Dr. Peter Kainz. Einführung in die Nucleinsäure Biochemie. I. Restriktionsendonucleasen II. Isolierung und Charakterisierung von RNA

Transkript

1 Dr. Peter Kainz Einführung in die Nucleinsäure Biochemie I. Restriktionsendonucleasen II. Isolierung und Charakterisierung von RNA

2 I. Restriktionsenzyme 1. Allgemeines 2. Wie macht man einen Restriktionsverdau? 3. Mögliche Fehler und Probleme

3 1. Allgemeines

4

5

6 (παληνδροµω, griech. hin-und hergehen, pendeln)

7 σχηζω, griech. spalten

8

9

10

11 2. Wie macht man einen Restriktionsverdau? Durchführung: (1) Unter Verwendung eines Plasmid- DNA Isolierungs-Kits wird aus etwa 1.5 ml E.coli Bakterienkultur ( Mini-Prep ) die Plasmid-DNA laut Rezept gereinigt. (2) Mittels UV- Spektrometrie wird die DNA-Konzentration ermittelt (50µg/ml:OD 260nm =1) (3) Restriktionsverdau: Zur Spaltung mit Restriktionsenzymen wird DNA mit einem Puffer-Konzentrat, das optimale Bedingungen für das Restriktionsenzym schafft, und dem Restriktionsenzym bei der für das Enzym optimalen Temperatur inkubiert. Für den Verdau werden dese Komponenten dem folgenden Pipettierschema entsprechend in 1.5ml Eppendorfgefäße pipettiert (Angaben in µl) Ansatz A B pci- Plasmid DNA (A, B) 5 (A) 5(B) 10x Puffer für das entspr. Enzym 2 2 Wasser Enzym 1 1 Die Proben werden 45 Minuten im Wasserbad bei 37 C inkubiert, mit 4 µl Ladepuffer gemischt und 10 µl davon in einem 1% Agarosegel bei 130 V elektrophoretisiert. Ein Aliquot der Proben enthält ein Plasmid, das von dem Restriktionsenzym XhoI nur an einer Stelle geschnitten, d.h. linearisiert, wird.. Ein anderes Aliquot wird mit dem Restriktionsenzym XhoI so geschnitten, dass das inserierte DNA- Fragment in voller Länge herausgeschnitten wird. Anhand des Größenstandards wird die Größe des inserierten DNA-Fragments abgeschätzt.

12 3. Restriktionsverdau: Mögliche Fehler und Probleme A. Statt Banden nur Schmier (entweder durch Nucleasetätigkeit oder nicht ausreichende Gelauflösung!) B. DNA ist nur unvollständig oder gar nicht verdaut: a. Ansatz wurde nicht gemischt ( Enzym in 50% Glycerin) b. Restr.enzym ist kaputt (...) c. Geringe Stabilität des Enzyms: (mehr Enzym einsetzen!) d. Falscher Puffer: (Staraktivität!) e. Falsche Temperatur :(Beipackzettel!) f. Verunreinigungen der DNA-Präparation: (ev. verdünnen) g. Ungünstige Sequenzen: (längere Verdauzeit!) h.methylierung: (eukaryot. DNA; bei E.coli Dam - Dcm - Mutante verwenden für die Plasmid-Produktion!) Wichtig: BSA-Zugabe (BSA acetyliert; Endkonz. 0.1µg/µl) stimuliert viele R. enzyme (spart Kosten!)

13 Unter extremen Nicht-Standardbedingungen können Restriktionsenzyme auch andere als ihre Erkennungssequenzen schneiden ( altered or relaxed specificity = star activity). z. B. EcoR I*: N/AATTN

14 Restriction enzyme database

15 II. Isolierung und Charakterisierung von RNA Hintergrund: Der chemische Unterschied zwischen DNA und RNA ist gering, somit ist das physikalische und chemische Verhalten der beiden Substanzklassen einander sehr ähnlich. Der Grund warum Methoden der RNA-Isolierung getrennt von denen der DNA-Isolierung besprochen werden sind die RNasen. RNasen sind allgegenwärtig, viele benötigen im Gegensatz zu ihren Verwandten, den DNasen, keine divalenten Kationen ( z.b. Mg 2+ ) als Cofaktoren. Zusätzlich sind die meisten von ihnen aus nur einer Polypeptidkette aufgebaut. Dies hat zur Folge, dass sie bei Hitzeeinwirkung zwar denaturieren, aber beim Abkühlen wieder renaturieren und somit unverändert katalytisch aktiv sein können. Im Gegensatz dazu besitzen DNasen im allgemeinen Quartärstruktur und können, wenn erforderlich, durch kurzes Erhitzen ( kochen für ca. 10 min) irreversibel denaturiert werden.

16 Umgang mit RNasen A. allgemeine Vorsichtsmaßnahmen wenn (finanziell!) möglich, sterile Einwegmaterialien verwenden, bei mangelnder Routine ist das Tragen von Einweg-Handschuhen empfehlenswert. Chemikalien, Pipetten, Tubes, Lösungen, Elektrophorese- Kammern etc. ausschließlich für RNA-Arbeiten verwenden und vor dem unkontrollierten Zugriff durch KollegInnen schützen. Schnelles, unter gekühlten Bedingungen erfolgendes Arbeiten ist per se nicht zielführend...rnasen sind immer schneller und sind auch bei 4 C nicht völlig inaktiv.!

17 B. Inaktivierungsmöglichkeiten 1. Zellen: werden in Guanidinium-Isothiocyanat (GTC) solubilisiert. GTC ist ein chaotropes Salz, das sehr effektiv Proteine denaturiert und damit inaktiviert, auch RNasen. Gewebe: werden vorzugsweise in flüssigem Stickstoff (-196 C) schockgefroren, in gefrorenem Zustand in kleine Stücke zerkleinert und dann unter Verwendung eines Potter-Homogenisators in GTChaltiger Lösung aufgetaut und dabei möglichst rasch solubilisiert. (Dieser Schritt ist entscheidend für die Qualität, d.h. Intaktheit der isolierten RNA!)

18

19 2. Die verbreitetste Methode, Lösungen RNase-frei zu bekommen, ist die Behandlung mit Diethylpyrocarbonat(DEPC). Dazu gibt man 1/1000 Volumen (0.1%) DEPC zu, mischt, bis sich die DEPC-Kügelchen aufgelöst haben, inkubiert über Nacht und autoklaviert die Lösung anschließend. Das DEPC zerfällt dabei in die beiden flüchtigen Produkte CO 2 und Ethanol. DEPC bindet kovalent an primäre und sekundäre Amine, z.b. u.a. auch an für die katalytische Funktion wichtige His-Seitenketten in den aktiven Zentren vieler RNAsen, die dadurch irreversibel inhibiert werden. Wichtig: DEPC nicht für Puffer verwenden welche prim. oder sek. Amine enthalten, z.b. Tris. Außerdem ist zu beachten, dass DEPC unter dem Verdacht steht karzinogen zu sein! Das Entfernen von überschüssigem DEPC ist wichtig, da ansonsten Purinbasen in der RNA durch Carboxethylierung kovalent modifiziert würden, was nachfolgende Experimente negativ beeinflussen kann (wie Hybridisierungen, in vitro-transcription, cdna-synthese) Nicht vergessen:durch das Entfernen von überschüssigem DEPC existiert kein weiterer Schutz vor RNasen in der betreffendenen Lösung mehr, d.h. die Lösung ist nur so lange RNasefrei, solange sie nicht durch von außen eingebrachte RNAsen wiederum kontaminiert wird.

20 Strukturformel und Wirkungsmechanismus von DEPC

21 3. Glaswaren und andere Utensilien, die hohe Temperaturen vertragen (Automatische Pipetten gehören nicht dazu!), werden für mindestens 3 Stunden bei ca. 250 C im Trockenofen gebacken und dadurch RNase-frei. 4. RNAse-Inhibitoren: Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe sind Übergangszustands-Analoga, die an RNAsen binden und dadurch deren Aktivität inhibieren. Sie haben den Nachteil, dass sie als Ribonucleoside die UV- Quantifizierung einer RNA-Probe durch ihre Absorption (hyperchromer Effekt!) überlagern. RNasin, ein Protein aus humaner Placenta, bildet nichtkovalente äquimolare Komplexe mit RNasen, ist nur unter nicht-denaturierenden Bedingungen einsetzbar und benötigt für seine Aktivität reduzierende Pufferbedingungen ( mindestens 5mM DTT ). RNasin wird bei weitem am häufigsten eingesetzt um kleine Volumina von RNA haltigen Lösungen vor endo-und exogenen RNasen zu schützen.

22 RNA-Elektrophorese Ähnlich wie einzelsträngige DNA bildet auch einzelsträngige RNA durch intra- und intermolekulare Basenpaarung Sekundärstrukturen und Aggregate aus. Agarose- Gele: für die Auftrennung komplexer RNA-Gemische ( z.b. für Northern Blots) denaturierende PAGE: für die Auftrennung kleinerer RNA-Moleküle. Für eine schnelle, ungenaue Analyse ( zum Bsp. zum Überprüfen der Integrität) sind native TAE- oder TBE-Agarose-Gele verwendbar. Soll RNA dem Molekulargewicht entsprechend laufen ist ein Aufbrechen der H- Brücken erforderlich. RNA-Denaturierungsmethoden: 1. Glyoxalgele 2. Formaldehydgele 3. Methylquecksilberhydroxid ( sehr toxisch, Methode veraltet) 4. Harnstoff für PAGE

23 ad 1.: Glyoxal: OHC-CHO (d.s. zwei aneinander gehängte Aldehydgruppen) Glyoxal bindet bei neutralem ph-wert kovalent an Guaninreste und verhindert so eine Basenpaarung. Im Gegensatz zu Formaldehydgelen wird dem Agarosegel oder dem Laufpuffer nichts zugegetzt. Die Denaturierung der RNA erfolgt vor dem Auftragen: RNA wird dabei in 1M Glyoxal in Gegenwart von NaPhosphat und Dimethylsulfoxid(DMSO) auf etwa 50 C erhitzt. NaPhosphat dient als Puffer, DMSO bricht H-Brücken auf, so dass das Glyoxal an den G-Resten angreifen kann. Pufferumwälzung erforderlich, kein ph-gradient darf entstehen, denn bei ph>8 dissoziierte Glyoxal von der RNA! ad 2.: Aldehydgruppen bilden mit den Aminogruppen von A, G und C Schiff sche Basen. Die Aminogruppen dieser Basen stehen dann nicht mehr zur Ausbildung von H- Brücken zur Verfügung. Das Gel enthält 1.1% Formaldehyd (toxisch, daher Abzug verwenden!). Wichtig: nicht Tris als Puffer verwenden ( Formaldehyd reagiert damit!), sondern z. B. MOPS( =substituierte Sulfonsäure).

24 Aufgabestellung des Praktikums-Versuchs: Ausgehend von einem Aliquot solubilisierter Mäusmilz (durch Homogenisieren in Guanidinium-hältigen Puffer) soll die Gesamt-RNA isoliert werden: Dazu steht ein RNA-Isolierungskit zur Verfügung. Die exakte Kitbeschreibung incl. Arbeitsanleitung wird Ihnen bei Praktikumsbeginn ausgehändigt. Funktionsprinzip des verwendeten Kits: 1.Gewebe wird in Puffer mit hoher chaotroper Salzkonzentration solubilisiert. Dabei werden RNasen wirkungsvoll inhibiert, gleichzeitig entstehen optimale Bedingungen für den nächsten Schritt: 2. Bindung der im Lysat vorhandenen Nucleinsäuren (DNA und RNA) an die Silica- Membran ( Siliciumhydroxid ) Wassermoleküle sind damit beschäftigt die chaotropen Ionen zu hydratisieren, Nucleinsäuren werden dadurch dazu gebracht mit den OH-Gruppen der Membran zu interagieren, d.h. Wasserstoff-Brücken auszubilden (so steht es zumindestens in Lehrbüchern, was genau passiert ist unbekannt ) 3. Ebenfalls an die Membranoberfläche gebundene DNA wird mittels RNase-freier DNase verdaut. 4. Zwei Waschschritte reinigen die gebundene RNA von Salzen, Metaboliten und anderen makromolekularen Zellkomponenten. 5. Die reine RNA wird schließlich mittels RNase-freiem Wasser von der Membran eluiert. Die nunmehrige Abwesenheit von chaotropen Salzen führt dazu, dass die RNA durch das Überangebot an OH-Gruppen im Wasser die Affinität zur Membranoberfläche verliert.

25

26 Ein Aliquot der isolierten RNA wird anschließend mittels TAE-Agarose- Elektrophorese einerseits auf ihre Integrität, andererseits auf eine mögliche Kontamination durch DNA untersucht. In der Abbildung ( aus zwei Praktikumsversuchen stammend) erkennt man in der rechten Hälfte (B) eine misslungene RNA-Präparation, erkennbar durch die außerordentlich starke DNA Kontamination. Der simple Fehler bei dieser Reinigung bestand in einer starken Überladung des Nucleo Spin-Säulchens in Kombination mit einer zu hohen Viskostät der Probe! Links im Bild (A) das Ergebnis einer Reinigung mit verhältnismäßig geringer DNA- Kontamination. Cytoplasmatische RNA eucaryotischer Zellen enthält ca. 95% rrna, zusammengesetzt aus 28S, 18S und 5S RNA. Bei guten RNA-präps laufen 28S (5.1kb) und 18S (1.9kb) als zwei scharfe, getrennte Banden und dienen als interne Marker für die Integrität der isolierten RNA.