Femtosekundenlaser-Mikroskopie

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1 Femtosekundenlser-Mikroskopie Nihtlinere optishe Phänomene revolutionieren Spektroskopie und Mikroskopie Die Welt in immer kleineren Dimensionen zu verstehen, ht die Wissenshftler eflügelt immer essere optishe Instrumente zu entwikeln. Mit den grundlegenden Areiten von Ernst Ae zum Auflösungsvermögen optisher Systeme wr der Grundstein für die moderne Optik gelegt. Während ei einem konventionellen Lihtmikroskop die Asorption und Reflexion von Weißliht zur Kontrsterzeugung genutzt wird, werden heutzutge uh eine Vielzhl weiterer Phänomene der Wehselwirkung von Liht und Mterie für die Bildgeung verwendet. Detillierte molekulre Informtionen üer ds zu untersuhende System eispielsweise eine iologishe Zelle lssen sih üer die -, die Infrrot-Asorptions- zw. die Rmn-Spektroskopie gewinnen (A. 1). DIE AUTOREN JÜRGEN POPP Jürgen Popp studierte Chemie n den Universitäten Erlngen und Würzurg und promovierte 1995 n der Universität Würzurg. Nh der Promotion wr er ls DFG-Stipendit für ein Jhr n der Yle University, New Hven, USA. Im Jhr 2001 hilitierte er sih in Physiklisher Chemie n der Universität Würzurg. Im Alter von nur 35 Jhren erhielt er 2002 einen Ruf uf eine C4-Profesur für Physiklishe Chemie nh Jen, wo er seit 2005 uh Leiter des Bereihes Mikrosysteme m Institut für Physiklishe Hohtehnologie Jen e.v. ist. Sein wissenshftlihes Huptinteresse gilt der Bio- und Mterilphotonik. MICHAEL SCHMITT Mihel Shmitt studierte Chemie n der Universität Würzurg, wo er uh 1998 promovierte. Im Anshluss n seine Promotion reitet er für 20 Monte ls Post-Do m Steie, Institute for Moleulr Sienes des Ntionl Reserh Counil of Cnd in Ottw ging er wieder nh Würzurg zurük, wo er sih 2004 hilitierte. Seit 2005 ist er ls kdemisher Rt in der Areitsgruppe von Prof. Popp m der tätig. Zu seinen Huptreitsgeieten gehören Femtosekunden-zeitufglöste Untersuhungen ngeregter elektronisher Zustände. Als ezeihnet mn ds Phänomen ei dem die elektronishe Asorption von Liht einer estimmten Wellenlänge durh ein Molekül zur Emission von Liht ei längeren Wellenlängen führt. Die Detektion von nsttt den shwhen Asorptionsänderungen von Weißliht ei der optishen Mikroskopie ietet zhlreihe Vorteile. So ist die detektion nhezu untergrundfrei und sehr sensitiv is in den Bereih des Nhweises einzelner Moleküle. D viele iologishe Proen keine intrinsishe Eigenfluoreszenz ei Anregung im sihtren Spektrlereih zeigen und eine direkte UV-Anregung oftmls zur einer Proenzerstörung führt, wurde die Leling-Tehnologie etliert. D. h. mn färt die Proe mit speziell entwikelten Frstoffen (Mrker zw. Lel) ein und detektiert eispielsweise dnn den Ort, wo mn diese unter Bestrhlung fluoreszierenden Lel wieder in den Proen findet. Durh die Einführung des konfoklen Messprinzips in die -Mikroskopie können sehr einfh dreidimensionle Bilder der Prof. Dr. Jürgen Popp Helmholtzweg 4 D Jen E-Mil: juergen.popp@uni-jen.de We: IR-Asorption Rmn Dr. Mihel Shmitt Helmholtzweg 4 D Jen E-Mil: m.shmitt@uni-jen.de We: ABBILDUNG 1: Zur Kontrsterzeugung in der optishen Mikroskopie eignen sih neen der Asorption und Reflexion uh ndere physiklishe Prozesse: Die IR-Asorption (), der linere Stokes Rmn-Prozess () und die (). LTJ 67

2 Proe erhlten werden. Bei dieser Tehnik wird ds Untersuhungsojekt sukzessive gerstert und durh den Einstz einer Blende (konfokles Pinhole) im detektionsstrhlengng immer nur ds Signl eines kleinen Volumensegments ufgenommen (A. 2). Mn ist heutzutge in Lge neen Ortsinformtionen uh die in iologishen Zellen lufende Prozesse zu verfolgen. Beispielhft sei hier ds konfokle mikroskop LSM 5 LIVE der Firm Crl Zeiss gennnt, welhes speziell für Ehtzeituntersuhungen shneller Prozesse n Leendpräprten entwikelt wurde. Ds im Oktoer 2004 uf den Mrkt eingeführte LSM 5 LIVE ermögliht durh eine einzigrtige Komintion von Sngeshwindigkeit, Bildqulität und Sensitivität exklusive Einlike hinter die Kulissen zellulärer Prozesse. Dmit ht sih -Mikroskopie zu einer Methode entwikelt, mit der sih viele Frgen us den Leenswissenshften und der Medizin entworten lssen. Konfokle mikroskope gehören mittlerweile zum Stndrdequipment eines Biologielors. Die tehnologie irgt jedoh uh einige Nhteile. Die Frstoffe können durh die Lserestrhlung usleihen, wodurh eine Quntifizierung extrem shwierig wird. Zudem ist die Proenvorereitung durh den Einstz externer Lel durhus umfngreih und edrf speziell geshulten Personls. Methoden die gnz ohne externe Mrker uskommen sind die IR-Asorptions- und die Rmn-Spektroskopie. Bei eiden Methoden können Shwingungen der in einer Proe vorhndenen DAS INSTITUT Ds der zählt ungefähr 50 Mitreiter und leistet wihtige Beiträge zur Aufklärung von Struktur-Eigenshfts- und Struktur-Dynmik-Beziehungen mithilfe frequenz-, orts- und zeitufgelöster Spektroskopie (linere und nihtlinere Lserspektroskopie, Festkörper-NMR) in Komintion mit qunten- und moleküldynmisher Rehenverfhren, zum Online-Monitoring und Identifizierung von iotishen und iotishen Mikroprtikeln, und zur Untersuhung von nnodispersen und nnoporösen oxidishen Festkörpern. Weitere Infos unter Anregung Detektion ABBILDUNG 2: Shemtishe Drstellung eines konfoklen Mikroskops sowie ild einer Arterie im Zungenquershnitt einer Rtte. Zur Aufnhme des Bildes wurde die Proe mit den Frstoffen ALEXA 594 und DAPI gelelt. (mit frdl. Genehmigung von CARL ZEISS AG) Moleküle sihtr gemht werden. Mn erhält somit einen molekulren Fingerdruk der Proe. Bei der Rmn-Spektroskopie wird ds Proenmteril mit monohromtishem Lserliht estrhlt, woei ds eingestrhlte Liht gestreut wird. Ein geringer Prozentstz des Streulihtes ist jedoh durh Molekülshwingungen im Vergleih zum einfllenden Liht frequenzvershoen (A. 1). Diese Frequenzvershieungen spiegeln ds Shwingungsmuster des Proenmterils wider und sind somit hohspezifish. Bei der IR-Spektroskopie werden die Molekülshwingungen direkt durh die Asorption von IR-Photonen ngeregt (A. 1). Owohl der Rmn-Effekt im Vergleih zur direkten IR-Asorption zw. zur ein extrem shwher Effekt ist, ht sih die Rmn-Spektroskopie durh eine konsequente Veresserung der Apprturen (optishe Filter, Detektoren, Spektrometer, et.) in letzten Jhren ls eine sehr leistungsstrke Methode etliert. Durh die Ortsuflösung im Sumikrometerereih können z. B. einzelnen Bkterien flähenmäßig untersuht und üer sutile Auswertelgorithmen direkt identifiziert werden [1]. Ein esonderer Vorteil ei der Rmn-Spektroskopie ist, dss die Proen gewöhnlih so verwendet werden können, wie sie nfllen. Im Vergleih zur IR-Asorptions-Spektroskopie müssen die Proen niht getroknet zw. zur -Spektroskopie niht durh externe Lel mrkiert werden. Nhteilig ist jedoh der niedrige Rmn-Streuquershnitt: Drus resultiert ein reltiv große Zeitedrf, um ein komplettes Rmn-Imge ufzunehmen. Zudem üerlgert im Flle der Anwesenheit von Fluorophoren die resultierende die Rmn-Informtion zw. ershwert ihre Detektion. Owohl es hier vielfältige tehnologishe Ansätze git, die Aufnhmezeiten zu verkürzen, ist mn weit dvon entfernt, Rmn-Bilder in Ehtzeit ufzeihnen zu können. Mit der Entwiklung von hohintensiven Ultrkurzzeitlsern wurde neen der Spektroskopie uh die Mikroskopie unter der Ausnutzung nihtlinerer optisher Phänomene in den letzen Jhren revolutioniert. Mittels Ultrkurzzeitlser lssen sih moderte Energiemengen in einer sehr kurzen Zeit (Pikois Femtosekunden) erzeugen, wodurh sih ei entsprehender Fokussierung extrem hohe Lihtintensitäten generieren lssen. Derrtige Intensitäten führen zu speziellen nihtlineren Liht-Mterie-Wehselwirkungen, ei denen im Gegenstz zu den isher eshrieen - zw. Rmn-Tehniken ds Signl niht mehr liner mit der eingestrhlten Lihtintensität skliert. Multi-Photonen-Asorptions- Die nihtlinere Antwort der Mterie ermögliht die Beohtung spezieller Prozesse wie z. B. der Multi-Photonen-Asorption. Bei der Multiphotonen-Asorption werden von einem Atom oder Molekül gleihzeitig m 2 Photonen soriert (A. 3). D m Photonen gleihzeitig vorhnden sein müssen, hängt dieser Effekt von der m-ten Potenz des eingestrhlten Lihtes. Eine derrtige nihtlinere Ahängigkeit lässt sih für Anwendungen nutzen, ei denen nur in einem winzigen Rumereih eine Rektion im System usgelöst werden soll. Dmit ist die Multiphotonen-Asorption esonders prädestiniert für den Einstz in der Mikroskopie. Durh die Verwendung eines Femtosekunden-Titn-Sphir-Lsers mit einer Anregungswellenlänge im NIR-Spektrlereih von nm können nun Fluorophore im Bereih von nm (Asorption von zwei Lserphotonen) zw. im Bereih von nm (Asorption von drei Lserphotonen) ngeregt und deren rot vershoen dzu detektiert werden. D die simultne Asorption von zwei zw. drei Photonen nur in einem sehr kleinen Volumensegment des fokussierten Lserstrhls erfolgen knn, resultiert hierus eine sehr gute Loklisierung der und dmit ein inhärenter 3D-Effekt, der den Einstz einer konfoklen Blende üerflüssig 68 LTJ Novemer 2005 Nr. 4

3 mht (A. 3). Durh dreidimensionles Arstern der Proe knn üer die detektierte die räumlihe Verteilung des Fluorophors in der Proe ermittelt und in 3D-Bilder mit hohem Bildkontrst drgestellt werden (A. 3). Weitere emerkenswerte Vorteile der Multi- Photonen-Asorptions--Mikroskopie sind: (1) D die Fluorophore niht durh ein energiereihes, sondern durh die simultne Asorption mehrere niederenergetisher Photonen ngeregt werden, können leende Proen shonender untersuht werden. Sowohl die emission ls uh möglihe Bleihungseffekte, d. h. die photohemishe zw. thermishe Zerstörung der Proe, sind uf ein sehr kleines Volumensegment eshränkt. (2) Die Wellenlänge des resultierenden lihts und die Wellenlänge des Anregungslsers liegen spektrl sehr weit useinnder, sodss es ei der Detektion des lihtes zu keiner Störung mit dem reitndigen Anregungslser kommt und somit ds Hintergrundrushen miniml ist. Wie ei der Beshreiung der konfoklen mikroskopie ereits erwähnt, existieren eine große Plette von synthetishen mrkern zw. ntürlihen iologishen Fluorophore wie z. B. NADH, Flvone oder grün fluoreszierende Proteine, die für die Untersuhung von leendem iologishem Mteril ngewendet werden können. Zwei-Photonen- zw. Multi-Photonen-Asorptions-- Spektroskopie ht sih seit ihrer Entwiklung 1990 zu einer unentehrlihen iophysiklishen Methode entwikelt [2]. Sie liefert wertvolle Informtionen üer suzelluläre iohemishe Vorgänge in leenden Zellen [z. B. 2 5]. Die Multiphotonen-Bildgeung mittels NIR-Femtosekundenlser zeihnet sih durh eine hohe Eindringtiefe us und ermögliht dmit die Drstellung von Geween mit hoher räumlihen Auflösung sowie hohem Kontrst. Sie eignet sih dher esonders für die nihtinvsive Geweedignostik [6]. Die Firm JenL rhte vor kurzem ds Gerät DermlInspet zur Multiphotonen-Tomogrphie von Hutkres uf den Mrkt. Diese Gerät verwendet eine durhstimmre Femtosekundenquelle zur Anregung von Multiphotonenutofluoreszenz von endogenen Biomolekülen in der Hut wie z. B. NAD(P)H, Flvine, Elstin, Melnin und Porphyrine (A. 3). Durh die Komintion der Multi-Photonen-Asorption mit der stimulierten Emission (ein weiterer nihtlinerer Prozess) gelingt es, die räumlihe Auflösung noh deutliher in Rihtung von wenigen Nnometern zu veressern. Die stimulierte Emission von Photonen ezeihnet den durh ein Photon induzierten Üergng eines Elektrons von einem höherenergetishen in einen niederenergetishen Zustnd. Dieser Effekt lässt sih dzu nutzen, um ds Fokusvolumen us dem mn die nh einer Multi-Photonen-Asorption resultierende eohtet noh weiter zu verkleinern [7]. Dei wird der Prozess der stimulierten Emission zur Auslöshung der genutzt, und zwr derrt, dss nur die m Rnde des spots usgelösht wird. A. 4 zeigt ds Anregungsshem dieser stimulierten löshung (Stimulted Emission Depeltion STED). Ein Anregungslser regt die Moleküle in einen ngeregten elektronishen Zustnd n, us dem Moleküle normlerweise durh spontne Emission von liht wieder relxieren würden. Durh Einstrhlung eines intensiven zum Anregungslser rot vershoenen und zeitlih leiht verzögerten STED-Lser-Pulses werden die ngeregten Moleküle evor sie spontn fluoreszieren können wieder in ABBILDUNG 3: ): Anregungsshem der Mehrphotonenfluoreszenzspektroskopie; ): Küvette gefüllt mit einem fluoreszierenden Frstoff ngeregt mit einem einzelnen Photon (Anregung von oen, rehts) und zwei Photonen eines intensiven Femtosekundenlsers (Anregung von unten, links). Mn erkennt sehr deutlih, dss die Zwei-Photonenfluoreszenz uf den Fokus des Anregungslsers reduziert ist. (Quelle: ): In-vivo-Multiphotoneutofluoreszenzild von sieen Zellen im Strtum spinosum. Die Aufnhme erfolgte in 45 µm Tiefe uf dem Vorderrm einer Fru (Anregungswellenlänge 760 nm). Die dunklen Stellen entsprehen den niht fluoreszierenden Zellkernen, während die hellen Stellen die NAD(P)H- zeigen, die fst nur in den Mitohondrien loklisiert ist. (Quelle: JenL) höhere Shwingungsniveus des elektronishen Grundzustndes geregt. Diese geregten Moleküle lssen sih durh den Anregungslser dnn jedoh niht mehr nregen. Wählt mn ds Strhlprofil des STED-Pulses in Form einer Donut -Mode, d. h. im Fokus-Punkt des Anregungslsers ist ds STED-Lser-Profil nhezu dunkel und kreis-symmetrish dzu sehr intensiv, so resultiert drus eine extreme Reduktion der Größe des spots, d nur die Moleküle im Zentrum eider Lserfoki von der Aregung niht etroffen sind. Ds resultierende liht stmmt somit us einem sehr viel shärferen nur noh wenige Nnometer-großen Spot. Ds Untersuhungsvolumen reduziert sih ei der STED-Mikroskopie uf is zu 0,67 Attoliter. Ds ist 18-ml kleiner ls ds, ws mn mit der konventionellen konfoklen -Mikroskopie erreiht. Eine weitere Möglihkeit die räumlihe Ausdehnung des Foklpunktes zu verkleinern ist die 4Pi-Mikroskopie [8]. D mn ufgrund eines mximl erreihren Öffnungswinkels nur ein Segment einer kugelförmigen Wellenfront generieren knn, erzeugt ein LTJ 69

4 Mikroskopojektiv einen entlng der optishen Ahse gedehnten Fokus (A. 4). Bei der 4Pi-Mikroskopie werden dher die Wellenfronten von zwei entgegengesetzt ngeordneten Ojektiven kohärent konstruktiv ddiert, um eine Kugelwelle mit dem vollen Rumwinkel von 4Pi nzunähern (A. 4). Durh diesen Trik der konstruktive Üerlgerung zweier entgegen gesetzt lufender Wellenfronten erhält mn einen 3- is 4-ml engeren Foklereih. entgegengesetzt lufende Pikosekunden- STED-Pulse, in einer 4Pi-Anordnung durh stimulierte Emission wieder geregt (A. 4d). Mittels einer derrtigen Anordnung lssen sih fokle Lihtfleken von ngeregten fluoreszierenden Molekülen mit einer räumlihen Ausdehnung von nur 33 nm entlng der optishen Ahse erzeugen. Der Einstz dieser Spots in der Mikroskopie ermögliht die Aufnhme von Fernfeld-Mikroskopieilder mit einer Auflösung von einigen 10 Nnometern (A. 4e). Ds gestttet völlig neue Einlike in leende Ojekte. Ein solhes System wurde vor kurzem von der Firm Lei Mirosystems (Lei TCS 4PI) uf den Mrkt gerht. Als Lserquellen der Multiphotonenmikroskopie werden huptsählih modengekoppelte Titn-Sphir-Lser verwendet, die mit Argonionen- oder frequenzverdoppelten Festkörperlsern gepumpt werden. Nhteile dieser Lser sind llerdings die reltiv hohen Anshffungs-, Betries- und Wrtungskosten. Zudem edürfen sie uh eines versierten Bedieners. Neuste Entwiklungen rhten leistungsstrke diodengepumpte modengekoppelte Festkörperlser hervor, die estens für den Einstz in der Multiphotonenmikroskopie geeignet sind [10]. Der Vorteil dieser Kurzpulslser gegenüer Titn-Sphir-Lsern esteht drin, dss diese mit einer Hohleistungslserdiode gepumpt werden, ws zu einer hohen Zuverlässigkeit, einer einfhen Bedienrkeit und einem geringem Preis führt. e STED Eine Symiose us der STED- und 4Pi-Mikroskopie zu einem STED-4Pi-Mikroskop ermögliht Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze des Lihtes und erlut so den Üergng von der Mikroskopie in die Nnoskopie [9]. Die Aeshe Beugungsgrenze des Lihtes ehält dei selstverständlih weiterhin ihre Gültigkeit, ist jedoh niht mehr Ihre Grenze. Bei der 4PI-STED-Mikroskopie wird die Proe mit einem Femtosekunden-Puls elektronish ngeregt und nhfolgend durh zwei Detektor Eine moderne nihtlinerer Vrinte der Rmn-Spektroskopie ist die kohärente Anti- Stokesshe Rmn-Spektroskopie (CARS Coherent Anti Stokes Rmn Sttering). Wie ereits erwähnt, ist der Vorteil dieser Methode im Vergleih zur lineren und nihtlineren mikroskopie, dss kein Fluorophor in der zu untersuhende Proe vorhnden sein zw. die Proe vorher niht mit einem speziellen Frstoff ngefärt werden muss. Die CARS-Mikroskopie ist somit eine lelfreie Methode, mit der sih uh durhsihtige Ojekte untersuhen lssen. CARS-Mikroskopieilder liefern detillierte hemishe Strukturinformtionen, d mit der CARS-Spektroskopie Molekülshwingungen wie ei der Rmn- Spektroskopie ngeregt werden. In einem CARS-Prozess werden drei Lserpulse in der Proe üerlgert und erzeugen dort ein räumlih gerihtetes CARS-Signl. Die Methode eruht uf der Ttshe, dss zwei Lserstrhlen (Pump- (ω p ) und Stokes-Lser (ω S )) gleihzeitig durh eine Proe geshikt werden und dort flls die Energiedifferenz zwishen Pump- und Stokes-Lser einem Rmn-Shwingungs-üergng ω R entspriht die Moleküle zu kohärenten d. h. in Phse Shwingungen nregen. An diesem Ensemle kohärent ngeregter Molekül-Shwingungs-Moden wird nun ein weiteres Pump-Photon inelstish gestreut, und zwr unter Aussendung eines zu den Anregungslsern lu vershoenen Anti- Stokes-Rmn-Signl ω S. Die Frequenz des Anti-Stokes-Rmn-Signls ergit sih us der Energieerhltung: ω S = 2ω P ω S woei ω S > ω P > ω S (A. 5), während die Rihtung des CARS-Signls durh die Wellenvektorerhltung estimmt wird. Die Summe der Wellenvektoren der vier m Prozess eteiligten Photonen muss Null ergeen ( k = 0 (k S = k p k S +k P )), dmit ds CARS-Signl mximl wird (A. 5). In einer häufig gewählten Strhlengeometrie zur Einhl- STED Lser Anregung ABBILDUNG 4: ): Anregungsshem der STED-Spektroskopie; ): 4Pi-Mikroskopie: Die Aeshe Beugungsgrenze führt zu einem entlng der optishen Ahse gedehnten Fokus. Die Fokusgröße lässt sih jedoh durh konstruktive Üerlgerung zweier Wellenfronten von zwei entgegengesetzt ngeordneten Ojektiven reduzieren. Diese Addition führt zu einem kleinen zentrlen Lihtflek sowie zwei Neenmxim; ): Strhlengng eines STED-4Pi-Mikroskops; d): STED-4Pi-Aufnhme eines Bkteriums (illus megterium) mit einer Auflösung von 30 nm. (Quelle: MPI für iophysiklishe Chemie, Zeihnungen modifiziert). d CARS-Mikroskopie 70 LTJ Novemer 2005 Nr. 4

5 tung der Phsennpssung werden die drei Lserstrhlen in drei Dimensionen ngeordnet, ws zu einer mximlen Trennung von Lser- und Signlliht führt. Ein wesentliher Vorteil der CARS-Spektroskopie ist, dss niht stört, d ds CARS-Signl lu vershoen zu den Anregungslsern ist. Die resultierenden Rmn-Signle ei CARS sind zudem um mehrere Größenordnungen intensiver ls eim klssishen Rmn-Effekt. D die Streustrhlung einen lserähnlihen Strhl ildet, ist es möglih ohne Monohromtoren zu reiten und eine hohe Auflösung zu erhlten. Nhteilig sind dgegen die kostenintensive Ausrüstung und der hohe experimentelle Aufwnd. Zur Erzeugung eines CARS-Signls enötigt mn hohe Lihtintensitäten (Piko- zw. Femtosekundenpulse) und mindestens zwei durhstimmre Kurzpulslser. Bei der Implementierung eines CARS-Mikroskops werden zwei kollinere Lserstrhlen (ω p und ω S ) üer ein Mikroskopojektiv mit möglihst großem Öffnungswinkel uf einen Punkt in der Proe fokussiert. Bei Verwendung eines Mikroskopojektivs, d. h. strk fokussierten Lserpulsen ist die Phsennpssung unkritish, d ds CARS-Signl nur üer eine reltiv kleine Flähe entsteht. Ds CARS-Signl knn entweder in Vorwärtsrihtung (F-CARS) [11] oder in Rükwärtsrihtung (EPI-CARS) [12] detektiert werden (A. 5) [13]. In der F- CARS-Anordnung wird ein zweites Ojektiv zum Smmeln des CARS-Signls enötigt, welhes sih durh ein geeignetes Filter vom Anregungsliht trennen lässt. Die Erzeugung eines EPI-CARS-Signl eohtet mn nur dnn, wenn die Größe der Proe kleiner ls die Wellenlänge der Anregungslser ist. EPI-CARS ht den Vorteil, dss mn nur ein Mikroskopojektiv enötigt und mn somit ein konventionelles mikroskop einfh in ein CARS-Mikroskop umuen knn. Durh gezieltes Arstern der Proe lssen sih so 2D- und 3D-CARS- Bilder estimmter Molekülshwingungen ufzeihnen, welhe detillierte hemishe Strukturinformtionen liefern (A. 5d). Fzit Molekulre Bildungsverfhren erlngten in den letzten Jhrzehnten esonders in den Bereihen der Leenswissenshften ls uh der Medizin immer mehr n Bedeutung. Hierei gelingt es esonders den optish sierten Methoden immer weiter in zelluläre und suzelluläre Regionen vorzudringen. Besonders Vorteilhft ht sih dei der ω p ω S ω p ω S F-CARS E-CARS ω S ωs ω S Einstz von spektroskopishen Verfhren erwiesen. Neen Bildinformtionen ekommt mn direkten molekulren Kontrst, ws die Aufklärung von Zellfunktionen ermögliht. Der Einstz moderner Femtosekunden-Lsersysteme in der Mikroskopie ermögliht zudem erstmls nihtlinere Phänomene in der Dignostik zu verwenden. Dmit sind gnz neue fszinierende Einlike in zelluläre Leensvorgänge möglih. Kurzpulslser sind inzwishen zu einem unverzihtren Werkzeug in der modernen optishen Fernfeld-Mikroskopie geworden und sind heutzutge us den modernen Leens- zw. Biowissenshften ( Biophotonik ) niht mehr wegzudenken. Litertur [1] P. Rösh et l., Appl. Environm. Mikroiol. 71, (2005). [2] W. Denk, J. H. Strikler, W. W. We, Siene 248, 73 (1996). [3] K. Svood, W. Denk, W. H. Knox, S. Tsud, Opt. Lett. 21, 1411 (1996). d F-CARS k S k S =k p k S +k p k S k p E-CARS x(µm) x(µm) ABBILDUNG 5: Energieniveushem () und Wellenvektordigrmm () zur Vernshulihung der Energieerhltung zw. der Phsennpssung innerhl eines CARS-Prozesses; ): Shemtishe Drstellung eines F- zw. E-CARS-Mikroskops (modifiziert nh [12]); d): F- und E-CARS-Mikroskopieilder von ungefärten leenden Epithelzellen ufgenommen für einen Rmn- Shift von 1579 m 1 im Flle des F-CARS-Bildes zw m 1 für ds E-CARS-Imge. In diesem Wellenzhlereih findet mn hrkteristishe Protein- zw. Nukleinsäure-Shwingungen (Bilder us [13]). [4] C. Xu et l., Pro. Ntl. Ad. Si. 93, (1996). [5] R. M. Willims, W. R. Zipfel, W. W. We, Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 603 (2001). [6] K. König, I. Riemnn, J. Biomedil Optis 8, 432 (2003). [7] T. A. Klr, S. Jkos, M. Dy, A. Egner, S. W. Hell, PNAS 97, 8206 (2000). [8] S. W. Hell, in: Topis in Fluoresene Spetrosopy, edited y J. R. Lkowiz, 5, 361 (Plenum Press, New York 1997). [9] M. Dy, S. W. Hell, Phys. Rev. Lett. 88, (2002). [10]A. Tünnermnn et l., New Conepts for Diode Pumped Solid Stte Lsers, in: High-Power Diode Lsers, Topis in Applied Physis, edited y R. Diehl, 78, 369 (Springer, Verlg, Heidelerg 2000). [11] A. Zumush, G. R. Holtom, X.S. Xie, Phys. Rev. Lett. 82, 4142 (1999). [12] A. Volkmer, J.-X. Cheng, X.S. Xie, Phys. Rev. Lett. 87, (2001). [13] A. Volkmer, J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59 (2005). k p LTJ 71