Chemische Synthese eines Dipeptids

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1 Praktikum IV, Frühlingssemester 10 Versuch C1; bis Autoren: Michael Schwarzenberger Philippe Knüsel Teilnehmer: Michael Schwarzenberger und Philippe Knüsel Assistenz: Samuel Jakob, Csaba Szabados

2 1. Abstract In diesem Praktikum ging es um die chemische Synthese eines Dipeptides aus zwei Aminosäuren. Namentlich wurde Aspartam aus Phenylalanin und Asparaginsäure hergestellt. In einem ersten Schritt wurden die geschützten Edukte Z-Asp(OBzl)-OH und H-Phe-OMe zu einer geschützten Form von Aspartam synthetisiert. In einer Hydrogenolyse wurde die Schutzgruppen Z und Bzl dann entfernt. Die Methylgruppe blieb weiterhin am Dipeptid, da das gewünschte Produkt Aspartam ein Methylester ist. Mittels verschiedener Analysemethoden wurde die Reinheit des Zwischen- und Endproduktes weitestgehend bestätigt. Lediglich im Endprodukt befand sich noch eine kleine Menge Methanol. Die Ausbeuten waren beim Zwischenprodukt zufriedenstellend, bei einem Versuchsteilnehmer aber aufgrund eines Missgeschickes etwas tiefer. Deshalb konnte keine Aussage darüber gemacht werden, ob die Verwendung von Dichlormethan oder Chloroform einen Einfluss auf die Ausbeute hat. Beim Endprodukt waren die Ausbeuten sehr unterschiedlich. Gründe dafür könnten verschiedene Verunreinigungen sein. 1

3 2. Einleitung Aminosäuren sind organische Moleküle, die eine Carbonsäure- und einer Aminogruppe enthalten. Diese sind über ein zentrales C-Atom verbunden, an welches noch ein Wasserstoffatom sowie eine organische Restgruppe gebunden sind. Man unterscheidet die verschiedenen Aminosäuren anhand ihres Rests (Abb. 1). Mit einer Ausnahme (Glycin, R = H) sind alle Aminosäuren chiral, da das zentrale C- Atome asymmetrisch substituiert ist. In der Fischerprojektion legt man jeweils die Carbonsäuregruppe nach oben und die Restgruppe Abb. 1: Fischerprojektion einer Aminosäure nach unten. Dann unterscheidet man zwischen L-Aminosäuren (Aminogruppe links) D- Aminosäuren (Aminogruppe rechts). Die natürlich vorkommenden Aminosäuren sind jeweils L-Aminosäuren. Aufgrund der sauren COOH-und der basischen NH 2 -Gruppe haben Aminosäuren sowohl basische als auch saure Eigenschaften. Durch Betrachtung der pk a -Werte der beiden funktionellen Gruppen (pk a 2 für die Carboxygruppe und pk a 10 für die Aminogruppe) wird klar, dass Aminosäuren in neutraler Umgebung als Zwitterion vorliegen. Aminosäuren sind die Grundbausteine des Lebens. Sie können sich unter Abspaltung von Wasser zu Polypeptiden verbinden (Abb. 2). Die dabei entstehende CO-NH-Bindung nennt man Peptidbindung. Sie ist planar, deshalb können Peptide nicht frei um die Achse dieser Bindung gedreht werden. Ab einer Kette von ungefähr 100 Aminosäuren spricht man nicht -H 2 O Abb. 2: Reaktion von zwei Aminosäuren unter Abspaltung von Wasser zu einem Dipeptid mehr von Peptiden, sondern von Proteinen. Die Nummerierung beginnt jeweils auf der Seite, auf welcher die Aminogruppe liegt. In diesem Versuch von Bedeutung war Aspartam, ein synthetischer Süssstoff der 1965 entdeckt wurde. Es wird auch H-Asp-Phe-OMe genannt. Diese Bezeichnung macht deutlich, dass es sich bei Aspartam um ein Dipeptid von Asparaginsäure und Phenylalanin handelt. Die Carboxygruppe des Phenylalanin liegt dabei als Methylester vor. Die Strukturformel von Aspartam ist in Abb. 3 gezeigt. Abb. 3: Strukturformel von Aspartam 2

4 Für die Synthese wurden geschützte Edukte verwendet, damit nur die gewünschten Gruppen reagieren. Die Stukturformeln der Edukte Z-Asp(OBzl)- H und H-Phe-OMe mit den markierten Schutzgruppen sind in Abb. 4 gezeigt. In Abb. 5, Abb. 6 und Abb. 7 sind drei verschiedene mögliche Reaktionswege zur Synthese von Dipeptiden dargestellt. Abb. 4: Stukturformeln der Edukte. Grün und rot markiert sind die Schutzgruppe. [1] Abb. 5: Mögliche Reaktion zur Synthese eines Dipeptids (A). Beim Reaktionsweg A lagert sich die Carboxykomponente der Asparaginsäure am DCCD an es entsteht Acyl-ureid (1). Bei der weiteren Reaktion mit dem Katalysator Hydroxybenzotriazol (HOBT) fällt ein Harnstoffderivat (2) aus und es entsteht letztendlich das Dipeptid (3). 3

5 Reaktionsweg B zeigt die Reaktion des Acy-ureids mit Asparaginsäure. Dabei entsteht ein Carbonsäureanhydrid, das mit Phenylalanin zum Dipeptid reagiert. Abb. 7: Reaktionsweg B zur Dipeptidsynthese. Abb. 6: Reaktionsweg C zur Dipeptidsynthese. Die dritte Möglichkeit ist der Reaktionsweg C, bei der Acyl-ureid direkt mit Phenylalanin zum Dipeptid reagiert. Als Nebenprodukt entsteht ein Harnstoffderivat. 4

6 3. Materialien und Methoden Aspartam (H-Asp-Phe-OMe) wurde in zwei Reaktionsschritten hergestellt. Im ersten Teilschritt wurde Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe synthetisiert. Anschliessend wurde das Zwischenprodukt zu Aspartam hydrogenolysiert Synthese von Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe Zuerst wurden zwei Lösungen hergestellt. Für die Lösung A wurde 1.62 g (4.53 mmol) (Philippe/Michael) Asparaginsäure (Z-Asp(OBzl)-OH) in einen 250 ml Rundkolben eingewogen. Es wurde 30 ml Chloroform (Philippe) bzw. Dichlormethan (Michael) hinzugegeben. Die Lösung wurde mit Hilfe eines Kochsalzeisbades unter ständigem Rühren auf -12 C gekühlt. Für die Lösung B wurden g (4.46 mmol)(p)/0.968 g (4.49 mmol)(m) Phenylalanin und THF/CHCl 3 (P) bzw. THF/CH 2 Cl 2 (M) (30 ml/40 ml) in einem 100 ml Rundkolben gelöst. Mit einer Spritze wurde zusätzlich 0.7 ml Hünigbase (N,N-Diisopropylethylamin). Das ganze wurde mit einem Kochsalzeisbad auf -12 C gekühlt und anschliessend in einen Tropftrichter überführt. Dabei wurde Lösung B verschüttet, weil der Tropftrichter nicht ganz dicht war (P) ca 20 ml bzw. weil der Tropftrichter überlief (M) wenig. Die Lösung B wurde dann sehr langsam während 15 min zu A hinzugetropft (M) bzw. direkt hinzugegeben (P). Anschliessend wurde die Lösung 30 min bei -12 C gerührt. Als dann die Mischung klar war, wurde g (4.71 mmol)(p)/0.984 g (4.77 mmol)(m) DCCD und 188 mg (1.38 mmol)(p)/184 mg (1.36 mmol)(m) dazugegeben. Die Mischung wurde weitergerührt bei -12 C und über Nacht auf RT aufgewärmt (Kältebad wurde nicht entfernt). Die unlöslichen Anteile wurden mit einer Glasfritte abgenutscht. Anschliessend wurde der Filterkuchen in 25 ml Chloroform (P)/Dichlormethan (M) erneut abgenutscht. Die Chloroform- /Dichlormethanphasen wurden vereinigt. Die gelbliche Lösung wurde danach insgesamt drei Mal mittels Scheidetrichter ausgeschüttelt, wobei die jeweils organische Phase weiterverwendet wurde. Zuerst wurde mit 50 ml 0.5 M HCl (aq), dann mit 50 ml 5 % NaHCO 3 und zuletzt mit 50 ml H 2 O ausgeschüttelt. Die resultierende organische Phase wurde über MgSO 4 getrocknet (5-10 min) und anschliessend filtriert und das Lösemittel im Rotationsverdampfer abgezogen. Der Rückstand im Kolben (mit aufgesetzter Vigreuxkolonne) wurde in einem Wasserbad auf 83 C erwärmt und soviel 2-Propanol hinzugetropft bis sich alles gelöst hatte (50-70 ml). Die Lösung wurde danach im Eisbad gekühlt und abgenutscht. Die Nutschte wurde zusammen mit dem Zwischenprodukt über Nacht in den Trockenschrank gelegt worauf dann die Ausbeute bestimmt werden konnte. Zur Analyse des Zwischenprodukts wurde eine Probe fürs 1 H-NMR, 10 mg in ein mit CDCl 3 gefülltes (4 cm hoch) NMR-Röhrchen, und fürs IR, 10 mg mit Achatmörser zerrieben in Eppendorfhüttchen, vorbereitet. Zudem wurde der Schmelzpunkt durch Variation der Menge und der Partikelgrösse bestimmt. 5

7 3.2. Hydrogenolyse von Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe zu Aspartam In einen 250 ml Zweihalsrundkolben wurden g (0.77 mmol) (P&M) des Zwischenprodukts Z- Asp(OBzl)-Phe-OMe in 70 ml Methanol gelöst. Zusätzlich wurde 70 mg einer Mischung von 10 % Palladium auf Aktivkohle hinzugegeben. Danach wurde ein 3-Weghahn mit einem Wasserstoff gefüllten Ballon aufgesetzt. Zuerst wurde ein paar Minuten mit Stickstoff gespült, worauf der 3-Weghahn kurz ein wenig geöffnet wurde, damit die Luft im Rundkolben durch Wasserstoff ersetzt wurde (hörbar durch Änderung des Ausflussgeräusches). Danach wurde das Ausflussventil zugedreht. Bei Philippe könnte möglicherweise zu viel Wasserstoff aus dem Ballon abgelassen worden sein (eventuell geringere Ausbeute). Unter der Wasserstoffatmosphäre wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Im nächsten Schritt wurde die Lösung abgenutscht, wobei in der Nutsche in der Reihenfolge Filterpapier-Celite-Filterpapier geschichtet wurde. Die Celite wurde dabei über dem Filterpapier direkt in der Nutsche mit Methanol aufgeschlämmt. Dann wurde vorsichtig Methanol abgezogen und das zweite Filterpapier draufgelegt. Die Suspension wurde mittig auf das Filterpapier geleert. Das klare Filtrat wurde in einen tarierten Kolben gegeben. Mit Hilfe des Rotationsverdampfers wurde das Lösungsmittel entfernt und das erhaltene Endprodukt Aspartam im Trockenschrank über Nacht gelagert. Probleme tauchten bei der grösseren Nutsche auf. Irgendwie dichtete das Filterpapier nicht genügend ab. Bei beiden Versuchen (P&M) wurde erst beim zweiten Anlauf, Wechsel zur kleineren Nutsche, ein klares Filtrat erzielt. Zudem wurde bei Michael ein bisschen zu viel nachgewaschen, worauf ein 500 ml Rundkolben beim Rotationsverdampfer verwendet werden musste. Zur Analyse des Endprodukts wurde eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt, wobei als Laufmittel eine CHCl 3 /CH 3 OH-Mischung im Verhältnis 20:1 verwendet wurde. Ausserdem wurde für ein DSC etwa 30 mg des Aspartams in ein Eppendorfhüttchen abgefüllt und für ein 1 H-NMR ca. 10 mg in ein NMR-Röhrchen mit DMSO-d6 (ca. 4 cm hoch) gegeben. 6

8 4. Resultate 4.1. Ausbeute Ausbeute Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe [g] Ausbeute Aspartam [g] Michael 1.58 (64.57%) (57.26%) Philippe 1.21 (49.45%) (107.04%) Tab. 1: Ausbeuten an geschützten Produkt und nach der Entfernung der Schutzgruppen 4.2. Analytik Zwischenprodukt Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe 1 H-NMR (300 MHz, CDCl 3 ): δ=2.77 (m, 2H, CH 2 -CO(OBzl)), 3.05 (d, J=2.1 Hz, 2H, Ar-CH 2 -CH-CO-OMe), 3.10 (t, J=5.7 Hz, 1H, CO-NH-CH-OMe), 3.72 (s, 3H, O-CH 3 ), 4.63 (s, 1H, NH-CH-CO), 4.84 (m, 1H, CH- CO-OMe), 5.14 (m, 4H, Ar-CH 2 -CO), 5.96 (d, 1H, O-CO-NH-CH), 6.94 (d, 1H, CH-CO-NH-CH), 7.15 (CHCl 3, Lösungsmittel), 7.52 ppm (s, 10H, Ar-CH2-CO). IR-Spektrum: Wellenzahl= (N-H st.), (C=O), , (Ar-H skel.), (Ar-H skel.), (Ar-H skel.), cm -1 (Ar-H def.). Wenig Substanz, gemörsert [ C] Viel Substanz, gemörsert [ C] Viel Substanz, ungemörsert [ C] Michael Philippe Tab. 2: Resultate der Schmelzpunktbestimmung des Zwischenproduktes Endprodukt Aspartam 1 H-NMR (300 MHz, [D6]-DMSO): δ=2.52 (DMSO, Lösungsmittel), 3.00 (m, 2H, Ar-CH 2 ), 3.18 (s, 3H, CH 3 ), 3.62 (s, 3H, CH 3 OH, Verunreinigung), 3.92 (m, 1H, NH 2 CH), 4.20 (m, 1H, Ar-CH 2 CH), 4.52 (d, J=6.9 Hz, 1H, NH), 7.23 (m, 5H, Ar-CH 2 ), 7.98 ppm (d, 2H, NH 2 ). IR-Spektrum: Wellenzahl= (N-H st.), (C=O), (Ar-H skel.), (Ar-H skel.), (Ar-H skel.), cm -1 (Ar-H def.). Bei der Schmelzpunktbestimmung des Endprodukts Aspartam wurde die Probe zuerst bei 170 C braun, worauf sie dann bei 210 C schwarz und flüssig war. Dünnschichtchromatographie: Substanz Retensionsfaktor R f Zwischenprodukt 0.95 Endprodukt 0.07 St 1 (H-Phe-OMe) 0.75 St 2 (Z-Asp(OBzl)-OH) 0.51 Tab. 3: Retensionsfaktoren, die basierend auf der DC-Messung berechnet wurden. 7

9 C Abb. 1: DSC des Endprodukts Aspartam 8

10 5. Diskussion 5.1. Zwischenprodukt Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe Die höhere Ausbeute des Zwischenprodukts Z-Asp(OBzl)-Phe-OMe bei Michael ist durch das Ausschütten einer grossen Menge (20 ml) von Lösung B bei Philippe zu erklären. Es kann daher aus diesen beiden Resultaten nicht gesagt werden, ob mit Dichlormethan (M) oder Choloroform (P) eine höhere Ausbeute erzielt werden kann. Es kann zudem sein, dass zusätzlich Zwischenprodukt in der Vigreuxkolonne verblieben ist. Die 1 H-NMR-Analyse des Zwischenproduktes bestätigte die erfolgreiche Durchführung des ersten Teil des Praktikum. Alle wichtigen Peaks waren vorhanden. Lediglich die Integrale waren teilweise nicht eindeutig, was daran liegen könnte, dass Austauschreaktionen mit den Deuterium-Isotopen stattgefunden haben könnten. Das IR-Spektrum hatte die wichtigsten Peaks, namentlich die N-H-Bindung sowie die Signale der C=O-Doppelbindung und des Benzolrings. Ein Literaturwert zum Schmelzpunkt konnte nicht gefunden werden. Der gemessene variiert aber trotz unterschiedlicher Menge und Partikelgrösse kaum ( C) Endprodukt Aspartam Bei der Dünnschichtchromatographie ist erkennbar, dass das Endprodukt Aspartam weder Edukte noch das Zwischenprodukt enthält. Somit kann man die Hydrogenolyse als erfolgreich und das Endprodukt als rein bezeichnen. Da das Lösemittel apolar und die stationäre Phase polar war, kann man bezüglich der R f -Werte sagen, dass diese umso grösser sind, je apolarer die Substanz ist. Folglich hat Aspartam einen niedrigen R f -Wert, da es sehr polar ist. Im Gegensatz dazu weist das Zwischenprodukt wegen seiner Apolarität einen hohen R f -Wert auf. Die hohe Ausbeute des Endprodukts Aspartam bei Philippe könnte durch das Durchsickern der Celite ins Filtrat zustande gekommen sein. Das Filtrat war jedoch nach dem Abnutschen klar, womit nicht mit viel durchgesickerter Celite gerechnet werden muss. Zusätzlich könnten noch Rückstände von Aktivkohle und Palladium vorhanden sein. Bei Michael könnte ein wenig vom Endprodukt in der Celite zurückgeblieben sein, was die niedrigere Ausbeute erklären könnte. Es wurde jedoch grosszügig nachgespült. Bei der DSC-Messung ist erkennbar, dass zwischen C Flüssigkeit abgedampft wurde. Anschliessend kam es zu einer exothermen Reaktion von etwa C gefolgt von einer endothermen bis 167 C. In diesem Bereich zersetzt sich Aspartam in seine Einzelkomponente (L- Asparaginsäure, L-Phenylalanin und Methanol) oder es zyklisiert sich unter Methanolabspaltung zu einem 2,5-Dioxopiperazin, welcher Vorgang auch beim Kochen und Backen unter Verlust der Süsskraft abläuft [2]. Welche der beiden Reaktionen abgelaufen ist kann man anhand der DSC-Analyse nicht bestimmen. Der Schmelzbereich des zersetzten Produkts befindet sich dann zwischen C, wobei der Schmelzpunkt bei 228 C gemessen wurde. Der Literaturwert des Schmelzpunkts von Aspartam liegt bei C [2]. Der Wert der DSC- Messung (228 C) sowie der mittels Schmelzpunktapparatur bestimmte (210 C) liegen leicht darunter, stimmen jedoch gut überein. 9

11 Auch hier bestätigten die Analysen (IR und 1 H-NMR) des Produktes im Wesentlichen die erwarteten Resultate. Allerdings war beim NMR-Spektrum zu erkennen, dass noch Methanol im Produkt sein musste. Dieses könnte sich beim Spülen eingelagert haben. Wie beim Zwischenprodukt war es schwierig, die Anzahl der H-Atome anhand der Integrale zu bestimmen. Der hohe Lösungsmittelpeak bei 2.52 ppm weist auf Austauschreaktionen zwischen dem Produkt und dem Lösungsmittel hin. 10

12 6. Referenzen Abb. 1 : Selber erstellt mit ChemSketch 11.0 Abb. 2 : Selber erstellt mit ChemSketch 11.0 Abb. 3 : Aspartame.svg/500px-Aspartame.svg.png [1]: Praktikumsanleitung Versuch 9: Chemische und enzymathische Synthesen eines Dipeptids, Frühlingssemester 10, Materialwissenschaft BSc, ETH Zürich. [2]: Wikipedia, Aspartam, , 7. Anhang 7.1. Fragen Frage Was scheint Ihnen die unangenehmste Eigenschaft der verwendeten Edukte bzw. Lösemittel zu sein? Chloroform hat eine toxische Wirkung auf Herz, Leber und andere innere Organe und ist eventuell krebserregend. DCCD ist krebserregend und die Hünig-Base ätzend. Zudem kann HOBT auf ein heranwachsendes Kind im Mutterleib schädigend wirken. Deswegen ist wie immer während des ganzen Versuchs das Tragen von Handschuhen sehr wichtig. Frage Welche Stoffe werden bei den einzelnen drei Abtrennungen aus der organischen Phase entfernt? Welcher Stoff verbleibt evtl. am Schluss zusammen mit dem Produkt in der organischen Phase? Im ersten Schritt werden mit HCl die polaren Reagenzien DCCD, Phe-NH2 und die Hünig-Base entfernt. Die unpolaren Stoffe HOBT und Asp-OH werden anschliessend mit NaHCO3 entfernt. Wasser werden schlussendlich Rückstände aus den ersten beiden Schritten entfernt. Mit dem Produkt verbleibt schlussendlich das Lösungsmittel. 11

13 7.2. Spektren Abb. 8: IR-Spektrum des Zwischenprodukts Abb. 9: IR-Spektrum des Endproduktes 12

14 Abb. 10: 1 H-NMR-Spektrum des Zwischenproduktes von Michael Abb. 11: 1 H-NMR-Spektrum des Endproduktes von Michael 13