Dynamik und Strukturbildung von Schleimpilzen

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1 Dynamik und Strukturbildung von Schleimpilzen Ein Versuch im Fortgeschrittenenpraktikum betreut von Adrian Fessel Prof. H.-G. Döbereiner Christina Oettmeier Erik Bernitt Inhaltsverzeichnis 1 Motivation 1 2 Biologischer Hintergrund Grundlagen der Zellmotilität Geschichtliche Einordnung Physarum polycephalum Mikroplasmodien Versuchsvorbereitung und -durchführung Zellkultur Aufschwimmen und Schütteln Präparation der Proben Bildaufnahme Datenauswertung Kymograph Gaußsche Tiefpassfilterung Binärisierung Flächenanalyse mittels Autokorrelation oder Fouriertransformation Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte Februar 2014

2 Motivation 1 Motivation Schleimpilze sind einzellige, vielkernige Amöben und dienen der biologischen Forschung als Modellorganismen, um die Bewegung von tierischen Zellen zu untersuchen: Wie fast alle Zellen nutzen Sie die Proteine Aktin und Myosin zur Fortbewegung. Obwohl Einzeller, können Schleimpilze einige Zentimeter groß werden. Den intrazellulären Transport von beispielsweise Nährstoffen erreichen Sie durch rhythmische Kontraktionen und dadurch erzeugte Zellplasma- Strömungen. Diese Oszillation ist die charakteristische Bewegungsform des Schleimpilzes. In diesem Versuch werden mit einem Lichtmikroskop Filme dieser Oszillationen aufgenommen und quantitativ ausgewertet. Hierbei sollen, unter Anleitung, eigene Bildanalyseroutinen entwickelt werden. Erlernt werden in diesem Versuch Grundlagen der Zellkultur, der Hellfeld- Mikroskopie, der automatischen Bildauswertung und der statistischen Analyse von Daten durch Autokorrelationsfunktionen. Das beschriebene Verfahren ist eine typische Vorgehensweise in der biophysikalischen Forschung. Die gewonnenen Daten dienen beispielsweise der Überprüfung von Modellen und der Identifikation von zugrunde liegenden Prozessen. 2 Biologischer Hintergrund 2.1 Grundlagen der Zellmotilität Lebende Zellen sind - rein physikalisch betrachtet - eine geordnete, strukturierte Ansammlung von Ionen und organischen Molekülen in wässriger Lösung, eingeschlossen von einer Hülle aus speziellen amphiphilen Molekülen, die die Zelle begrenzen und die Kommunikation mit der Umgebung erlauben. Zur aktiven Bewegung verwenden Zellen ein wässriges Gel aus faserförmigen Proteinen, den Aktinfilamenten, und molekularen Motoren, den Myosinen, die die Filamente verbinden und an ihnen entlangwandern können. Diese Bewegung wird angetrieben durch den zellulären Brennstoff, das Adenosintriphosphat (ATP). Eine lebende Zelle befindet sich also typischerweise in einem mechanisch und chemischen Nichtgleichgewichtszustand. Die Materialeigenschaften des Gels werden bestimmt durch eine Vielzahl an weiteren Proteinen, die die Aktinfilamente untereinander und mit anderen Makromolekülen verbinden, die Polymerisation und Depolymerisationsgeschwindigkeit der Filamente beeinflussen, sowie die Aktivität der Motorproteine steuern. Die Gesamtheit der molekularen Wechselwirkungen des aktiven Gels wird kontrolliert durch spezielle molekulare Signalkaskaden, die die Zelle an die Umgebung ankoppeln, sowie kausale Verknüpfungen mit anderen Prozessen im Zellinneren herstellen. Durch Daten der Art wie Sie im Praktikumsversuch gewonnen werden lassen sich Rückschlüsse auf Beschaffenheit des Gels und der zellulären Steuerungsmechanismen ziehen. 1

3 Geschichtliche Einordnung 2.2 Geschichtliche Einordnung Im Laufe der letzten zwei Jahrzehnte ist es gelungen, einen Großteil der für die Zellbewegung verantwortlichen Proteine zu charakterisieren und ihre molekulare Wechselwirkung untereinander zu verstehen, siehe [1]. Diese Entwicklung ermöglichte gezielte biophysikalische Experimente an gut beschriebenen Zellsystemen. Weiterhin entbrannte ein lebhaftes Interesse an den physikalischen Prinzipien von molekularen Motoren [2]. Modelle aktiver Gele wurden experimentell und theoretisch untersucht [3, 4]. In der Literatur dokumentierte Experimente zur Morphologie der Zellbewegung waren in der Vergangenheit vorwiegend qualitativer Natur. Erst in jüngster Zeit gelang mit Einzelzellexperimenten eine voll quantitative Beschreibung [5, 6]. In den 70er und 80er Jahren war das Zugpferd der Forschung zur Zellbewegung der Schleimpilz Physarum polycephalum. Im weiteren Verlauf wurden dann in den letzten 20 Jahren wegen der einfacheren genetischen Handhabbarkeit hauptsächlich Amöben des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum und Mäusezellen untersucht. In jüngster Zeit hat der Schleimpilz Physarum polycephalum durch seine erstaunliche Netzwerkbildung [8] wieder die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft erlangt [7]. 2.3 Physarum polycephalum Schleimpilze (lat. Myxomyceten) sind, trotz ihres deutschen Namens, keine Pilze. Sie gehören auch zu keinem anderen Reich der Systematik der Lebewesen, sind also weder Pilze, noch Tiere oder Pflanzen. Sie bilden taxonomisch ihr eigenes Reich, das der Amoebozoa. Sie kommen auf allen Kontinenten (außer der Antarktis) vor, und es gibt tausende Arten, die man meist nur an der Struktur ihrer Sporen bestimmen kann. Man unterscheidet zelluläre und azelluläre Schleimpilze, wobei die zellulären Schleimpilze die meiste Zeit ihres Lebens als solitäre Amöben umherkriechen und sich nur zum Zweck der Fortpflanzung zusammen finden. Azelluläre Schleimpilze, wie unser Versuchsorganismus Physarum polycephalum, bestehen aus einer einzigen Zelle mit tausenden von Zellkernen. Damit sind Sie die größten Einzeller der Welt, siehe Abbildung 2.1. Physarum kann sogar mehr als einen Quadratmeter groß werden. Schleimpilze haben einen vielfältigen Lebenszyklus, der in Abbildung 2.2 dargestellt ist: Die dominierende Phase im Lebenszyklus ist das Plasmodium. Es ist bei Physarum leuchtend gelb pigmentiert, es gibt jedoch auch Arten in anderen Farben. Wie bereits erwähnt, ist es mehrere Quadratzentimeter groß. Es ernährt sich in der obersten Schicht des Waldbodens von totem organischem Material, d.h. von abgestorbenen Blättern und Holz. Im Labor wird es auf Nähragar gezüchtet, der ein Extrakt aus Hefezellen und fermentierten Proteinen enthält. Gerät der Schleimpilz in Gefahr, auszutrocknen, so bildet er das Sklerotium, ein trockenes und widerstandsfähiges Gebilde, aus dessen Inneren der Organismus bei günstigen Umweltbedingungen auch nach längerer Inaktivität wieder ausschlüpfen kann. 2

4 Mikroplasmodien Abbildung 2.1: Plasmodium von Physarum polycephalum auf einer 9 cmpetrischale mit Nähragar Unter bestimmten Umständen, beispielsweise starker Lichtexposition, bildet der Schleimpilz Sporen, die mit dem Wind verbreitet werden. In den Sporen sind haploide (d.h. nur mit einem Satz von Chromosomen ausgestattete) Amöben. Treffen sich Sporen verschiedenen Ursprungs, d.h. von unterschiedlichen Individuen (bei Schleimpilzen gibt es 13 Geschlechter), so können Sie nach dem Ausschlüpfen fusionieren und bilden wieder ein diploides (2 Kopien der Chromosomen) Plasmodium. 2.4 Mikroplasmodien Der Schleimpilz Physarum polycephalum bildet in Flüssigkultur kleine kugelförmige Gebilde, sogenannte Mikroplasmodien, die in der Natur nicht vorkommen. Sie entstehen durch die Kultivierung des Organismus in Flüssigkultur und die Scherkräfte, die durch das Schütteln auf Sie einwirken. Mikroplasmodien haben einen Durchmesser von 100 bis über 1000 µm. Abbildung 2.3 zeigt ein solches Mikroplasmodium. Charakteristisch ist für diese Lebensform von Physarum polycephalum, dass die Mikroplasmodien nach Aufbringen auf einen Nähragar in Form riesiger makroskopischer Zellen mit mehreren Kernen weiter wachsen, also zu adulten Plasmodien werden und Netzwerke ausbilden. Ebenfalls charakteristisch ist die Motilität des Schleimpilzes: Die Mikroplasmodien zeigen zunächst interne Oszillationen, und sobald das Plasmodium eine bestimmte Größe erreicht hat, führt es sowohl Bewegungen des ganzen Organismus aus als auch das sogenannte shuttle streaming, eine Art rhythmischer Plasmaströmung durch die Adern des Netzwerks [10, 9] Versuchsvorbereitung und -durchführung Zellkultur Physarum polycephalum wird in unserem Labor in zwei Formen kultiviert, als Mi3

5 Zellkultur Abbildung 2.2: Lebenszyklus von Physarum polycephalum. Abbildung 2.3: Links: Makroplasmodium. Rechts: Mikroplasmodium. kroplasmodien in Schüttelkultur und als Makroplasmodien auf Petrischalen mit Nährstoffagar. Übliche Arbeitsschritte sind das Umsetzen der Kulturen sobald vorhandene Nährestoffe aufgebraucht oder der Lebensraum ausgefüllt ist. Bei großen Plasmodien werden Stücke mit dem Skalpell herausgeschnitten oder von der Agar- Oberfläche abgeschabt. Im Versuch soll mit Mikroplasmodien gearbeitet werden. Die Handhabung und das Umsetzen der Flüssigkulturen wird im folgenden Ab- 4

6 Aufschwimmen und Schütteln schnitt beschrieben. Beim Umsetzen und Handhaben der Kulturen soll steriles Arbeiten unter der Sicherheitswerkbank gelernt werden, das Verhalten in einem S1-Labor und generell der Umgang mit Mikroorganismen. Zudem sollen Präparate für das spätere Betrachten unter dem Mikroskop angefertigt werden. 3.2 Aufschwimmen und Schütteln Mikroplasmodien werden aus großen Plasmodien erzeugt, die mindestens drei Viertel der Petrischale bedecken. Zunächst wird Mikroplasmodien-Wachstumsmedium (WM) auf ca. 24 C angewärmt, dann wird das Plasmodium mit etwa 10 ml WM bedeckt. Lässt man es nun ein paar Minuten stehen, so löst sich das Plasmodium ein wenig von der Agaroberfläche ab und kann vorsichtig mit einer Pipette aufgesaugt werden. Die Fragmente werden dann in vorbereitete Erlmeyerkolben mit WM überführt und bei ca. 150 rpm auf den Schüttler gestellt. Ein bis zwei Tage später hat man eine Mikroplasmodien-Kultur mit Größen von 50 bis 500 µm. Die Geschwindigkeit des Schüttelns beeinflusst die Größenverteilung, daher kann mit verschiedenen Einstellungen gearbeitet werden. 3.3 Präparation der Proben Im Labor werden stets mehrere Mikroplasmodienkulturen unterschiedlichen Alters erhalten. Neben der Objektdichte in der Lösung variieren auch Größe und Form der Mikroplasmodien. Während die Mikroplasmodien in den jüngeren Kulturen von Form und Größe her eher den Anforderungen des Versuches entsprechen, sind hier jedoch auch meist deutlich weniger Mikroplasmodien vorhanden. Nach Auswahl der Kultur muss dieser unter der Sterilbank eine Probe entnommen und für die Bildaufnahme vorbereitet werden. Die Schritte sind im groben Probenpräparation Entnahme einer Probe (2 ml) Zentrifugation zur Trennung von Mikroplasmodien und Stoffwechselendprodukten (1300 rpm, 3 min) Resuspension in frischem Wachstumsmedium (2 ml) Ausplattieren in einer Agarbedeckten Mikroskopieschale Vor der Erstellung der Probe für die Filmaufnahme sollten die Plasmodien unter dem Labormikroskop auf Vitalität geprüft werden. 3.4 Bildaufnahme Die Bildaufnahme findet an einem invertierten Mikroskop, dem Zeiss Axio Observer statt. Prinzipiell stehen Vergrößerungen von 2x bis 100x zur Verfügung. 5

7 Datenauswertung Aufgrund der Agarschicht, die den Plasmodien Nährstoffe und Feuchtigkeit liefern soll, sind jedoch Vergrößerungen jenseits des 10x Objektives nicht praktikabel, da die Fokusebene bei höheren Vergrößerungen so dicht am Objektiv liegt, dass es nicht möglich ist die Agarschicht zu durchdringen ohne mit dem Objektiv an die Schale zu stoßen, was unter allen Umständen vermieden werden muss. Die Computersteuerung des Mikroskops ermöglicht eine zeitgesteuerte Aufnahme einer oder mehrerer Positionen in der Probe. Wählen Sie ein geeignetes Mikroplasmodium aus (Lebend, ausreichend sphärisch, entfernt von Nachbarn) und nehmen Sie eine Zeitreihe über etwa fünf Stunden auf. Verwenden Sie hierbei eine Bildrate unterhalb von 5 s je Bild. Die Begründung hierfür liegt in der erwarteten Oszillationsfrequenz von ca. 1,5 min und dem Nyquist-Theorem. Bildaufnahme Informieren Sie sich über das Entstehen der Vergrößerung in einem Mikroskop,... den prinzipiellen optischen Aufbau,... die Funktionsweise eines CCD-Chips,... die Auflösungsbegrenzung und die Rolle der numerischen Apertur,... das Nyquist-Theorem. 4 Datenauswertung Ziel des Versuches ist es, die Oszillation der Mikroplasmodien zu quantifizieren. Da die gewonnen Daten in Bildform vorliegen, müssen konkrete physikalische Messgrößen zunächst noch gewonnen werden. Was mit dem Auge direkt ersichtlich ist (Beispielsweise die Größenänderung bei der Oszillation, Helligkeitsänderungen o.ä.) ist quantitativ am Computer oft schwierig zu erfassen. Die hohe Anzahl der aufgenommenen Bilder macht eine automatisierte Analyse jedoch notwendig. Aus diesem Grund werden im folgenden Abschnitt Methoden aus Bildverarbeitung und Segmentierung vorgestellt, die im Versuch verwendet werden können und sollen. It s dangerous to go alone.. Die Analyse kann in Matlab erfolgen, jedoch gibt es auch gute OpenSource Alternativen. Speziell genannt seien: Fiji - is just ImageJ: Ein hervorragendes Programm zur Bildverarbeitung und -analyse. GNU Octave: Ein Matlab Clon, der zwar auf die Annehmlichkeiten eines GUI verzichtet, dafür jedoch beinahe alle Funktion des Vorbilds bietet. 6

8 Kymograph Sie erhalten Ihre Meßergebnisse als einen Satz von.tif Bildern. Diese müssen sie zunächst mit Matlab einlesen: Einlesen der Bilder: Beginnen sie Ihre Auswertungsroutine mit dem Einlesen der Bilder. Nützliche Befehle: uigetfile imread double imshow num2str uigetdir imwrite str2num Ist es sinnvoll, alle Bilder auf mal einzulesen? Was sind in diesem Falle die Probleme? Sobald Sie die Bilder einlesen können sollen diese ausgewertet werden. In den folgenden Abschnitten finden sie diverse Methoden, die Sie zur quantitativen Auswertung heran ziehen können. Ziel ist die Quantifikation der Flächenoszillation sowie die Berechnung einer Geschwindigkeitskarte wie unten beschrieben. 4.1 Kymograph t x x t Abbildung 4.1: Entstehung eines Kymographen Um Veränderungen entlang einer definierten Linie (üblicherweise eine Gerade senkrecht zur Kante des Plasmodiums) sichtbar zu machen, ist der Kymograph geeignet. Wie in Abb. 4.1 gezeigt, können die Grauwerte entlang eines Profils zeitlich angeordnet werden. In der Darstellung ist bereits die Periodizität zu erkennen. Nachteil dieser Methode ist, dass Informationen über eventuelle Asymmetrien der Oszillationen entlang der Kontur verloren gehen. 7

9 Gaußsche Tiefpassfilterung Erstellung eines Kymographen: Fiji: Befehl reslice unter image/stacks Matlab: Ein Profil lässt sich bequem mittels improfile erstellen. Auch eine Ausgabe der Grauwerte ist mit diesem Befehl möglich 4.2 Gaußsche Tiefpassfilterung Auch wenn man bei Bildgebungsmethoden üblicherweise auf eine möglichst hohe Auflösung bzw. einen möglichst hohen Detailgrad abzielt ist für manche Techniken eine geringere Informationsdichte nützlich. Zu diesem Zweck bietet die Signalverarbeitung diverse Filter, z.b. Hoch-, Tief- oder Bandpass. Exemplarisch vorgestellt werden soll der Gaußsche Tiefpassfilter, welcher hilfreich bei der Rauschreduzierung und Glättung eines Signals ist. Am einfachsten kann der Filter über seine spektrumsmodifizierende Wirkung im Fourierraum verstanden werden. In 4.2 ist im rechten Panel das Spektrum F = F(f) eines Grauwertprofils f Grey Level Power x [µm] f [1/µm] Abbildung 4.2: Links: Grauwertprofil entnommen einem Beispielbild (blau), geglättetes Profil (rot). Rechts: Fourier-Spektrum des Profils (blau), Anteil des Spektrums, der die geglättete Kurve ergibt (rot). gezeigt. Ein simpler Tiefpassfilter erzeugt durch abschneiden höherer Frequenzen den in rot dargestellten Anteil. Die Rücktransformierten der beiden Datensätze (linkes Panel) zeigen die Veränderung in der Bildinformation. Die Frequenzmodifikation erfolgte durch Multiplikation des Spektrums mit einer Fensterfunktion G = F(g): F = F G (4.1) Es gilt das Faltungstheorem F(f g) = F(f) F(g) (4.2) und somit für die Rücktransformierte des modifizierten Spektrums f f = F 1 ( F ) = F 1 (F(f) F(g)) = f g. (4.3) 8

10 Binärisierung Im Falle von Abb. 4.2 wurde als Fensterfunktion eine Heaviside-Funktion gewählt, deren scharfes Abschneiden zu Gibbschen Ringing führt. Eine bessere Wahl ist üblicherweise eine normierte Gaußsche Glockenfunktion. Gaußscher Tiefpass: In 2 Dimensionen ist die Glockenkurve gegeben als g(x, y) = 1 x 2 +y 2 2πσ 2 e 2σ 2 (4.4) Warum ist diese besser geeignet? Was ist ihre Fouriertransformierte? Welcher Parameterzusammenhang besteht zwischen der Funktion und ihrer Transformierten? Überzeugen Sie sich, dass die Faltungsdarstellung f g = f(τ)g(x τ) dτ (4.5) einem gleitenden Mittelwert entspricht. Was bedeutet dieser Begriff? Implementation eines Gauß-Filters: Sie können zur Implementation eines Gauß-Filters die Faltungsdarstellung, die Fourierdarstellung oder bereits vorimplementierte Befehle verwenden. Nützliche Befehle in Matlab: conv2 fft2 fspecial fftshift imfilter 4.3 Binärisierung Ein Großteil der zur Auswertung benötigten Informationen kann gewonnen werden, wenn das Bild in die Sinnzusammenhänge Hintergrund und Objekt eingeteilt wird. Eine Darstellung, in welcher jeder Pixel mittels der Werte 1 (Ja) und 0 (Nein) die Frage "Gehört dieser Pixel zum Objekt?"beantwortet, bezeichnet man als Binärbild. Eine solche Darstellung kann auf diversen Wegen erreicht werden. Die simpelste Methode ist eine Grauwertschwelle (Schwellenwert). Hierbei muss eine Zahl definiert werden, anhand derer entschieden werden kann, ob der Grauwert eines Pixels zum Hintergrund oder zum Objekt gehört. Beispielhaft: Ein dunkles Objekt (Grauwerte geringer höhe) kann vom hellen (hohe Grauwerte) Hintergrund durch eine Schwelle, welche zwischen diesen Werten liegt, abgetrennt werden. Die Schwierigkeit besteht also in der Wahl des Schwellenwertes. Im einfachsten Falle kann durch betrachten des Histograms (Grafik 4.3) ein Wert per Hand gewählt werden, welcher dann für alle Bilder einer Serie gültig ist. Was ist aber, wenn sich 9

11 Binärisierung Number of Pixels Histogram Data Segmentation Threshold Grey Scale Value x 10 4 Abbildung 4.3: Bildsegmentierung durch eine Grauwertschwelle: Die im Graustufen-Histogramm (rechts) erkennbaren Peaks lassen sich Objekt und Hintergrund des Bildes (links oben) zuordnen. Indem man einen Schwellenwert wählt, der zwischen diesen Peaks liegt (hier als rot gestrichelte Linie), nimmt man die Segmentierung vor. Das fertig segmentierte Bild (links unten) ist vom Datentyp logic : Es enthält nur noch Werte, die quasi die Frage "gehört der Pixel zu dem Objekt?"mit ja (weiß) oder nein (schwarz) beantworten. 10

12 Flächenanalyse mittels Autokorrelation oder Fouriertransformation das Histogram verändert? In diesem Falle muss der Schwellenwert automatisiert gewählt werden. Eine Methode ist es, die Grauwerte der Bildanteile (in diesem Fall Objekt und Hintergrund) als normalverteilt anzunehmen und das Histogram automatisiert mittels einer Mixtur von Gauß-Funktion anzufitten ( Gaussian Mixture Model). Einfacher in der Implementation ist die Methode nach [12], welche auf die Berechnung des Histograms verzichtet und von dessen Beschaffenheit unabhängig ist. Der Schwellenwert berechnet sich hier nach der Formel T = i j e ija ij i j e ij (4.6) wobei a ij die Grauwertmatrix (also das Bild) und e ij die Matrix der Beträge des Grauwertgradienten darstellt. Die Binärisierung kann durch Tiefpassfilterung erheblich vereinfacht werden, falls neben dem Plasmodium auch andere Bereiche (Schmutz) also Objekt erkannt werden (siehe Profil in Grafik 4.2), oder das Objekt sehr inhomogen erscheint. Achtung: Bei starker Filterung verliert auch die tatsächliche Grenze des Plasmodiums an Genauigkeit. Unter Umständen können Fehler in der Binärisierung nicht vermieden werden. Solche Fehler (wie z.b. Löcher im Objekt) können durch geeignete Methoden am Binärbild korrigiert werden. Binärisierung und Korrektur: In Matlab ist es nicht nötig, (beispielsweise durch zwei for-schleifen) den Schwellenwert für jeden Pixel einzeln anzuwenden. Die korrekte vektorisierte Syntax einer solchen logischen Abfrage lautet: Logical = Bild Threshold; (4.7) Nützliche Befehle: hist imhist sum gradient imfill bwmorph bwlabel regionprops find 4.4 Flächenanalyse mittels Autokorrelation oder Fouriertransformation Ergebnisse erster Ordnung können aus der Veränderung der vom Mikroplasmodium überdeckten Fläche gewonnen werden. Überlegen Sie sich, wie Sie aus dem Binärbild die Fläche des Mikroplasmodiums berechnen können. Um die Fläche in physikalischen Einheiten zu berechnen, benötigen Sie die im Labor verwendete Vergrößerung. In der verwendeten CCD-Kamera ist die Kantenlänge eines Pixels 11

13 Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte stets gegeben durch 6.45 µm. Stellen Sie sicher, dass ihr Ergebnis mit der erwarteten Größe eines Mikroplasmodiums übereinstimmt! Flächenanalyse: Der Flächenverlauf A(t) zeigt rhythmische Oszillationen. Charakterisieren Sie den Verlauf! Welche Aussage können Sie über die Amplituden machen? Analyse mittels FFT: Sie können die Frequenz(en) der Oszillation mittels Fouriertransformation bestimmen. Die notwendigen Befehle sind unten aufgelistet: fft fftshift Wie lässt sich das Ergebnis der fft-funktion vernünftig darstellen? Fragen Sie sich, auf welchen Zahlenraum das Fourierintegral abbildet. Welche Aussage macht das Nyquist-Theorem über die maximal auflösbare Frequenz? Gegen welche Frequenzen können Sie das berechnete Spektrum also auftragen? Testen Sie ihre Berechnung anhand von Testdaten bekannter Frequenz! Analyse mittels Autokorrelation: Die Autokorrelationsfunktion einer Funktion gibt die Ähnlichkeit einer Funktion zu sich selbst bei Verschiebung um einen Parameter τ an: Ψ = f (t)f(t τ) dτ (4.8) Mathematisch entspricht Sie also einer Faltung. Nützliche Befehle: xcorr corrcoeff Sollte ihre Autokorrelationsfunktion stark einer Dreiecksfunktion gleichen, führen Sie sich vor Augen, wie die Autokorrelation eines Rechteckspulses aussieht. Welche Relevanz hat dies für ihre Daten? Wie groß sollten Sie die maximale Verschiebung wählen? Hinweis: Sollte die Gesamtfläche sich während der Sequenz stark ändern, sollten Sie in Betracht ziehen einen das gleitende Flächenmittel abzuziehen (siehe Abschnitt zur Filterung). 4.5 Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte Die Änderung der Fläche gibt keine Aufschluss über Formveränderungen bei gleicher Fläche, wie z.b. abwechselnde Kontraktionen der beiden Kompartimente eines Hantelförmigen Objektes oder laterale Wellen entlang der Begrenzung. Daher soll 12

14 Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte im letzten Auswertungsschritt die Veränderung der Kontur mithilfe einer sogenannten Geschwindigkeitskarte untersucht werden. Eine solche ist exemplarisch in Abb. 4.4 gezeigt. Die Kontur (Abb. 4.5) eines Objektes kann vereinfacht definiert Abbildung 4.4: Darstellung der Schleimpilz-Oszillation durch eine Geschwindigkeitskarte. Die Normalengeschwindigkeit vn der Kontur ist, als Funktion der Konturlänge und der Zeit, farblich dargestellt. Hierbei stehen positive (rote) Werte für eine Bewegung nach außen, während negative (blaue) Werte für eine nach innen gerichtet Bewegung stehen. werden als die Menge der Objektpixel, welche einen Hintergrundpixel in ihrer 3x3 Umgebung haben (andere Definitionen sind möglich). Abbildung 4.5: Mikroplasmodium mit eingezeichneter Berandung oder Kontur. 13

15 Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte Finden der Konturpositionen: Die Koordinaten der Konturpixel können gefunden werden, indem die Umgebungen der Objektpixel einzeln untersucht werden, oder indem vorgefertigte Befehle verwendet werden: bwboundaries regionprops find cell Finden Sie zu jedem Bild die Kontur des Objektes als Satz von x- und y-koordinaten der einzelnen Pixel. Wieso können die gesuchten Geschwindigkeiten nicht direkt durch Differenzbildung dieser Koordinaten gebildet werden? Lesen Sie hierzu auch [10]. Die gefunden kartesischen Koordinaten sind nicht direkt zur Geschwindigkeitsberechnung durch Differenzbildung geeignet. Es bietet sich an, zunächst in ein Schwerpunktssystem überzugehen und anstelle von kartesischen Koordinaten mit Polarkoordinaten zu arbeiten. Vereinfacht kann die lokale Veränderung der Kontur als rein radial angenommen werden - dies ermöglicht es, die Geschwindigkeit als Änderung der Radialkomponente in Polarkoordinaten zu betrachten. Schwerpunkt und Polarkoordinaten: Wie berechnet man den Schwerpunkt einer beliebig geformten Fläche, deren Punktmenge (x,y) bekannt ist? Welche Vorteile bringt ein Schwerpunktssystem mit sich? Transformation in Polarkoordinaten: ρ = x 2 + y 2 (4.9) θ = tan 1 ( y /x) (4.10) Nützliche Befehle: unique sort cart2pol Transformieren Sie ihre Koordinaten in das Polarkoordinatensystem. Ist es bereits möglich, die Änderung des Radiusvektors abhängig von der Winkelposition zu berechnen? Worin bestehen die Probleme? 14

16 Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte Interpolation in einer Dimension: Bevor die Änderung des Radiusvektors berechnet werden kann, muss noch eine Interpolation auf ein äquidistantes Winkelgitter vorgenommen werden. Interpolationen werden üblicherweise verwendet um den Wert einer Funktion an Positionen zu bestimmen, an denen diese eigentlich gar nicht bekannt ist. Die Radiuskomponente des Polarkoordinatenpaares kann aufgefasst werden als eine Funktion des Winkels: ρ(θ). Soll die Änderung der Radialen Komponente bestimmt werden, muss dies an bekannten Kontur- bzw. Winkelpositionen geschehen. Die ermittelten Werte für θ weichen sind jedoch gemessen und daher nicht wohldefiniert. Mithilfe einer Interpolation kann die Funktion ρ(θ) jedoch an gewählten Positionen ausgewertet werden. Nützliche Befehle: interp1 sort unique Informieren Sie sich über das Prinzip der Interpolation. Genaue mathematische Kenntnis ist nicht notwendig. Machen Sie sich klar, weshalb eine Interpolation von Nöten ist. Darstellung der Geschwindigkeitskarte: Sobald Sie die Konturpositionen geeignet interpoliert haben, können sie mithilfe des diff oder gradient Befehls die Zeitliche Veränderung bestimmen. Fügen Sie die Ergebnisvektoren zu einer Matrix zusammen, welche in x-richtung die Zeit und in y-richtung den Winkel oder die Konturposition als Achse verwendet. Zur Darstellung eignet sich der Befehl imagesc, welcher ein Falschfarbenbild eines Datensatzes erzeugt. Die Farbdarstellung kann mithilfe einer geeigneten colormap angepasst werden. Es bietet sich die colormap redblue.m an, welche Sie online schnell finden. Achten sie auf eine vernünftige Darstellung und skalieren Sie die Geschwindigkeitswerte entsprechend der Meßparameter hin zu physikalischen Größen. Diskutieren Sie die in Ihrer Geschwindigkeitskarte erkennbaren Strukturen! 15

17 LITERATUR Literatur [1] T. D. Pollard and G. G. Borisy, Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments, Cell 112, 453 (2003). [2] F. Jülicher, Statistical Physics of Active Processes in Cells, Physica A 369, 185 (2006) [3] D. Humphrey, C. Duggan, D. Saha, D. Smith, and J. Käs, Active fluidization of polymer networks through molecular motors, Nature ( London) 416, 413 (2002). [4] K. Kruse and F. Jülicher, Self-organization and Mechanical Properties of Active Filament Bundles, Phys. Rev. E 67, (2003). [5] H.-G. Döbereiner, B. Dubin-Thaler, G. Giannone, H. S. Xenias, and M. P. Sheetz Dynamic Phase Transitions in Cell Spreading, Phys. Rev. Lett. 93, (2004). [6] H.-G. Döbereiner, B.J. Dubin-Thaler, J. M. Hofman, H. S. Xenias, T. N. Sims, G. Giannone, M. L. Dustin, C. H. Wiggins, and M. P. Sheetz, Lateral Membrane Waves Constitute a Universal Dynamic Pattern of Motile Cells, Phys. Rev. Lett. 97, (2006). [7] [8] Atsushi Tero et al., Rules for Biologically Inspired Adaptive Network Design, Science 327, (2010) [9] T.Saigusa, A. Tero, T. Nakagaki and Y. Kuramoto, Amoeba anticipate Periodic Events, Phys. Rev. Lett. 100, (2008) [10] E. Bernitt, C. Oettmeier, and Hans-Günther Döbereiner, Microplasmodium dynamics of physarum polycephalum, C.T. Lim and J.C.H. Goh (Eds.): WCB 2010, IFMBE Proceedings 31, (2010). [11] [12] J. Kittler, J. Illingworth, and J. Föglein. Threshold selection based on a simple image statistic, Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 30: , (1985). 16