagerung immunstimulatorischer Adjuvantien in die Mikropartikel die Reaktion des Abwehrsystems moduliert werden (COX u. COULTER 1997; SINGH u. O'HAGAN 2003). Die von KÖHRMANN (2002) in Vakzinierungsversuchen mit rekombinantem MSP verwendeten Adjuvantien GERBU-Adjuvans 100 und GERBU-Adjuvans LQ bestehen aus einer Nanosuspension biologisch abbaubarer Lipide, Esterquat 1 und dem Glykopeptid GMDP (N-Acetyl-glucosaminyl-[ß1,4]-N-acetylmuramyl-Ala-D-Isoglutamin), einem Zellwandbestanteil von Lactobacillus bulgaricus. Neben der Depotwirkung werden die immunstimulatorischen Eigenschaften dieser Substanzen besonders durch eine vermehrte Phagozytose des Adjuvans-Antigen-Komplexes ausgelöst, wobei aber keine unerwünschten Reaktionen durch die Impfung verursacht werden sollen.

34 Schrifttum nicht partikuläre Adjuvantien Die Substanzen dieser Gruppe zeichnen sich durch ihre immunstimulatorischen Eigenschaften aus. Saponine als gesamter Pflanzenextrakt oder aus ihnen aufgereinigte Komponenten wie das Quil A verursachen eine starke Anregung der humoralen und vor allem der zellulären Immunität. Der Mechanismus ihrer Wirkung ist unbekannt, es konnte aber eine Einlagerung der Saponine in die Zellmembran mit einer daraus resultierenden Porenbildung nachgewiesen werden. Über diese Poren wäre ein Einstrom von Antigenen in das Zytosol möglich, so dass deren Präsentation über MHC I-Moleküle eine zelluläre Immunantwort bewirken könnte (SINGH u. O'HAGAN 2003). Trotz ihrer unbekannten Wirkungsweise sind Saponine seit langem in vielen, in der Veterinärmedizin genutzten Vakzinen enthalten, da sie ähnlich den Aluminiumsalzen eine hohe Sicherheit aufweisen (COX u. COULTER 1997). Als weiteres der Gruppe zugehöriges Adjuvans ist das Monophosphoryl Lipid A zu nennen, das eine starke Th1-Antwort induziert. Die Substanz ist ein Bestandteil der Lipopolysaccharide von Salmonella minnesota und scheint über die Bindung an Rezeptoren der antigenpräsentierenden Zellen eine Freisetzung proinflammatorischer Zytokine zu bewirken. Unter diesen finden sich überwiegend IL-2 und IFN-γ, welche die Ausbildung einer zellulären Abwehr hervorrufen (COX u. COULTER 1997; SINGH u. O'HAGAN 2003). Diese kann ebenfalls über die Verwendung von Interleukin 12 als Adjuvans erreicht werden. Allerdings ist aufgrund der teuren Herstellung und ihrer Spezies-Spezifität mit einem Einsatz dieser Zytokine in der Veterinärmedizin nicht zu rechnen (COX u. COULTER 1997; SINGH u. O'HAGAN 2003). Eine neue Klasse von immunstimulatorisch aktiven Stoffen wurde mit der sogenannten CpG- DNA beschrieben, einem Bestandteil bakterieller DNA, die eine verstärkte zelluläre Immunität hervorruft. Dieses Adjuvans besitzt in vivo direkte, die Abwehrzellen anregende Eigenschaften, welche durch die Bindung an Rezeptoren oder aber durch Endozytose der CpG-DNA ausgelöst werden (SINGH u. O'HAGAN 2003).

35 Schrifttum 35 Ein neuer Ansatz zur Herstellung von Vakzinen ist die Expression rekombinanter Antigene in transgenen Pflanzen (KIRK u. WEBB 2005; STREATFIELD u. HOWARD 2003). Durch die Konstruktion von Fusionsproteinen, die das gewünschte Antigen in Verbindung mit einer immunstimulatorischen Komponente beinhalten, kann eine immunogene Wirkung ohne den Zusatz klassischer Adjuvantien erzeugt werden. Dabei werden die Antigene mit Substanzen wie dem hitzelabilen Toxin aus enterotoxischen E. coli konjugiert, womit die Induktion einer Th1- und Th2-Antwort möglich ist (RIGANO u. WALMSLEY 2005) Immunisierungsversuche mit nativen/rekombinanten Proteinen Trematoden und Zestoden Die Entwicklung rekombinanter Vakzinen umfasst im Bereich der Trematoden insbesondere die auch zu den humanpathogenen Erregern zählenden Schistosomen und Leberegel. Verschiedene Proteine dieser Helminthen wurden zunächst in nativer Form und anschließend als rekombinante Antigene in Immunisierungen eingesetzt. Eine Auswahl dieser Impfversuche ist in Tabelle 2 wiedergegeben. Impfversuche mit rekombinanten Antigenen werden gegen Zestoden seit ca. 20 Jahren durchgeführt. Mit einer Kombination der drei Antigene GST-45W, 16K und 18K gelang es dabei, gegen Taenia ovis einen > 99 %igen Schutz hervorzurufen. Aufgrund dieses Erfolges wurde eine Vakzine auf Basis dieser drei Proteine in Neuseeland zum kommerziellen Gebrauch registriert. Politische und wirtschaftliche Faktoren verhinderten aber die Markteinführung (LIGHTOWLERS et al. 2000). Auch weitere, gegen Zestoden gerichtete Antigene zeigten eine ähnliche protektive Wirkung. Diese sind in Tabelle 3 dargestellt.

36 FCA: vollständiges Freundsches Adjuvans, FIA: unvollständiges Freundsches Adjuvans - : keine Angabe; Alum: Kalium-Aluminiumsulfat Tabelle 2: Exemplarische Darstellung der in Immunisierungsversuchen gegen Trematoden verwendeten Antigene Name Fatty acid Binding Protein Glutathion -S-Transferase Kathepsin L Leukin- Aminopeptidase Paramyosin Antigen isoliert aus / eingesetzt gegen F. hepatica F. hepatica S. mansoni F. hepatica F. hepatica S. japonicum nativ / rekombinant nativ rekombinant nativ rekombinant nativ nativ rekombinant rekombinant Dosis/ Injektion 40 µg 40 µg - 50 µg 67 µg µg 100 µg 100 µg 1000 µg µg Tierart Hase Hase Schaf Ratte / Hamster Pavian Schaf Schaf Schaf Schwein Wasserbüffel Adjuvans FCA/FIA FCA/FIA FCA Alum Alum FCA FCA/FIA FCA/FIA Alum Quil A Effizienz Eier Adulte % % - 57 % % 0 % 38 % 70 % 5 % - 60 % - 89 % 0 % 33 % > 42 % 0-34 % Referenz MURO et al. (1997) KNOX et al. (2001a) MURO et al. (1997) HILLYER (2005) BALLOUL et al. (1987) BOULANGER et al. (1991) WIJFFELS et al. (1994) PIACENZA et al. (1999) PIACENZA et al. (1999) CHEN et al. (2000) MCMANUS et al. (2001) Schrifttum 36

37 - : keine Angabe Tabelle 3: Exemplarische Darstellung der in Immunisierungsversuchen gegen Zestoden verwendeten Antigene Name Onkosphärenproteine Onkosphärenproteine GST-45W / 16K / 18K Onkosphärenproteine Onkosphärenproteine TSA-9 / TSA-18 Onkosphärenproteine TSOL18 / TSOL45 Onkosphärenproteine EG95 Antigen isoliert aus / eingesetzt gegen T.ovis T. saginata T. solium E. granulosus nativ / rekombinant nativ rekombiant nativ rekombiant rekombiant rekombiant Dosis/ Injektion - 50 µg µg 200 µg 50 µg Tierart Schaf Schaf Rind Rind Schwein Schaf Adjuvans Mineralöl Saponin Quil A Quil A Quil A Quil A Effizienz gegen Zystizerki 99 % > 99 % 99 % 94 % > 97 % > 95 % Referenz JOHNSON et al. (1989) LIGHTOWLERS et al. (2000) LIGHTOWLERS et al. (1996b) LIGHTOWLERS (2006) GONSALEZ et al. (2005) FLISSER et al. (2004) LIGHTOWLERS et al. (1996a) LIGHTOWLERS et al. (1999) Schrifttum 37

38 Schrifttum Nematoden Ein großer Teil der zu diesen Parasiten betriebenen Forschungen wurde mit Haemonchus contortus durchgeführt, bei dem die Identifizierung und Charakterisierung vieler potentiell protektiver Antigene gelang. Mit der Beschreibung des H11, eines Darm-assoziierten Glykoproteins von H. contortus, wurde die Klasse der sogenannten hidden antigens begründet. Antikörper gegen diese Antigene liegen nicht nach einer natürlichen Infektion vor, da sich die immunogenen Strukturen im Inneren des Parasiten befinden und keinen Kontakt zum Immunsystem des Wirtes haben. Nach einer Vakzinierung unterbleibt somit der Booster- Effekt durch die Aufnahme von infektiösen Larven. Allerdings können auch Lämmer gegenüber den hidden antigens eine Immunantwort entwickeln, wohingegen die Ausbildung einer Immunität gegen natürliche Antigene bei sehr jungen Schafen nicht stattfindet. Eine zweite Klasse umfasst die natural antigens wie die exkretorisch/sekretorischen-produkte (e/s-produkte), gegen die im Verlauf einer natürlichen Immunantwort reagiert wird (NEWTON u. MUNN 1999; SMITH 1999). Erste Immunisierungen mit angereichertem, nativem H11 gegen H. contortus in verschiedenen Schafrassen äußerten sich in einer antikörpervermittelten Reduktion der adulten Würmer um bis 95 %, wobei die Anzahl weiblicher Adulter deutlicher zurückging als die der männlichen. Die Eiausscheidung konnte mit einer Effizienz von % verringert werden. Die Dosis des verwendeten Proteins schwankte dabei zwischen 0,5 µg und 500 µg pro Vakzinierung. Diese wurde als Erstimmunisierung mit vollständigem Freundschem Adjuvans in Kombination mit Aluminiumhydroxid und als Boosterimpfung mit unvollständigem Freundschen Adjuvans in Verbindung mit Aluminiumhydroxid durchgeführt. Bei einer Menge von 50 µg Antigen wurden die besten Ergebnisse erzielt, die sich mit dem Gebrauch von Quil A als Adjuvans noch verbessern liessen (NEWTON u. MUNN 1999; SMITH et al. 1993; TAVERNOR et al. 1992a; TAVERNOR et al. 1992b). ANDREWS et al. (1995) wiesen den kolostralen Transfer partiell protektiver Antikörper auf Lämmer nach der Vakzinierung der Mutterschafe mit nativem H11 nach. Zugleich konnte eine peripartale Erhöhung der Eiausscheidung der Muttertiere, wie sie im Verlauf einer natürlichen Infektion beobachtet wird, durch die Immunisierung fast komplett verhindert werden. Das Wirkungsspektrum einer nativen H11-Vakzine beinhaltet verschiedene Isolate von H. contortus. Ein Schutz nach Challenge-Infektionen konnte dazu bei Isolaten aus

39 Schrifttum 39 unterschiedlichen geographischen Regionen wie Europa und Australien nachgewiesen werden. Auch gegen Würmer mit multiplen Anthelminthikaresistenzen zeigte dieser Impfstoff eine protektive Wirkung (NEWTON et al. 1995). Feldstudien sollten zur Bestätigung der nach experimenteller Challenge-Infektionen erreichten Erfolge dienen. In Südafrika konnte eine um mehr als 82 % verminderte Eiausscheidung bei auf kontaminierten Weiden grasenden Schafen beobachtet werden, die mit einer verringerten haemonchosebedingten Todesrate der Tiere einherging (SMITH et al. 2001). In einem ähnlich durchgeführten Versuch in den USA waren die Resultate allerdings nicht reproduzierbar, da durch große individuelle Variationen keine eindeutigen Ergebnisse gefunden werden konnten (KABAGAMBE et al. 2000). Die Bedeutung der Konformationsepitope dieser als Antigen genutzten Aminopeptidase H11 wurde nach den Untersuchungen von MUNN et al. (1997) deutlich. Diese wiesen nach Immunisierung mit einer durch SDS und DTT denaturierten H11-Fraktion eine Reduktion der Wurmbürde um 54 % nach, während natives H11 eine Effizienz von 95 % aufwies. Vergleichbare Zahlen wurden zudem für die Eiausscheidung erzielt. Für H11 konnten bisher fünf Isoformen entdeckt werden, von denen drei über ein Baculovirussystem in Insektenzellen als rekombinante Proteine exprimiert wurden. Diese invitro funktionellen Antigene wurden ebenfalls in Impfversuchen gestestet, wo sie aber keine protektive Wirkung entfalteten. Demgegenüber konnte mit den gleichen, in E. coli hergestellten inaktiven Isoformen zumindest ein teilweiser Schutz vor einer Belastungsinfektion hervorgerufen werden (NEWTON u. MEEUSEN 2003). Eine weitere Glykoproteinfraktion von der luminalen Oberfläche der Intestinalzellen von H. contortus wurde als H-gal-GP Komplex beschrieben. Vakzinierungsversuche mit diesen aufgereinigten, nativen Antigenen resultierten in Schafen in einer bis zu 72 % verringerten Wurmbürde und einer Reduktion der Eiausscheidung um bis zu 93 % (SMITH et al. 1994). Diese antikörpervermittelte protektive Immunität konnte durch die Verwendung von Quil A anstelle von vollständigem Freundschem Adjuvans erhöht werden. Die Effizienz gegenüber der Eiausscheidung lag hier bei 95 % (NEWTON u. MUNN 1999). Untersuchungen der Bestandteile dieses Proteinkomplexes wiesen Aspartyl-, Metallo- und Cysteinproteasen nach (KNOX u. SMITH 2001). Zwei der Aspartylproteasen zeigten in nativer Form einen begrenzten Schutz gegenüber einer Challenge-Infektion, der aber mit durch SDS denaturierten

40 Schrifttum 40 oder in E. coli exprimierten rekombinanten Proteinen nicht erreicht werden konnte. Aufgrund dieser Tatsache wurde von den Autoren die Existenz von Konformationsepitopen bei diesen Antigenen vermutet (SMITH et al. 2003b). Die Fraktion der Metalloendopeptidasen besteht aus vier verschiedenen Enzymen, die als MEP 1-4 bezeichnet wurden. Hier wurde eine protektive Wirkung hauptsächlich durch MEP 3 induziert. Versuche mit denaturiertem und prokaryontisch hergestelltem Protein deuten auch bei diesen Proteasen auf das Vorhandensein von Konformationsepitopen hin (SMITH et al. 2003a; SMITH et al. 2000b). Nach Immunisierung mit dem heterologen, aus Ostertagia ostertagi angereicherten nativen H-gal-GP und weiteren heterologen Proteasen konnte in mit H. contortus infizierten Schafen eine Kreuzimmunität ausgelöst werden (SMITH et al. 2000a). Aus Caenorhabditis elegans isolierte Darm-assoziierte Glykoproteine bewirkten dagegen in Schafen keinen Schutz gegen H. contortus, obwohl kreuzreaktive Immunglobuline gegen dessen H-gal-GP Fraktion vorhanden waren. Der fehlende Erfolg dieses Versuches wurde mit einem wahrscheinlich unterschiedlichen Glykosylierungsmuster der Proteine parasitischer Nematoden im Vergleich zu denen von C. elegans erklärt (REDMOND et al. 2004). Eine dem H-gal-GP Komplex sehr ähnliche Proteinfraktion aus H. contortus sind die sogenannten H-sialgal-GP Proteine, die ebenfalls in den Intestinalzellen lokalisiert sind. Obwohl bei diesen Antigenen die Metalloproteasen MEP 1, 2 und 4 nicht gefunden werden konnten und sie über andere Glykoproteinstrukturen verfügen, wurde in Impfversuchen mit den nativen Proteinen hinsichtlich der Reduktion der Wurm- und der Eizahlen eine protektive Immunität erzielt. Diese war ähnlich der nach Vakzinierung mit dem H-gal-GP Komplex und einem identischen Impfprotokoll beobachteten Ergebnisse (SMITH et al. 2000b). Weitere an der Oberfläche der Darmzellen integrierte Proteine sind Cysteinproteasen. Diese sind einer der Hauptbestandteile der als Thiol-Sepharosebindende Proteine (TSBP) bezeichneten Proteinfraktion von H. contortus. Nach einer Immunisierung mit den nativen Antigenen konnte die Eiausscheidung um 77 % gesenkt werden, wobei die Wirkung nur durch die Cysteinproteasen vermittelt wurde und die anderen in dem Komplex enthaltenen Proteine keine Rolle spielten (KNOX et al. 2001; KNOX et al. 2005; REDMOND u. KNOX 2004). Die Expression dreier Cysteinproteasen in E. coli ergab unlösliche rekombinante GST- Fusionsproteine, die nach einer Behandlung mit Harnstoff und DTT in Vakzinierungsversuchen eingesetzt wurden. Hierbei konnte eine Reduktion der Wurmbürde

41 Schrifttum 41 um 38% in Schafen beobachtet werden, während die Eizahl im Kot keine Differenz zur Kontrollgruppe aufwies (REDMOND u. KNOX 2004). Nachfolgende Versuche mit diesen rekombinanten Antigenen als Nicht-Fusionsproteine in einer Dosis von µg mit Quil A resultierten in einer um 29 % verringerten Wurmzahl und einer um 27 % verminderten Eiausscheidung (REDMOND u. KNOX 2006). Neben diesen hidden antigens wurden auch verschiedene natural antigens bezüglich ihres protektiven Potentials untersucht. Zwei aus e/s-produkten adulter H. contortus angereicherte 15 und 24 kda große Proteine erreichten nach dreimaliger Immunisierung in Schafen eine Effizienz von 77 % bzw. 85 % gegenüber der Eiausscheidung und der Wurmzahl (NEWTON u. MUNN 1999). Beide Antigene wurden als rekombinante Proteine in E. coli exprimiert und in adulten Schafen und Lämmern getestet. Eine Senkung der Wurmbürde und der ausgeschiedenen Eier um etwa 50 % konnte nach Belastungsinfektion in den adulten Schafen beobachtet werden. Bei den Lämmern zeigte die Vakzine hingegen keinen protektiven Effekt. Durch den Zusatz von Glykanextrakten aus Insektenzellen ließ sich die Effizienz des Impfstoffs leicht erhöhen, wobei diese Versuche aber nicht reproduzierbar waren (VERVELDE et al. 2002). Auch somatische Proteine von dritten Larven und adulten H. contortus dienen als immunogene Strukturen im Rahmen der Immunantwort nach natürlicher Infektion. Ein natives, von der Oberfläche der L 3 extrahiertes Protein bewirkte in Verbindung mit Aluminiumhydroxid einen signifikanten Schutz in Schafen vor einer Challenge-Infektion, der sich in einer Reduktion der ausgeschiedenen Eier um > 64 % und einer Verminderung der Wurmbürde um > 45 % äußerte. Dagegen zeigte das gleiche Antigen in Kombination mit Quil A keine Wirkung (JACOBS et al. 1999; NEWTON u. MUNN 1999). Drei weitere somatische Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die aus adulten H. contortus angereichert und in Schafen als Vakzine eingesetzt wurden, konnten keine protektive Immunität hervorrufen (ALUNDA et al. 2003). In geringerem Umfang wurde auch mit Antigenen anderer parasitärer Nematoden gearbeitet. SMITH et al. (2000a) isolierten aus Intestinalzellen von O. ostertagi verschiedene Glykoproteine, die weitestgehende Homologien mit den in H. contortus identifizierten Proteinkomplexen aufwiesen. Vakzinierungen in Kälbern mit einem Pool dieser Proteasen

42 Schrifttum 42 und Quil A als Adjuvans verursachten eine %ige, nicht signifikante Reduktion der Eizahl, ohne die Anzahl der Würmer zu verkleinern. Immunisierungsversuche an Rindern mit nativen Cysteinproteasen, die membrangebunden (S3-thiol) oder aber in e/s-produkten (ES-thiol) von O. ostertagi enthalten waren, ergaben sehr unterschiedliche Resultate. Beide Proteinfraktionen wurden dazu in einer Menge von 100 µg pro Impfung verwendet. In Kombination mit 750 µg Quil A wurden sie dreimalig im Abstand von drei Wochen intramuskulär appliziert. Die mit ES-thiol vakzinierten Kälber schieden 60 % weniger Eier aus, besaßen eine erhöhte Anzahl inhibierter vierter Larven und kleinere Würmer. Neben diesen signifikanten Ergebnissen war zudem die Wurmbürde um 18 % verringert. Dagegen konnten in der S3-thiol-Gruppe keine dieser Wirkungen aufgefunden werden (GELDHOF et al. 2002). In zusätzlichen vergleichenden Versuchen nach identischem Protokoll mit Aluminiumhydroxid und Quil A als Adjuvantien und ES-thiol als Antigen wurde der Einfluss des Adjuvans deutlich. In der Quil A-Gruppe konnten die Werte der ersten Immunisierung reproduziert werden, während die Aluminiumhydroxid-Vakzine keine Reduktion von Wurm- oder Eizahl und Wurmgröße verursachte (GELDHOF et al. 2004). Gegen Haemonchus placei erfolgten Vakzinierungen in Kälbern mit aus diesem Parasiten gewonnenem Darmhomogenisat. Hierbei wurden eine signifikant geringere Eiausscheidung, eine verminderte Wurmgröße und eine kleinere Anzahl weiblicher Würmer als in der Kontrollgruppe beobachtet. Diese Werte waren negativ korreliert mit dem Titer systemischer IgG1 und IgG2 (SIEFKER u. RICKARD 2000a). Die Anwendung dieses Antigens als Impfstoff in Challengeversuchen mit O. ostertagi führte trotz hoher Antikörpertiter von IgG1 und IgG2 im Serum zu keinem Erfolg (SIEFKER u. RICKARD 2000b). Lösliche Extrakte adulter Oesophagostomum radiatum wurden bezüglich ihres immunogenen Potentials in Kälbern mit verschiedenen Adjuvantien getestet. Eine signifikante Verminderung der Eizahl im Kot von 93,6 % konnte dabei mit dem Gebrauch von Dextransulfat als Adjuvans erzielt werden. Bei der Applikation des Antigens in vollständigem Freundschem Adjuvans reduzierte sich die Eiausscheidung um 27 %, wohingegen eine Kombination der Proteine mit Quil A keinen Schutz erzeugte (EAST et al. 1993). Die Verwendung larvaler Oberflächenantigene wurde bei Vakzinierungen in Schafen gegen Teladorsagia circumcincta untersucht. Mit diesen konnte eine signifikante, um 72 %

43 Schrifttum 43 geringere Wurmbürde erreicht werden (WEDRYCHOWICZ et al. 1995). Erst kürzlich wurde von REDMOND et al. (2006) ein weiterer, potentieller Vakzinekandidat für die Bekämpfung von T. circumcincta beschrieben. Diese isolierten als Hauptbestandteil der e/s-produkte eine Protease aus der Klasse der Kathepsine, die als Ziel lokaler, spezifischer IgA im Rahmen einer natürlichen Infektion von Schafen diente. Die weitere Erprobung dieses Antigens in Immunisierungsversuchen steht allerdings noch aus. Gegen Ancylostoma caninum, einen Hakenwurm des Hundes, wurde mit gleichem Erfolg wie gegen D. viviparus eine Vakzine aus röntgenattenuierten Larven entwickelt. Im Gegensatz zu dem gegen Lungenwürmer wirksamen Lebendimpfstoff wurde diese Prophylaxe allerdings nach wenigen Jahren vom Markt genommen (KNOX 2000). Auch bei A. caninum wird daher wie bei den Parasiten der Nutztiere eine Immunisierung mittels rekombinanter Antigene angestrebt. Aus den e/s-produkten der dritten Larven wurde dazu das sogenannte Secreted Protein 1 isoliert und nach Expression in E. coli zu Vakzinierungen bei Mäusen eingesetzt. Nach viermaliger Applikation mit Alum und nachfolgender Belastungsinfektion konnte eine protektive Immunität durch die Reduktion von dritten Larven nachgewiesen werden. Diese war positiv korreliert mit einem Anstieg aller Immunglobulinklassen und -subklassen, wobei nach passiver Immunisierung parasitennaiver Mäuse mit diesem Serum die schützende Wirkung übertragen werden konnte. Die höchsten Antikörpertiter im Rahmen dieser Versuche wurden bei IgG1 und IgG2b beobachtet (GHOSH u. HOTEZ 1999). Ein zweites prokaryontisch hergestelltes Enzym dritter Larven war die Metalloprotease 1, welche in Form eines His-Fusionsproteins Hunden appliziert wurde. Nach der Challenge-Infektion konnte mit diesem Impfstoff kein Schutz der vakzinierten Tiere erreicht werden, allerdings war die individuelle Wurmbürde mit der Höhe des IgG2-Titers negativ korreliert (HOTEZ et al. 2003). Eine in Pichia pastoris exprimierte enzymatisch aktive Cysteinprotease, welche in nativer Form von adulten Würmern sezerniert wird, wurde in Impfversuchen an Hunden getestet. Nach Bildung von antigenspezifischen Antikörpern konnten im Anschluss an die Infektion mit dritten Larven signifikant kleinere Würmer, eine reduzierte Eiausscheidung und eine verminderte Anzahl weiblicher Parasiten in den vakzinierten Tieren gefunden werden. Immunglobuline des Isotyps G aus dem Serum immunisierter Hunde waren zudem in der

44 Schrifttum 44 Lage, die proteolytische Aktivität der eukaryontisch hergestellten Protease in vitro zu hemmen (LOUKAS et al. 2004). Die Impfung von Hunden mit einer rekombinanten Hämoglobinase, welche ebenfalls in P. pastoris produziert worden war, resultierte in einer signifikanten 70 %igen Reduktion der ausgeschiedenen Eizahl und einer signifikanten 33 %igen Verringerung der Wurmzahl. Zusätzlich konnten klinische Symptome gemildert werden. Auch hier wurde die Funktion der Protease in vitro teilweise durch das Serum vakzinierter Tiere blockiert (LOUKAS et al. 2005). Weitere aus den adulten Stadien des Hakenwurms isolierte Proteine wurden in E. coli exprimiert und in Immunisierungsversuchen an Hunden eingesetzt. Unter diesen waren ein Inhibitor von Metalloproteasen (Ac-TMP), ein Antikoagulans (Ac-AP) und eine Kathepsin-Dähnliche Protease (Ac-ARR). Der Vakzinierung mit diesen His-Fusionsproteinen in Kombination mit Alum folgend konnte eine heterogene Induktion von Antikörpern beobachtet werden. Die Tiere, welche systemische Immunglobuline gebildet hatten, zeigten nach der Belastungsinfektion eine um 4,5-18 % verringerte Ansiedlung von adulten A. caninum im Dünndarm, wohingegen die Anzahl der Würmer im Dickdarm gegenüber einer Kontrollgruppe um 500 % erhöht war. Hunde ohne zirkulierende Antikörper wiesen keine Unterschiede zu den Kontrolltieren auf (HOTEZ et al. 2002) Dictyocaulus viviparus Bei Impfstoffversuchen gegen die Lungenwürmer der Rinder wurde zunächst versucht, immunogene Strukturen der verschiedenen Larven- und Adultenstadien zu identifizieren. Nachfolgende Schritte beinhalteten die Charakterisierung einzelner Bestandteile dieser Antigene, um sie abschließend als rekombinante Vakzinen einsetzen zu können. In den e/s-produkten adulter Würmer konnte über Enzymfärbungen und Untersuchungen wie MALDI-TOF die Existenz von Acetylcholinesterasen (AChE), Proteasen, Superoxid- Dismutasen (SOD), eines putativen MSP und sechs weiterer, noch nicht identifizierter Proteine gezeigt werden (BRITTON et al. 1994; MATTHEWS et al. 2004; MCKEAND 2000; MCKEAND et al. 1994). Unter diesen Proteinen konnte nur ein einziges Glykoprotein nachgewiesen werden. Durch Immunopräzipitationen mit Seren lungenwurminfizierter Kälber konnte die Antigenität fast aller Proteine der e/s-produkte im Verlauf einer natürlichen

45 Schrifttum 45 Dictyocaulus-Infektion gezeigt werden (BRITTON et al. 1993; MATTHEWS et al. 2004). Vakzinierungsversuche an Meerschweinchen mit e/s-produkten adulter D. viviparus erzeugten nach zweimaliger Injektion mit vollständigem Freundschem Adjuvans eine protektive Immunität gegenüber einer Challenge-Infektion, wobei die Schutzwirkung auf antikörpervermittelten Immunreaktionen beruhte. Dieses konnte durch die Übertragung von Seren aus Tieren der Impfgruppe in parasitennaive Meerschweinchen gezeigt werden. Nach dieser passiven Immunisierung waren diese vor einer Belastungsinfektion geschützt (MCKEAND et al. 1995b). Daraufhin wurden Impfungen mit den e/s-produkten in Kälbern durchgeführt. Eine Dosis von 100 µg Antigen wurde dazu in Kombination mit unvollständigem Freundschem Adjuvans im Abstand von vier Wochen zweimal subkutan appliziert, womit nach der Belastungsinfektion der Tiere keine protektive Immunität erzielt werden konnte (MATTHEWS et al. 2001). Als ein attraktiver Vakzinekandidat wurde die SOD bewertet, nachdem über den Zusatz von Seren infizierter Kälber die in-vitro Aktivität der SOD gesenkt werden konnte (BRITTON et al. 1994). Weiterführende Arbeiten zum immunologischen Potential dieses Antigens wurden allerdings noch nicht veröffentlicht. Die Verwendung des MSP in diagnostischen Tests aufgrund seiner antigenen Eigenschaften wurde bereits in Kapitel geschildert. Dieses Protein wurde zusätzlich in einem prokaryontischem Expressionssystem als rekombinantes His-Fusionsprotein hergestellt und in Immunisierungsversuchen an Mäusen und Rindern getestet. Die Applikation erfolgte bei den Mäusen in einer Dosis von 10 µg in GERBU-Adjuvans 100, die Kälber erhielten 100 µg des Proteins in Verbindung mit GERBU-Adjuvans LQ. Das Impfschema sah für die Mäuse eine zweimalige subkutane Injektion in zweiwöchigem Abstand vor, die Rinder wurden ein drittes Mal drei Wochen nach der zweiten Boosterimpfung immunisiert. Auch hier fand eine subkutane Anwendung statt. 14 Tage nach der ersten Impfung wurde bei beiden Tierarten ein Anstieg spezifischer Immunglobuline des Isotyps G im Serum beobachtet. Nach der Challenge-Infektion der Kälber konnten um 64 % verminderte Larvenzahlen im Kot und um 71 % reduzierte Wurmzahlen in der vakzinierten Gruppe aufgefunden werden. Aufgrund einer geringen Anzahl an Versuchstieren konnten diese Ergebnisse aber nicht statistisch abgesichert werden Die Länge der adulten D. viviparus aus den immunisierten Rindern war mit einer Reduktion von 40 % signifikant verringert (KÖHRMANN 2002).

46 Schrifttum 46 Die Impfung von Meerschweinchen mit einer aus e/s-produkten angereicherten AChE- Fraktion in Kombination mit vollständigem Freundschem Adjuvans resultierte in einem hohen spezifischen Immunglobulinspiegel. Nach der Belastungsinfektion der Tiere wurden in der Impfgruppe signifikant geringere Wurmbürden beobachtet als in der Kontrollgruppe (MCKEAND et al. 1995a). Bei Untersuchungen der AChE in sezernierten Überständen adulter Würmer konnten fünf Isoformen des Enzyms gefunden werden, von denen mehrere in E. coli als rekombinante Proteine exprimiert wurden (LAZARI et al. 2003; MCKEAND et al. 1994). Mit einem dieser Antigene, welches als His-Fusionsprotein hergestellt worden war, wurden Immunisierungsversuche in Rindern durchgeführt. Nach zweimaliger subkutaner Injektion von je 100 µg Protein in Verbindung mit unvollständigem Freundschem Adjuvans wurde keine protektive Immunität gegenüber einer Infektion mit Lungenwürmern hervorgerufen (MATTHEWS et al. 2001). Auch somatische Antigene der infektiösen oder parasitären Stadien von D. viviparus wurden bezüglich ihrer Eignung zur Immunoprophylaxe einer Dictyokaulose untersucht. McKeand et al. (1996) wiesen dabei die Bindung von Antikörpern, die aus Seren infizierter Kälber gewonnen worden waren, an die Oberflächenstrukturen von adulten Würmern sowie bescheideten und artifiziell entscheideten dritten Larven nach. Vakzinierungen mit dem aus ganzen adulten Lungenwürmern extrahiertem Antigen erreichten in Rindern eine signifikante Reduktion der Wurmzahl, obwohl stark schwankende individuelle Wurmbürden in der Impfgruppe beobachtet wurden (JARRETT et al. 1957). In Meerschweinchen dagegen wurde nach der Immunisierung mit somatischen Antigenen adulter Würmer trotz Bildung spezifischer Immunglobuline kein Schutz gegen eine Belastungsinfektion induziert (MCKEAND et al. 1995b). Eine Charakterisierung der Bestandteile somatischer Antigene wurde bisher mit der Identifikation zweier neuromuskulärer AChE-Gene und eines für eine putative Kathepsin L Protease kodierenden Gens nur marginal beschrieben (BRITTON u. MURRAY 2002; LAZARI et al. 2004; SELKIRK et al. 2005). Dieses Enzym besitzt aufgrund seiner für die Embryogenese der Nematoden essentiellen Rolle die nötigen Voraussetzungen, um als Antigen im Rahmen von Vakzinierungen eingesetzt werden zu können (BRITTON u. MURRAY 2002).

47 Schrifttum Das Major Sperm Protein (MSP) Major Sperm Proteine sind nematodenspezifische, kleine Proteine mit einer Länge von unter 150 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von ungefähr 14 kda. Sie werden ausschließlich in den Spermatozyten der männlichen Würmer synthetisiert, wo sie 15 % des gesamten und über 40 % des löslichen Proteins der Zellen bilden (SCOTT 1996). Diese Proteine erfüllen zwei wichtige Funktionen in der Reproduktion der Helminthen. Zum einen bewirken sie als zytosolische Komponente die Fortbewegungsfähigkeit der reifen Spermien, und zum anderen dienen sie in sezernierter Form als Hormone für den weiblichen Geschlechtstrakt (MILLER et al. 2001). Aufgrund ihrer Spezifität und ihrer Rolle bei der Vermehrung der Würmer erscheinen die MSPs als geeignete Ziele zur Bekämpfung von Nematodeninfektionen (SCOTT 1996; TARR u. SCOTT 2005b). Die Sequenz des in dieser Arbeit verwendeten MSP von D. viviparus wurde als Dv3-14 erstmals von SCHNIEDER (1993b) beschrieben und nach Korrektur unter der Accession number S64873 in der Datenbank des National Centre for Biotechnology Information (NCBI) veröffentlicht (SETTERQUIST u. FOX 1995) MSP-Domänen Proteine (MDPs) Das MSP als monomeres Protein liegt in einer ß-Faltblattstruktur vor und besitzt damit eine sogenannte Immunglobulin-ähnliche (Ig-ähnliche) Domäne. Diese wird als MSP-Domäne bezeichnet und dient generell der Protein-Protein Interaktion mit anderen Ig-ähnlichen Regionen. Werden die MSP-Domänen in anderen Proteinen gefunden, so erhalten diese die Bezeichnung MSP-Domänen Proteine (MDPs). Diese Proteine wurden in einer Vielzahl eukaryontischer Organismen wie Pflanzen, Pilze, Säugetiere, Protozoen und Helminthen nachgewiesen (TARR u. SCOTT 2005b). Die Autoren teilen die MDPs anhand der relativen Position ihrer MSP-Domänen in fünf Gruppen ein. Typ I MDPs sind dabei kleine, unter 150 Aminosäuren lange Proteine, die zu über 80 % aus der MSP-Domäne bestehen und keine andere Domäne enthalten. Diese Gruppe wird vorrangig von den klassischen MSPs der Nematoden gebildet. Zu den Typ II MDPs werden die Proteine zugeordnet, die 150 bis 350 Aminosäuren lang sind und bei denen die MSP-Domäne im N-terminalen Bereich zu finden ist. Durch das Fehlen bzw. die Existenz einer oder zweier C-terminaler Transmembranregionen kann diese Gruppe weiter unterteilt werden. Typ II MDPs sind in

48 Schrifttum 48 vielen Spezies vertreten, ihr Nachweis gelang in Nematoden-, Pflanzen-, Säugetier- und Hefearten. Die 150 bis 450 Aminosäuren langen Proteine, die am C-Terminus eine MSP- Domäne aufweisen, sind in den Typ III MDPs zusammengefasst. Diese kommen vorwiegend bei Nematoden vor und können am N-terminalen Ende entweder keine oder aber eine Transmembrandomäne besitzen. Die zu den Typ IV MDPs gehörenden Proteine zeigen eine zentrale MSP-Domäne und sind mit oder ohne Transmembranregion in ähnlich vielen Spezies wie Typ II MDPs vorhanden. Typ V MDPs dagegen sind nur vereinzelt bei Pflanzen und Schistosomen nachgewiesen worden. Sie sind durch zwei MSP-Domänen charakterisiert. Über die Funktionen der MDPs ist mit Ausnahme des MSP bisher wenig bekannt. Bei Nematoden scheinen die MDPs eine wichtige Rolle im Bereich der Reproduktion der männlichen Würmer einzunehmen. Dieses wurde aus der verstärkten Expression dieser Proteine in männlichen, geschlechtsspezifischen Zellen von A. suum und C. elegans hergeleitet (TARR u. SCOTT 2004; TARR u. SCOTT 2005b). In den Abschnitten und werden einige Funktionen der MDPs dargestellt Vorkommen MSP-Gene wurden bei mehr als 25 Nematodenspezies beschrieben, wo sie als Multigen- Familie mit einer stark schwankenden Anzahl von Genen zwischen den Arten identifiziert wurden (SCOTT 1996). Bei dem nicht parasitierenden Erdnematoden C. elegans konnten 60 MSP-Gene aufgefunden werden, während parasitisch lebende Helminthen wie A. suum, Brugia malayi und Onchocerca volvulus nur zwei dieser Gene aufweisen. Die Gründe für die so verschiedene Ausprägung der genomischen Organisation der MSPs konnten aber bisher nicht herausgefunden werden (SCOTT et al. 1989a; SCOTT et al. 1989b; SCOTT 1996). Die bei den genannten Parasiten vorhandenen zwei MSP-Gene kodieren für zwei Isoformen des MSP, die sich bei B. malayi und O. volvulus in nur fünf Aminosäuren unterscheiden. Die als MSPα und MSPβ bezeichneten Isoformen des MSP von Ascaris suum besitzen sogar nur vier unterschiedliche Aminosäuren. Zwischen den drei Spezies sind die Aminosäuresequenzen der MSPs zu 80 % bis 90 % identisch, was den sehr hohen Konservierungsgrad des Proteins charakterisiert (COTTEE et al. 2004; HOJAS u. POST 2000; SCOTT 1996). Dieser konnte bei weiteren Vergleichen von MSP- Aminosäuresequenzen bestätigt werden. Eine über 80 %ige Identität wurde dazu innerhalb

49 Schrifttum 49 der MSP-Sequenzen von Oesophagostomum dentatum, Ancylostoma ceylanicum, Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta, Nippostrongylus brasiliensis, C. elegans, A. suum, O. volvulus und D. viviparus festgestellt (COTTEE et al. 2004). Der Aufbau der genomischen Sequenzen der MSPs variiert je nach Spezies, wobei Gene mit und ohne Introns nachgewiesen wurden. Bei den Filarien Mansonella ozzardi und O. volvulus beispielsweise ist jeweils ein Intron unterschiedlicher Länge vorhanden, das bei allen Sequenzen an der gleichen Stelle beginnt. Die Größe des Introns schwankt dabei zwischen 233 Basenpaaren (bp) in M. ozzardi und bp in verschiedenen Isolaten von O. volvulus (HOJAS u. POST 2000). Demgegenüber enthalten zwei MSP-Gene von O. dentatum kein Intron (COTTEE et al. 2004). Die geschlechtsspezifische und stadienspezifische Expression des MSP wurde mittels quantitativer Real-time PCR in B. malayi und O. dentatum untersucht. Hierbei konnte bei beiden Helminthen die Existenz von für das MSP kodierender mrna ausschließlich bei männlichen Würmern nachgewiesen werden (COTTEE et al. 2004; LI et al. 2004). Diese war ebenfalls in geschlechtlich differenzierten späten vierten Larven von O. dentatum mit einem niedrigeren Level als bei den adulten Nematoden nachweisbar. Frühe vierte und dritte Larven hingegen zeigten noch keine Transkription des MSP (COTTEE et al. 2004). Das in den Spermien von Graphidium strigosum exprimierte MSP wurde in Immunoblots und in immunozytochemischen Untersuchungen mit einem polyklonalen, gegen das MSP von C. elegans gerichteten Antikörper detektiert. Durch welche Immunglobulinklasse diese Kreuzreaktion stattfand wurde allerdings nicht näher beschrieben (MANSIR u. JUSTINE 1999) Funktionen Im Verlauf der Spermatogenese bei Nematoden entstehen aus Spermatogonien reife, motile Spermatozoen. Dazu werden aus den Spermatogonien zunächst primäre und später sekundäre Spermatozyten gebildet, die durch Meiose haploide Zellkerne enthalten. Jeder dieser Kerne wird mit dem umgebenden Zytoplasma durch Knospung zu unbeweglichen Spermatiden, die nach Reifung als motile Spermatozoen im Vas deferens vorliegen. Während des Prozesses der Knospung werden das Endoplasmatische Reticulum, der Golgi Apparat, die Ribosomen, Mikrotubuli und Mikrofilamente als Residualkörper zurückgelassen, so dass die

50 Schrifttum 50 nachfolgenden Spermatiden und Spermatozoen keine Möglichkeit der Proteinsynthese mehr besitzen. Die Bildung des MSP findet daher in den Spermatozyten statt. Anschließend werden die Proteine als sogenannte fibröse Körper im Zytoplasma gelagert und gehen mit diesem auf die Spermatiden über. Hier kann nach Aktivierung der reifen Spermien auf den MSP-Vorrat zurückgegriffen werden (SCOTT 1996) Spermienmotilität Die Spermien der Nematoden zeigen im Gegensatz zu den Spermien von Säugetieren eine amoeboide, kriechende Fortbewegung, die eine Geschwindigkeit von bis zu 50 µm/min erreichen kann. Diese Art der Bewegung wird durch die Ausbildung von Pseudopodien ermöglicht, deren Grundlage durch ein Zytoskeleton aus MSP-Filamenten gebildet wird (ROBERTS u. STEWART 2000; SCOTT 1996; STEWART et al. 1998). Die amoeboide Fortbewegungsfähigkeit aller anderen eukaryontischen Zellen basiert dagegen auf Aktin, das in Spermien nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ist (MANSIR u. JUSTINE 1999). Trotz fehlender Sequenzhomologien und keiner strukturellen Ähnlichkeiten beider Proteine sind die mechanischen Prinzipien der Kriechbewegung bei diesen fast identisch. Der größte Unterschied zwischen der Struktur des Aktin und der des MSP besteht in der fehlenden Polarität des MSP, die eine Steuerung der Zytoskeletonbildung über Motorproteine wie Myosin unmöglich macht. Daher erfolgt die Organisation und Regulation der MSP- Polymerisation durch externe Faktoren, zu denen auch einige MDPs gehören (ROBERTS u. STEWART 2000; STEWART u. ROBERTS 2005; TARR u. SCOTT 2005b). Das Zytoskeleton der Spermien besteht aus einem Netzwerk von MSP-Filamenten, die aus von MSP-Dimeren gebildeten Subfilamenten aufgebaut sind. Diese Zusammenlagerung der MSP-Moleküle findet in den hervorstehenden Randbezirken der Pseudopodien statt und bewirkt ein Vorwärtsschieben des Zellausläufers. Gleichzeitig wird das polymerisierte MSP an dessen Basis abgebaut, was in einer Retraktion des Zellkörpers resultiert. Eine Neutralisation dieser beiden gegensätzlichen Kräfte wird über die Adhäsion des zwischen ihnen liegenden Zellbereiches an eine Oberfläche verhindert. Das Prinzip dieser amoeboiden Bewegung wird auch als Push-Pull Mechanism bezeichnet (MIAO et al. 2003; ROBERTS u. STEWART 2000; STEWART u. ROBERTS 2005).

51 Schrifttum 51 Die externen Faktoren, die diese Prozesse koordinieren, sind zum einen der intrazelluläre ph- Wert und zum anderen verschiedene Proteine. Über eine Veränderung des ph-wertes kann dabei sowohl die Polymerisation als auch die Depolymerisation der Filamente gestoppt oder aber auch wieder aufgenommen werden (ITALIANO et al. 1999). Die Steuerung des Filamentnetzwerkes wird auch von MDPs übernommen. In Ascaris-Spermien konnten dazu zwei als MSP-Fiber Proteine (MFP) 1 und 2 benannte Proteine identifiziert werden, die auf den Filamentaufbau entgegengesetzte Wirkungen haben, wobei dieser durch MFP 1 gehemmt und durch MFP 2 gefördert wird (BUTTERY et al. 2003). Der Mechanismus der Wechselwirkungen zwischen den Proteinen ist unbekannt. Neuere Untersuchungen beweisen allerdings die direkte Bindung eines Bestandteils des MFP 1 an das MSP (TARR u. SCOTT 2005a). Den Transmembranproteinen unter den MDPs wird eine Rolle bei der Verankerung der MSP-Filamente an der Membran des Pseudopodiums zugeschrieben (TARR u. SCOTT 2005b). Ein 48 kda großes, in der Membran integriertes Phosphoprotein erwies sich hierzu in Ascaris-Spermien als der Ausgangspunkt der MSP-Polymerisation in den Membranen der Zellausläufer (LECLAIRE 2003). Aufgrund einer starken Ähnlichkeit einiger MDPs mit dem Chaperon PapD aus E. coli wird eine zusätzliche Funktion von MDPs bei der Faltung des MSP in Nematoden vermutet (TARR u. SCOTT 2005b) Oozytenreifung und Ovulation Das Vorkommen eines putativen MSP in e/s-produkten adulter D. viviparus wurde erstmals von MATTHEWS et al. (2004) gezeigt, die damit neben der intrazellulären, filamentösen Form des MSP eine zweite, sezernierte Form bei Lungenwürmern nachweisen konnten. Die Funktion dieses extrazellulären Proteins bei C. elegans besteht in einer hormonellen Wirkung auf den Geschlechtstrakt weiblicher Würmer, wodurch die Oozytenreifung und die Ovulation hervorgerufen werden. Dazu sind zwei Signalregionen auf dem MSP vorhanden: das C- terminale Ende mit den Aminosäuren vermittelt die Ovulation und das N-terminale Ende von Aminosäure die Oozytenreifung (MILLER et al. 2001). Diese besteht in einer Wiederaufnahme der Meiose der Eizellen, die bis zur Insemination unterbrochen ist (MILLER et al. 2001; YAMAMOTO et al. 2006). Die Bindung von MSP an membranständige Rezeptoren der Oozyten löst dann eine intrazelluläre Enzymkaskade aus, deren Resultat die Bereitstellung befruchtungsfähiger Eizellen ist (KUWABARA 2003;

52 Schrifttum 52 MILLER et al. 2003). Der Transport dieser reifen Oozyten zu den Spermien wird ebenfalls über das MSP als Hormon erreicht, welches die Ovulation mit Scheidenzellkontraktionen bewirkt (MILLER et al. 2001). Die Sekretion des MSP, das keine Signalsequenz zur Ausschleusung aus der Zelle besitzt, findet trotz des Fehlens von Golgi Apparat, Endoplasmatischem Reticulum und Ribosomen statt. Mittels neuerer Untersuchungen konnte in den Spermien der Nematoden die Existenz einer neuen Form von Vesikeln nachgewiesen werden, die anscheinend durch das MSP selber gebildet werden. Diese enthalten nach der Knospung von der Zelle zwischen ihrer inneren und äußeren Membran MSP-Moleküle. Aufgrund ihrer Labilität erfolgen ein Zerfall der Vesikel und damit eine Freisetzung des MSP, worauf es seine Wirkung entfalten kann (KOSINSKI et al. 2005; YAMAMOTO et al. 2006).

53 Material und Methoden 53 3 Material und Methoden 3.1 Puffer und Lösungen AP-Puffer: 100 mm NaCl; 5 mm MgCl 2 x 6 H 2 O; 100 mm Tris-HCl ph 9,5 in Reinstwasser BCIP-Stocklösung: 50 mg/ml 5-Brom-4-Chloro-3-Indolylphosphat in 100 %igem Dimethylformamid Beschichtungspuffer für ELISA 15 mm Na 2 CO 3 ; 35 mm NaHCO 3 ; Na 2 CO 3 vorlegen und mit NaHCO 3 auf ph 9,6 einstellen Blotpuffer für Westernblot: 24 mm Tris; 192 mm Glycin; 20 % Methanol in Reinstwasser Coomassie-Blue Stammlösung: 0,1 % Brilliant blue R 250 Coomassie-Fixier-Färbelösung.: 40 % Methanol; 10 % Eisessig; 10 % 0,01 %ige Coomassie-Blue Stammlösung; 40 % Reinstwasser Coomassie-Entfärbelösung: 10 % Eisessig, 90 % Reinstwasser DEPC-Bidest: 0,1 % Diethylpyrocarbonat in Aqua bidest., 12 Stunden bei 37 C rühren, anschließend 15 min bei 100 C ELISA-Substrat: 12,5 ml Reinstwasser; 6,075 ml Zitratpuffer; 6,425 ml Phosphatpuffer; 10 mg o-phenylendiaminedihydrochlorid; 10 µl 30 %iges H 2 O 2 Elutionspuffer für Protein: 10 mm reduziertes Glutathion; 50 mm Tris (ph 8,0) in Aqua bidest. Geltrocknungslösung: 40 % Methanol; 10 % Glycerol; 7,5% Eisessig; 42,5 % Reinstwasser GIT-Puffer: 4M Guanidinium; 0,1 M Tris (ph 7,5); 1 % ß- Mercaptoethanol in Aqua bidest. Glycerol für Stocks: 65 % Glycerol; 100 mm MgSO 4 ; 25 mm Tris-HCl (ph 8,0) in Aqua bidest. Laufpuffer für SDS-PAGE, 10x: 0,025 M Tris; 0,192 M Glycin; 0,1 % Sodium-Dodecyl- Sulfat (ph 8,5) in Reinstwasser

54 Material und Methoden 54 Ladungspuffer für Agarosegele, 6x: 0,25 % Bromphenolblau; 40 % Saccharose in Aqua bidest. Lysispuffer (Gateway): 50 mm Kaliumphosphat (ph 7,8); 400 mm NaCl; 100 mm KCl; 10 % Glycerol; 0,5 % Triton X-100; 10 mm Imidazol Nativer Elektrophoresepuffer: 0,025 M Tris; 0,192 M Glycin (ph 8,5) in Reinstwasser Natives Polyacrylamidsammelgel: 4,23 ml Aqua bidest.; 1,02 ml 30 %iger Acrylamidmix; 0,75 ml 1,0 M Tris (ph 6,8) ; 30 µl 10 %iges Ammoniumpersulfat ; 10 µl TEMED Natives Polyacrylamidtrenngel : 3,3 ml Aqua bidest, 4,0 ml 30 %iger Acrylamidmix, 2,5 ml 1,5 M Tris (ph 8,8) ; 50 µl 10 %iges Ammoniumpersulfat ; 5 µl TEMED Nativer Probenpuffer für Proteine: 6,375 ml Aqua bidest.; 625 µl 1,0 M Tris (ph 6,8); 3 ml Glycerol; 0,1 ml Bromphenolblau ( aus Stocklösung: 5 mg/100 µl) NBT-Stocklösung: 50 mg/ml Nitro-Tetrazolium-Chlorid in 70 %igem Dimethylformamid PBS, 1x: 150 mm NaCl; 16 mm Na 2 HPO 4 x 7 H 2 O; 4 mm NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O in Aqua bidest. PBS-Tween: 1x PBS; 0,05 % Tween 20 Phosphatpuffer: 0,2 M Na 2 HPO 4 in Reinstwasser SDS-Sammelgel, 5 %ig: 2,7 ml Aqua bidest.; 0,67 ml 30 %iger Acrylamidmix; 0,5 ml 1,0 M Tris (ph 6,8) ; 40 µl 10 %iges SDS ; 40 µl 10 %iges Ammoniumpersulfat ; 4 µl TEMED SDS-Probenpuffer: 5,4 ml Aqua bidest.; 0,5 ml 1,0 M Tris (ph 6,8); 2 ml 10 %iges SDS; 1 ml Glycerol; 0,1 ml Bromphenolblau (aus Stocklösung: 5 mg/100 µl) Kurz vor Gebrauch: 1 M DTT im Verhältnis 1:11 zugeben

55 Material und Methoden 55 SDS-Trenngel, 12 %ig: 3,3 ml Aqua bidest, 4,0 ml 30 %iger Acrylamidmix, 2,5 ml 1,5 M Tris (ph 8,8); 0,1 ml 10 %iges SDS; 0,1 ml 10 %iges Ammoniumpersulfat; 4 µl TEMED Stopplösung für ELISA: 2,5 M H 2 SO 4 TAE-Puffer, 1x: 40 mm Tris; 1mM EDTA (ph 8,0) in autoklaviertem Aqua bidest. TBS, 1x: 140 mm NaCl; 10 mm Tris-Base (ph 7,3) TBS-Tween: 1x TBS; 0,05 % Tween 20 TE-Puffer: 10 mm Tris-HCl; 1mM EDTA in autoklaviertem Aqua bidest. Trizin-EDTA: 10 mm Trizin; 1 mm EDTA (ph 8,5 mit KOH einstellen) Westernblot-Färbelösung: 10 ml AP-Puffer; 66 µl NBT-Stocklösung; 33 µl BCIP- Stocklösung Zitratpuffer: 0,1 M C 6 H 6 O 7 in Reinstwasser 3.2 Medien und Platten LB-Medium: 1 % Bacto Trypton; 0,5 % Hefeextrakt; 1 % NaCl (ph 7) LB-Agarplatten: LB-Medium mit 15 g Agar/l Sämtliche Lösungen wurden autoklaviert. Als Antibiotika kamen Kanamycin in einer Konzentration von 50 µg/ml Medium bzw. Ampicillin in einer Konzentration von 100 µg/ml Medium zum Einsatz. 3.3 Reagentien, Enzyme, Reaktionsgefäße, Reaktionskits und Geräte ADVANCED BIOTECHNOLOGIES ABGENE, Hamburg Thermo-Start DNA Polymerase AGILENT TECHNOLOGIES, Waldbronn Agilent 2100 Bioanalyzer; Protein 200 Plus LabChip-Kit

56 Material und Methoden 56 AMERSHAM BIOSCIENCES, Freiburg Hybond-C-Extra ; Thrombin-Protease; Glutathion Sepharose High Performance ; Ultrospec 2000 Photometer; GeneQuant pro RNA/DNA Calculator; APPLIED BIOSYSTEMS, Darmstadt GeneAmp PCR System 9700; MgCl 2 -Solution BD CLONTECH, Heidelberg Advantage 2 Polymerase Mix; Advantage 2 PCR Kit BECKMAN Coulter, Krefeld J2-21 M/E Zentrifuge BIOMETRA, Göttingen Trio-Thermoblock; Standard Power Pack P25; UNO-Thermoblock BIO-RAD, München Mini-Protean II ; Electro-Eluter Modell 422; Quickstart Bradford Dye Reagent BIO-TEK, Bad Friedrichshall Elx800 ELISA-Reader BIOZYM, Hessisch Oldendorf GelStar CEDI-DIAGNOSTICS, Lelystad, Niederlande Ceditest Lungworm EPPENDORF, Hamburg Centrifuge 5415 R

57 Material und Methoden 57 FERMENTAS, St. Leon-Rot EcoR I; BamH I, Not I; T4 DNA Ligase FRESENIUS, Bad Homburg Ampuwa GERBU BIOTECHNIK, Galberg Saponin Quil A; Alhydrogel Adjuvant GFL, Burgwedel Wärmeschrank 3033; Überkopf-Schwenker 3025 HERAEUS SEPATECH, Osterode Omnifuge 2.ORS; Biofuge Pico, Wärmeschrank BT 5042 E HOEFER, San Francisco, USA TE 70 Blotkammer; HE33 Mini Submarine Electrophoresis Unit, Multiscreen Kammer INVITROGEN, Karlsruhe TA Cloning Kit ; Low DNA Mass Ladder; Trizol Reagent; Superscript III Rnase H- Reverse Transcriptase; BenchMark Fluorescent Protein Standard; Gateway LR Clonase Enzyme Mix; Oligo (dt) 20 Primer INTAS, Göttingen UV-Tisch TF-M 20x40cm, 312nm; Video-Geldokumentations-Anlage JOUAN, Unterhaching Zentrifuge BR4i LABORTECHNIK FRÖBEL, Lindau Blotschüttler 1200

58 Material und Methoden 58 MACHEREY & NAGEL, Düren Nucleobond Ax-100; Nucleospin Plasmid; Blotting-Papier 14x16 cm MIN 440 B MSE SCIENTIFIC INSTRUMENTS, Sussex, Großbritannien Ultraschallgerät PK 1653 NUNC, Wiesbaden Immunowasher 12; Nunc Immobilizer Amino, F 96, transparent; Nunc Immobilizer Glutathion, F96, transparent; Immuno Platten, transparent, F96, MaxiSorp; Klebefolie 96 OLYMPUS OPTICAL, Hamburg Digitalkamera C5050; Software DP-Soft C-5050; Stereolupe Pharmacia LKB Bromma, Stockhom, Schweden 2303 Multidrive XL Stromquelle PROMEGA, Mannheim Gel Drying Film; Rnasin Plus Rnase Inhibitor; MagneGST Protein Purification System; Set of Deoxynucleotide Triphosphates (dntps); RQ Rnase-Free Dnase RENNER, Dannstadt Celluloseacetat Membrane 0,2 µm Sterilfilter; Parafilm ROTH, Karlsruhe Roti-Block ; LB-Medium; Agarose NEEO Ultra Qualität Rotiagarose ; Roti Mark prestained; Ampicillin Natriumsalz; Isopropyl-ß-D-thiogalactosid (IPTG); Kanamycinsulfat; Natriumhypochlorid-Lösung 12% Cl, Chloroform SARTORIUS, Göttingen Elektronische Präzisionswaage L610D; Vivaspin 6ml Concentrator, MWCO

59 Material und Methoden 59 SCHRÖDER, Hamburg Kryosafe SEROTEC, Düsseldorf Sheep Anti Bovine IgA: HRP; Sheep Anti Bovine IgG: HRP; Sheep Anti Bovine IgG1: HRP; Sheep Anti Bovine IgG2: HRP; Sheep Anti Bovine IgM:HRP SIGMA-ALDRICH, Steinheim Monoclonal Anti-Bovine IgG, Clone BG-18, AP-Conjugate; Anti-Mouse IgG (whole molecule), AP-Conjugate; Monoclonal Anti Glutathione-S-Transferase, Clone GST-2; bovines Serumalbumin STRATAGENE, Amsterdam, Niederlande MX 4000 Multiplex Quantitative PCR System; Brilliant Quantitative PCR Core Reagent Kit ZEISS, Jena Stereomikroskop Axiostar plus; Stereomikroskop Axiophot Als Pipetten dienten Eppendorf Research 10, 100, 1000, 5000 und für die quantitative Realtime PCR Eppendorf Research pro 10, 100, 1000 der Firma EPPENDORF, Hamburg. Als Reaktionsgefäße wurden 0,5 ml Safe-Lock Gefäße der Firma EPPENDORF, Hamburg, 1,5 ml und 2 ml Gefäße sowie 0,5 ml, 1,5 ml und 2 ml DEPC-Gefäße der Firma BIOZYM, Hessisch Oldendorf, 12 ml Gefäße der Firma RENNER, Dannstadt und 50 ml Gefäße der Firma SARSTEDT, Nürmbrecht verwendet. In der quantitativen Real-time PCR wurden als Reaktionsgefäße 8x strip tubes im 0,2 ml-format sowie optische Deckel (8x strip optical cap) der Firma STRATAGENE, Amsterdam, Niederlande genutzt. Für die PCR wurden Sterilfiltertips der Firma BIOZYM, Hessisch Oldendorf gebraucht. Zur Blutentnahme wurden Strausskanülen der Firma WDT, Garbsen und Serum- sowie EDTA-Monovetten mit dem Volumen 9 ml der Firma SARSTEDT, Nürmbrecht verwendet. Die Impfungen wurden mit 1 ml bzw. 2 ml Spritzen und 0,9 x 40 mm Kanülen der Firma WDT, Garbsen durchgeführt.

60 Material und Methoden Bakterien und Vektoren Bakterien: One Shot TOP10 Chemically Competent Escherichia coli (INVITROGEN) F - mcra (mrr-hsdrms-mcrbc) Φ80lacZ M15 lacx74 reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk rpsl (Str R ) enda1 nupg One Shot BL21 (DE3) Chemically Competent Escherichia coli (INVITROGEN) F - ompt hsds B (r - B m - B ) gal dcm (DE3) Vektoren: pcr4 -TOPO pgex-2tk pgex-4t-3 pgex-6p-3 pentr 3C pdest 15 Gateway Technology System pet160-dest Alle verwendeten Vektoren stammten von der Firma INVITROGEN, Karlsruhe. 3.5 Versuchsplan Basierend auf der von SCHNIEDER (1993b) veröffentlichten Gensequenz Dv3-14 wurden für das MSP von D. viviparus spezifische Primer hergestellt. Mittels darauffolgender Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde dann aus der cdna adulter Lungenwürmer das kodierende Genfragment amplifiziert und isoliert. Dieses konnte anschließend in verschiedene Vektoren kloniert und in einem prokaryontischem Expressionssystem als rekombinantes Protein exprimiert werden. Nach der Aufreinigung des Proteins mittels eines Glutathion-S-Transferase- (GST-) Tags und seiner Identifizierung über Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight- (MALDI-TOF-) Analyse wurde es in Immunisierungsversuchen eingesetzt.

61 Material und Methoden 61 Dazu wurde das MSP einzeln oder in Kombination mit anderen rekombinanten Proteinen an Rindern getestet. Die Vakzinierung umfasste ebenfalls die Erprobung verschiedener Adjuvantien, als Negativkontrolle dienten nur mit dem Adjuvans immunisierte Rindergruppen. Nach Boosterimpfungen wurde eine Challenge-Infektion aller Tiere mit infektiösen Lungenwurmlarven durchgeführt. Am Ende des Versuches konnten nach der Sektion der Rinder die adulten Würmer aus der Lunge gewonnen und im Anschluss an die Bestimmung des Geschlechtes gezählt werden. Daneben wurde die Wirkung der Immunisierung mittels klinischer und weiterer parasitologischer Parameter wie der Larvenausscheidung und der Wurmgröße erfasst. Zudem wurden zur Überwachung der serologischen Reaktionen mehrere Enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) auf Basis des rekombinanten MSP entwickelt, anhand derer die spezifische Antikörperbildung verfolgt werden sollte. Zusätzliche labordiagnostische Untersuchungen zum Differentialblutbild und zur Serologie machten eine umfassende Bewertung des Versuches möglich. Einer der oben beschriebenen ELISA wurde aufgrund seiner Spezifität und Sensitivität dazu ausgewählt, als serologischer Test in der Diagnostik von Lungenwurminfektionen angewendet zu werden. Daher erfolgte eine Validierung dieses ELISA mit Seren parasitennaiver und mit Seren D. viviparus-infizierter Rinder. Kreuzreaktionen wurden durch die Einbeziehung von Seren ausgeschlossen, die von Rindern mit Ostertagia- bzw. Cooperia- Infektionen stammten. Schließlich wurden auf der Grundlage isolierter RNA aus Larven- und Adultenstadien mittels einer quantitativen Real-time PCR stadien- und geschlechtsspezifische Transkriptionsunterschiede für das MSP erarbeitet. Darüberhinaus wurde diese Methode angewendet, um eventuelle Unterschiede in der Transkription des MSP adulter Lungenwürmer festzustellen, die aus den immunisierten und den Kontrollgruppen des Vakzinierungsversuches stammten.

62 Material und Methoden Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) Die Polymerase-Kettenreaktion beruht im Grundsatz auf einer spezifischen enzymatischen Vervielfältigung von Nukleinsäuren, bei der in einem ersten Schritt doppelsträngige DNA durch hohe Temperaturen in zwei Einzelstränge gespalten wird (Denaturierung). Daraufhin können sich nach Abkühlung auf eine für sie optimale Temperatur spezifische Oligonucleotidprimer an die zu flankierende DNA-Matrize anlagern (Annealing). Anschließend wird ausgehend von den Primern eine komplementäre DNA-Kopie durch thermostabile Polymerasen erstellt (Extension), so dass wieder eine doppelsträngige DNA vorhanden ist. Diese drei Schritte werden in mehreren Zyklen wiederholt, bei denen jeweils die Anzahl des zwischen den beiden Primern liegenden DNA-Abschnitts vervielfältigt wird, da die neu entstandene DNA wieder als Matrize im nächsten Zyklus dient. Zur Kontrolle des Ablaufs der PCR kamen Negativkontrollen zum Einsatz, bei denen die cdna und die genomische DNA als Template fehlten Primer Die folgenden als Primer eingesetzten Oligonucleotide entsprechen dem Anfang und Ende der von SCHNIEDER (1993b) veröffentlichten Gensequenz Dv Mit diesen Primern sollte die Sequenz des MSP aus der cdna von D. viviparus amplifiziert werden. Primer Dv for: Primer Dv rev: 5 -GGA TCC AAT TCG CGG CCG CAA ACA ATG-3 5 -AAG TTC GAT TTT GTT AAG CAT AGT GTA-3 Zur Isolierung der MSP-Sequenz aus genomischer DNA wurden die nachfolgend dargestellten Primer genutzt. Primer gdna MSP for: Primer gdna MSP rev: 5 -CAA ACA ATG GCG TCA GTT CCC-3 5 -CGG CCG CTT CGA TTT TGT TA-3 Alle Primer wurden mit dem Softwareprogramm Primer Express (APPLIED BIOSYSTEMS) ausgewählt und durch die Firma INVITROGEN hergestellt.

63 Material und Methoden Reaktionsbedingungen und Reaktionsansätze PCR-Temperaturprofile Temperaturprofil zur Amplifikation der MSP-Sequenz aus cdna: Initiale Denaturierung 95 C, 2 Minuten Denaturierung 95 C, 1 Minute Primerannealing 65 C, 1 Minute 35 Zyklen Primerextension 72 C, 1 Minute Temperaturprofil zur Amplifikation der MSP-Sequenz aus genomischer DNA: Initiale Denaturierung 95 C, 15 Minuten Denaturierung 95 C, 1 Minute Primerannealing 55 C, 1 Minute 35 Zyklen Primerextension 72 C, 1 Minute finale Primerextension 72 C, 10 Minuten PCR-Ansätze Die hier eingesetzte cdna und genomische DNA stammten aus dem Bestand des Instituts für Parasitologie. Die der cdna zugrunde liegende RNA war ebenso wie die genomische DNA aus adulten Lungenwürmern isoliert worden. Die PCR fand im GeneAmp PCR System 9700 (APPLIED BIOSYSTEMS) statt. PCR-Ansatz zur Amplifikation der MSP-Sequenz aus cdna: 42 µl Aqua bidest. (AMPUWA, FRESENIUS) 5 µl 10x Advantage 2 PCR Puffer (BD CLONTECH) 1 µl 2mM dntps (PROMEGA) 0,5 µl Primer Dv for (50 pmol/µl) 0,5 µl Primer Dv rev (50 pmol/µl) 0,5 µl 50x Advantage 2 Polymerase Mix (BD CLONTECH) 0,5 µl cdna

64 Material und Methoden 64 PCR-Ansatz zur Amplifikation der MSP-Sequenz aus genomischer DNA: 33,75 µl Aqua bidest. (AMPUWA, FRESENIUS) 5 µl 10x Puffer (ABGENE) 2 µl 2mM dntps (PROMEGA) 3 µl MgCl 2 (APPLIED BIOSYSTEMS) 0,5 µl Primer gdna MSP for (50 pmol/µl) 0,5 µl Primer gdna MSP rev (50 pmol/µl) 0,25 µl Thermo-Start DNA Polymerase (5 U/µl) (ABGENE) 1 µl genomische DNA 3.7 Darstellung von Nukleinsäuren durch Agarosegel-Elektrophorese Die in der PCR amplifizierten Nukleinsäuren wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese nachgewiesen. Dazu dienten 1 %ige Agarosegele, welche aus Agarose (NEEO Ultra Qualität Rotiagarose, ROTH) und dem entsprechenden Volumen 1x TAE-Puffer zusammengesetzt waren. Nach Aufkochen der Agarose und Abkühlung auf 55 C wurde dem noch flüssigen Gel als Farbstoff Gelstar (BIOZYM) im Verhältnis 1:10000 hinzugefügt. Durch dessen Eigenschaft, sich in Nukleinsäuren einzulagern und diese damit fluoreszierend anzufärben, konnte die Visalisierung der amplifizierten DNA erfolgen. Die auspolymerisierten Agarosegele wurden in die mit 1x TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammmer HE 33 (HOEFER) gegeben und jeweils 24 µl Probe geladen. Zur Vorbehandlung dieser Proben waren 20 µl des PCR-Ansatzes mit 4 µl 6x Ladungspuffer versetzt worden. Als Größenstandard wurde Low DNA Mass Ladder genutzt, die Elektrophorese fand bei 95 Volt (Standard Power Pack P25, BIOMETRA) für 60 bis 90 Minuten statt. Im Anschluss wurden die fluoreszierenden Proben auf einem UV-Tisch (INTAS) bei einer Wellenlänge von 312 nm sichtbar gemacht und zur Dokumentation mit der Video-Geldokumentations-Anlage fotografiert.

65 Material und Methoden Klonierung von PCR-Amplifikaten Isolierung von PCR-Amplifikaten aus Agarosegelen Um die Amplifikate aus dem Gel zu isolieren, wurden die Banden unter UV-Beleuchtung mit einer sterilen Skalpellklinge aus dem Gel ausgeschnitten und in 1,5 ml Gefäße überführt. Daran anschließend folgte eine Zentrifugation für 5 Minuten bei Raumtemperatur und g (HERAEUS). Der Überstand wurde dann zur Klonierung im Ligationsschritt eingesetzt Klonierungsvektor Zur Klonierung der PCR-Amplifikate diente der Vektor pcr4 -TOPO (INVITROGEN). Mit diesem Vektor ist es möglich, Amplifikate ohne weitere Modifikationen nach einer PCR und ohne die Hilfe von Ligasen in Plasmide einzufügen. Die Reaktion kann allerdings nur unter der Voraussetzung stattfinden, dass die PCR mit Taq-Polymerasen durchgeführt worden ist. Denn durch deren Transferase-Aktivität wird ein einzelnes Deoxyadenosin an die 3`- Enden eines Amplifikats angefügt, welches mit einem an den 3`-Enden des Plasmids vorhandenen Deoxythymidin interagieren kann. Diese Ligation wird durch die kovalent an das Plasmid gebundene Topoisomerase I des Vaccinia-Virus katalysiert. Zudem enthält der Vektor das Ampicillin- (bla-) Resistenzgen, welches ein Wachstum der Zellen in mit Ampicillin angereicherten Medien erlaubt. Eine Selektion der rekombinanten Klone wird mittels des LacZα-ccdB-Gens ermöglicht. Die Expression dieses für E. coli letalen Gens wird durch die Ligation eines Inserts unterbrochen, so dass ein Wachstum der rekombinanten Klone möglich ist Ligation Die Ligation der Amplifikate wurde mit Hilfe des TOPO TA Cloning Kits for Sequencing (INVITROGEN) durchgeführt. Dazu wurden in ein 0,5 ml Reaktionsgefäß 4 µl der isolierten PCR-Bande gegeben, worauf die Zugabe von 1 µl der im Kit enthaltenen Salzlösung und von 1 µl pcr4 -TOPO Vektor erfolgte. Die Ansätze wurden für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, ehe sie zur Transformation verwendet wurden.

66 Material und Methoden Transformation Die zur Transformation genutzten Zellen waren One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli (INVITROGEN). Nach Hinzufügen des Ligationsansatzes folgte eine Inkubation von 30 Minuten auf Eis. Danach wurden die Bakterien 30 Sekunden bei 42 C im Wasserbad einem Hitzeschock ausgesetzt und anschließend sofort wieder auf Eis gekühlt. In jedes Gefäß wurde 250 µl SOC-Medium pipettiert und die Zellen bei 37 C und 200 rpm für eine Stunde geschwenkt (Wärmeschrank 3033, GFL). Nach dieser Inkubation wurde jeder Ansatz gleichmäßig mit Hilfe eines sterilen Drygalskispatels auf zwei LB-Agarplatten, die zuvor mit 100 µg Ampicillin/ml Agar versetzt worden waren, aufgetragen. Die Bebrütung der Nährböden erfolgte im Wärmeschrank (HERAEUS) bei 37 C über Nacht. Die Darstellung der Inserts nach Plasmidpräparation sowie die Sequenzierung mit Sequenzidentitätsvergleich fanden wie in 3.10 und 3.11 beschrieben statt. Die weitere Verwendung der cdna-klone nach diesen Schritten wird ab 3.9 geschildert. 3.9 Klonierung in Expressionsvektoren Expressionsvektoren Zur Expression der rekombinanten Proteine wurden zwei unterschiedliche prokaryontische Systeme verwendet. Durch die Klonierung des MSP in mehrere pgex-vektoren und in Vektoren des Gateway Technology Systems wurde eine vergleichende Expression von GST- Fusionsproteinen möglich. Anhand dieser Untersuchungen konnte der Klon mit der höchsten Expressionsrate ausgewählt werden, um das rekombinante Protein in möglichst großer Menge zu erhalten. pgex: Die genutzten Plasmide pgex-2tk, pgex-4t-3 und pgex-6p-3 besitzen aufgrund des Glutathion-S-Transferase- (GST-) Gens die Fähigkeit, die rekombinanten Proteine als Fusionsproteine mit einem N-terminalen GST-Tag zu exprimieren. Dadurch ist zur Gewinnung der Fusionsproteine in möglichst reiner Form eine Aufreinigung mittels Affinitätschromatografie möglich. Zusätzlich kann durch eine für eine Proteaseschnittstelle codierende Genregion, welche zwischen GST-Gen und Insert gelegen ist, im exprimierten Fusionsprotein der Tag abgespalten werden. Die Plasmide pgex-2tk und pgex-4t-3

67 Material und Methoden 67 beinhalten dazu die Sequenz für eine Schnittstelle der Thrombin Protease, pgex-6p-3 dagegen enthält die Genregion für eine Schnittstelle der PreScission Protease. Die mit dem Vektor pgex-2tk exprimierten Proteine können zudem in vitro über eine direkte Markierung nachgewiesen werden. Dazu ist im Plasmid die Sequenz der katalytischen Untereinheit der camp-abhängigen Protein-Kinase zwischen der Thrombinschnittstelle und der multiple cloning site vorhanden. Nach Zugabe von Protein-Kinase und [γ- 32 P] ATP ist eine Detektion des Fusionsproteins mittels autoradiografischer Techniken möglich. Alle pgex-plasmide besitzen zur Selektion das ß-lactamase Gen, welches die Fähigkeit zum Wachstum auf ampicillinhaltigen Nährböden bewirkt. Die Induktion der Proteinsynthese findet unter der Kontrolle des laci q -Gens statt, womit erst durch die Zugabe von IPTG die Herstellung des rekombinanten Proteins beginnt. Gateway Technology System: In diesem System muss zunächst das Insert in die sogenannten Eingangsvektoren kloniert werden, von denen aus dann eine Umklonierung in jeden anderen Expressionsvektor des Gateway Technology Systems mittels der unten beschriebenen Recombination Reaction möglich ist. Das als Eingangsvektor verwendete pentr 3C-Plasmid besitzt als Selektionsmerkmal ein Kanamycin-Resistenzgen, die ausgewählten Expressionsvektoren dagegen ein Ampicillin-Resistenzgen, so dass nach der Recombination Reaction nur noch ein Wachstum der Zellen mit den Expressionsvektoren in den ampicillinhaltigen Medien stattfindet. Das als Expressionsvektor dienende pdest 15 enthält wie die pgex-plasmide das GST-Gen, womit über einen N-terminalen Tag auch hier eine Aufreinigung möglich ist. Der ebenfalls zur Expression befähigte pet160-dest-vektor besitzt dagegen sowohl einen N-terminalen His-Tag als auch einen N-terminalen LUMIO -Tag, über den eine fluoreszierende Färbung stattfinden kann. Hiermit ist eine spezifische Färbung dieses rekombinanten Fusionsproteins und über den His-Tag auch eine Aufreinigung möglich. Neben der bereits erwähnten Ampicillinresistenz erfolgt bei den beiden hier verwendeten Plasmiden des Gateway Technology Systems darüber hinaus eine Selektion rekombinanter Klone über das für E. coli letale ccdb-gen, dessen Expression bei Ligation eines Inserts abgebrochen wird. Die Induktion durch IPTG und eine hohe Expressionsrate wird über den T7-Promotor vermittelt.

68 Material und Methoden Restriktionsenzymverdau Zur Klonierung der MSP-Sequenz in die pgex-expressionsvektoren wurde zunächst ein Restriktionsenzymverdau der pcr4 -TOPO Vektoren aus der oben beschriebenen Klonierung der PCR-Amplifikate durchgeführt, nachdem die Plasmide mittels der unter beschriebenen Plasmidaufreinigung isoliert worden waren. Parallel fand ebenfalls ein Enzymverdau der drei pgex-vektoren 2TK, 4T-3 und 6P-3 statt. Dazu dienten folgende Ansätze: pcr4 -TOPO : 8 µl autoklaviertes Aqua bides 2 µl Multi-Puffer (FERMENTAS) 1 µl BamH I ( 10 U/µl) (FERMENTAS) 1 µl EcoR I (12 U/µl) (FERMENTAS) 8 µl pcr4 -TOPO aus der Mini-Prep pgex: 14 µl autoklaviertes Aqua bidest. 2 µl Multi-Puffer (FERMENTAS) 1 µl BamH I (10 U/µl) (FERMENTAS) 1 µl EcoR I (12 U/µl) (FERMENTAS) 2 µl pgex-vektor Die Inkubation erfolgte für 4 Stunden bei 37 C im Wärmeschrank (HERAEUS). Zur Expression des MSP im Gateway-System musste zunächst die Sequenz in den pentr 3C Vektor kloniert werden. Aus diesem Eingangsvektor konnte dann das MSP in jeden beliebigen Expressionsvektor des Gateway-Systems mittels der sogenannten Recombination Reaction umkloniert werden. Auch hier begann dieser Vorgang mit einem Restriktionsenzymverdau, wobei als Ursprung der MSP-Sequenz der Klon pgex-6p 4.4 (siehe 3.12) nach der Midiprep genutzt wurde. Der Ansatz war sowohl für den pentr 3C- Vektor als auch für pgex-6p 4.4 identisch.

69 Material und Methoden 69 pgex-6p 4.4/pENTR 3C: 11 µl autoklaviertes Aqua bidest. 2 µl D-Puffer (FERMENTAS) 0,2 µl bovines Serumalbumin (SIGMA) 1 µl BamH I (10 U/µl) (FERMENTAS) 1 µl Not I (10 U/µl) (FERMENTAS) 5 µl pgex-6p 4.4/pENTR 3C Der Verdau fand in diesem Fall bei Raumtemperatur über Nacht statt. Zur Kontrolle der durchgeführten Restriktionsenzymverdaue wurden die Proben im Verhältnis 1:6 mit Ladungspuffer für Agarosegele versetzt und auf ein 1 %iges Agarosegel aufgetragen. Die Zusammensetzung der Gele und die Elektrophorese waren mit den in Kapitel 3.7 geschilderten Sachverhalten identisch. Die Isolierung der jeweiligen Banden wurde wie in dargestellt vorgenommen. Auch hier wurde der Überstand nach Zentrifugation in der Ligation eingesetzt Ligation Reaktionsansatz zur Klonierung in pgex: 1µl des verdauten pgex-vektors (INVITROGEN) 2µl des isolierten Inserts aus pcr4 -TOPO (siehe 3.9.2) 0,4 µl 10x Ligationspuffer (FERMENTAS) 1 µl T4 DNA Ligase (1 U/µl) (FERMENTAS) Reaktionsansatz zur Klonierung in Gateway : 1µl des verdauten pentr 3C-Vektors (INVITROGEN) 2µl des verdauten pgex-6p 4.4-Klons 0,4 µl 10x Ligationspuffer (FERMENTAS) 1 µl T4 DNA Ligase (1 U/µl) (FERMENTAS) Die Ligationen wurden bei 14 C (BIOMETRA) über Nacht durchgeführt.

70 Material und Methoden Transformation Die verwendeten Zellen waren für die zur Expression genutzten pgex-vektoren One Shot BL21 (DE3) Chemically Competent E. coli (INVITROGEN) und für den pentr 3C-Vektor One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli (INVITROGEN). Die Transformation erfolgte wie in Kapitel beschrieben mit dem pentr 3C-Vektor, den pgex-vektoren, die die MSP-Sequenz enthielten, und mit einem nicht ligiertem pgex-2tk-vektor als sogenanntem Leervektor. Die mit den pgex-vektoren transformierten Bakterien wurden auf LB-Agar mit 100 µg Ampicillin/ml Agar ausplattiert. Die den pentr 3C-Vektor enthaltenden Zellen dagegen wurden auf LB-Agar gegeben, der zuvor mit 50 µg Kanamycin/ml Agar versetzt worden war. Die Inkubation der Platten fand bei 37 C (HERAEUS) über Nacht statt. Anschließend wurden Plasmidpräparationen, Kontrolle der Inserts und Sequenzierungen wie in 3.10 und 3.11 dargestellt durchgeführt. Im Gateway Technology System (INVITROGEN) musste nach diesen Schritten noch die MSP-Sequenz in die Expressionsvektoren pdest 15 und pet160-dest kloniert werden. In der Recombination Reaction konnte dazu in einem Reaktionsansatz das MSP-Gen aus dem pentr 3C-Vektor geschnitten und in die Expressionsvektoren ligiert werden. Hierzu diente der Gateway LR Clonase Enzyme Mix (INVITROGEN), der aus einer Integrase, einer Excisionase und einem Integration Host Factor bestand. Nach Plasmidpräparation und Darstellung der Inserts des pentr 3C-Vektors wurde folgender Reaktionsansatz als Recombination Reaction verwendet. 5 µl pentr 3C aus der Miniprep 2 µl pdest 15 bzw. pet160-dest (INVITROGEN) 4 µl 5x LR Clonase Reaction Buffer (INVITROGEN) 5 µl TE-Puffer 4 µl Gateway LR Clonase Enzyme Mix (INVITROGEN) Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 25 C (BIOMETRA) wurden dann 2 µl der im Kit enthaltenen Proteinase K zugesetzt. Im Anschluss erfolgte eine weitere Inkubation der Ansätze für 10 Minuten bei 37 C (HERAEUS).

71 Material und Methoden 71 Die darauf folgende Transformation der Expressionsvektoren in One Shot BL21 (DE3) Chemically Competent E. coli (INVITROGEN) fand wie in Kapitel geschildert statt. Zur Ausplattierung der Zellen diente LB-Agar, der 100 µg Ampicillin/ml Agar enthielt. Nach einer Bebrütung der Platten bei 37 C (HERAEUS) über Nacht wurden auch die Plasmide dieser Klonierungen in der Plasmidpräparation aufgereinigt Plasmidpräparation und Darstellung der Inserts Plasmidpräparation mittels Miniprep Von den nach den Klonierungen gewachsenen Zellen wurden pro Vektor mehrere Kolonien in je 5 ml LB-Medium mit 100 µg Ampicillin/ml Medium bzw. 50 µg Kanamycin/ml Medium für den pentr 3C-Vektor überführt und über Nacht bei 37 C und 200 rpm (GFL) geschwenkt. Zur dauerhaften Lagerung jedes Klons wurden je 600 µl der Zellkultur mit 600 µl Glycerol für Stocks versetzt und bei -20 C gelagert. Die Miniprep der gepickten Kolonien wurde dann mit Hilfe des NucleoSpin Plasmid-Kits (MACHEREY&NAGEL) durchgeführt. Zur Gewinnung der Zellpellets fand zunächst eine Zentrifugation der jeweiligen Kultur in einem 12 ml Falcon bei 1550 g für 20 Minuten (HERAEUS) statt. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 250 µl A1-Puffer resuspendiert. Nach der Zugabe von 250 µl A2-Puffer wurde das Gefäß 6-8 x invertiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin wurden 300 µl A3-Puffer zugesetzt und das Falcon nochmals 6-8 x invertiert. Im Anschluss an eine Zentrifugation von 20 Minuten bei 2750 g (HERAEUS) wurde der Überstand auf die im Kit enthaltene Säule aufgetragen und diese bei g für 1 Minute zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Säule mit 600 µl A4-Puffer gewaschen. Nach einer erneuten Zentrifugation von 1 Minute bei g mit Verwerfen des Durchflusses diente eine unmittelbar anschließende Zentrifugation von 2 Minuten bei g dazu, die Säule zu trocknen. Die Elution der Plasmide erfolgte schließlich mit 50 µl autoklaviertem Aqua bidest., wobei nach einer Inkubation von 1 Minute bei Raumtemperatur die Säule bei g für eine Minute zentrifugiert wurde. Alle in der Miniprep durchgeführten Zentrifugationen fanden bei Raumtemperatur statt, die erhaltenen Plasmide konnten dann auf ihr Insert hin überprüft werden (siehe ).

72 Material und Methoden Plasmidpräparation mittels Midiprep Von den ausgewählten Klonen wurden aus den vor der Miniprep angelegten Glycerolstocks jeweils 100 µl entnommen und in je 50 ml LB-Medium mit 100 µg Ampicillin/ml Medium gegeben. Der Bebrütung über Nacht bei 37 C und 200 rpm (GFL) folgte die Zentrifugation in einem 50 ml Falcon für 15 Minuten bei Raumtemperatur und 2750 g (HERAEUS). Die Aufreinigung der Plasmide wurde mit dem Nucleobond Ax-100-Kit (MACHEREY&NAGEL) nach Protokoll des Herstellers vorgenommen. Die Aufnahme der präzipierten Plasmid-DNA erfolgte abweichend vom Protokoll mit 50 µl autoklaviertem Aqua bidest.. Die Proben wurden nach der Kontrolle des Inserts wie auch die der Miniprep bei -20 C gelagert. Die Reinheit und Konzentration der aufgereinigten Plasmide wurde photometrisch mit dem GeneQuant pro RNA/DNA Calculator (AMERSHAM BIOSCIENCES) bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm bestimmt Kontrolle und Darstellung der Inserts Restriktionsenzymverdau Die pgex-plasmide und der pcr4 -TOPO -Vektor wurden mit EcoR I und BamH I bzw. nur mit EcoR I verdaut, da die Inserts von diesen Schnittstellen flankiert waren. Zum Verdau des pentr 3C-Vektors dagegen mussten die Enzyme BamH I und Not I ausgewählt werden. Es wurden folgende Reaktionen angesetzt: Amplifikate der cdna: pgex/pcr4 -TOPO : 11 µl autoklaviertes Aqua bidest. 2 µl Multi-Puffer (FERMENTAS) 1 µl BamH I (10 U/µl) (FERMENTAS) 1 µl EcoR I (12 U/µl) (FERMENTAS) 5 µl der Plasmid-DNA

73 Material und Methoden 73 pentr 3C: 11 µl autoklaviertes Aqua bidest. 2 µl D-Puffer (FERMENTAS) 0,2 µl bovines Serumalbumin (SIGMA) 1 µl BamH I (10 U/µl) (FERMENTAS) 1 µl Not I (10 U/µl)(FERMENTAS) 5 µl Plasmid-DNA Amplifikate der genomischen DNA: pcr4 -TOPO : 11 µl autoklaviertes Aqua bidest. 2 µl Multi-Puffer (FERMENTAS) 2 µl EcoR I (12 U/µl) (FERMENTAS) 5 µl der Plasmid-DNA Die Inkubationzeit betrug für die Ansätze mit dem pcr4 -TOPO -Plasmid und den pgex- Vektoren 4 Stunden, der Ansatz des pentr 3C-Plasmids hingegen wurde über Nacht inkubiert. Jeder Verdau fand bei 37 C im Wärmeschrank (HERAEUS) statt. Anschließend wurden die Proben mittels der in 3.7 dargestellten Gelelektrophorese aufgetrennt Polymerase-Kettenreaktion Die Kontrolle des Inserts des pentr 3C-Plasmids erfolgte zudem mittels PCR. Der Reaktionsansatz und das dazugehörige Temperaturprofil sind nachfolgend geschildert. Als Primer wurden die unter als Dv for und Dv rev beschriebenen Oligonukleotidsequenzen eingesetzt, die Reaktion wurde im GeneAmp PCR System 9700 (APPLIED BIOSYSTEMS) durchgeführt. Abschließend diente auch hier eine Gelelektrophorese (siehe 3.7) zur Dokumentation der Ergebnisse.

74 Material und Methoden 74 Ansatz: 41,5 µl Aqua bidest. (AMPUWA, FRESENIUS) 5 µl 10x Advantage 2 PCR Puffer (BD CLONTECH) 1 µl 2mM dntps (PROMEGA) 0,5 µl Primer Dv for (50 pmol/µl) 0,5 µl Primer Dv rev (50 pmol/µl) 0,5 µl 50x Advantage 2 Polymerase Mix (BD CLONTECH) 1 µl Plasmid-DNA Temperaturprofil: Initiale Denaturierung 95 C, 2 Minuten Denaturierung 95 C, 1 Minute Primerannealing 65 C, 1 Minute 35 Zyklen Primerextension 72 C, 1 Minute 3.11 Sequenzierung der Inserts und Sequenzidentitätsvergleich Die automatische Sequenzierung der zu untersuchenden Proben fand bei der Firma Sequence Laboratories (SEQLAB), Göttingen statt. Die Proben wurden hierzu nach einer Konzentrationsbestimmung (GeneQuant pro, AMERSHAM BIOSCIENCES) auf eine Konzentration von ca. 250 ng DNA/µl eingestellt und in mit Parafilm (RENNER) umwickelten Gefäßen mit der Post verschickt. Die Übermittlung der Sequenzen und der zugehörigen Elektropherogramme erfolgte auf elektronischem Weg per . Die Bearbeitung der Sequenzen und der Identitätsvergleich der Vorwärts- und Rückwärtssequenzen sowie die theoretische Translation in Aminosäuren wurden mit dem Programm Align Plus (Sequence Alignment Program Version 4.0, S&E SOFTWARE) durchgeführt. Der Identitätsvergleich mit anderen bereits in GenBank (NCBI, USA) publizierten Sequenzen erfolgte sowohl für die DNA- als auch für die Aminosäuresequenzen mit Hilfe des basic local alignment search tool (BLAST, NCBI,

75 Material und Methoden Proteinexpression Die Proteinexpression des MSP-Fusionsproteins erfolgte in zwei Schritten. Zunächst wurden die aus den mit pgex-2tk, pgex-4t-3, pgex-6p-3 und pdest 15 transformierten Zelllinien ausgewählten Klone in der Small-scale-Expression eingesetzt. Diese Klone wurden als 2T 4.14 (pgex-2tk), 4T 4.4 (pgex-4t-3), 6P 4.4 (pgex-6p-3) und pdest 15.3 (pdest 15) bezeichnet. Eine Aufreinigung der entstandenen Proteine fand unter gleichen Bedingungen mit verschiedenen Methoden statt, um eine vergleichende Aussage über die Menge des exprimierten Proteins treffen zu können. Zudem konnte somit auch die Effizienz der unterschiedlichen Aufreinigungsverfahren beurteilt werden. Die Kultur der mit pet160- DEST transformierten Zellen in der Small-scale-Expression diente nur zur Dokumentation der Expression des rekombinanten MSP in der Gateway Lumio Technology. Nachdem in diesem ersten Schritt also der Klon mit der höchsten Expressionsrate und die optimalste Aufreinigungsmethode bestimmt worden waren, folgte die Proteinproduktion im Large-scale-Verfahren mit dem jeweiligen Klon. Das nach Aufreinigung vorhandene rekombinante MSP-Fusionsprotein konnte dann ebenso wie die in der Large-scale-Expression aus dem Leervektor hergestellte GST für alle weiteren Versuche verwendet werden Small-scale-Expression der rekombinanten Proteine Zum Ansetzen der Kulturen wurde aus den angefertigten Glycerolstocks des jeweiligen Klons 100 µl entnommen und damit 50 ml LB-Medium, das als Antibiotikum 100 µg Ampicillin/ml Medium enthielt, beimpft. Dieses wurde über Nacht bei 37 C und 190 rpm bebrütet (Wärmeschrank, GFL). Die zur Induktion genutzten Kulturen wurden ebenfalls in 50 ml LB- Medium mit 100 µg Ampicillin/ml Medium angezüchtet, in welches 4 ml der Über-Nacht- Kultur gegeben wurden. Die daraufhin gemessene optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm (AMERSHAM BIOSCIENCES) betrug bei allen Kulturen ca. 0,3 und stieg nach einer Stunde Inkubation bei 37 C und 190 rpm auf Werte zwischen 0,5 und 0,6. Mit dem Erreichen dieses Schwellenwertes wurde die Expression der Proteine durch Zugabe von 50 µl 1 M IPTG induziert. Anschließend wurden die Kulturen für weitere 4 Stunden bei 37 C und 190 rpm geschwenkt. Nach Beenden der Bebrütung wurden die Kulturen in 50 ml Falcons überführt und bei 2750 g und 4 C für 20 Minuten zentrifugiert. Nach Abgießen des

76 Material und Methoden 76 Mediums wurden die im Falcon zurückgebliebenen Zellpellets bei -80 C (Kryosafe, SCHRÖDER) eingefroren Large-scale-Expession der rekombinanten Proteine Die aus der Large-scale-Expression gewonnenen Proteine sollten nach der Aufreinigung den Pool bilden, auf den für die Durchführung der Vakzinierungen und ELISA zurückgegriffen werden konnte. Aus dem Glycerolstock des MSP-Klons 2T 4.14 und dem des pgex-2tk- Leervektors wurden jeweils 200 µl in 100 ml LB-Medium mit 100 µg Ampicillin/ml Medium gegeben. Je Klon wurden insgesamt vier solcher Kulturen angesetzt und über Nacht bei 37 C und 190 rpm bebrütet (GFL). Anschließend wurden je Klon sieben Ansätze von 500 ml LB- Medium mit 100 µg Ampicillin/ml Medium hergestellt, die jeweils mit 40 ml Über-Nacht- Kultur beimpft wurden. Die darauf folgende Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 600 nm ergab bei allen Kulturen Werte zwischen 0,28 und 0,32. Nach einer Inkubation von 1,5 Stunden bei 37 C und 150 rpm konnte ein Anstieg der OD 600 auf ca. 0,5 festgestellt werden. Die Induktion der Expression wurde daraufhin mit 500 µl 1 M IPTG je Kultur eingeleitet; die sich daran anschließende Bebrütung fand bei 37 C und 150 rpm für fünf Stunden statt. Die Kulturen wurden zur Zentrifugation in 500 ml Zentrifugenbecher überführt und bei 2000 g und 4 C für eine Stunde zentrifugiert (Beckman). Nach Entfernen des Mediums wurden die Pellets bei -80 C (Kryosafe, SCHRÖDER) eingefroren. Diese Large-scale-Expression wurde für den MSP-Klon 2T 4.14 einmal wiederholt, so dass es zwei Proteinpools für das Fusionsprotein und einen für die GST gab Aufreinigung der rekombinanten Proteine Außer dem mit einem luminiszierenden Tag verbundenen MSP aus der Gateway Technology besaßen alle anderen exprimierten Proteine die Möglichkeit der Aufreinigung über einen GST-Tag. Nach Aufschluß der Bakterien mittels Ultraschall befand sich das rekombinante MSP als löslicher Bestandteil in dem entstandenen Zelllysat. Über den N- terminalen GST-Tag der Fusionsproteine fand daraufhin eine Bindung an immobilisiertes Glutathion statt, das entweder an magnetische Partikel oder aber an Sepharose gebunden war. Während dieser Bindungsreaktion wurden die restlichen, ungebundenen Proteine des Lysats

77 Material und Methoden 77 mit mehreren Waschschritten entfernt und das gebundene Fusionsprotein schließlich wieder in reiner Form über die Zugabe eines Elutionspuffers eluiert Lyse der Zellen Sowohl die Zellpellets der Small-scale- als auch die der Large-scale-Expression wurden nach Resuspension in 1x PBS (Proteine aus pgex-vektoren) bzw. in Gateway-Lysispuffer (Proteine aus Gateway-Vektoren) mit Ultraschall behandelt. Dazu wurden die Pellets der 50 ml Kulturen in jeweils 500µl 1x PBS bzw. Gateway-Lysispuffer aufgenommen und anschließend für drei Minuten bei einer Amplitude von 20 Micron einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt (MSE). Dieser Prozess fand in Intervallen von je 15 Sekunden statt, bei denen auf jede Ultraschallbehandlung eine Abkühlungsphase folgte. Die in einem 2 ml Eppendorfgefäß enthaltene Proteinsuspension wurde während der gesamten Zeit in Eiswasser gekühlt. Zum Entfernen der nach der Lyse vorhandenen groben Zellbestandteile wurde das Lysat bei g und Raumtemperatur für fünf Minuten zentrifugiert (HERAEUS). Die daran angeschlossene Aufreinigung erfolgte mit dem entstandenen Überstand. Zum Aufschluss der Zellen aus der Large-scale-Expression wurden jeweils zwei Pellets in 10 ml 1x PBS resuspendiert und in ein 50 ml Falcon überführt. Die Ultraschallbehandlung wurde mit den oben beschriebenen Intervallen für eine Dauer von 6 Minuten und bei einer Amplitude von 20 Micron durchgeführt. Auch hier befand sich die Proteinsuspension während der gesamten Zeitdauer in einem Eiswasserbad. Die Zentrifugation (HERAEUS) fand bei 4 C und 2750 g für 15 Minuten statt. Der proteinhaltige Überstand wurde abgenommen und im folgenden Schritt aufgereinigt Aufreinigung über MagneGST -Partikel Mit diesem Verfahren wurden nur die aus der Small-scale-Expression gewonnenen Fusionsproteine aufgereinigt. Jedes aus einer 50 ml Kultur erhaltene Lysat wurde in einem 2 ml Eppendorfgefäß mit 100 µl der magnetischen MagneGST -Partikel (PROMEGA) versetzt, die zuvor in drei Waschschritten mit jeweils 250 µl MagneGST -Waschpuffer (PROMEGA) equilibriert wurden. Der Überstand in allen durchgeführten Wasch- und Bindungsschritten konnte nach Anlagerung der Partikel an einen Magneten, der außen an das

78 Material und Methoden 78 Gefäß gehalten wurde, abgenommen werden. Die Bindung der Fusionsproteine bzw. der GST an die Partikel fand bei Raumtemperatur für 30 Minuten statt, nach Entfernen des Lysats wurden die Partikel insgesamt fünfmal für je 45 Minuten mit jeweils 800 µl MagneGST - Waschpuffer gewaschen. Sowohl das nach der Bindung entfernte Lysat als auch der nach jedem Waschen vorhandene Überstand wurden verworfen. Die Elution der gebundenen Proteine wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 500 µl Elutionspuffer für Proteine durchgeführt. Alle Schritte zur Aufreinigung wurden mit einem Überkopf-Schwenker (GFL) betrieben. Das eluierte Protein wurde anschließend sterifiltriert (RENNER), bei -20 C gelagert und in einer Sodium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zusammen mit den aus dem zweiten Aufreinigungsverfahren gewonnenen Proteinen aufgetrennt und mittels Coomassie Blue gefärbt. Damit waren eine Beurteilung des Grades der Aufreinigung beider Methoden und ein Vergleich der eluierten Proteinmengen möglich Aufreinigung über Glutathione Sepharose High Performance Diese zweite Methode wurde nach einem ähnlichen Protokoll wie die oben dargestellte durchgeführt. Es wurden hier aber sowohl die in der Small-scale-Expression produzierten Proteine als auch die der Large-scale-Expression verwendet. Zur Aufreinigung der 50 ml Kulturen dienten je 100 µl Glutathion Sepharose High Performance (AMERSHAM). Die Equilibrierung der Partikel erfolgte durch dreimaliges Waschen mit je 500 µl 1x PBS. Im Anschluss an jeden Wasch- und Bindungsschritt musste zur Abtrennung der Sepharose vom Überstand das 2 ml Gefäß für fünf Minuten bei 500 g und Raumtemperatur zentrifugiert werden (HERAEUS). Nach Equilibrierung folgte die Bindung des Proteins an die Sepharose für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Der nach der Zentrifugation vorhandene Überstand wurde ebenso wie die nach allen Waschschritten erhaltenen Überstände verworfen. Es wurde insgesamt fünfmal mit jeweils 1 ml 1x PBS für 45 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Die Elution des Proteins erfolgte mit 500 µl Elutionspuffer für Proteine für eine Stunde bei Raumtemperatur. Auch hier wurden alle Schritte mit dem Überkopf-Schwenker (GFL) durchgeführt. Die eluierten Proben wurden wie in beschrieben weiterverwendet. Die in der Large-scale-Expression exprimierten MSP-Fusionsproteine und GST wurden wie oben geschildert aufgereinigt, es wurden hier nur das Volumen der Partikel und Puffer

79 Material und Methoden 79 variiert. Zu dem aus jeweils einem Liter Kultur hergestellten Lysat wurden je drei ml Sepharose-Partikel gegeben, die Equilibrierung fand mit je 15 ml 1x PBS statt. Alle Schritte wurden in 50 ml Falcons durchgeführt, die Zentrifugation fand bei 500 g und Raumtemperatur für 15 Minuten statt (HERAEUS). Zum Waschen dienten je 10 ml 1x PBS. Die Elution der Proteine mit je 1 ml Elutionspuffer für Proteine wurde einmal wiederholt. Die aus dieser ersten und zweiten Elution gewonnenen Proteine wurden gepoolt und das Volumen mit autoklaviertem Aqua bidest. auf 100 ml aufgefüllt. Nach Sterilfiltration (RENNER) und Aufteilung in 10 ml Aliquots wurden diese bei -80 C (Kryosafe, SCHRÖDER) eingefroren. Damit konnte für die Durchführung der Impfungen und der ELISA des zweiten und dritten Vakzinedurchgangs auf eine Proteincharge zurückgegriffen werden. Im Rahmen des ersten Vakzineversuch mit den dazugehörigen ELISA wurde ein weiterer Proteinpool verwendet Schneiden des Fusionsproteins mittels Thrombin Das mit dem MSP-Klon 2T 4.14 produzierte rekombinante Fusionsprotein besaß durch den Vektor pgex-2tk die Möglichkeit, den GST-Tag abzuspalten. Dazu konnte nach der Expression das Enzym Thrombin Protease spezifisch an dieser Stelle ansetzen und den GST- Tag vom MSP trennen. Es wurden zwei verschiedene Verfahren durchgeführt, um das Fusionsprotein zu schneiden und anschließend getrennt vom GST in reiner Form zu erhalten. Zunächst wurde der Thrombinverdau im Verlauf der Aufreinigung getestet. Dazu wurde nach einer Small-scale- Expression die Aufreinigung sowohl mit MagneGST -Partikeln als auch mit Glutathion Sepharose High Performance wie in und beschrieben ausgeführt, wobei der Elutionsschritt jedoch entfiel. Stattdessen wurden nach Ende des letzten Waschschrittes 25 units Thrombin (AMERSHAM) in 500 µl 1x PBS auf die Partikel gegeben. Während einer Über-Nacht-Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Blotschüttler (LABORTECHNIK FROEBEL) wurde dann das MSP von dem an die Partikel gebundenen GST geschnitten. Nach einer Zentrifugation für fünf Minuten bei Raumtemperatur und 500 g konnte dann der Überstand mit dem reinem MSP von der Sepharose abgenommen werden. Der gleiche Schritt wurde mit einem Magneten bei den MagneGST -Partikeln durchgeführt. Anschließend wurde das noch gebundene GST mit dem Elutionspuffer für Proteine eluiert. Beide Proteinfraktionen wurden bei -20 C gelagert und in einer SDS-PAGE analysiert.

80 Material und Methoden 80 Als weitere Möglichkeit des Thrombinverdaus wurde das Fusionsprotein nach der Elution geschnitten. Da das hierbei verwendete 10 ml Aliquot aus der Large-scale-Expression das MSP-Fusionsprotein im Elutionspuffer-/Aqua bidest.-gemisch enthielt, musste ein Pufferaustausch vorgenommen werden. Mit Hilfe der Vivaspin 6 ml Konzentratoren (SARTORIUS) wurde das Volumen des Elutionspuffer-/Aqua bidest.-gemischs auf einen ml verringert. Die dazu notwendige Zentrifugation (HERAEUS) fand bei 2750 g und Raumtemperatur für ca. 30 Minuten statt. Daraufhin wurde das Volumen mit 1x PBS wieder auf fünf ml aufgefüllt. Nach Überführung in ein 12 ml Falcon wurden 40 units Thrombin zugesetzt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur, wobei das Gefäß über Kopf geschwenkt wurde (GFL). Um das geschnittene MSP schließlich vom GST zu separieren wurde die in 3.15 dargestellte Elektro-Elution gewählt Darstellung der Proteine Zum Nachweis und zur Visualisierung von Proteinen dienen im Wesentlichen zwei Methoden, zum einen die SDS-PAGE mit anschließender Proteinfärbung und zum anderen der Western Blot. Die SDS-PAGE nach LÄMMLI (1970) ist eine vertikale Gelelektrophorese, bei der Proteine anhand ihrer Größe aufgetrennt werden. Die natürliche Ladung der Eiweiße spielt dabei keine Rolle, da durch den beigegebenen Probenpuffer alle Proteine negativ geladen sind. Nach der Auftrennung der einzelnen Fraktionen kann eine unspezifische Färbung aller enthaltenen Proteine stattfinden, oder es kann ein Western Blot angeschlossen werden. Diese Methode bietet den Vorteil, dass einzelne Proteine spezifisch nachgewiesen werden können. Im Anschluss an eine SDS-PAGE werden dazu die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Nach dem Blockieren unspezifischer Bindungsstellen der Membran wird dann ein Primärantikörper aufgetragen, der an das membrangebundene Protein bindet. In einem zweiten Schritt wird der Primärantikörper von einem für ihn spezifischen Sekundärantikörper detektiert. Dieser ist mit einem Enzym gekoppelt, das durch die Bildung eines farbigen Substratkomplexes das Protein darstellt und nachweist.

81 Material und Methoden SDS-PAGE Zur Auftrennung der rekombinanten Proteine diente ein 12 %iges, ca. 6x8 cm großes und ca. 1 mm tiefes SDS-Polyacrylamidgel (Trenngel), das nach einer Polymerisierungsdauer von einer Stunde mit einem 5 %igem SDS-Polyacrylamidgel (Sammelgel) überschichtet wurde. Die Taschen dieses Sammelgels wurden nach einer Aushärtungszeit von einer halben Stunde mit den vorbereiteten Proben befüllt. Dazu wurde jede Proteinprobe im Verhältnis von 2:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und anschließend für fünf Minuten auf 99 C erhitzt (BIOMETRA), um eine negative Ladung aller Proteine und die Auftrennung von Disulfid- Bindungen zu gewährleisten. Anschließend wurden jeweils 15 µl von diesen Proben in eine Tasche geladen, als Größenstandard diente Roti Mark prestained (ROTH). Es wurde zunächst eine Spannung von 70 Volt für 20 Minuten angelegt (PHARMACIA LKB), um die Proteine im Sammelgel auf einer einheitlichen Höhe zu sammeln. Darauffolgend fand die Auftrennung der Proteine anhand ihrer Größe bei einer Spannung von 120 Volt und über eine Zeitdauer von ca. 1,25 Stunden statt. Für diese Gelelektrophorese stand das Mini-Protean II -System (BIORAD) zur Verfügung Färbung der Proteine mittels Coomassie Blue Nach Durchführung der SDS-PAGE wurden die Polyacrylamidgele für 30 Minuten in der Coomassie Fixier- und Färbelösung geschwenkt (LABORTECHNIK FRÖBEL), die eine Nachweisgrenze von 0,3 1 µg Protein pro Bande besitzt. Nicht gebundene Farbkomplexe wurden über die Coomassie-Entfärbelösung nach mehrmaligem Wechseln der Lösung entfernt. Alle Färbe- und Entfärbungsschritte wurden in Schalen mit einem Deckel durchgeführt, um ein Verflüchtigen der Substanzen zu vermeiden. Die Dokumentation der Ergebnisse erfolgte durch Einspannen und Trocknen der vorher über Nacht in Reinstwasser geschwenkten Gele zwischen zwei Lagen Gel Drying Film (PROMEGA). Dazu wurden sowohl die Gele als auch der Gel Drying Film für kurze Zeit vor dem Einspannen in die Geltrocknungslösung eingelegt Färbung des Proteins mittels des Lumio Green Detection Kits Zur Darstellung des Proteins, das durch das Gateway Technology System (INVITROGEN) mit einem lumineszierenden Tag verbunden war, musste eine andere Färbung gewählt

82 Material und Methoden 82 werden. Alle im Folgenden beschriebenen Schritte sind in Anlehnung an das von Invitrogen mitgelieferte Protokoll durchgeführt worden. Zunächst wurden ein 12 %iges SDS-Trenngel und ein 5 %iges SDS-Sammelgel wie in beschrieben hergestellt. 37,5 µl des nicht aufgereinigten Proteins wurde daraufhin im Verhältnis von 4:1 mit 12,5 µl des im Kit enthaltenen Lumio Gel Sample Buffers versetzt. Nach Zugabe von 0,5 µl Lumio Green Detection Reagent wurde die Probe kurz gevortext und für 10 min bei 70 C inkubiert (Thermoblock, BIOMETRA). Es folgte eine zweiminütige Abkühlung bei Raumtemperatur, anschließend wurde 5 µl Lumio In-Gel Detection Enhancer hinzugefügt und die Probe kurz gemischt. Einer Inkubation von fünf Minuten bei Raumtemperatur schloss sich die SDS- PAGE (siehe ) an, wobei 25 µl Probe und 5 µl BenchMark Fluorescent Protein Standard (INVITROGEN) aufgetragen wurden. Die Lumineszenz der Proteine wurde nach Ende der Elektrophorese bei einer Wellenlänge von 312 nm auf einem UV-Tisch (INTAS) sichtbar gemacht und mit einer Digitalkamera (OLYMPUS) fotografiert Western Blot Die Übertragung der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Hybond-C-Extra, AMERSHAM) fand im horizontalen Semi-Dry Verfahren in einer TE 70 Blotkammer (HOEFER) statt. Die nach der SDS-PAGE vorhandenen Gele wurden zusammen mit den vorher in Blotpuffer eingelegten Nitrocellulosemembranen zwischen mehrere Lagen in Blotpuffer getränkten Blotting-Papiere (MACHEREY&NAGEL) gelegt. Der Transfer der Proteine wurde bei einer Stromstärke von 100 ma über 90 Minuten durchgeführt (PHARMACIA LKB). Die Membranen wurden in allen nachfolgend beschriebenen Waschund Bindungsschritten auf einem Blotschüttler (LABORTECHNIK FROEBEL) geschwenkt. Zunächst wurden die Membranen jeweils in eine Schale überführt und für fünf Minuten mit 1x TBS gewaschen, um den restlichen Blotpuffer zu entfernen. Es folgte eine einstündige Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit jeweils 25 ml Roti-Block (ROTH), ehe sich drei Waschschritte von jeweils fünf Minuten mit TBS-Tween anschlossen. Daraufhin wurden die Membranen mit dem Primärantikörper für eine Stunde inkubiert. Dabei wurden ein aus Mäusen isolierter anti-gst-antikörper (SIGMA-ALDRICH) in einer Verdünnung von 1:10000 oder positives bzw. negatives Rinderserum in einer Verdünnung von 1:50 eingesetzt. Diese Seren wurden entweder von mit D. viviparus infizierten Rindern oder aber von

83 Material und Methoden 83 parasitennaiven Kälbern gewonnen. Alle Verdünnungen wurden ebenso wie die Verdünnungen der verwendeten Konjugate mit TBS-Tween angesetzt. Als Sekundärantikörper diente ein mit Alkalischer Phosphatase konjugierter anti-mouse IgG- Antikörper (SIGMA-ALDRICH) in einer Verdünnung von 1:20000 oder ein monoklonaler anti-bovine IgG-Antikörper (SIGMA-ALDRICH), der 1: verdünnt war. Die Inkubation mit den Konjugaten wurde nach drei jeweils fünfminütigen Waschschritten mit TBS-Tween für eine Dauer von einer Stunde durchgeführt. Im Folgenden wurden die Membranen einmalig für fünf Minuten mit TBS-Tween und anschließend zweimal je fünf Minuten lang mit 1x TBS gewaschen, bevor die Western-Blot-Färbelösung als Substrat für die Alkalische Phosphatase in die Schalen gegeben wurde. Nachdem die Banden durch die Bildung eines blauen, unlöslichen Farbkomplexes sichtbar geworden waren, wurde die Lösung abgegossen und die Reaktion durch die Zugabe von Reinstwasser gestoppt. Die Membranen wurden zum Abschluss zwischen zwei Lagen Filterpapier getrocknet Elektro-Elution des geschnittenen MSP Zur Gewinnung des vom GST-Tag geschnittenen MSP erfolgte zunächst eine SDS-PAGE präparativer Gele. Dazu wurde wie in beschrieben ein 12 %iges SDS-Tenngel hergestellt und mit einem 5 %igem SDS-Sammelgel überschichtet. In die kleine Tasche dieses 1,5 mm tiefen Gels wurde dann als Größenstandard 5 µl Roti Mark prestained (ROTH) gegeben, während die große Tasche mit 300 µl des geschnittenen Fusionsproteins geladen wurde. Die Probenaufbereitung fand ebenso wie die Elektrophorese unter den in genannten Bedingungen statt. Im Anschluss an die SDS-PAGE wurde ein ca. 1 cm breiter Streifen von jeder Seite des Gels mit einer Skalpellklinge abgeschnitten und wie in aufgeführt mit Coomassie Blue gefärbt. Der mittlere Teil des Gels wurde während dieses Schrittes weiter in SDS-Probenpuffer geschwenkt. Nachdem auf einer Glasplatte die abgeschnittenen Streifen wieder an den mittleren Teil angelegt worden waren, konnte die MSP-Bande anhand der gefärbten äußeren Streifen in dem ungefärbten Mittelstück identifiziert und ausgeschnitten werden. Daraufhin wurde die Bande im ausgeschnittenen Gelstreifen in eine Kammer des Elektro-Eluters (BIO-RAD) überführt. Die Elution des Proteins aus dem Gelstück wurde unter denaturierenden Bedingungen mit SDS-Probenpuffer bei einer Stromstärke von 6-7 ma über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Die

84 Material und Methoden 84 Kontrolle der Elektro-Elution erfolgte über die in dargestellte SDS-PAGE, bei der als Probe das in SDS-Probenpuffer vorliegende eluierte Protein verwendet wurde. Zur Gewinnung von nativem, nicht denaturiertem rekombinanten MSP diente eine Elektro- Elution nach oben geschildertem Protokoll, bei der die Gele und der Puffer ohne SDS angesetzt waren. Die anschließende Kontrolle des eluierten MSP fand dagegen wieder mittels SDS-PAGE statt Identifizierung des rekombinanten Major Sperm Proteins Um das exprimierte und aufgereinigte Protein als MSP zu verifizieren, erfolgte eine Matrix- Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) Analyse. Dazu wird in einem ersten Schritt das zu untersuchende Protein mittels Trypsin an dessen Schnittstellen geschnitten. Die entstandenen Fragmente, die für jedes Protein spezifisch sind, werden dann in die Kristalle einer Matrixsubstanz eingelagert. Dieses Proben-Matrix-Gemisch wird anschließend mit einem gepulsten Laserstrahl gezielt beschossen, woraufhin die Probenmoleküle durch eine Protonenübertragung aus der Matrix positiv geladen werden (MALDI). In der nachfolgenden Hochvakuumphase des Massenanalysators werden die geladenen Moleküle dann mit Hilfe eines elektrostatischen Feldes beschleunigt und von einem Detektor nach Durchfliegen des Feldes detektiert (TOF). Aufgrund des unterschiedlichen Masse/Ladungsverhältnisses der einzelnen Fragmente entwickeln diese individuelle Geschwindigkeiten. Diese als individuelle Flugzeiten vom Detektor gemessenen Daten ermöglichen die Erstellung eines für ein Protein spezifischen finger-prints. Zur Bestimmung mittels MALDI-TOF wurden zum einen das Fusionsprotein aus dem Klon 2T 4.14 und zum anderen das mit Thrombin geschnittene MSP des selben Klons in einer SDS-PAGE (siehe ) aufgetrennt und mittels Coomassie Blue angefärbt (siehe ). Anschließend wurden beide Banden aus dem SDS-Gel ausgeschnitten und zur Analyse gesendet. Dabei fand die Untersuchung des Fusionsproteins im Institut für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover statt, die des geschnittenen MSP dagegen in der Firma Sequence Laboratories (SEQLAB) in Göttingen. Für das Fusionsprotein wurde die Auswertung der gemessenen Daten direkt im Institut für Mikrobiologie vorgenommen, so dass das endgültige Ergebnis übermittelt wurde. Bei der Firma SEQLAB dagegen wurden die in der MALDI-TOF Analyse gewonnenen Rohdaten per versendet und mussten im

85 Material und Methoden 85 Folgenden mit Hilfe der Suchmaschine Mascot, ausgewertet werden. Unter MS/MS Ion Search wurden dazu folgende Parameter eingegeben: Enzym: Trypsin; Misscleavage: 1; Peptidetolerance: 50 ppm; MS/MS Tolerance: 0,5 Da; Peptidecharge 1; Instrument: MALDI TOF/TOF. Als Grundlage für veröffentlichte Daten diente die Datenbank des National Centre for Biotechnology Information (NCBI), Quantifizierung des Major Sperm Proteins Messung der Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay Die Bestimmung der Konzentration mittels Bradford-Assay wurde für das rekombinante Fusionsprotein, für das geschnittene und elektroeluierte MSP und für die exprimierte GST durchgeführt. Zur Erstellung einer Eichkurve diente bovines Serumalbumin (SIGMA), das in einer Verdünnungsreihe mit Aqua bidest. von 2000 µg/ml bis 125 µg/ml eingesetzt wurde. Zu jeweils 20 µl einer Verdünnungsstufe bzw. der zu bestimmenden Probe wurde dann 1 ml Quickstart Bradford Dye Reagent (BIO-RAD) gegeben. Nach kurzem Vortexen und einer Inkubation für fünf Minuten bei Raumtemperatur fand die Bestimmung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 595 nm in einem Photometer (AMERSHAM) statt. Alle Messungen erfolgten als Tripletts, der Leerwert wurde nach der Zugabe von 20 µl Aqua bidest. zu einem ml Quickstart Bradford Dye Reagent (BIO-RAD) bestimmt. Mit den Mittelwerten der Dreifach-Messungen der Verdünnungsreihe wurde dann eine Eichkurve erstellt. Zur Berechnung der Proteinkonzentration der Proben wurden ebenfalls die Mittelwerte der Tripletts verwendet Messung der Konzentration mittels Agilent Bioanalyzer Die Konzentration der oben aufgeführten Proteine sollte zusätzlich zum Bradford-Assay mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (AGILENT) gemessen werden. Dazu wurden die Proben nach Herstellerangaben aufbereitet und zusammen mit einem im Kit enthaltenen Marker auf den Proteinchip (Protein 200 Plus LabChip-Kit, AGILENT) gegeben. Anschließend wurden die Proben im Bioanalyzer analysiert und die Ergebnisse mit der mitgelieferten Systemsoftware ausgewertet. Neben der Bestimmung der Gesamtkonzentration aller Proteine einer Probe wie im Bradford-Assay konnten mit diesem Verfahren auch verschiedene andere Parameter

86 Material und Methoden 86 erfasst werden. Die Quantifizierung eines bestimmten Proteins sollte ebenso möglich sein wie die Berechnung seines relativen Anteils an der Gesamtmenge der Proteine. Damit wiederum konnte auf den Grad der Aufreinigung der rekombinanten Proteine geschlossen werden Immunisierungsversuche Das rekombinante MSP-Fusionsprotein wurde nach der Aufreinigung in Vakzinierungsversuchen an Rindern eingesetzt. Diese Impfungen umfassten zum einen den Test zweier Adjuvantien und zum anderen die Erprobung des MSP als alleinige Vakzine oder als Kombinationsvakzine mit mehreren anderen Proteinen. Serologische Untersuchungen dienten dabei zum Nachweis der immunogenen Eigenschaften der Impfstoffe. Dazu wurden verschiedene ELISAs etabliert und auch ein kommerzieller Lungenwurm-ELISA sowie der Western Blot verwendet. Als weitere labordiagnostische Untersuchung wurde die Bestimmung von Differentialblutbildern durchgeführt. Zum Abschluß jedes Impfdurchganges wurde dann die potentiell protektive Wirkung der Immunisierungen durch eine Belastungsinfektion mit infektiösen Lungenwurmlarven untersucht. Zur Beurteilung dieser Fragestellung wurden neben einer Reihe von parasitologischen Parametern auch klinische Symptome und pathologisch-anatomische Veränderungen erfasst. Die Bestimmung der Larvenzahlen und der Anzahl adulter Lungenwürmer sowie deren geschlechtliche Differenzierung ermöglichten ebenso wie die Messung von Wurmlänge und -breite eine vollständige Bewertung der Wirkungen der Vakzinen Versuchstiere und Haltungsbedingungen Es wurden für die insgesamt drei Impfdurchgänge jeweils 12 männliche Rinder der Rasse Holstein-Friesian unter parasitenfreien Bedingungen aufgestallt. Alle Tiere stammten aus regionalen Betrieben und wurden im Alter von drei bis vier Monaten zugekauft. Sie wurden mit handelsüblichem Kraftfutter und Heu ad libitum gefüttert. Die Kälber standen gruppenweise in mit Stroh eingestreuten Ställen und hatten jederzeit Zugang zu einem Auslauf. Die Größe der Gruppen lag im ersten und zweiten Durchgang bei vier Tieren, während sie im letzten Versuch sechs Rinder pro Gruppe betrug.

87 Material und Methoden Impfstoffe Jeder verwendete Impfstoff setzte sich aus einem rekombinanten Protein und einem Adjuvans zusammen. Die zur Verfügung stehenden Adjuvantien waren zum einen Saponin Quil A (GERBU) und zum anderen Alhydrogel Adjuvant (GERBU) mit dem Wirkstoff Aluminiumhydroxid (Al(OH) 3 ). Das Volumen der Vakzine betrug für Quil A 1 ml und für Al(OH) 3 1,5 ml, Volumenschwankungen durch Verwendung der verschiedenen Poole wurden mit sterilfiltriertem (RENNER) 10 mm Tris-HCl, ph 7,4 ausgeglichen. Die Kontrollgruppe erhielt das Adjuvans in Verbindung mit ebenfalls sterilfiltriertem Elutionspuffer für Proteine. Dabei wurde im ersten und dritten Durchgang Quil A in der Kontrollgruppe angewendet, bei der zweiten Immunisierung dagegen Al(OH) 3. Die Vakzinen wurden in autoklavierten 2 ml Eppendorfgefäßen angesetzt und für 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur geschwenkt (LABORTECHNIK FROEBEL). Im Anschluss an diese Inkubation wurde der Al(OH) 3 - Impfstoff bzw. die Al(OH) 3 -Kontrolle in 2 ml Spritzen (WDT) und der Quil A-Impfstoff bzw. die Quil A-Kontrolle in 1 ml Spritzen (WDT) überführt. Die Vakzine wurde intramuskulär in die Halsmuskulatur verabreicht, die Durchführung der Boosterimpfungen erfolgte an jeweils anderen Bereichen des Halses. Zur einfacheren Beobachtung eventueller lokaler Impfreaktionen fand vor jeder Immunisierung eine Rasur der ausgewählten Bezirke statt. Vakzineversuch I: 400 µl Aluminiumhydroxid = 4 mg Aluminium 166 µl MSP = 200 µg Protein Al(OH) 3 -Impfstoff 934 µl Tris-Puffer 75 µl Quil A 1 % = 750 µg Quil A 166 µl MSP = 200 µg Protein Quil A-Impfstoff 759 µl Tris-Puffer 75 µl Quil A 1 % = 750 µg Quil A 166 µl Elutionspuffer Kontrolle 759 µl Tris-Puffer

88 Material und Methoden 88 Vakzineversuch II: 400 µl Aluminiumhydroxid = 4 mg Aluminium 764 µl MSP = 200 µg Protein Al(OH) 3 -Impfstoff 336 µl Tris-Puffer 75 µl Quil A 1 % = 750 µg Quil A 764 µl MSP = 200 µg Protein Quil A-Impfstoff 161 µl Tris-Puffer 400 µl Aluminiumhydroxid = 4 mg Aluminium 610 µl Elutionspuffer Kontrolle 490 µl Tris-Puffer Vakzineversuch III : 75 µl Quil A 1 % = 750 µg Quil A 617 µl MSP = 100 µg Protein Quil A-Impfstoff 308 µl Tris-Puffer 75 µl Quil A 1 % = 750 µg Quil A 422 µl Elutionspuffer Kontrolle 503 µl Tris-Puffer Neben diesem Impfstoff erhielt jedes Tier des zweiten und dritten Durchgangs noch weitere Vakzinen mit verschiedenen rekombinanten D. viviparus-proteinen. Die Herstellung und Verabreichung dieser Impfstoffe erfolgte wie oben beschrieben, wobei jede Vakzine aus einem Protein und dem entspechenden Adjuvans zusammengesetzt war. Jedes Tier erhielt die Proteine in Kombination mit dem gleichen Adjuvans, die Kontrollgruppe wurde wie oben dargestellt behandelt. Es wurde für jede Verabreichung ein anderer Bereich des Halses ausgewählt, um eine Differenzierung eventueller lokaler Impfreaktionen zu ermöglichen. Impfschema und Untersuchungsplan entsprachen den für MSP geschilderten.

89 Material und Methoden 89 Die Rinder des zweiten Durchgangs wurden zusätzlich zum MSP mit jeweils 200 µg/impfung der Protein-Disulfidisomerase und der Phenyl-N-Methyl-Transferase immunisiert. Neben diesen drei Proteinen dienten im dritten Vakzinierungsversuch noch die Acetylcholinesterase und Paramyosin zur Immunisierung. Hier wurden alle Proteine mit 100 µg/ Impfung eingesetzt Lungenwurm-Stammhaltung Die für die Belastungsinfektion notwendigen infektiösen dritten Lungenwurmlarven stammten aus der im Institut für Parasitologie vorhandenen Stammhaltung von D. viviparus. Die Gewinnung der ersten Larven erfolgte mit Hilfe des Auswanderverfahrens nach BAERMANN (1917) aus rektal entnommenem Kot der experimentell infizierten Kälber. Nach einer ersten Auswanderungsphase über Nacht bei Raumtemperatur folgte zur Konzentrierung und Aufreinigung der Larven eine Sedimentation des abgelassenen Überstandes in einem 500 ml Standzylinder. Diese fand ebenfalls bei Raumtemperatur über Nacht statt. Daran wurde ein zweiter Auswanderungsschritt angeschlossen, in dem die Larven nach Entfernen des Überstands aus dem Standzylinder in drei Lagen Zellstoff gehüllt auf Siebe mit einer Maschenweite von 50 µm gegeben wurden. Die nach einer Nacht ausgewanderten Larven wurden abschließend in Erlenmeyerkolben überführt und bei Raumtemperatur gelagert. Die nach einer Entwicklungsdauer von 5 bis 10 Tagen vorliegenden infektiösen dritten Larven konnten zur Durchführung weiterer Infektionen verwendet werden. Zur Dokumentation der jeweiligen Larvenstadien wurden diese unter einem Stereomikroskop (Axiophot, ZEISS) bei einer 100fachen Vergrößerung betrachtet und mit Hilfe einer am Mikroskop angebrachten Kamera (OLYMPUS) fotografiert Impfschema und Untersuchungsplan Die Impfungen, die Belastungsinfektion und die Sektion wurden in allen drei Durchgängen nach folgendem Schema durchgeführt, wobei Tag -7 den Tag der Ankunft der Tiere bezeichnete und Tag 0 den der ersten Immunisierung. Alle folgenden Daten sind als Tag x nach der ersten Vakzinierung benannt.

90 Material und Methoden 90 Larvenausscheidung Vakzinierung Infektion Sektion Bei Ankunft der Rinder, an den Tagen der Impfungen und der ersten Infektion sowie am Tag der Sektion wurde jedes Tier gewogen und klinisch untersucht. Um sicherzustellen dass kein Kalb vor der planmäßigen Infektion mit D. viviparus infiziert war, wurden an den Tagen 0, 21, 42, 63 und dreimalig vor Tag 0 Kotproben rektal entnommen und die Larvenausscheidung nach dem modifizierten Baermann-Verfahren bestimmt. Dieses diente auch zur täglichen Kontrolle der Larvenausscheidung nach der Challenge-Infektion von Tag 84 bis zur Sektion. Die Belastungsinfektion mit insgesamt 3300 infektiösen dritten Larven je Rind fand an drei aufeinander folgenden Tagen beginnend mit Tag 63 statt. Dazu wurden an diesen Tagen jedem Tier 1100 Larven in Leitungswasser mit einer 20 ml Spritze (WDT) oral eingegeben. Von Tag -7 bis Tag 69 erfolgte eine tägliche Beobachtung der Rinder, die ab Tag 70 von einer täglichen klinischen Überwachung ersetzt wurde. Bis zur Infektion an Tag 63 wurden zweimal pro Woche Serum-Blutproben (SARSTEDT) entnommen, ab diesem Zeitpunkt fand eine wöchentliche Entnahme statt. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4 C wurden die Monovetten bei 1550 g und 4 C für 15 Minuten zentrifugiert (HERAEUS), die Seren anschließend abgenommen und in 12 ml Falcons (RENNER) überführt. Die Lagerung dieser Proben und der von jedem Serum angefertigten 1 ml Aliquots erfolgte bei -20 C. Zusätzlich wurden an den Tagen -7, 63, 84, 91 und 98 EDTA-Blutproben (SARSTEDT) zur Bestimmung eines Differentialblutbildes entnommen. Alle Blutprobennahmen wurden an der Vena jugularis externa durchgeführt. Konnte durch die tägliche Überwachung der Tiere eine schwerwiegende Erkrankung festgestellt werden, wurde das Tier der Krankheit entsprechend mit für Rinder zugelassenen Präparaten behandelt. Dazu mussten im Verlauf der Versuche neben Antibiotika

91 Material und Methoden 91 (Baytril 10% und Draxxin, WDT) auch nicht steroidale Antiphlogistika (Finadyne RP, WDT) eingesetzt werden. Alle Tiere wurden an Tag 98 per Bolzenschuss betäubt und anschließend ausgeblutet. Die Lungen wurden einschließlich der Trachea entnommen und pathologisch-anatomisch beurteilt. Daraufhin folgten als Abschluss die Isolierung der adulten Lungenwürmer aus der Lunge und die Bestimmung von Geschlecht und Anzahl der Würmer sowie die Messung der Breite und Länge Klinische und pathologische Auswertung der Vakzinierungsversuche Klinische Untersuchungen Die Erfassung der klinischen Symptome gliederte sich wie in dargestellt in drei unterschiedliche Untersuchungsgänge auf. Die bis Tag 69 durchgeführte tägliche Beobachtung der Rinder umfasste neben der Beurteilung des Verhaltens insbesondere eine Bewertung der lokalen Impfreaktionen. Dazu wurden Schwellung und Schmerzhaftigkeit der Impfstellen untersucht. Zudem wurden auch schon in diesem Untersuchungsabschnitt respiratorische Symptome wie Nasenausfluss und Husten erfasst. Diese wurden dann auf einer Skala von nicht vorhanden bis purulent bei Nasenausfluss und von keinem Husten bis Hustenattacke bewertet. Ab Tag 70 diente eine eingehendere tägliche klinische Überwachung mit dem Schwerpunkt Atmungstrakt dazu, das eventuelle Auftreten einer Dictyokaulose zu diagnostizieren. Die oben beschriebenen Parameter Verhalten, Nasenausfluss und Husten wurden ebenso wie die Atemfrequenz, die Körpertemperatur, die Herzfrequenz und der Atemtyp zur Diagnose hinzugezogen. Wurden bei den täglichen Beobachtungen oder den täglichen klinischen Überwachungen andere Erkrankungen oder deren Symptome festgestellt, wurden diese ebenfalls dokumentiert. Bei der Ankunft, an den Tagen der Impfungen, dem Tag der ersten Infektion und dem Tag der Sektion fanden klinische Untersuchungen aller Tiere statt. Im Rahmen einer erweiterten Allgemeinuntersuchung wurden hierbei neben dem Respirationstrakt auch der Gastro- Intestinaltrakt, das Herz- und Kreislaufsystem, Haut und Haare sowie der Bewegungsapparat untersucht, womit eine Aussage über das Allgemeinbefinden der Rinder getroffen werden

92 Material und Methoden 92 konnte. Anhand dieser wurde die Aufnahme der Tiere in den Versuch festgelegt und zudem ihre Impffähigkeit beurteilt Pathologische Untersuchungen Unmittelbar nach Entnahme der Lungen aus den Tieren fand eine kurze makroskopische Untersuchung durch Mitarbeiter des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover statt. Es wurden die von außen sichtbaren Befunde für jeden einzelnen Lungenlappen erhoben. Die unterschiedliche Ausprägung der Entzündungsreaktionen wurde als prozentualer Anteil des veränderten Gewebes am gesamten Lappen geschätzt. Eventuelle Veränderungen der mit der Lunge entnommenen Lymphknoten oder der Pleura wurden zusätzlich untersucht und bewertet Labordiagnostische Auswertung der Vakzinierungsversuche Differentialblutbild Das an den Tagen -7, 63, 84, 91, 98 entnommene EDTA-Blut diente zur Anfertigung eines Differentialblutbildes. Diese Untersuchungen wurden in der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorische Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Vorversuche Zur Detektion systemischer, durch die Immunisierungen und die Belastungsinfektion hervorgerufener Antikörper dienten verschiedene ELISAs. Diese beruhten auf dem auch für die Vakzinierungen verwendeten MSP-Fusionsprotein, dem geschnittenem MSP und der GST. Zur Etablierung der Methode wurde in Vorversuchen mit den von Stammhaltungstieren gewonnenen Seren gearbeitet. Dabei wurde einerseits Serum parasitennaiver Kälber und andererseits Serum, welches 5 Wochen nach einer D. viviparus-infektion entnommen wurde, genutzt. Die Behandlung und Lagerung der Blutproben erfolgte wie in beschrieben. Die in den Vorversuchen verwendeten aufgereinigten Fusionsproteine stammten aus gepoolten Small-scale-Expressionen und nicht aus den angefertigten ELISA-Pools.

93 Material und Methoden 93 Zunächst wurde in einem ersten Vorversuch der ELISA auf der Grundlage der MaxiSorp- Platten (NUNC) durchgeführt. Dazu dienten zwei unterschiedlich aufbereitete Fusionsproteine als Antigene. Zum einen wurden 150 µl (1 µg/µl) des Fusionsproteins mit 150 µl 8 M Harnstoffs gemischt, anschließend in 2700 µl Beschichtungspuffer aufgenommen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zum anderen wurden 150 µl (1 µg/µl) Fusionsprotein direkt mit 2850 µl Beschichtungspuffer vermengt. Zur Beschichtung der Platten wurde mit beiden Antigenlösungen eine Titration durchgeführt, so dass schließlich eine Verdünnungsreihe von 5 µg Antigen/well bis 0,04 µg/well auf jeder Platte vorlag. Die Bindungsreaktion des Antigens an die Platte fand bei 4 C über Nacht statt, die Platten waren wie bei allen folgenden Inkubationsschritten mit einer Folie (NUNC) bedeckt. Nach Entfernen der Antigenlösungen wurden die Platten drei Mal für jeweils fünf Minuten mit 1x PBS gewaschen (Immunowasher, NUNC). Die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen erfolgte mit 100 µl 5 %igem BSA-PBS/well für eine Stunde bei 37 C im Glasperlenwasserbad (Wärmeschrank, HERAEUS). Nach Abgießen des Überstands und drei Waschschritten (Immunowasher, NUNC) mit PBS-Tween für je fünf Minuten folgte eine Inkubation der Platten mit positivem und negativem Serum. Dazu wurden die Seren 1:10 mit 1 %igem BSA-PBS-Tween verdünnt und 100 µl von dieser Verdünnung in jedes well gegeben. Als Leerwert diente ein well, welches kein Serum enthielt. Nach einer Lagerung der Platten von einer Stunde bei 37 C im Glasperlenwasserbad, der Entfernung des Überstandes und dreimaligem Waschen mit PBS-Tween für je fünf Minuten wurde die Gebrauchslösung des Konjugates aufgetragen. Hierzu wurde eine 1:10000 Verdünnung des anti-bovinen IgG- Konjugates (SEROTEC) mit 1 %igem BSA-PBS-Tween angefertigt und 100 µl in jedes well pipettiert. Im Anschluss an die Inkubation für eine Stunde bei 37 C im Glasperlenwasserbad erfolgten nach Abschütten des Überstandes drei Waschschritte von je fünf Minuten mit PBS- Tween, ehe 50 µl der frisch hergestellten Substratlösung in jedes well gegeben wurden. Nach einer Inkubation von 10 Minuten im Dunkeln und bei Raumtemperatur wurde die Bildung des Farbkomplexes durch Zugabe von 50 µl Stopplösung je well abgestoppt. Die Messung der optischen Dichte wurde bei einer Wellenlänge von 490 nm in einem ELISA-Reader (BIO- TEK) durchgeführt.

94 Material und Methoden 94 In weiteren Vorversuchen folgte die Erprobung von zwei weiteren Mikrotiterplatten, Immobilizer Amino (NUNC) und Immobilizer Glutathion (NUNC). Die Durchführung dieser beiden ELISA fand nach dem gleichen Protokoll statt. Auch hier wurde bei der Beschichtung der Platten eine Antigentitration vollzogen, bei der als Ausgangslösung 300 µl (0,5 µg/µl) des Fusionsproteins mit 2700 µl 1x PBS je Platte vermischt wurden. Es ergab sich daraus wie bei den MaxiSorp-Platten eine Verdünnungsreihe von 5 µg/well bis 0,04 µg/well. Die Inkubation der Platten erfolgte ebenfalls bei 4 C über Nacht, wobei die Platten bei diesem und jedem weiteren Schritt mit Folie abgeklebt waren. Im Anschluss an die Beschichtung wurde der Überstand abgegossen und die Platten dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Zur Inkubation mit positivem und negativem Serum wurden 100 µl des vorher 1:10 in PBS-Tween verdünnten Serums in jedes well gegeben, wobei ein well je Platte ohne Serum blieb und als Leerwert diente. Nach einer Stunde bei 37 C im Glasperlenwasserbad wurden die Platten wie oben beschrieben dreimal gewaschen. Daran anschließend fand die Detektion der Primärantikörper durch das Konjugat statt, wozu jedes well mit 100 µl der Gebrauchslösung des anti-bovinen IgG-Konjugates (SEROTEC) gefüllt wurde. Diese war vorher durch eine 1:10000 Verdünnung des Sekundärantikörpers in PBS-Tween hergestellt worden. Die folgende Inkubation bei 37 C im Glasperlenwasserbad für eine Stunde wurde durch ein dreimaliges Waschen mit PBS-Tween beendet. Nach Zugabe von 50 µl/well des frisch angesetzten Substrats wurde eine Zeitspanne von 10 Minuten abgewartet, ehe 50 µl/well der Stopplösung zugefügt wurden. Während dieser Zeit lief die stattfindende Farbreaktion bei Raumtemperatur im Dunkeln ab. Die optische Dichte wurde im ELISA- Reader (BIO-TEK) bei einer Wellenlänge von 490 nm bestimmt. Nach Auswertung dieser Vorversuche wurden alle weiteren ELISA und auch die in , sowie 3.22 dargestellten ELISA mit der Immobilizer Amino Platte (NUNC) ausgeführt.

95 Material und Methoden ELISA auf der Grundlage des rekombinanten Fusionsproteins Mit diesem ELISA wurden die aus allen drei Durchgängen vorhandenen Seren getestet, wobei nur die ab Tag -7 wöchentlich entnommenen Proben berücksichtigt wurden. Zur Darstellung des Beginns der Antikörperbildung nach der jeweiligen ersten Immunisierung dienten zusätzlich die an den Tagen 4 und 11 entnommenen Seren. Nach der Durchführung von Schachbretttitrationen des Antigens und des Serums sowie der Erprobung verschiedener Konjugat-Verdünnungsstufen konnte dann ein gemeinsames Protokoll für alle ELISA auf der Grundlage des Fusionsproteins erstellt werden. Dazu musste das für die Immobilizer Amino Platte beschriebene Protokoll nur geringfügig modifiziert werden. Die eingesetzten Konjugate zum Nachweis von bovinem IgA, IgG, IgG1, IgG2 und IgM (SEROTEC) konnten alle in einer Verdünnung von 1:10000 verwendet werden. Die Beschichtung der Platten erfolgte mit 0,5 µg Fusionsprotein/well aus dem angefertigten ELISA-Pool, die Konzentration des Proteins wurde hierbei über den Bradford-Assay bestimmt. Die Seren wurden schließlich 1:40 in PBS-Tween verdünnt und als Duplikate getestet. Als positive und negative Kontrollen wurden auf jeder Platte Duplikate der aus Stammhaltungstieren gewonnenen Seren verwendet, wobei bei den ELISA des dritten Durchgangs auf einen einheitlichen Pool zurückgegriffen werden konnte. Die Ergebnisse der ELISA des ersten und zweiten Durchgangs wurden als Mittelwert der optischen Dichten (OD) der Probe nach Subtrahieren der OD des Leerwerts angegeben. Zur Auswertung der ELISA der dritten Vakzine wurde ein Index-Wert berechnet, der auch auf den Mittelwerten der Duplikate beruhte: Index = OD Probe - OD Leerwert / OD positives Referenzserum - OD Leerwert ELISA auf der Grundlage des geschnittenen MSP und der GST Auch diese ELISAs fanden mit wenigen Veränderungen nach dem in beschriebenen Protokoll für die Immobilizer Amino Platte statt. Nachdem verschiedene Konjugatverdünnungen getestet und zur Ermittlung der optimalen Antigenkonzentration und Serumverdünnung auch Schachbretttitrationen durchgeführt worden waren, konnten für alle

96 Material und Methoden 96 ELISAs auf Basis des geschnittenen MSP sowie für alle GST-ELISA einheitliche Antigen-, Serum- und Konjugatverdünnungen festgelegt werden. Als Antigen des MSP-ELISA wurde dabei 0,25 µg Protein/well eingesetzt, die Seren wurden 1:40 verdünnt als Duplikate aufgetragen und die Konjugate in einer Gebrauchslösung von 1:10000 angewendet. GST dagegen wurde in einer Menge von 1 µg/well gebraucht, die Seren für diesen ELISA wurden 1:20 verdünnt und auch als Duplikate getestet. Die Gebrauchslösung der Konjugate betrug ebenfalls 1: Diese ELISAs dienten ausschließlich zum Testen der Seren des dritten Vakzinedurchgangs, es wurden hierzu Seren der Tage 0, 21, 42, 63, 70, 77, 84, 91 und 98 genutzt. Zudem wurde hier nicht das anti-bovine IgM-Konjugat verwendet. Als positives und negatives Referenzserum wurden für den ELISA mit dem geschnittenen MSP die in genannten Seren eingesetzt. Im GST-ELISA dagegen diente als positive Referenz ein Pool aus Seren, der aus den an Tag 46 des ersten Vakzineversuchs aus den Impfgruppen entnommenen Proben bestand. Die Auswertung der Ergebnisse wurde nach der Berechnung der Mittelwerte der Duplikate wie in geschildert als Index-Werte vorgenommen Ceditest Lungworm Dieser kommerzielle ELISA (CEDI-DIAGNOSTICS) zum Nachweis einer Lungenwurm- Infektion basiert auf einer aus adulten D. viviparus angereicherten, nativen Proteinfraktion. Der Hauptbestandteil der Fraktion scheint nach Herstellerangaben identisch zu sein mit dem von SCHNIEDER (1993b) beschriebenen und auch in der vorliegenden Dissertation bearbeiteten MSP. Daher sollte der Ceditest Lungworm in den durchgeführten Immunisierungsversuchen dazu dienen, die Bindungfähigkeit der gegen das rekombinante MSP gebildeten Immunglobuline an natives MSP nachzuweisen. Der ELISA wurde nach dem mitgelieferten Protokoll durchgeführt und ausgewertet, es wurden hierzu die Seren der Tage 0, 21, 42, 63, 70, 77, 84, 91 und 98 aus allen drei Durchgängen verwendet. Die an Tag -7 des ersten Impfversuches entnommenen Seren wurden ebenfalls mit dem Ceditest Lungworm getestet.

97 Material und Methoden Western Blot mit nativem Lungenwurmantigen Auch diese Methode erfolgte zur Überprüfung der Bindungsfähigkeit der Impfantikörper an native Epitope des MSP von D. viviparus. Das verwendete Rohantigen wurde dabei sowohl aus männlichen als auch aus weiblichen adulten Würmern gewonnenen, die aus dem Bestand des Instituts für Parasitologie stammten und bei -80 C gelagert worden waren. Nach Überführung der Würmer in einen Glashomogenisator und Zugabe von 0,5 ml 1x PBS wurden diese für zwei Minuten manuell zerkleinert, woraufhin sich eine Ultraschallbehandlung (MSE) der entstandenen Suspension in einem 12 ml Falcon anschloss. Dazu wurde die Suspension unter ständiger Kühlung in Eiswasser für drei Minuten dem Ultraschall ausgesetzt, wobei nach einer 15 Sekunden langen Lysierungsphase bei 20 Micron die Probe für darauffolgende 15 Sekunden abgekühlt wurde. Anschließend wurde das Lysat in 2 ml Eppendorfgefäße überführt und für fünf Minuten bei g und Raumtemperatur zentrifugiert (HERAEUS). Der Überstand wurde abgenommen und bei -20 C aufbewahrt. Die Proteinkonzentration in dem aus den männlichen und den weiblichen Würmern erhaltenen Lysat wurde mit dem unter dargestellten Bradford-Assay bestimmt. Im Anschluss wurde die Konzentration beider Proben durch Zugabe von 1x PBS auf 160 µg/ml eingestellt. Eine SDS-PAGE präparativer Gele diente zur Auftrennung der nativen Proteine. Dazu wurde wie in beschrieben ein 12 %iges SDS-Tenngel hergestellt und mit einem 5 %igem SDS-Sammelgel überschichtet. In die kleine Tasche dieses 1 mm tiefen Gels wurde dann als Größenstandard 5 µl Roti Mark prestained (ROTH) gegeben, während die große Tasche mit 200 µl des aufbereiteten Rohantigens geladen wurde. Die Probenaufbereitung fand ebenso wie die Elektrophorese und der Western Blot unter den in und genannten Bedingungen statt. Die weiteren Schritte des Immunoblots wurden mit den an Tag 0, 63 und 98 gewonnenen Seren der Rinder des ersten Durchgangs nach dem in beschriebenen Protokoll durchgeführt. Nach der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wurde allerdings die Nitrocellulosemembran in ca. 4 mm breite Streifen geschnitten, von denen jeder mit einem Serum in einer einzelnen Kammer inkubiert werden konnte (Multiscreen Kammer, HOEFER).

98 Material und Methoden Parasitologische Auswertung der Vakzinierungsversuche Bestimmung der Larvenzahlen Zur Bestimmung der Larvenausscheidungen diente ein modifiziertes Auswanderverfahren nach BAERMANN (1917). Dazu wurde für jedes Kalb ein Doppelansatz von jeweils 10 g rektal entnommenen Kots abgewogen und in eine Lage Zellstoff gehüllt in die Siebe gegeben. Die Trichter wurden soweit mit Leitungswasser gefüllt, dass der Boden der eingelegten Siebe bedeckt war. Nach einer Auswanderungsphase über Nacht wurden am nächsten Tag wenige ml in eine Zählkammer abgelassen und die ausgeschiedenen Larven mit einer 31,25fachen Vergrößerung (ZEISS) gezählt. Waren mehr als 20 Larven pro Gramm (LpG) Kot in einer Probe enthalten, wurden bei der nachfolgenden Probe dieses Tieres 8 ml aus dem Trichter abgelassen und von diesem nach kurzem Vortexen ein Aliquot von 1 ml ausgezählt. Anschließend wurde daraus das LpG errechnet Bestimmung der Anzahl und des Geschlechts der adulten Würmer Nach Entnahme der Lungen aus den Tieren und ihrer pathologisch-anatomischen Beurteilung wurden die adulten Lungenwürmer isoliert. Dazu konnten nach Aufschneiden der Trachea und Bronchien entlang des Bronchialbaums die Würmer mit einer Pinzette erfasst und in ein mit 0,9 %iger NaCl-Lösung gefülltes, eisgekühltes Glas überführt werden. Anschließend wurde jeder einzelne Wurm in einer ebenfalls mit 0,9 %iger NaCl-Lösung gefüllten Petrischale unter einem Stereolupe (OLYMPUS) bei 10facher Vergrößerung geschlechtlich differenziert und die Anzahl der weiblichen und männlichen Adulten dokumentiert. Nicht mehr vollständige Lungenwürmer wurden insofern differenziert und gezählt, als dass nur die aufgefundenen Hinterenden dazu beurteilt wurden, während die Vorderenden nicht weiter berücksichtigt wurden. Zur Verwendung der adulten Würmer in der quantitativen Real-time PCR folgte dann nach einem Waschschritt in DEPC-Bidest das Abfüllen von jeweils 20 einzelnen männlichen und weiblichen Würmern pro Rind des zweiten und dritten Durchgangs in 1,5 ml DEPC-Gefäße. Diese enthielten bereits 500 µl GIT-Puffer und wurden nach Zugabe des Wurms bei -80 C gelagert.

99 Material und Methoden Messung der Wurmlänge und breite Die nach der Isolierung und Zählung vorhandenen Würmer wurden weiter in einer 0,9 %igen NaCl-Lösung auf Eis gelagert und am gleichen oder aber am folgenden Tag fotografiert (OLYMPUS). Hierzu konnten jeweils 25 bis 30 zufällig ausgewählte Adulte jeden Geschlechts pro Rind auf einem Bild aufgenommen werden. Die eisgekühlten Würmer wurden lebend der Länge nach ausgestreckt auf einen schwarzen Untergrund gelegt und mit Hilfe eines Statives aufgenommen. Auf jedem Bild war zur späteren Kalibrierung ein Lineal als Maßstab vorhanden. Die Auswertung dieser digitalen Aufnahmen erfolgte mit der Software Olympus DP-Soft C Nachdem jedes Bild mit Hilfe des beigefügten Maßstabs kalibriert worden war, konnten mit der Funktion Polygonlänge je 25 weibliche und männliche Würmer pro Rind vermessen werden. Im ersten Durchgang wurden ebenfalls 25 weibliche und 25 männliche Würmer pro Tier erfasst, hier konnten allerdings die Würmer nicht mehr einem bestimmten Rind sondern nur noch der Gruppe zugeordnet werden. Konnten von einem Tier nicht genügend Würmer gemessen werden, wurden so viele Würmer anderer Rinder der gleichen Gruppe verwendet, bis eine Gesamtzahl von 100 Würmern je Geschlecht und Gruppe erreicht war. Alle gemessenen Werte wurden in eine Excel-Tabelle überführt und statistisch ausgewertet Validierung eines ELISAs zur Diagnostik einer Lungenwurminfektion Der in beschriebene IgG1-ELISA auf der Basis des rekombinanten Fusionsproteins wurde als Methode zum Nachweis einer Lungenwurminfektion validiert. Zur Validierung dienten zum einen 112 Einzelseren von experimentell mit D. viviparus infizierten Rindern. Von 1991 bis 2006 wurden diese Proben von den im Institut für Parasitologie eingestallten Tieren ab einem Zeitpunkt von 5 Wochen post infectionem entnommen. Die Seren wurden nach einer Inkubation bei 4 C über Nacht mit anschließender Zentrifugation bei Raumtemperatur und 1550 g für 15 Minuten gewonnen und bei -20 C gelagert. Bei allen Tieren konnte mit Hilfe des Auswanderverfahrens nach BAERMANN (1917) eine patente Lungenwurminfektion diagnostiziert werden, so dass diese Seren als sicher positiv gewertet wurden. Zum anderen konnten 129 Einzelseren von parasitennaiven Kälbern eingesetzt werden. Auch diese waren im Institut für Parasitologie von 1989 bis 2006 eingestallt, die Serumgewinnung und Lagerung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Diese Seren

100 Material und Methoden 100 wurden als sicher negativ beurteilt, da mittels Auswanderverfahren nach BAERMANN (1917) keine patente Lungenwurminfektion vorlag. In den Jahren 2005 und 2006 wurden zudem 8 Blutproben von mit Ostertagia ostertagi- und 2 Blutproben von mit Cooperia oncophora-infizierten Rindern entnommen. Nach der oben dargestellten Gewinnung und Lagerung der Seren wurden diese im ELISA auf Kreuzreaktionen hin getestet. Auch hier wurde die Patenz der jeweiligen Infektionen mit der Bestimmung der Wurmeier im Kot nachgewiesen. Zusätzlich diente das aus einem ELISA-Kit (ELISA Fasciolasis, INSTITUT POURQUIER) entnommene positive Referenzserum für Fasciola hepatica ebenfalls zum Test auf Kreuzreaktion. Jedes Serum und die auf allen Platten verwendeten negativen und positiven Referenzseren sowie der Leerwert wurden als Duplikate angesetzt und die ELISAs an einem anderen Tag in unabhängigen Untersuchungen wiederholt. Die Referenzseren stammten aus gepoolten Proben von Stammhaltungstieren, die wie oben beschrieben als sicher positiv und sicher negativ gewertet wurden. Die Durchführung des ELISA fand nach dem in geschilderten Protokoll statt, die Auswertung wurde mit dem dort beschriebenen Index-Wert vorgenommen Quantitative Real-time PCR Die Bestimmung der Transkriptionsrate eines Gens und damit, wenn auch eingeschränkt, die Aussage über dessen Expression ist mit Hilfe dieser Methode möglich. Die hier genutzte quantitative Real-time PCR arbeitet dazu mit fluoreszenzmarkierten TaqMan -Sonden, welche zur Detektion und Quantifizierung des eingesetzten Templates dienen. Diese Sonden sind kurze, zu dem internen Abschnitt des Amplifikats komplementäre DNA-Sequenzen, die am 3 -Ende einen Quencherfarbstoff und am 5 -Ende einen Reporterfarbstoff gebunden haben. In der so beschriebenen Konformation findet keine Emission von Fluoreszenz statt, da der Quencherfarbstoff die emittierte Energie des Reporterfarbstoffes absorbiert. Wenn nach Anlagerung der Sonde an das Template im Zuge der Primerextension das 3 -Ende der Sonde durch die 5 3 -Exonucleaseaktivität der eingesetzten Taq-Polymerase abgetrennt wird, entsteht eine räumliche Trennung des Quencher- vom Reporterfarbstoff. Damit ist die Absorption der emittierten Energie nicht mehr möglich, worauf diese als Fluoreszenzsignal erfasst werden kann. Die Bindung der TaqMan -Sonden an die komplementäre Sequenz

101 Material und Methoden 101 bewirkt zum einen eine hohe Spezifität der quantitativen Real-time PCR, und zum anderen ermöglicht sie über die Messung der Stärke des fluoriszierenden Signals die Quantifizierung des Templates. Mit dieser Technik sollte die geschlechts- und stadienspezifische Transkription des MSP in D. viviparus untersucht werden. Des Weiteren sollten eventuelle Transkriptionsunterschiede zwischen den adulten Würmern, die aus immunisierten Rindern stammten, und solchen aus nicht immunisierten Tieren erarbeitet werden. Die quantitative Real-time PCR erfolgte nach Isolation der RNA und Synthese der ErststrangcDNA mit dem Brilliant Quantitative PCR Core Reagent Kit (STRATAGENE). Die Reaktionen fanden in einem mit einem Fluoreszenzdetektor ausgestatteten Thermocycler, dem MX 4000 Multiplex Quantitative PCR System (STRATAGENE) statt. Zum Vergleich der unterschiedlichen Populationen mussten die für das MSP erhaltenen Werte mit Hilfe eines sogenannten housekeeping-gens normalisiert werden. Als solches wurde das 18S-Gen von D. viviparus ausgewählt, da die Verwendung der 18S-RNA als interner Standard aufgrund der bei unterschiedlichen Organismen nachgewiesenen konstanten, geschlechts- und stadienunabhängigen Expression von verschiedenen Autoren empfohlen wird (BUSTIN 2000; BUSTIN 2002; DEINDL et al. 2002; MOE et al. 2001). Die Real-time PCR wurde für jede Probe mit einem Duplikat des MSP und einem parallelen Duplikat des Referenzgens durchgeführt Probenmaterial Adulte Lungenwürmer Die adulten D. viviparus wurden nach der Schlachtung aus den Lungen der Tiere der Kontroll- und Impfgruppen des dritten Durchgangs gewonnen (siehe ). In der Real-time PCR wurde dann die cdna von jeweils fünf männlichen und fünf weiblichen Lungenwürmern pro Rind eingesetzt. Somit konnte also eine Aussage über die Transkription des MSP bei einer Gesamtpopulation von je 30 männlichen und 30 weiblichen Würmern pro Kontroll- und Impfgruppe getroffen werden.

102 Material und Methoden Larvenstadien Als Larvenstadien wurden die mit dem Kot ausgeschiedenen ersten Larven und die infektiösen dritten Larven von D. viviparus verwendet. Die ersten Larven stammten aus experimentell infizierten Stammhaltungstieren, sie wurden mit dem Auswanderverfahren nach BAERMANN (1917) aus rektal entnommenem Kot isoliert. Dazu wurde der Kot auf die mit drei Lagen Zellstoff ausgelegten Siebe gegeben und der Trichter soweit mit Wasser gefüllt, bis der Boden der Siebe bedeckt war. Nach einer Auswanderungsphase über Nacht konnten die Larven in ein 12 ml Falcon abgelassen und die Larvenzahl mit Hilfe mehrerer Aliquots in einer Zählkammer bei 31,25facher Vergrößerung unter einem Steromikroskop (ZEISS) bestimmt werden. Daraufhin folgte eine Zentrifugation des Falcons bei 1550 g und Raumtemperatur für 10 Minuten. Nach Abnahme des Überstands wurde das Falcon mit 10 ml DEPC-Bidest gefüllt und nochmals unter den oben beschriebenen Bedingungen zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt und das entstandene Larvenpellet anschließend in ein 1,5 ml DEPC-Gefäß mit 500 µl GIT-Puffer überführt und bei -80 C gelagert. Die dritten Larven konnten aus der in geschilderten Stammhaltung entnommen werden. Vor ihrem weiteren Einsatz in der Real-time PCR mussten zunächst die Scheiden der Larven entfernt werden. Dazu wurden die Larven nach Bestimmung der Anzahl noch einmal in einem 500 ml Standzylinder über Nacht sedimentiert und der Überstand soweit entfernt, dass ca Larven in 5 ml enthalten waren. Diese 5 ml wurden in ein 12 ml Falcon überführt. Zur Entscheidung wurden 300µl Na-Hypochlorid (12 % Cl) hinzugefügt und die Larven bei 37 C und 150 rpm für 10 Minuten inkubiert (GFL). Zur Kontrolle der Entscheidung wurde ein Aliquot auf einem Objektträger bei 31,25facher Vergrößerung unter einem Stereomikroskop (ZEISS) betrachtet. Bei unvollständiger Entscheidung wurde die Inkubation mit Na-Hypochlorid so lange unter ständiger Kontrolle fortgesetzt, bis alle Larven entscheidet waren. Danach wurde das Falcon mit DEPC-Bidest aufgefüllt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur und 1550 g zentrifigiert. Nach Verwerfen des Überstands wurde dieser Waschschritt noch zweimal wiederholt, das Larvenpellet dann in 500µl GIT-Puffer in einem 1,5 ml DEPC-Gefäß aufgenommen und bei -80 C gelagert.

103 Material und Methoden Isolierung der Gesamt-RNA Zur Gewinnung der RNA aus den adulten Würmern und den Larven musste zunächst eine mechanische Zerkleinerung der Organismen erfolgen. Die adulten Lungenwürmer wurden dazu nach dem Auftauen für ca. 1 Minute gevortext, woraufhin sie vollständig lysiert im GIT- Puffer vorlagen. Die Kutikula der Larven hingegen musste mittels Ultraschallbehandlung aufgeschlossen werden. Über einen Zeitraum von 3 Minuten wurden Larven in einem 2 ml DEPC-Gefäß, welches sich in Eiswasser befand, mit einer Amplitude von 20 Micron beschallt. Diese Behandlung fand in 15 Sekunden Intervallen statt, bei denen sich an jede Beschallungs- eine Abkühlungsphase anschloss. Mit Hilfe eines Stereomikroskops (ZEISS) wurde der Erfolg des Aufschlusses überprüft, um bei noch vorhandener Integrität der Kutikula die Ultraschallbehandlung weiter fortzusetzen. Zu den so aufgeschlossenen Proben wurde im Folgenden zur Durchführung einer Phenol- Chloroform-Extraktion jeweils 1 ml Trizol Reagent (INVITROGEN) hinzugefügt. Nach einer Inkubation von 5 Minuten bei Raumtemperatur folgte die Zugabe von je 0,2 ml Chloroform (ROTH), worauf die Proben für etwa 15 Sekunden geschwenkt und abermals für 2-3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die sich anschließende Zentrifugation (EPPENDORF) erfolgte bei g und 4 C für 15 Minuten, worauf die wässrige Phase abgenommen und in ein neues 2 ml DEPC-Gefäß überführt wurde. Zur Präzipitation der RNA wurden 0,5 ml 100 %iges Isopropanol pro Probe dazugegeben, diese für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und bei g und 4 C für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstands folgte ein Waschschritt mit je 1 ml 75 %igem Ethanol, an den sich nach Vortexen der Proben eine Zentrifugation bei 7500 g und 4 C für 5 Minuten anschloss. Der Überstand wurde verworfen und das getrocknete Pellet in 9 µl DEPC-Bidest resuspendiert Bestimmung von Quantität und Reinheit der isolierten RNA Vor der Quantifizierung der RNA wurde ein Verdau der eventuell noch in den Proben vorhandenen DNA durchgeführt. Nach Resuspension des Pellets diente der Zusatz von 1 µl RNasin Plus RNase Inhibitor (PROMEGA) zum Schutz der RNA, ehe mit der Zugabe von 1 µl 10x Puffer (PROMEGA) und 1 µl RQ RNase-Free DNase (PROMEGA) der DNA- Verdau begonnen wurde. Dieser fand bei 37 C (HERAEUS) für 30 Minuten statt und wurde

104 Material und Methoden 104 durch das Hinzufügen von 1 µl Stopp- Lösung (PROMEGA) und einer anschließenden Inkubation von 10 Minuten bei 65 C (BIOMETRA) beendet. Die Messung der Konzentration der RNA und die Bestimmung ihrer Reinheit erfolgten photometrisch mit dem GeneQuant pro RNA/DNA Calculator (AMERSHAM BIOSCIENCES) bei Wellenlängen von 230 nm, 260 nm und 280 nm Synthese der Erststrang-cDNA Die Synthese der Erststrang-cDNA wurde mittels Oligo (dt) 20 Primer (INVITROGEN) und genspezifischer Primer durchgeführt. Während die erstgenannten Primer mit der bei fast allen eukaryontischen mrnas vorliegenden Poly(A)-Sequenz hybridisieren sollten, konnten als genspezifische Primer die Rückwärtsprimer des Zielgens und des housekeeping-gens aus der quantitativen Real-time PCR genutzt werden (siehe ). Da in jeder Probe neben dem MSP als weiteres Zielgen die Protein-Disulfidisomerase (PDI) untersucht werden sollte, wurden zur Synthese der Erststrang-cDNA also die Rückwärtsprimer von MSP, PDI und 18S- RNA genutzt. Die als Template verwendete isolierte RNA sollte mit einer Menge von 5 µg RNA pro Reaktionsansatz eingesetzt werden. Diese 5 µg mussten in einem Volumen von höchstens 8 µl DEPC-Bidest enthalten sein, da dies das maximal einsetzbare Volumen darstellte. Lag diese Menge in einem kleineren Volumen vor, wurde dieses mit DEPC-Bidest auf 8 µl aufgefüllt. Konnten keine 5 µg RNA isoliert werden, so wurden 8 µl der isolierten RNA zur Synthese der Erststrang-cDNA verwendet, unabhängig von der dann eingesetzten RNA-Menge. Zunächst wurden zu 8 µl der RNA 1 µl Oligo (dt) 20 Primer (INVITROGEN), jeweils 1µl der Primer MSP qpcr rev, PDI qpcr rev und 18S qpcr rev sowie 1 µl 10 mm dntps (PROMEGA) gegeben. Das Annealing der Primer fand bei 70 C (BIOMETRA) für 7 Minuten statt, worauf die Ansätze sofort für 2 Minuten auf Eis inkubiert und dann kurz zentrifugiert wurden. Anschließend wurden noch 4 µl 5x First Strand Buffer (INVITROGEN), 1 µl 0,1 M DTT (INVITROGEN), 1µl DEPC-Bidest und 1 µl Superscript III RNase H-Reverse Transcriptase (INVITROGEN) hinzugefügt und der Ansatz für 60 Minuten bei 55 C (BIOMETRA) inkubiert. Die Synthese der Erststrang-cDNA wurde mit einer Inkubation von 10 Minuten bei 72 C (BIOMETRA) abgeschlossen.

105 Material und Methoden Quantitative Real-time PCR mittels TaqMan -Sonden Die Primer und TaqMan -Sonden wurden mit Hilfe des Softwareprogramms Primer Express (APPLIED BIOSYSTEMS) ausgewählt. Die Herstellung der Sonden erfolgte bei der Firma APPLIED BIOSYSTEMS und die der Primer bei der Firma INVITROGEN. Als Primer dienten folgende Oligonucleotidsequenzen: 18S qpcr Dv for: 18S qpcr Dv rev: MSP qpcr Dv for: MSP qpcr Dv rev: 5 -CGT CAT TGC TGC GGT TAA AA-3 5 -CGC CAA AGG CGA ATC G-3 5 -GGC TAC TCT CAT GGC TGT GTC TT-3 5 -GGG TGT TGC ACC ACT CAA CA-3 Die als Sonden genutzten Oligonucleotide besaßen als Quencherfarbstoff am 3 -Ende der Sequenz TAMRA, während der Reporterfarbstoff am 5 -Ende aus Fluoreszin (FAM) bestand. Die Sonde für das MSP überspannte dabei die im Alignment festgestellte Intron-Exongrenze, um eine alleinige Detektion der mrna in der Real-time PCR zu gewährleisten. Sonde 18S Dv: Sonde MSP Dv: 6-FAM-CGT AGT TGG ATC TGA GTT ACA TGC AA-TAMRA 6-FAM-ACG TGA GGA CAC CAA CAA CGA CCG TA-TAMRA Als Temperaturprofil wurde das durch Primer Express welches sich folgendermaßen zusammensetzte: vorgegebene Schema genutzt, Initiale Denaturierung 95 C, 10 Minuten Denaturierung 95 C, 30 Sekunden Primerannealing 55 C, 1 Minute 40 Zyklen Primerextension 72 C, 30 Sekunden

106 Material und Methoden 106 Reaktionsansatz: 10 µl Aqua bidest. (AMPUWA, FRESENIUS) 12,5 µl Brilliant Quantitative PCR Core Reagent (STRATAGENE) 0,3 µl Vorwärtsprimer (50 µm) 0,3 µl Rückwärtsprimer (50 µm) 0,5 µl TaqMan -Sonde (10 µm) 0,4 µl Referenzfarbstoff ROX (2 µm) 1 µl Template In der qpcr lagen die Primer mit einer Endkonzentration von 600 nm vor, die Sonden wurden auf 200 nm eingestellt und ROX wurde mit einer Endkonzentration von 32 nm verwendet. Dazu wurde vor jedem Real-time PCR-Lauf eine 2 µm Stocklösung des Referenzfarbstoffes durch die Zugabe von 499 µl Aqua bidest. (AMPUWA, FRESENIUS) zu 1 µl ROX (1 mm) hergestellt, aus der dann für den Ansatz der qpcr zurückgegriffen werden konnte. Die Duplikate wurden als Mastermix mit einem Volumen von 52,8 µl angesetzt, zu dem dann 2,2 µl Template pipettiert wurden. Daraufhin wurden nach mehrmaligem Auf- und Abpipettieren 25 µl in ein zweites Gefäß überführt und alle Gefäße nach Verschluß durch optische Deckel kurz zentrifugiert. Mit dieser Maßnahme sollte eine Störung der Fluoreszenzmessung durch eventuell an den Deckeln anhaftende Tropfen verhindert werden. Alle hier beschriebenen Schritte wurden zur Vermeidung von Pipettierungenauigkeiten mit Eppendorf Research pro 10, 100 und 1000 Pipetten (EPPENDORF) durchgeführt. Zur Auswertung der sich anschließenden quantitativen Real-time PCR wurden dann zwei unterschiedliche Verfahren gewählt. Zum einen sollte die Bestimmung der Transkriptionsrate mittels der absoluten Quantifizierung und zum anderen mittels der relativen Quantifizierung versucht werden.

107 Material und Methoden Absolute Quantifizierung Bei dieser Methode sollte die absolute Kopienzahl der MSP-mRNA in den einzelnen Proben angegeben werden. Dazu wurden zunächst die mit Hilfe der qpcr-primer aus der cdna adulter Lungenwürmer amplifizierten Genfragmente der 18S-RNA und des MSP in den pcr4 -TOPO -Vektor kloniert und nach Sequenzierung mit einer Midi-Prep aufgereinigt. Diese Schritte fanden nach den in 3.7 bis 3.11 aufgeführten Protokollen statt. Anschließend wurde die Konzentration der isolierten Plasmid-DNA mit dem GeneQuant pro RNA/DNA Calculator (AMERSHAM BIOSCIENCES) bestimmt und Verdünnungsreihen der Plasmid- DNA von 10 7 bis 10 1 Kopien pro Reaktionsansatz erstellt. In den folgenden qpcrs wurden dann die Verdünnungsreihen als Duplikate in jedem Lauf eingesetzt. Als Funktion des MX 4000 Multiplex Quantitative PCR System (STRATAGENE) wurde quantitative Realtime PCR gewählt. Die absolute Quantifizierung der Kopienzahlen des MSP und der 18S- RNA erfolgte anhand der eingesetzten Plasmidstandardreihen Relative Quantifizierung Zur Durchführung der relativen Quantifizierung konnte auf die Verdünnungsreihen der Plasmid-DNA verzichtet werden. Bei jedem Lauf wurde stattdessen als so genannter Kalibrator die cdna des männlichen Lungenwurms 1 des Rindes K-795 der Kontrollgruppe verwendet. Nach der Normalisierung des Zielgens MSP mit dem housekeeping-gen 18S- RNA wurde dann jede getestete cdna in Verhältnis zu dem ebenfalls mit der 18S-RNA normalisierten Kalibrator gesetzt. Um eventuelle Differenzen in der Effizienz der MSP- und 18S-RNA-Amplifikationen zu erkennen, wurden zuvor mehrere cdna-verdünnungsreihen in der qpcr ausgewertet. Diese wurden in einer Verdünnung von 10-1 bis 10-7 je Reaktionsansatz als Duplikate eingesetzt. Als Funktion des MX 4000 Multiplex Quantitative PCR System (STRATAGENE) wurde hier wie auch bei den weiteren Versuchen zur relativen Quantifizierung comparative Real-time PCR genutzt.

108 Material und Methoden 108 Die Berechnung der jeweiligen Effizienz erfolgte daraufhin mit Hilfe dieser Softwarefunktion. Die effizienzbereinigte relative Quantifizierung konnte abschließend mit folgender Formel, dem sogenannten effizienz-korrigiertem relativen Quantifizierungsmodell, berechnet werden (PFAFFL 2004): Ratio = (E MSP ) CT MSP (Kalibrator - Probe) / (E 18S ) CT (Kalibrator - Probe) 18S Kalibrator: männlicher Wurm 1 von Rind K-795 E: Effizienz des jeweiligen Gens 3.24 Statistische Auswertung Zur statistischen Auswertung der in den Immunisierungsversuchen erhaltenen parasitologischen Parameter wurden verschiedene Verfahren herangezogen. Die Anzahl ausgeschiedener Larven wurde mit der zweifaktoriellen Varianzanalyse für abhängige Stichproben bewertet, wohingegen die Anzahl adulter Lungenwürmer, die nach den Messungen vorliegenden Längen- und Breitenangaben sowie die Anzahl ausgeschiedener Larven pro weiblichem Wurm mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests ausgewertet wurden. Zur Berechnung statistischer Werte der in der quantitativen Real-time PCR erzielten Ergebnisse diente der Mann-Whitney Rank Sum Test für nicht normalverteilte Stichproben. Der Korrelationskoeffizient nach Pearson wurde zur Berechnung der Korrelationen zwischen Wurmgröße und Wurmanzahl angewendet.

109 Ergebnisse Ergebnisse 4.1 Amplifikation und Klonierung Amplifikate aus cdna und genomischer DNA In den PCRs konnte das MSP-Genfragment sowohl aus der cdna als auch aus der genomischen DNA von D. viviparus amplifiziert werden, wobei sich die beiden Amplifikate in der anschließenden Gelelektrophorese als deutliche Banden mit unterschiedlichen Größen darstellten (Abb.1). Die erwartete Größe der aus der Amplifikation der cdna erhaltenen Sequenz betrug ca bp. Anhand des auf dem Gel aufgetragenen Größenstandards konnte diese Länge der MSP-Sequenz bestätigt werden. Das über 400 bp große Amplifikat aus der genomischen DNA deutete hingegen auf die Existenz eines oder mehrerer Introns hin. Beide Banden wurden aus dem Gel isoliert und in den Klonierungen eingesetzt. a b bp M bp M 2 Abbildung 1: Auftrennung der Amplifikate aus der a: cdna und b: genomischen DNA von D. viviparus Zur Amplifikation der MSP-Sequenz aus der cdna wurden die Primer Dv for und Dv rev verwendet. Die Vervielfältigung des MSP-Gens aus der genomischen DNA fand mittels der Primer gdna MSP for und gdna MSP rev statt. Es wurden 20 µl des PCR-Produkts mit 4 µl Ladungspuffer für Agarosegele aufgetragen. Die 1 %igen Agarosegele waren mit Gelstar versetzt, um eine Anfärbung der DNA zu erreichen. M: Größenstand Low DNA Mass Ladder (INVTROGEN); 1: Amplifikat des MSP aus der cdna; 2: Amplifikat des MSP aus der genomischen DNA