Bioanalytik. Seminar zum Praktikum pharmazeutische Chemie III. Martin Schmitt

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1 Bioanalytik Seminar zum Praktikum pharmazeutische Chemie III Martin Schmitt

2 Bioanalytik Einsatzgebiet als Apotheker: - V.a. zur Analyse von nieder- & makromolekularen Stoffen sowie Zellen und Zellbestandteilen aus biologischen Matrices Niedermolekulare Stoffe Makromolekulare Stoffe Zellen Ionen Proteine (Enzyme, AK) Leukocyten Kohlenhydrate DNA Erythrocyten Fette RNA Bakterien Xenobiotika Peptide Kohlenhydrate Lipide Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 2

3 Anwendungsgebiete Klinische Bioanalytik Industrie Forschung Apotheke Umweltanalytik Spurenanalytik Lebensmittelanalytik Dopinganalytik Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 3

4 Klinische Bioanalytik Plasmaspiegelüberwachung beim therapeutic drug monitoring (TDM) Individuelle Therapie (z.b. Krebstherapie) Unterstützung im diagnostischen Prozess Unterstützung von klin. Studien Überwachung von Krankheitsverläufen oder Therapieerfolgen Prüfung auf genetische Disposition Infektionsdiagnostik Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 4

5 Klinische Bioanalytik Gerinnungsdiagnostik Differentialblutbild Urindiagnostik Molekulare Diagnostik (PCR, Microarrays) Point-of-care (am Krankenbett) Gewebediagnostik (individuelle Tumortherapie) Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 5

6 Probenvorbereitung Entnahme durch Patienten: Einweisung Entnahme durch Fachpersonal: - Nach standardisiertem Vorgehen (SOP) - Wahl der Probenbehältnisse Messgrößenabhängig Haltbarmachung Transport zum analytischen Labor Lagerung bis zur Analytik Analytik im Labor Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 6

7 Der analytische Prozess Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 7

8 Blut Venöses Blut - Serum: kaolinbeschichtete Polystyrolkugeln Polyesterbeschichtetes Trenngel mit Gerinnungsaktivatoren - Plasma: Citrate und Heparinate zur Gerinnungshemmung - Vollblut: Hämatologische Untersuchungen (mit EDTA zur Gerinnungshemmung) Kapillarblut - Bestimmung von Blutzucker, Gesamtcholesterin, Laktat, INR Arterielles Blut - Blutgasuntersuchung Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 8

9 Blut Blutvolumen 7-8 % des KG Ca. 44% zelluläre Bestandteile Erythrozyten Leukozyten 5.2x10 6 /μl (Mann) 4,6x10 6 /μl (Frau) /μl 55-70% neutrophile Granulozyten 2-4% eosinophile Granulozyten 0-1% basophile Granulozyten 25-40% Lymphozyten 2-6% Monozyten Thrombozyten /μl 4-6 l Ca. 56% Plasma / Serum 900g/l Wasser ca. 9g/l Elektrolyte Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Chlorid, Carbonat, Phosphat, Sulfat 7-18g/l Lipide / SW-Produkte 65-80g/l Proteine Albumin Alpha1-Glob. Alpha2-Glob. Beta-Glob. Gamma-Glob. 40g/l 3g/l 7g/l 9g/l 13g/l Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 9

10 Blut Charakteristika: Komplexe, gepufferte Flüssigkeit (ph 7,3-7,5) Erhitzen, Einfrieren, Rühren, Ionenstärkeveränderung: Blutkörperchen können platzen Eisen wird frei Enzyme evtl. noch aktiv (CP, Esterasen, Lipasen) Reduktive Systeme (Glutathion, Hämoglobin) Hoher Proteingehalt Lipidgehalt schwankt nahrungsabhängig Mögliche Interferenzen durch physiologische Bestandteile, Comedikation, Metabolite Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 10

11 Urin Anorganische Bestandteile - Natrium 2,8-5,1g - Kalium 2g - Calcium 0,5g - Magnesium 0,25g - Ammoniak 0,02-0,07g - Chlorid 4,3-8,5g - Sulfat 3,8g - Phosphat 2,9-3,8g Organische Bestandteile - Harnstoff 20-35g - Harnsäure 0,3-2,0g - Kreatinin 1,0-1,8g - Kreatin bis 0,1g - Aminosäuren 1-3g - Glucose bis 0,16g - Ketone bis 3g - Proteine bis 0,04g - Porphyrine bis 0,0003g - Metabolite - Vitamine, Hormone Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 11

12 Bioanalytik in der Forschung Proteinaufreinigung durch chromatographische oder elektrophoretische Methoden Aktivitätstests von Enzymen durch Assays (ELISA, Fluoreszenzassays, radioaktive Assays, UV-Absorption ) Nucleinsäureanalytik (RNA, DNA mittels PCR, Hybridisierung, Isolierung ) 3D-Strukturaufklärung mittels Spektroskopie Systematische Funktionsanalytik (Hybridisierung, Aktivität, Genkartierung, Metabolomics, Proteomics, Peptidomics, ) Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 12

13 Edman-Abbau Analyse von Aminosäuresequenzen Reaktion von Phenylisothiocyanat mit aminotherminalem Peptidende bei ph 8. Umlagerung bei Ansäuerung mit TFA Analyse der resultierenden Phenylthiohydantoine Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 13

14 Microarray-Technologie DNA/RNA-Microarrays Protein-Microarrays Gewebs-Mikroarrays Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 14

15 DNA-Microarrays Extraktion der RNA Amplifikation mittels markierter Nukleotide Hybridisierung mit Mikroarray Waschschritt Auswertung Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 15

16 DNA-Microarrays Vorteile: - Stabile Chips, einheitliche Sonden, dadurch unkompliziertes Handling (Temperatur, Luftfeuchte, ph, Salze) - PCR einfach, schnell, günstig, markierbar - Nur ein Waschschritt notwendig - Hochaffine Capture molecules leicht herzustellen Nachteile: - RNA-Quantifizierung korreliert nicht eindeutig mit biologischer Aktivität - Posttranslationale Modifikationen nicht erfassbar - Unbekannte SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 16

17 Protein-Microarrays Forward-phase Microarray = Doris (Patientin) markierter Anti-Kaninchen AK Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 17

18 Protein-Microarrays Reversed-phase Microarray Doris (Patientin 1) = mit interagierendes Protein = markierter Anti- -AK Günther (Patient 2) Hildegard (Patientin 3) = mit interagierendes Protein = markierter Anti- -AK Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 18

19 Protein-Microarrays Reversed-phase Microarray Doris (Patientin 1) Günther (Patient 2) Hildegard (Patientin 3) = markierter Anti- = markierter Anti- -AK -AK Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 19

20 Protein-Microarrays Reversed-phase Microarray Doris (Patientin 1) Günther (Patient 2) Hildegard (Patientin 3) = mit interagierendes markiertes Protein = mit interagierendes markiertes Protein Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 20

21 Protein-Microarrays Vorteile: - Konzentration korreliert meist mit biol. Aktivität - Posttranslationale Modifikationen detektierbar Nachteile: - Anfällig für externe Schwankungen - Sehr kompliziert und individuell - Teuer Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 21

22 Luminex-System Analyse von Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden und niedermolekularen Stoffen - Coating von Capture-Molekülen an Metallbeads unterschiedlicher Farben - Orientierung mit Magneten an Plattenunterseite - Zugabe und Bindung des Analyten - Zugabe von markiertem zweiten Capture-Molekül - Überführung in Durchflusszelle und Auszählung der Beads und der daran gebundenen zweiten Capture-Moleküle Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt

23 Luminex-System Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 23

24 Luminex-System Aktivierung der Beads Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 24

25 Luminex-System Kopplung der Beads Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 25

26 Luminex-System Markierung des 2. Capture-Moleküls - Streptavidin/Biotin-Wechselwirkung Streptavidin = Protein aus S. avidinii (Tetramer aus 4 identischen UE) Biotin = Vitamin B7 Sehr starke nichtkovalente biologische Bindung - Streptavidin gebundenes Fluorophor (SA-PE, Streptavidin- Phycoerythrin) - Biotin gebundenes Capture-Molekül Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 26

27 Dopinganalytik Nichtinvasive: - Urin - Speichel - Haare Invasive: - Blut Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 27

28 Dopinganalytik Zuständig sind von der WADA, dem EOC oder ähnlichen Institutionen akkreditierte Labors Gefahndet wird nach Stoffen bestimmter Klassen, die dem Sportler Vorteile im Wettkampf verschaffen Verbotsliste unterteilt in: - Wirkstoffe und Methoden, die zu allen Zeiten (in und außerhalb von Wettkämpfen) verboten sind - Im Wettkampf verbotene Wirkstoffe und Methoden - Bei bestimmten Sportarten verbotene Stoffe Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 28

29 Dopinganalytik Verbotene Substanzen Nachweismethoden (nach Probenaufbereitung) Anabole Wirkstoffe GC-MS, -MS/MS, -HRMS, LC-MS Urin Hormone und verwandte Wirkstoffe (EPO, hgh, IGF-1, Gonadotropine, Insulin, Cortikotropine, HCG (Männer)) Elektrophorese, isoelektrische Fokussierung (IEF), Enzymimmunoassay, LC-MS ß2-Agonisten LC-MS Urin Hormon-Antagonisten und Modulatoren Diuretika und andere Maskierungsmittel LC-MS/MS LC-DAD, LC-MS, GC-MS, CE, PCR Probenmatrix Urin, Blut Urin Urin Stimulantien LC-MS Urin Narkotika LC-MS Urin Cannabinoide LC-MS Urin Glucocortikosteroide LC-MS, GC-MS Urin, Haar Alkohol ph-wert der Atemluft Atem ß-Blocker LC-MS Urin Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 29

30 Bioanalytik in der Industrie Klinische Studien - Untersuchungen an isolierten Enzymen oder in Zellkulturen - Untersuchungen an tierischem Material (Gewebe, Blut, Urin ) in Phase 0 - Kontrolle der Plasmaspiegel, des Urins, des Faeces, Speichel - Kontrolle der Veränderung bestimmter Laborparameter Aktivitätstests von Enzymen als Arzneimittel - Bspw. Aktivität von Botolinustoxin Affinitätstests von Antikörpern - Finden neuer AK im Screeningverfahren - Testung rekombinant hergestellter AK zu Therapiezwecken Reinheit einer Proteinzubereitung Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 30

31 Bioanalytik in der Industrie Beispiel zur Untersuchung eines industriell produzierten AK: - Identität Peptide mapping, Sequenzierung, MS, Immunologie - Proteingehalt Komplexbildung mit komplexierendem Farbstoff und photometrischer Messung (Biuret, Lowry, BCA, Bradford) - Reinheit Trennung: SDS-PAGE, IEF, CE Visualisierung: Coomassie Brilliant Blau (auch Quantifizierung) - Wirksamkeit In vivo Assay (ACTH, Calcitonin, Glucagon, hgh, EPO u.v.m) Zellkulturen/ex vivo (Interferone, Interleukine) Rezeptor-Bindung (z.b. Biacore-Technologie) oder ELISA (mak) Biochemisch (Plasminogenaktivatoren, Gerinnungsfaktoren) Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 31

32 Bioanalytik in der Apotheke Urinteststreifen (Harnsäure, Schwangerschaft, Dichte, ph, Leukozyten, Eiweiß, Glucose, Keton, Urobilinogen, Bilirubin, Blut) Kapillarblutmessungen (Glucose, Cholesterin, Laktat, Harnsäure, INR) Untersuchung von mikrobiologisch kontaminiertem Material (Zecken auf FSME, Borreliose, Blutanalytik) oder dessen Weiterleitung Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 32

33 Blutzucker Biosensoren - Biologische Komponenten direkt auf einem Silicium-Halbleiter - Gemessen wird potentiometrisch oder photometrisch nach der Umsetzung der Glucose durch: Glucose-Dehydrogenase Hexokinase + Glucose-6- Phosphatdehydrogenase Glucoseoxidase + Peroxidase Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 33

34 Blutzucker Reflexionsphotometrie - Glucosedehydrogenase- Methode - Glucoseoxidase-Methode Absorptionsphotometrie - Hexokinase-Methode - Glucosedehydrogenase- Methode Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 34

35 Blutzucker Potentiometrie - Protonen werden gebildet - Wandern über das Gate und den Isolator zum Leiter - Potentiometrische Messung der Protonenkonzentration - c (Glucose) ~ c (Protonen) - Reduktion von FAD zu FADH 2 - reduziert Fe 3+ zu Fe 2+ - Abgabe der aufgenommen Elektronen an Elektrode - Messen eines Stroms Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 35

36 Cholesterin, Triglyceride, Laktat Mit einfachen Geräten nur Gesamtcholesterinmessung Meist mit gleichem Gerät möglich Zumeist reflexphotometrische Messung nach Umsetzung der Analyten Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 36

37 Cholesterin Schritt 1: Spaltung der Cholesterinester mit Esterasen Schritt 2: Cholesterin + O2 Schritt 3: Cholesterinoxidase Cholesten-3-on + H2O2 2 H2O2 + 4-Aminoantipyrin + Phenol Chinonimin + Wasser Schritt 4: Reflexionsphotometrische Messung HRP Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 37

38 Triglyceride Schritt 1: Triglyceridspaltung mit Lipasen Schritt 2: Glycerin + ATP Schritt 3: Glycerokinase Glycerinphosphat + O2 Schritt 4: Glycerinphosphat + ADP GP-oxidase Dihydroxyaceton-P + H2O2 2 H2O2 + 4-Aminoantipyrin + Phenol Chinonimin + Wasser Schritt 4: Reflexionsphotometrische Messung HRP Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 38

39 INR-Wert Am Beispiel Coagguchek (Roche) Testträger mit stäbchenförmigen Eisenoxidpartikeln und Kaninchenhirn- Thromboplastin Ausrichten der Partikel durch Dauermagnet Senkrecht dazu Elektromagnet in 2Hz-Takt Kapillarblut-Tropfen auf Auftragsfeld Blut wandert Richtung Reaktionsfeld Gerinnungskaskade durch Kontakt mit Thromboplastin Bewegung der Eisenoxidpartikel wird gestoppt Verringerung der Reflexion Gemessen wird die Zeit zwischen Anfang der Reaktion und abgeschlossener Gerinnung Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 39

40 Schwangerschaftstest Verlauf der hcg-konzentration in der Schwangerschaft Seminar Bioanalytik, Praktikum Pharmazeutische Chemie III, Martin Schmitt 40