Wiederholung. Genetischer Code Transskription Processing Translation

Transkript

1 Wiederholung Genetischer Code Transskription Processing Translation 1

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5 Transgene Pflanzen Gentechnologie; direkte Veränderungen Kallus- oder Protoplastenkulturen von Pflanzen Einschleusen der DNA Regeneration von Pflanzen oder Blütensprossen

6 Methoden der Biotechnologie Biotechnologie = praxisorientierte Manipulation von Zellen und Organismen mit wissenschaftlichen Methoden Transgene Organismen: Gene (DNA) von einem Organismus werden auf einen anderen transformiert: Gentransfer Übertragene Gene produzieren die gleichen Proteine wie im Ursprungsorganismus

7 Grüne Biotechnologie Die Grüne Biotechnologie ist der Zweig der Biotechnologie, der sich mit den Pflanzen befasst (Pflanzenbiotechnologie) Sie bedient sich moderner Methoden der Biochemie, Systembiologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und Verfahrenstechnik, um Nutzpflanzen zu verbessern, pflanzliche Inhaltsstoffe (Phytochemikalien, Sekundärmetabolite) oder Fasern zu gewinnen oder um pflanzliche Enzyme bzw. Wirkprinzipien (Bionik) für neue Anwendungsbereiche zu erschließen Die Übergänge zu den anderen Zweigen der Biotechnologie sind fließend. So können pflanzliche Zellen oder Enzyme zur Produktion industrieller Stoffe (weiße Biotechnologie) oder gar von Medikamenten (rote oder Pharmazeutische Biotechnologie) genutzt werden Und auch zur Entgiftung von Böden (Phytoremediation) oder als Umweltsensoren sind Pflanzen geeignet, ein Berührungspunkt zur grauen Biotechnologie (Wasseraufbereitung).

8 Grüne Gentechnik (Agrogentechnik) Die Funktion der meisten Gene in Pflanzen ist unbekannt, daher muss man, um sie zu erkennen, die Steuerung des Gens modifizieren Normalerweise werden Effekte von Genen durch einen Vergleich dreier Pflanzenpopulationen aufzuklären versucht (Wildtyp, Überexpressoren und Knock out -Population). Hierfür gibt es verschiedene Techniken, wie etwa RNAi (RNA-Interferenz, RNA Silencing) Allen Techniken ist gemein, dass sie doppelsträngige RNA produzieren, die der Pflanze den Befehl gibt, normale Ribonukleinsäure des zu untersuchenden Gens abzubauen Außerdem gehören auch deskriptive Techniken zur Standardausrüstung der gentechnischen Pflanzenforschung Dabei werden Gene kloniert, dann bestimmt man die Häufigkeiten von Transkripten (Bauanleitungen für Proteine) oder mittels so genannter DNA-Chips gleich die meisten Gene einer Pflanze in ihrer Ablesehäufigkeit. Der Agrobakterium-vermittelte Gentransfer ist ebenfalls eine wichtige Technik. Bei dieser gentechnischen Methode werden einzelne Erbfaktoren von Zellen eines Organismus in Zellen eines anderen Lebewesens übertragen

9 RNA Silencing Transkriptionelles Gen-Silencing ist ein Resultat von DNA-Methylierung oder Histonmodifikationen. Durch diese Modifikationen der Histonenden wird eine Art heterochromatischer Zustand um das Gen geschaffen, welcher es der Transkriptions-maschine (RNA-Polymerase, Transkriptionsfaktoren, etc.) verwehrt, zu binden. Das klassische Beispiel ist das als Positionseffekt-Variegation (PEV) bezeichnete Phänomen. Es verändert den Chromatinzustand und kontrolliert somit die Transkriptionsaktivität des betroffenen Gens oder der Genregion. Post-Transkriptionelles Gen-Silencing (PTGS) entsteht durch den intensivierten Abbau der mrna eines bestimmten Gens. Durch den Abbau der mrna wird die Translation und somit die Bildung des spezifischen Genproduktes (meist ein Protein) verhindert. Ein Mechanismus ist der Abbau durch mehr oder weniger spezifische sirnas (small interfering RNA)

10 RNA Interferenz, RNA Silencing Die RNA-Interferenz (kurz RNAi oder auch RNA- Silencing) ist ein natürlicher Mechanismus in den Zellen von eukaryotischen Lebewesen, welcher der zielgerichteten Abschaltung von Genen dient Die RNA-Interferenz beruht auf einer Wechselwirkung kleiner spezialisierter Moleküle der Ribonukleinsäure (mirna) mit der Erbinformationübertragenden mrna unter Beteiligung mehrerer Enzymkomplexe Als Folge wird die mrna in mehrere Bruchstücke gespaltet und die zu übertragende Information wird zerstört oder eine Translation in ein Protein verhindert

11 Somatische Hybridisierung Die somatische Hybridisierung wiederum erlaubt es, gewünschte Merkmale verschiedener Elternpflanzen zu kombinieren Im Vergleich zum Agrobakterium-vermittelten Gentransfer müssen hierbei keine spezifischen Gene identifiziert und isoliert werden Außerdem wird damit die Einschränkung der Transformation (Gentransfer) überwunden, nur wenige Gene in einen vorgegebenes Erbgut einführen zu können Auch kann bei der Zellfusion die Chromosomenzahl der Zellen multipliziert werden, also die Anzahl der Chromosomensätze (Ploidiegrad) erhöht werden Dies kann die Ertragsfähigkeit von Pflanzen steigern (Heterosiseffekt) Molekulare Marker oder biochemische Analysen werden genutzt, um aus der somatischen Hybridisierung hervorgegangene Pflanzen zu charakterisieren und zu selektieren.

12 Rote Biotechnologie Rote Biotechnologie, auch medizinische Biotechnologie genannt, umfasst die Bereiche der Biotechnologie, die medizinische Anwendungen, insbesondere im Bereich der Gesundheit, zum Ziel haben. Die Farbe Rot steht für die Farbe des Blutes. Es soll ein praktischer Nutzen aus den Forschungsergebnissen der Bio- und Gentechnologie gewonnen werden. Dazu gehören: die Entwicklung entsprechender Produkte (Therapeutika, Diagnostika, Impfstoffe etc.), die dazu erforderlichen Plattformtechnologien sowie die Modellorganismen aus dem tierischen Bereich, die zur Entwicklung neuer Therapeutika benötigt werden und die Produktion von Wirkstoffen durch genetisch veränderte Organismen.

13 Rote Gentechnik Eine gentechnische Methode der roten Biotechnologie ist die Gentherapie. Hier wird davon ausgegangen, dass Krankheiten durch defekte Gene verursacht werden, die man versucht zu ersetzen. Bei Ansätzen der in vitro Gentherapie werden dem Patienten Zellen entnommen, gentechnisch verändert und dann dem Patienten wieder zugeführt. Bei Ansätzen der in vivo Gentherapie wird der Patient direkt mit der Korrektur- DNA in einem Vektor (z.b. Retroviren) behandelt, die die DNA mit dem Genom der Zielzellen in Kontakt bringen soll. Biotechnologische Medikamente werden durch transgene Organismen (Mikroorganismen, Nutztiere oder Pharmapflanzen) hergestellt. Dabei wird iterativ so lange verändert bis ein Wirkstoff entsteht, der die Krankheit heilen kann.

14 Weiße Biotechnologie Die Weiße Biotechnologie, auch Industrielle Biotechnologie genannt, ist der Bereich der Biotechnologie, der biotechnologische Methoden für industrielle Produktionsverfahren einsetzt. Dazu werden biologische und biochemische Kenntnisse und Prozesse durch die (Bioverfahrenstechnik) in technische Anwendungen übertragen. Dabei kommen Organismen (zum Beispiel Bakterien wie Escherichia coli oder Corynebacterium glutamicum, Hefen, etc.) oder auch Enzyme oder Enzymsysteme zum Einsatz. Durch große Fortschritte in der Entwicklung biotechnologischer Methoden und Anwendungen hat die Weiße Biotechnologie in den vergangenen Jahren stark an Bedeutung gewonnen und wird auch zukünftig als Wachstumsbranche gesehen.

15 Weiße Biotechnologie Großes Potential wird in diesen Bereichen erwartet: Optimierung von Produktionsverfahren, zum Beispiel für Grund- und Feinchemikalien Reduzieren der Rohstoffabhängigkeit, zum Beispiel durch Nutzung nachwachsender Rohstoffe statt fossiler Rohstoffe Reduzierung der Energie- und Entsorgungskosten, zum Beispiel durch Ersetzen chemischer Verfahren Entwicklung neuer Produkte und Systemlösungen mit hohem Wertschöpfungspotenzial, zum Beispiel durch Nutzbarmachung von biologischen Stoffwechselwegen mit gentechnischen Methoden

16 Weiße Gentechnik Durch gelenkte Evolution werden hier Stämme von mutierten Mikroorganismen erzeugt und aufgrund ihrer Erträge der gewünschten Produkte, die durch ein Screening festgestellt wurden, selektiert Dieser Vorgang wird in iterativen Zyklen wiederholt, bis die angestrebten Veränderungen erreicht sind Zur Identifizierung von nicht kultivierbaren Organismen untersucht man Metagenome, d. h. die Gesamtheit der Genome eines Lebensraums, Biotops oder einer Lebensgemeinschaft (Biozönose). In Metagenomen können beispielsweise Biokatalysatoren aufgefunden werden, die bisher noch nicht bekannte biochemische Reaktionen katalysieren und neue, interessante Stoffwechselprodukte bilden. Zum Einschleusen von Plasmid-DNA in die Bakterie wird u. a. die Eigenschaft von Calciumchlorid genutzt, Zellmembranen durchlässig zu machen.

17 DNA schneiden Einbau in Plasmide (Vektoren) oder Bakteriophagen: Transformation DNA Klonierung: Vermehrung der Bakterien + Vektoren Screening: Bakterien ohne Vektoren erkennen (Antibioticum/Galaktidodase)

18 Zerschneiden DNA an definierten Stellen Sticky ends: überhängende Einzelstränge zum Kleben an DNA

19 Herstellung rekombinanter DNA. Ein Restriktionsenzym heftet sich an die Erkennungs-stellen der DNA, die durch eine bestimmte Nucleotidsequenz gekennzeichnet sind (im Beispiel GAATTC oder CTTAAG). Das Enzym zerschneidet die DNA zwischen zwei Nucleotiden der Erkennungsstelle. Wird das Enzym zum Zerschneiden der DNA zweier unterschiedlicher Organismen benutzt, so haben die resultierenden DNA-Fragmente komplementäre klebrige Enden. Durch Hinzufügen von DNA-Ligase verbinden sich die DNA-Fragmente an ihren klebrigen Enden dauerhaft. Wenn Fragmente aus unterschiedlichen Quellen auf Diese Weise kombiniert werden, entsteht als Ergebnis rekombinante DNA.

20 Plasmide und Vektoren sind Vehikel, die die Fremd- DNA einbringen

21 Klonieren: Plasmide in Bakterien PCR

22 Zur Sequenzbestimmung: viel DNA nötig DNA-Abschnitt wird ausgeschnitten (Restriktions- Endonucleasen) Auf Plasmid übertragen (E. coli), z.b. R-Plasmid Bakterien + Antibiotikum Wird durch Bakterien repliziert, die Plasmid haben Plasmide werden isoliert, klonierte DNA herausgeschnitten

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24 MULLIS und FALOONA 1983 Starke Vervielfältigung eines DNA-Abschnittes Primer: kurzer DNA Abschnitt, komplementär zum Gewünschten Aufschmelzen durch Hitze Hitzebeständige DNA-Polymerase

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26 Ti-Plasmide Genkanonen Mikroinjektion Liposomen Elektroporation

27 Zwei alternative Methoden zur Übertragung eines fremden Gens in eine Pflanzenzelle. (a) Mit einer Genkanone werden DNA-beschichtete Partikel auf Pflanzenzellen geschossen. (b) Mit einer feinen Nadel werden Gene direkt in das Cytoplasma eines Protoplasten injiziert, der mithilfe einer Mikropipette stabilisiert wird. Bei beiden Methoden gelangen einige der ins Cytoplasma eindringenden Gene in den Zellkern und können in die Chromosomen eingebaut werden.

28 Unbegrenztes Wachstum, Entdifferenzierung, Polaritätsverlust, Irreversibel, transplantierbar Agrobacterium tumefaciens Bakterienfreie Tumoren Haben Plasmide: Ti (tumor inducing) -Plasmide t-dna (transferred DNA) Abschnitt wird in die pflanzliche Zellkern-DNA integriert

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31 Hierbei werden die Zellen des zu transformierenden Gewebes zuerst durch Pektinasen vereinzelt (siehe Protoplastenkultur) und anschließend durch Zellulasen die Zellwände aufgelöst (Protoplastenisolation). So erhält man nur noch durch die Zellmembran zusammengehaltene Protoplasten Für den eigentlichen Gentransfer wird diesen Protoplasten entweder Polyethylenglykol hinzugefügt oder es erfolgt ein kurzer Stromstoß (Elektroporation), wodurch die Membran durchlässig für die DNA wird. Die Methode ist zwar bei allen Pflanzen anwendbar, allerdings ist es äußerst schwierig, anschließend aus den Protoplasten wieder Pflanzen zu regenerieren

32 Gewebekultur. Vollständige Pflanzen oder Pflanzenorgane wie Sprosse oder Wurzeln können auf einem künstlichen Medium, das Nährstoffe und Hormone enthält, aus isolierten Zellen oder Geweben gezogen werden.

33 Wildkraut, Kohlgewächse (Brasicacae) ca. 30 cm, Pflanzen / m 2 6 Wochen: Samenreife Zwittrige Blüten, Selbstbestäubung, 30 bis 50 Samen pro Blüte, mehrere pro Pflanze 5 Chromosomen (haploid) Genom = klein, wenig disperse repetitive DNA

34 Jahr 2000: Gesamtsequenz des Genoms 125 Mb DNA, kodieren für Proteine; ca. 100 Mb proteincodierend; daher pro Protein durchschnittlich 4 kb 250 Mbit = ca. 31,3 MB Information bzw. 25 MB für Proteine; ca. 1 kb für 1 Protein

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37 Chemische Methode Basenspezifische Spaltung denaturierter Einzelstrang- DNA durch Chemikalien Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Enzymatische Methode Einbau in Bakteriophagen-Einzelstrang Hybridisierung mit einer synthetischen DNA Desoxynucleoside3P + DNA-Polymerase - Lösung Veränderte Nucleoside (Didesoxy), Synthese wird abgebrochen Gelelektrophorese

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40 DNA-Microarrays

41 Die DNA-Chip-Technologie nutzt Techniken aus der Halbleiterfertigung, um bekannte Gene auf einem fingernagelgroßen Plastik- oder Glasplättchen, dem Microarray, zu identifizieren und deren Aktivität zu messen

42 1. DNA-Bruchstücke auf Glasplatte 2. Isolation von m-rna 3. Inverse Transskriptase Fluoreszenzfarbstoff cdna, cdna + 4. cdna + Fluoreszenzfarbstoff + Microarray 5. Gepaarte DNA (ungepaarte wird abgewaschen)

43 Zerschneiden mit Restriktionsenzymen Auftrennen durch Gelelektrophorese gemäß der Länge der Fragmente (RFLP = Restriktionsfragmentlängen- Polymorphismus Färben Übertragen vom Gel auf Zellulose Sonden Detektion

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