Evolution der Antigenrezeptorgene. RAG1 + 2 ist eine Transposase

Transkript

1 Evolution der Antigenrezeptorgene RAG1 + 2 ist eine Transposase Hairpin Formierung: direkte Transesterbildung wie bei Mu Transposase oder HIV Integrase RAG1/2 kann in vitro mit RSS exogene DNA attackieren ohne Sequenzbevorzugung 5 bp staggered ends

2 Transposition über beide Enden

3 Evolutionärer Ursprung der AG-Rezeptorgene durch Transposoninsertion? (Knorpelfische)

4 Hermes transposon: Signal ends open, other end forms hairpin, similar VDJ recombination

5 Transposition mit einem Ende Reversible Reaktion

6 Possible chromosomal translocation by RAG-promoted transposition

7 Analogien Rag1/2 Rekombination und Transposons: Invertierte repeats - DNA Signale Bindung Transposase an Signalsequenzen Mechanismus Spaltung: nick ss, Transesterbildung Hairpin + blunt end Unterschiede: Transposase mit herausgespaltenem Fragment attackiert DNA Insertion des Transposons 5 bp staggered ends Rag1/2 Rekombination: nach hairpin + blunt end Bildung normal weiter dann mit ds-reparatursystem, Degradierung/ Inversion DNA zwischen Signalsequenzen aber: in vitro kann auch Insertion mit geringer Häufigkeit auftreten

8 Somatische Hypermutation (SH) Genkonversion (GC) und Klassenwechsel (class-switch) -Rekombination (CSR)

9 gemeinsamer Basismechanismus für SHM, GC, CSR

10 Activation-induced cytidine deaminase (only lymphocyte-specific factor required for SHM, GC, CSR) Homologie zu RNA editierendem Enzym C to U deamination in vitro vor allem exprimiert in sekundären lymphoiden Organen Defizienz: keine CSR und SHM In Chicken/Rabbits keine Genkonversion direkte Aktivität auf dc in DNA U-G mismatch Läsionen: C-T and G-A Transitionen base excision Reparatur - jedes Nukleotid mismatch Reparatur mit Polymerase mit hoher Fehlerquote Template-vermittelte Reparatur mit Sister-Chromatid oder V-Pseudogen Läsion in switch site: Reparatur mit anderer switch site

11 Affinitätsreifung

12 Somatische Mutationen in Ig V Genen Mutations clustered in CDRs (complemetarity determining region) Kd: dissociation constant

13 Mutationsrate 10-3, 10 6 x höher als normal hauptsächlich Punktmutationen Mutationen proportional der Transkriptionsrate

14 Modell 2002 für somatische Hypermutation: Promoter bestimmt Region Enhancer lizensiert Locus Mutatorsome A. Ig Enhancer bindet Mutator-Faktor (rot) B. Enhancer-Promoter Interaktion C. Mutator-Faktor bei TIC D. Transkription ist wichtig Mutator-Faktor fährt mit TC mit E. Assymetrischer DSB (nicht unbedingt notwendig) F. 5 -end Resektion, 3 -overhang lagert sich an intaktes Sister Chromatid Reparatur durch homologe Rekombination G. DNA Synthese führt zu Punktmutationen Polymerase mit hoher Irrtumsrate (wie DNA Pol.-iota)

15 Modell: AID Funktion im ersten Schritt: Nick und Initiierung des Doppelstrangbruches (bei SHM nicht unbedingt notwendig - auch andere Mechanismen)

16 Modell 2006

17 SHM Modell 2006 BER: base excision repair MMR: mismatch repair Unrepaired transition mutation uracile-dna glycosylase T A (eta)

18 AID: activation-induced cytidine deaminase Target ist ssdna (kleine Regionen ssdna enstehen transient bei Transkription) dc - deamination U - G mismatch - Replication w/o repair: C - T, G - A transition - BER: base excision repair with error prone Polymerase: U excised by UNG: Uracil N-Glycosylase removes the U residue, leaving abasic site replaced by any other (transition and transversion) -MMR: mismatch repair machinery mutations at A/T pairs near UG lesion Exo1, MSH (homologue of E.coli MutS) DNA polymerase eta -ds Bruch: MRE11 (meiotic recombination 11 homologue)-rad50 complex cleaves DNA at abasic site, generates 3 -ends that cannot be extended by normal DNA polymerase?

19 Dendritic cell of non-hematopoietic origin B Zellselektion in germinal centers der Lymphknoten und Differenzierung zu Ak-sezernierenden Plasmazellen

20 Klassenwechsel der schweren Ketten

21 Switch recombination : AID und germline Transkription führen zu Doppelstrangbrüchen in switch Regionen, (GC-rich regions, I exon for initiation of germline transcription, IL4 transcription from Iε bzw. IFN-γ from I2α)

22 SHM CSR Introduction and repair of lesions Distinct set of repair factors for SHM and CSR

23 Hauptwege der Reparatur: mutations-assoziierte Brüche normalerweise durch homologe Rekombination repariert oder nicht-homologes end-joining: NHEJ ist Mechanismus bei CSR CSR und SHM - AID notwendig: CSR: ds Bruch SHM: ss Mutation (und ds Bruch?) - verschiedene Reparatur: CSR durch NHEJ (wie VDJ recombination) SHM durch BER, MMR (und homol. Rek.?)

24 Wichtig für Lymphomagenese Die meisten Lymphome entstehen in den Germinal Centers aus B Zellen 50 % zeigen translocation break points innerhalb der Target-Sequenzen für CSR, die anderen dürften mit Fehlern bei SHM zusammenhängen SHM kann auch auf Protoonkogene in Tumorzellen übergreifen, in gleichen Regionen: Translokationen und Mutationen auch ohne Translokation Fehler im Targeting der SHM und CSR Mechanismen oder in der Reparatur der DNA Brüche?

25 N. Bhutani et al., Nature 2010 AID in germ cells, necessary for reprogramming of somatic cells to ips cells, required for promoter demethylation and induction of OCT4 and NANOG

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