Aus dem Institut für Ernährungswissenschaften

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1 Aus dem Institut für Ernährungswissenschaften Wirkung konjugierter Linolsäuren (CLA) auf den Lipidstoffwechsel und auf die Bildung von Eicosanoiden von Hep G2-Zellkulturen und am Modelltier Ratte Der Landwirtschaftlichen Fakultät (Dekan: Prof. Dr.-Ing. P. Pickel) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg als Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Trophologie (Dr. troph.) vorgelegt von Diplom-Ökotrophologin geboren am Nadine Slomma in Querfurt Gutachter: Prof. Dr. K. Eder Prof. Dr. G. Stangl Prof. Dr. G. Jahreis Verteidigung am: Halle/Saale 2004 urn:nbn:de:gbv: [

2 Inhaltsverzeichnis Seite Tabellen- und Abbildungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Material und Methoden Studie zur Wirkung der konjugierten Linolsäure-Isomere 6 cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA auf den Lipidstoffwechsel und auf die Bildung von Eicosanoiden von Hep G2-Zellkulturen Verwendete Reagenzien Hep G2-Zellkulturen Kultivierung von Hep G2-Zellen Bestimmung von Zellzahlen Bestimmung der Lebensfähigkeit von Zellen Morphologische Untersuchungen von Hep G2-Zellen Gewinnung von Zellmikrosomen und Zellcytosol Proteinbestimmung Untersuchungen zum Einfluss von cis-9,trans-11 CLA und 11 trans-10,cis-12 CLA auf den Lipidstoffwechsel von Hep G2-Zellkulturen Inkubation von Hep G2-Zellen mit cis-9,trans-11 CLA und 11 trans-10,cis-12 CLA Analytische Methoden Extraktion von Gesamtlipiden Trennung von Lipidfraktionen Fettsäureanalytik Bestimmung der mrna-konzentration von 9-, 6- und 14 5-Desaturasen Isolierung von Gesamt-RNA cdna-synthese real-time PCR Agarosegel-Elektrophorese Isolierung und Quantifizierung von DNA-Fragmenten aus 18 Agarosegelen Bestimmung von Triglycerid- und Cholesterinkonzentrationen Bestimmung der Aktivität lipogener Enzyme Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase Fettsäure-Synthetase Untersuchungen zum Einfluss von cis-9,trans-11 CLA und 20 trans-10,cis-12 CLA auf die Bildung von Eicosanoiden von Hep G2-Zellkulturen Stimulierung von Hep G2-Zellen zur Eicosanoidbildung Inkubation von Hep G2-Zellen zur Bestimmung der spla 2-21 Aktivität und der mrna-konzentration von Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase Analytische Methoden Bestimmung von Eicosanoidkonzentrationen 22

3 Bestimmung der spla 2 -Aktivität Bestimmung der mrna-konzentration von Cyclooxygenase-1 24 und Cyclooxygenase Isolierung von Gesamt-RNA cdna-synthese real-time PCR Studie zur Wirkung eines Gemisches konjugierter Linolsäuren 26 (cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA) auf den Lipidstoffwechsel und auf die Bildung von Eicosanoiden am Modelltier Ratte Verwendete Reagenzien Versuchsdesign Haltung und Fütterung der Ratten Zusammensetzung der Diäten Gewinnung und Aufbereitung des Probenmaterials Gewinnung von Plasma und Entnahme der Leber Gewinnung von Lebermikrosomen und Lebercytosol Proteinbestimmung Untersuchungen zum Einfluss des CLA-Gemisches auf den 32 Lipidstoffwechsel von Ratten Extraktion von Gesamtlipiden aus der Leber Trennung von Lipidfraktionen aus der Leber Fettsäureanalytik Bestimmung von Triglycerid- und Cholesterinkonzentrationen 33 in Leber und Plasma Bestimmung der mrna-konzentration von 9-, 6- und 5-33 Desaturasen der Leber Isolierung von Gesamt-RNA cdna-synthese real-time PCR Bestimmung der Aktivität lipogener Enzyme in der Leber Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase Fettsäure-Synthetase Untersuchungen zum Einfluss des CLA-Gemisches auf 35 die Bildung von Eicosanoiden in Ratten Bestimmung von Eicosanoidkonzentrationen in Leber und Plasma Bestimmung der spla 2 -Aktivität in Leber und Plasma Bestimmung der mrna-konzentration von Cyclooxygenase-1 36 und Cyclooxygenase-2 der Leber Isolierung von Gesamt-RNA cdna-synthese real-time PCR Statistische Auswertung der Ergebnisse 38

4 3 Ergebnisse Studie zur Wirkung der konjugierten Linolsäure-Isomere 39 cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA auf den Lipidstoffwechsel und auf die Bildung von Eicosanoiden von Hep G2-Zellkulturen Hep G2-Zellkulturen Zellwachstum und Lebensfähigkeit Proteingehalt Morphologie Einfluss von cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA 40 auf den Lipidstoffwechsel von Hep G2-Zellkulturen Anteile der CLA-Isomere in Lipide und Lipidfraktionen Fettsäurezusammensetzung von Gesamtlipiden Fettsäurezusammensetzung von Lipidfraktionen mrna-konzentration von 9-, 6- und 5-Desaturasen Konzentration von Triglyceriden und Cholesterin Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 57 Fettsäure-Synthetase Einfluss von cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA 58 auf die Bildung von Eicosanoiden von Hep G2-Zellkulturen Eicosanoidkonzentrationen spla 2 -Aktivität mrna-konzentration von Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase Studie zur Wirkung eines Gemisches konjugierter Linolsäuren 62 (cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA) auf den Lipidstoffwechsel und auf die Bildung von Eicosanoiden am Modelltier Ratte Lebendmassezunahme und Futteraufnahme Lebergewicht Einfluss des CLA-Gemisches auf den Lipidstoffwechsel von 63 Ratten Anteile der im CLA-Gemisch enthaltenen CLA-Isomere an den 63 Gesamtfettsäuren der Lipide und Lipidfraktionen in der Leber Fettsäurezusammensetzung von Gesamtlipiden in der Leber Fettsäurezusammensetzung von Lipidfraktionen in der Leber mrna-konzentration von 9-, 6- und 5-Desaturasen in der Leber Konzentration von Triglyceriden und Cholesterin in Leber und Plasma Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 74 Fettsäure-Synthetase in der Leber Einfluss des CLA-Gemisches auf die Bildung von Eicosanoiden 75 in Ratten Eicosanoidkonzentrationen in Leber und Plasma spla 2 -Aktivität in Leber und Plasma mrna-konzentration von Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase-2 77 in der Leber

5 4 Diskussion Zellwachstum und Lebensfähigkeit von Hep G2-Zellkulturen Morphologie von Hep G2-Zellkulturen Futteraufnahme und Gewichtsentwicklung von Ratten Lebergewicht von Ratten Einfluss konjugierter Linolsäuren (cis-9,trans-11 CLA und 80 trans-10,cis-12 CLA) auf den Lipidstoffwechsel von Hep G2- Zellkulturen und der Rattenleber Cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA in Lipiden 80 und Lipidfraktionen Desaturierung von gesättigten Fettsäuren, SFA und MUFA 82 in Lipiden und Lipidfraktionen Desaturierung von Linolsäure und α-linolensäure, (n-6)- und 84 (n-3)-pufa in Lipiden und Lipidfraktionen Aktivität lipogener Enzyme und Konzentration an Triglyceriden Einfluss konjugierter Linolsäuren (cis-9,trans-11 CLA und 90 trans-10,cis-12 CLA) auf die Bildung von Eicosanoiden von Hep G2-Zellkulturen und der Rattenleber 5 Zusammenfassung 94 6 Literaturverzeichnis 100

6 Tabellenverzeichnis Tab. 1: Versuchsdesign 27 Tab. 2: Zusammensetzung der Diäten 29 Tab. 3: Supplementierung der Diät mit Mineralstoffen 30 Tab. 4: Supplementierung der Diät mit Vitaminen 30 Tab. 5: Fettsäurezusammensetzung der Versuchsfette 31 Tab. 6: Zellwachstum, Lebensfähigkeit, Proteingehalt und Länge von 39 Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 10µmol/l und 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 10µmol/l und 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium Tab. 7: Prozentualer Anteil der CLA-Isomere des Zellmediums in 40 Gesamtlipide von Hep G2-Zellen nach 0,5- und 24stündiger Inkubation mit 10µmol/l und 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 10µmol/l und 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA Tab. 8: Prozentualer Anteil der CLA-Isomere des Zellmediums in Lipid- 43 fraktionen von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 25µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 25µmol/l trans-10,cis-12 CLA und jeweils 25µmol/l Linolsäure/α-Linolensäure oder jeweils 25µmol/l Arachidonsäure/Eicosapentaensäure Tab. 9: Fettsäurezusammensetzung in Gesamtlipiden von Hep G2-Zellen 48 nach 0,5stündiger Inkubation mit 10µmol/l und 100µmol/l cis-9, trans-11 CLA oder 10µmol/l und 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium Tab. 10: Fettsäurezusammensetzung in Gesamtlipiden von Hep G2-Zellen 49 nach 24stündiger Inkubation mit 10µmol/l und 100µmol/l cis-9, trans-11 CLA oder 10µmol/l und 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium Tab. 11: Fettsäurezusammensetzung in Lipidfraktionen von Hep G2-Zellen 50 nach 24stündiger Inkubation mit 25µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 25µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium Tab. 12: Fettsäurezusammensetzung in Lipidfraktionen von Hep G2-Zellen 51 nach 24stündiger Inkubation mit 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium Tab. 13: (n-6)-pufa und Quotienten von (n-6)-fettsäuren in Phospholipid- 52 fraktionen von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 25µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 25µmol/l trans-10,cis-12 CLA und 25µmol/l Linolsäure im Zellmedium Seite

7 Tab. 14: (n-3)-pufa und Quotienten von (n-3)-fettsäuren in Phospholipid- 53 fraktionen von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 25µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 25µmol/l trans-10,cis-12 CLA und 25µmol/l α-linolensäure im Zellmedium Tab. 15: (n-6)-pufa und Quotienten von (n-6)-fettsäuren in Phospholipid- 54 fraktionen von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 25µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 25µmol/l trans-10,cis-12 CLA und 25 µmol/l Arachidonsäure im Zellmedium Tab. 16: (n-3)-pufa und Quotienten von (n-3)-fettsäuren in Phospholipid- 55 fraktionen von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 25µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 25µmol/l trans-10,cis-12 CLA und 25µmol/l Eicosapentaensäure im Zellmedium Tab. 17: Relative mrna-konzentration von 9-, 6- und 5-Desaturasen 56 von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 10µmol/l und 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 10µmol/l und 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium Tab. 18: Triglycerid- und Cholesterinkonzentrationen in Hep G2-Zellen und 57 im Zellmedium nach 24stündiger Inkubation mit 100µmol/l cis-9, trans-11 CLA oder 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA und in HBSS nach zusätzlich 1stündiger Inkubation Tab. 19: Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und Fettsäure- 58 Synthetase im Cytosol von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA Tab. 20: Konzentration an 6-keto-PGF 1α, TXB 2, PGF 2α im Überstand (HBSS) 60 von Hep G2-Zellen nach 0,5stündiger Inkubation mit 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium und Stimulation mit 10µmol/l Ca 2+ -Ionophore und/oder 25µmol/l Arachidonsäure Tab. 21: Konzentration an 6-keto-PGF 1α, TXB 2, PGF 2α, PGE 2 im Überstand 61 (HBSS) von Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA oder 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA im Zellmedium und Stimulation mit 10µmol/l Ca 2+ -Ionophore und/ oder 25µmol/l Arachidonsäure Tab. 22: spla 2 -Aktivität im Überstand (HBSS) und in Mikrosomen von 59 Hep G2-Zellen nach 24stündiger Inkubation mit 100µmol/l cis-9, trans-11 CLA oder 100µmol/l trans-10, cis-12 CLA Tab. 23: Lebendmassezunahme und Futteraufnahme von Ratten während und 2. Fütterungsperiode

8 Tab. 24: Anteile von cis-9,trans-11 CLA und trans-10,cis-12 CLA an den 63 Gesamtfettsäuren der Gesamtlipide und Lipidfraktionen in der Leber von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 25: Fettsäurezusammensetzung von Gesamtlipiden in der Leber von 68 Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, vor und nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 26: Fettsäurezusammensetzung von Neutrallipiden in der Leber von 69 Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, vor und nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 27: Fettsäurezusammensetzung von Phosphatidylcholin in der Leber von 70 Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, vor und nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 28: Fettsäurezusammensetzung von Phosphatidylethanolamin in der Leber 71 von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, vor und nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 29: Quotienten und Summen von (n-3)- und (n-6)-fettsäuren in Phospha- 72 tidylcholin der Leber von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, vor und nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 30: Quotienten und Summen von (n-3)- und (n-6)-fettsäuren in Phospha- 73 tidylethanolamin der Leber von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, vor und nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 31: Relative mrna-konzentration der 9-, 6- und 5-Desaturasen 67 in der Leber von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 32: Triglycerid- und Cholesterinkonzentrationen im Plasma und in der 74 Leber von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 33: Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und Fettsäure- 75 Synthetase im Lebercytosol von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ Tab. 34: Konzentration an 6-keto-PGF 1α, TXB 2, PGF 2α, PGE 2 und spla 2-76 Aktivität im Plasma von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ

9 Tab. 35: Konzentration an 6-keto-PGF 1α, TXB 2, PGF 2α, PGE 2, spla 2 -Aktivität 76 und relative mrna-konzentration von Cyclooxygenase-1 in der Leber von Ratten, deren Diäten 30g/kg CLA, SBÖ oder HÖ-SBÖ enthielten, nach Supplementierung der Diäten mit 50g/kg LÖ

10 Abbildungsverzeichnis Seite Abb. 1: Strukturen von Linolsäure, cis-9,trans-11 CLA und 1 trans-10,cis-12 CLA. Abb. 2: Desaturations- und Elongationsprozesse von (n-6)- und 2 (n-3)-fettsäuren. Abb. 3: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen einer Hep G2-Zellkultur 42 bei 200-facher Vergrößerung A: Hep G2-Zellen (Kontrolle) B: Hep G2-Zellen 24h inkubiert mit 100µmol/l cis-9,trans-11 CLA C: Hep G2-Zellen 24h inkubiert mit 100µmol/l trans-10,cis-12 CLA D: Hep G2-Zellen 24h inkubiert mit 10µmol/l cis-9,trans-11 CLA E: Hep G2-Zellen 24h inkubiert mit 10µmol/l trans-10,cis-12 CLA.

11 Abkürzungsverzeichnis A Abb. abs. AIN ANOVA bidest. bp C C14:0 C15:0 C16:0 C18:0 C16:1 (n-7) C18:1 (n-9) C18:2 (n-6) C18:3 (n-3) C20:3 (n-6) C20:4 (n-6) C20:5 (n-3) C22:5 (n-6) C22:6 (n-3) ca. cdna CLA cm CoA COX datp dctp DEPC dest. dgtp DNA dntp DTNB DTT dutp EC EDTA EIA EMBL FAME FFAP FID FKS FsS fwd g g GAPDH Absorption Abbildung absolut American Institute of Nutrition Varianzanalyse (analysis of variance) bidestilliert Basenpaare Kohlenstoff-Atom Myristinsäure Pentadecansäure Palmitinsäure Stearinsäure Palmitoleinsäure Ölsäure Linolsäure α-linolensäure Dihomo-γ-Linolensäure Arachidonsäure Eicosapentaensäure Docosapentaensäure Docosahexaensäure circa copy Desoxyribonucleinsäure konjugierte Linolsäure(n) (conjugated linoleic acid) Zentimeter Coenzym A Cyclooxygenase(n) 2 -Desoxyadenosin-5 triphoshat 2 -Desoxycytidin-5 -triphosphat Diethylpyrocarbonat destilliert 2 -Desoxyguanosin-5 -triphosphat Desoxyribonucleinsäure Desoxynucleosidtriphosphat 5,5 -Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) Dithiotreitol 2 -Desoxyuridin-5 -triphosphat Klassifizierung für Enzyme (enzyme classification) Ethylendiamintetraessigsäure Enzymimmunassay European Molecular Biology Laboratory Fettsäuremethylester Free-Fatty-Acid-Phase Flammenionisationsdetektor Fötales Kälberserum Fettsäure-Synthetase forward Gramm Fallbeschleunigung g = 9,81 ms -2 Glycerinaldehydphosphat-dehydrogenase

12 GC G6PDH h HBSS HÖ-SBÖ ID IE Ig kg 6-keto-PGF 1α l LÖ m M mg min ml mm mmol mrna MUFA MW µg µl µm µmol NADP NADPH NCBI NL nm OD PBS PCR PC PE pg PG PGE 2 PGF 2α PGI 2 PLA 2 PUFA rev RNA RT s SBÖ SD SFA spla 2 Tab. Gaschromatograph Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase Stunde(n) Hank s bilanzierte Salzlösung (Hank s Balanced Salt Solution) hochölsäurehaltiges Sonnenblumenöl Innendurchmesser Internationale Einheiten Immunglobuline Kilogramm 6-keto-Prostaglandin F 1α Liter Leinöl Meter Mol Milligramm Minute(n) Milliliter Millimeter Millimol Boten-Ribonucleinsäure (Messenger-RNA) einfach ungesättigte Fettsäuren (monounsaturated fatty acids) Mittelwert Microgramm Microliter Micrometer Micromol Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat National Center for Biotechnology Information Neutrallipide Nanometer optische Dichte phosphatgepufferte Salzlösung (Phosphate Buffered Saline) Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chainreaction) Phosphatidylcholin Phosphatidylethanolamin Picogramm Prostaglandin Prostaglandin E 2 Prostaglandin F 2α Prostacyclin Phospholipase A 2 mehrfach ungesättigte Fettsäuren (polyunsaturated fatty acids) reverse Ribonucleinsäure Raumtemperatur Sekunde (n) Sonnenblumenöl Standardabweichung gesättigte Fettsäuren (saturated fatty acids) sekretorische Phospholipase A 2 Tabelle

13 TBE TMSH TRIS TX TXA 2 TXB 2 U u.a. UV V v.a. VLDL Tris-Borat-EDTA Trimethylsulfoniumhydroxid 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol Thromboxan Thromboxan A 2 Thromboxan B 2 Units unter anderen ultraviolett Volt vor allem very low density lipoprotein