9.3 Ortsspezifische Rekombination

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1 340 Rekombination.3 Ortsspezifische Rekombination Die ortsspezifische Rekombination erfordert Rekombinasen, die spezifische DNA-Motive erkennen und den Strangaustausch zwischen zwei Stellen katalysieren, was zur Inversion, Deletion oder Integration von DNA führen kann. Es gibt zwei große Familien von ortsspezifischen Rekombinasen, die Tyrosin-Rekombinasen und die Serin-Rekombinasen. Bei beiden entsteht ein Intermediat mit kovalent an die jeweils namensgebende Aminosäure gebundene DNA. Die Beteiligung weiterer Proteine kann die Richtung des eigentlich reversiblen Prozesses bestimmen. Ortsspezifische Rekombination ist an Auflösung von Chromosomendimeren während der Replikation, an der Integration von Phagen ins Wirtsgenom und an der Genregulation durch Phasenvariation beteiligt..3.1 Formaler Ablauf Ortsspezifische Rekombinasen haben jeweils enzymspezifische Erkennungsmotive. Die Rekombinasen binden zwei Motive und katalysieren die Spaltung der DNA an beiden Motiven sowie die kreuzweise Wiederverknüpfung. Die Motive sind nicht symmetrisch (im Gegensatz zu den Erkennungsmotiven der meisten Restriktionsenzyme, S. 482), und sie besitzen daher eine Richtung. Befinden sich zwei Erkennungsstellen auf einem DNA-Molekül, die unterschiedliche Richtungen aufweisen, so führt die ortsspezifische Rekombination zwischen ihnen zu einer Inversion des zwischen ihnen liegenden DNA-Bereichs (Abb..11a). Befinden sich zwei Stellen mit derselben Richtung auf einem DNA- Molekül, so führt die ortsspezifische Rekombination zur Deletion des zwischen ihnen liegenden DNA-Bereichs (Abb..11b). Findet die ortsspezifische Rekombination zwischen zwei Erkennungsmotiven statt, die sich auf unterschiedlichen DNA-Molekülen befinden, so kommt es zur Fusion beider Moleküle, die meist als Integration bezeichnet wird, da die beiden Moleküle typischerweise eine sehr unterschiedliche Größe aufweisen (Abb..11c). Ein typisches biologisches Beispiel ist die Integration eines Phagengenoms in das Genom der Wirtszelle. Integration und Deletion sind gegenläufige Prozesse, die bei symmetrischen Systemen beide von derselben ortsspezifischen Rekombinase katalysiert werden. Bei den biologischen Beispielen (s. u.) werden Mechanismen beschrieben, wie die Richtung der Reaktion reguliert wird.

2 .3 Ortsspezifische Rekombination 341 Abb..11 Drei unterschiedliche Folgen ortsspezifischer Rekombination. Ortsspezifische Rekombination: Rekombinase bindet an zwei Wiederholungen eines nichtsymmetrischen DNA-Motivs, spaltet die DNA und verknüpft sie kreuzweise neu. Inversion: zwei Motive mit gegenläufiger Richtung auf einem DNA-Molekül. Deletion: zwei Motive mit identischer Richtung auf einem DNA-Molekül. Integration: zwei Motive auf zwei unterschiedlichen DNA-Molekülen..3.2 Biochemie von zwei konservierten Proteinfamilien Die ortsspezifische Rekombination wurde schon vor Jahrzehnten bei der Untersuchung der Vermehrungszyklen von temperenten Phagen entdeckt, die nach Infektion in das Genom der Wirtszelle integrieren, und es akkumulierte eine immer unübersichtlicher werdende Liste von Einzelbeispielen. Vor einigen Jahren wurde jedoch deutlich, dass sämtliche ortsspezifischen Rekombinasen zu einer von nur zwei Proteinfamilien gehören. Die beiden Proteinfamilien sind nicht homolog zueinander. Sie werden nach einer jeweils für den Mechanismus wichtigen Aminosäure im aktiven Zentrum als Tyrosin- bzw. als Serin-Rekom-

3 342 Rekombination binasen bezeichnet. In beiden Fällen müssen beide DNA-Stränge an beiden Erkennungsmotiven gespalten werden. Insgesamt werden also vier Stränge gespalten, entsprechend ist die aktive Konformation in beiden Fällen ein Proteintetramer, das beide Motive gebunden hat. Da die Proteine in Lösung typischerweise als Dimere vorliegen, ist anzunehmen, dass zunächst Dimere an die beiden Erkennungsmotive binden und anschließend der aktive Komplex gebildet wird. In beiden Fällen wird die DNA nicht hydrolysiert, sondern es findet eine Transveresterung der Phosphatgruppe mit der jeweils namensgebenden Aminosäure, Tyrosin bzw. Serin, im aktiven Zentrum der Rekombinase statt. Die energiereiche Bindung bleibt also erhalten, sodass der Prozess reversibel ist. Dies ist ähnlich wie bei den Topoisomerasen (S. 8). Obwohl die Produkte der Rekombination gleich sind, sind der jeweilige enzymatische Mechanismus der beiden Proteinfamilien sowie die Struktur des aktiven Komplexes unterschiedlich. Die Tyrosin-Rekombinasefamilie Tyrosin-Rekombinasen sind in Bacteria und Archaea weit verbreitet und kommen auch bei einigen Eukaryoten vor. Die Proteinfamilie ist entsprechend groß in Sequenzdatenbanken sind mehr als 1000 Mitglieder vertreten. Ein DNA-Erkennungsmotiv besteht aus zwei invertierten Monomerbindungsstellen, die durch einen Spacer von 6 8 Nucleotiden getrennt sind. Die Spacer sind unsymmetrisch und geben der Bindungsstelle daher eine Richtung. Die Spaltung erfolgt am 5 -Ende des Spacers. Der aktive Komplex ist ein Proteintetramer, an das zwei DNA-Stränge gebunden sind. Jedes Monomer bindet die DNA wie eine Klammer und wechselwirkt mit einer großen Furche und einer kleinen Furche auf beiden Seiten der DNA-Helix. Die Spaltung erfolgt durch einen nucleophilen Angriff des Tyrosins im aktiven Zentrum auf das Phosphat (Abb..12a). Es entsteht ein kovalentes Intermediat zwischen Tyrosin und Phosphat, wobei das Phosphat am 3 -Ende einer Ribose gebunden ist und ein freies 5 -OH an der benachbarten Ribose vorliegt. Vermutlich wird die Katalyse durch weitere Aminosäuren im aktiven Zentrum unterstützt, die als Säure bzw. Base wirken. In der Nähe des Tyrosins gibt es hochkonservierte Arginine und Histidine, die diese Rolle spielen könnten. Bei Tyrosin-Rekombinasen sind jeweils nur zwei der vier Monomere aktiv, sodass nur zwei der vier DNA-Stränge geschnitten werden (Abb..12b). Danach erfolgt eine Isomerisierung, die dazu führt, dass die freien 3 -Enden in die Nähe des Tyrosinphosphat-Intermediats des anderen Stranges gelangen. Aufgrund der quadratischen planaren Anordnung des synaptischen Komplexes ist dazu nur eine relativ geringe Konformationsänderung der Proteine nötig. Das 3 -OH kann nun durch einen nucleophilen Angriff auf das Phosphat den DNA-Strang wieder schließen und das Tyrosin freisetzen. Bis hierher ist die Reaktion zur Hälfte abgelaufen, und es wurde eine Holliday- Struktur in der DNA gebildet. Die beiden bislang aktiven Monomere werden nun

4 .3 Ortsspezifische Rekombination 343 Abb..12 Tyrosin-Rekombinasen. a Chemie der Spaltung; b Ablauf der Rekombination.

5 344 Rekombination inaktiv und aktivieren die beiden anderen Monomere. Diese spalten die beiden bislang noch ungespaltenen DNA-Stränge und verbinden sie nach einer Isomerisierung kreuzweise miteinander (Abb..12b). Die Strukturen der Komplexe mehrerer Tyrosin-Rekombinasen mit DNA sind so ähnlich, dass vermutet wird, dass dieser Mechanismus verallgemeinert werden kann. Zu individuellen Unterschieden kann es durch die Wechselwirkung mit weiteren Proteinen kommen, die die Reaktivität und die Richtung der Reaktion regulieren (s. u.). Die Serin-Rekombinasefamilie Die Serin-Rekombinasefamilie ist kleiner und weniger einheitlich als die Familie der Tyrosin-Rekombinasen. Die Größe der Proteine reicht von 180 bis zu 800 Aminosäuren, was daran liegt, dass die Rekombinasedomäne, die in allen Vertretern der Familie konserviert ist, N-terminal und/oder C-terminal mit anderen Domänen fusioniert ist. Auch in diesem Fall besteht der aktive Komplex aus einem Proteintetramer und zwei gebundenen DNA-Strängen. Ansonsten gibt es allerdings große Unterschiede zwischen den beiden nichthomologen Proteinfamilien. Die Spaltung erfolgt ebenfalls durch einen nucleophilen Angriff einer Aminosäure im aktiven Zentrum auf ein Phosphat, allerdings ist es ein Serin. Es entsteht also ein Serylphosphat, das an das 5 -C-Atom einer Ribose gebunden ist, und ein freies 3 -OH an der benachbarten Ribose (Abb..13a). Bei den Serin-Rekombinasen sind alle vier Untereinheiten gleichzeitig aktiv, so dass ein Doppelstrangbruch verursacht wird. Die Spaltung geschieht jeweils um zwei Nucleotide versetzt, sodass kurze Überhänge entstehen, die für eine produktive Rekombination bei beiden Erkennungsmotiven identisch sein müssen. Jede Untereinheit hat Kontakt zu allen drei anderen Untereinheiten des Tetramers, wodurch eine koordinierte Spaltung aller vier DNA-Stränge erreicht wird (Abb..13b). Bei den Tyrosin-Rekombinasen interagieren die Untereinheiten nicht mit den diagonal liegenden Untereinheiten. Auch der Aufbau des aktiven Komplexes ist unterschiedlich: Bei Serin-Rekombinasen bildet das Proteintetramer das Zentrum des Komplexes, und die beiden DNA-Stränge liegen auf der Außenseite. Damit die kreuzweise Verknüpfung der beiden DNA-Moleküle erfolgen kann, muss bei Serin-Rekombinasen eine große Konformationsänderung stattfinden, die einer Rotation eines Dimers gegenüber dem anderen Dimer von 180 h entspricht. Die Verknüpfung der DNA-Stränge geschieht durch nucleophilen Angriff der vier 3 -OH-Gruppen auf die vier Serylphosphate, wodurch die Serinreste wieder frei werden. Dieses Prinzip eint die Familie der Serin-Rekombinasen, aber auch hier gibt es individuelle Unterschiede durch Wechselwirkungen mit weiteren Proteinen oder durch spezifische Anforderungen an die Konformation des DNA-Substrates.

6 .3 Ortsspezifische Rekombination 345 Abb..13 Serin-Rekombinasen. a Chemie der Spaltung; b Ablauf der Rekombination. Ortsspezifische Rekombinasen: Die aktive Struktur ist ein Proteintetramer mit zwei gebundenen DNA-Erkennungsmotiven. Tyrosin-Rekombinasen: Sehr weit verbreitete große Proteinfamilie; in zwei Schritten werden jeweils zwei DNA-Stränge gespalten und kreuzweise wieder verknüpft; kovalente Tyrosylphosphate als Intermediate und freie 5 -OHs; Holliday-Struktur nach der Halbreaktion. Serin-Rekombinasen: Es werden alle vier DNA-Stränge gleichzeitig gespalten; versetzte Spaltung mit Überhang von zwei Nucleotiden; kovalente Serylphosphate und freie 3 -OHs; Protein im Zentrum und DNA außen; große Konformationsänderung der beiden Dimere gegeneinander..3.3 Ortsspezifische Rekombination in biologischen Prozessen Von den vielen Beispielen für ortsspezifische Rekombination werden nachfolgend einige ausgewählte Beispiele besprochen, die unterschiedliche Prinzipien illustrieren, wie ortsspezifische Rekombination in ihrer Richtung, in der Produktbildung sowie zeitlich und örtlich reguliert werden kann.

7 346 Rekombination Integration und Ausschneiden von Phagen Viele Phagen codieren ortsspezifische Rekombinasen, die für ihren Lebenszyklus wichtig sind. Ein einfaches Beispiel ist die Cre-Rekombinase des Phagen P1, die durch Rekombination an zwei DNA-Erkennungsmotiven, die loxp-stellen genannt werden, die Zirkularisierung des Phagengenoms nach der Infektion einer Zelle katalysiert. Das Protein gehört zur Tyrosin-Rekombinase-Familie. Das Protein und DNA-Moleküle mit zwei loxp-stellen sind ausreichend, um die Reaktion in vitro ablaufen zu lassen, und beide Richtungen werden katalysiert. Abb..14 zeigt einen Komplex aus Protein und zwei DNA-Strängen. Es ist zu erkennen, dass die DNA-Stränge im Komplex in räumliche Nähe gebracht werden und nach dem Einzelstrangbruch geringe Konformationsänderungen für den Strangaustausch ausreichend sind. Aufgrund seiner Einfachheit und Robustheit wird das Cre-Lox-System heute vielfach als Werkzeug in der Molekulargenetik angewendet, um Genome von Pro- und Eukaryoten gezielt zu verändern (S. 368). Eine andere Tyrosin-Rekombinase mit einem komplexeren Mechanismus ist die Integrase (Int) des Phagen Lambda. Nach Infektion einer Zelle kann der Phage einen lytischen Lebenszyklus einschlagen und die Zelle unter Bildung neuer Phagenpartikel zerstören, er kann sein Genom aber auch als lysogener Phage in das Genom der Wirtszelle integrieren. Dabei erfolgt die ortsspezifische Rekombination nur in einer Richtung, der Integration. Der Prophage wird nun mit dem Bakteriengenom repliziert und an die Nachkommen weitergegeben. Unter bestimmten Bedingungen schaltet Lambda vom lysogenen zum lytischen Ablauf um. Dazu muss das Phagengenom wieder aus dem Bakteriengenom ausgeschnitten werden. Auch das wird von der Integrase katalysiert, die nun aus- Abb..14 Strukturen von Komplexen ortsspezifischer Rekombinasen mit DNA. a die Tyrosin-Rekombinase Cre (ein Dimer blau, ein Dimer rot) mit LoxP-Stelle; b die Serin-Rekombinase gd-resolvase (ein Dimer rot, ein Dimer gelb) mit DNA. (pdb:1nzb, 1ZR4)

8 .3 Ortsspezifische Rekombination 347 schließlich in der zur Integration entgegengesetzten Richtung arbeitet. Die gezielte Katalyse der für den Phagen jeweils benötigten Richtung wird dadurch erreicht, dass ein Int-Tetramer allein die Rekombination nicht katalysieren kann, sondern zusätzliche Proteine für die Reaktion essentiell sind. Int erkennt dabei eine Stelle im Phagengenom, die attp genannt wird, und eine Stelle im Bakteriengenom, die attb genannt wird. Während attb eine klassische Bindestelle für ein Int-Dimer ist, ist attp komplexer aufgebaut (Abb..15). Die Affinität für Int zur Rekombinationsstelle (R-R ) ist nur sehr gering, dagegen bindet Int über eine zusätzliche N-terminale Domäne hochaffin an weiter außen liegende Stellen (P1, P2, P ). Zwischen den Bindestellen für Int ist eine Bindestelle für das Bakterienprotein IHF (integration host factor), das bei der Bindung eine Biegung in die DNA einführt. Dadurch kommen die P-Stellen in die Nähe der R-Stellen, Int kann nun die niederaffinen R-Stellen besetzen und die Rekombination mit attb kann stattfinden, was zur Integration führt. Nach der Integration ist der Prophage umgeben von zwei Stellen, die anders aufgebaut sind als beide vorherigen Stellen und die attr und attl genannt werden. Die Anwesenheit von IHF ist nicht ausreichend, um die Rekombination zwischen attr und attl zu ermöglichen, und daher bleibt der Prophage stabil integriert. Zur Deletion des Prophagen ist ein von ihm codiertes Protein notwendig, das Xis (excision) genannt wird. Wird die Expression von xis induziert, bindet Xis an Stellen in attr, was Voraussetzung für die Ausbildung eines produktiven Rekombinationskomplexes an attr-attl ist. Nach dem Ausschneiden verhindert die Bindung von Xis an attp, das die Rückreaktion stattfinden kann, daher ist die Rekombination bei Anwesenheit von Xis irreversibel. Abb..15 Integration des Phagen Lambda in das E. coli-genom und späteres Xis-abhängiges Herausschneiden.

9 348 Rekombination Der Phage Lambda bietet ein Beispiel dafür, wie die ortsspezifische Rekombination durch die Beteiligung weiterer Proteine und den Aufbau von unsymmetrischen Rekombinationskomplexen in ihrem Ablauf und ihrer Richtung reguliert werden kann. Viele andere temperente Phagen benutzen ähnliche Mechanismen, um die Rekombination ihrem Lebenszyklus anzupassen und gezielt für die Integration ins oder die Deletion aus dem Wirtschromosom einzusetzen. Phasenvariation Mehrere Serin-Rekombinasen katalysieren die Inversion eines DNA-Segmentes im Chromosom von Bakterien. Der Mechanismus ist anders als bei der homologen Rekombination (S. 338) beschrieben, der biologische Sinn ist derselbe: die qualitative Umschaltung von einem Zustand zu einem anderen als Mittel der Genregulation. Am besten untersucht ist die Hin-Rekombinase von Salmonella, die es den Zellen erlaubt, zwischen zwei Flagellen hin- und herzuschalten, die aus unterschiedlichen Flagellinen aufgebaut sind. Das invertierbare DNA-Element zwischen den Erkennungsmotiven der Rekombinase enthält das hin-gen für die Rekombinase sowie am Rand einen Promotor, der die Transkription des Bereiches jenseits des Inversionselementes steuert. In der Folge werden in der einen Richtung zwei Gene abgelesen: fljb codiert das Flagellin H2 und flja codiert einen Repressor, der die Expression des Gens für das Flagellin H1 verhindert. Dadurch werden in dieser Orientierung Flagellen aus H2 gebildet. Wird das Element durch die Rekombinase Hin invertiert, wird kein H2 mehr gebildet; dafür ist die Produktion des Flagellins H1 nicht mehr reprimiert, und dieses wird nun für die Flagellensynthese verwendet. Da Flagellen antigene Oberflächenstrukturen sind, handelt es sich bei dieser Phasenvariation auch um eine Antigenvariation. Die Hin-Rekombinase katalysiert die ortsspezifische Rekombination ausschließlich zwischen Erkennungsstellen, die auf einem DNA-Molekül (in cis) liegen, nicht zwischen Stellen auf verschiedenen Molekülen (in trans). Damit wird garantiert, dass Hin ausschließlich Inversionen katalysiert und nicht z. B. die Dimerbildung von zwei Chromosomen nach der Replikation. Wieder wird die Einschränkung der möglichen Reaktionen dadurch erreicht, dass ein weiteres Protein für die Ausbildung des Rekombinationskomplexes benötigt wird. Innerhalb des invertierbaren Elementes liegt eine Bindungsstelle für das bakterielle Protein Fis (factor for inversion stimulation). Für die Ausbildung des aktiven Rekombinationskomplexes ist eine Wechselwirkung von zwei Fis-Dimeren mit dem Hin-Tetramer nötig, das die Rekombination zwischen den beiden Erkennungsmotiven katalysiert. Eine Variation des Themas ist bei dem Phagen Mu zu finden, bei dem die Inversion eines DNA-Elementes das Umschalten zwischen zwei Proteinen bewirkt, die für die Wirtserkennung nötig sind. Daher stellt eine Mu-Population eine Mischung von Phagen dar, die den einen bzw. den anderen von zwei mög-

10 .3 Ortsspezifische Rekombination 34 lichen Wirten befallen können. In diesem Fall liegt das Gen für die Rekombinase außerhalb des Inversionselementes, und die Inversion erfolgt mitten in dem Gen für das Schwanzfaserprotein. Das Protein besteht somit aus einem konstanten N-Terminus und einem von zwei möglichen C-Termini, die durch die Inversion ausgetauscht werden können. Wieder ist das Fis-Protein für die Ausbildung eines aktiven Rekombinationskomplexes nötig. In diesen und weiteren Fällen der Genregulation durch ein Inversionselement wird die Richtung und der Zeitpunkt des Schaltens nicht reguliert. Es handelt sich um ein stochastisches Schalten zwischen zwei Zuständen, das sicherstellt, dass in einer Population zwei verschiedene Arten von Zellen oder Phagen vorhanden sind, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dem Immunsystem zu entgehen, oder den Wirtsbereich erweitert. Auflösung von Chromosomendimeren Die am Weitesten verbreitete und daher allgemeinste biologische Funktion von ortsspezifischen Rekombinasen liegt darin, Chromosomendimere von Prokaryoten in Monomere zu spalten, die auf die Tochterzellen verteilt werden können. Wie beschrieben (S. 332), ist die homologe Rekombination ein integraler Bestandteil der Replikation. Dabei werden zumeist die Non-Crossover-Produkte gebildet, zu einem bestimmten Anteil aber auch Crossover-Produkte. Ein Crossover führt bei der Replikation (oder bei der DNA-Reparatur durch homologe Rekombination bei Doppelstrangbrüchen an schon replizierten Bereichen) zu der Bildung eines Chromosomendimers, dessen Verteilung auf die beiden Tochterzellen natürlich unmöglich ist (Abb..16). Eine ortsspezifische Rekombinase spaltet das Dimer in zwei Monomere, die segregiert werden können. Für das Überleben der Zellen ist es wichtig, dass die Rekombination ausschließlich in einer Richtung abläuft der Spaltung von Dimeren und es keinesfalls zu der Dimerbildung aus zwei Monomeren kommt. Dies wird garantiert, indem die Rekombination auf einen bestimmten Zeitpunkt des Zellzyklus und einen bestimmten Ort innerhalb der Zelle beschränkt wird. Dies geschieht wiederum dadurch, dass die Rekombinase allein die Rekombination nicht katalysieren kann, sondern die Wechselwirkung mit einem weiteren Protein nötig ist. Anders als bei den bislang vorgestellten Beispielen besteht die Rekombinase nicht aus einem Homotetramer, sondern ist ein Heterotetramer aus den beiden Proteinen XerC und XerD, die zu den Tyrosin-Rekombinasen gehören. Das DNA- Erkennungsmotiv, dif genannt, liegt im Bereich des Replikationsterminus (S. 10). Für eine erfolgreiche Rekombination ist die Wechselwirkung des XerCD- Tetramers mit dem Protein FtsK nötig. FtsK ist ein integrales Membranprotein, das am sich während der Zellteilung bildenden Septum lokalisiert ist, und ist eine ATP-abhängige DNA-Pumpe, die sicherstellt, dass bei einer normalen Teilung keine DNA im Bereich des Septums verbleibt. Bei Chromosomendimeren jedoch bleibt der Bereich der Termini (und damit auch dif) in der Zellmitte.

11 350 Rekombination Abb..16 Replikation eines Bakteriengenoms. a ohne und b mit Crossover-Rekombination; gelb und grün = neusynthetisierte DNA. Die Wechselwirkung von FtsK mit XerCD aktiviert XerD, das ansonsten inaktiv ist. Ohne FtsK kann das XerCD-Tetramer zwar an dif binden und XerC kann einen Strang austauschen, aber ohne die XerD-Aktivität wird der zweite Strang nicht gespalten und es kommt zur Rückreaktion. Chromosomenmonomere können auf die beiden Zellhälften verteilt werden, bevor das Septum gebildet wird, daher kommt der XerCD-Komplex ausschließlich dann mit FtsK in Kontakt, wenn ein Chromosomendimer nicht verteilt werden kann und die beiden dif-sequenzen in der Zellmitte verbleiben. Auf diese Art werden durch die Lokalisation eines Hilfsproteins Zeit, Ort und Richtung der ortsspezifischen Rekombination durch XerCD bestimmt. Ortsspezifische Rekombination (biologische Prozesse): Integration Deletion von Phagen: Rekombinase allein reicht nicht; Richtung reguliert durch zusätzliche Proteine des Wirts und des Phagen; Beispiel Lambda Int. Phasenvariation: Genregulation durch Inversion; unreguliert; selten. Trennung von Chromosomendimeren: Bei Prokaryoten weit verbreitet; XerCD (E. coli); örtlich und zeitlich reguliert durch Benötigung des Septumproteins FtsK.