Abteilung Neurophysiologie

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1 Abteilung Neurophysiologie Direktor Prof. Dr. med. Christoph Fahlke (ab ) Kommissarischer Direktor: Prof. Dr. med. Gerolf Gros (bis ) Forschungsprofil Unser wissenschaftliches Hauptinteresse gilt der molekularen und zellulären Physiologie erregbarer Zellen. Dabei stehen zwei Teilaspekte im Vordergrund: Die Funktion von Ionenkanälen und Ionentransportern auf molekularer Ebene und die Rolle dieser Membranproteine in normalen und pathologisch veränderten Zellen. Alle von uns bearbeiteten Membranproteine sind von großer Bedeutung für die normale Organphysiologie, und spielen alle eine Rolle in der Entstehung bestimmter Krankheitsbilder. Wir untersuchen die Aufgaben, die diese Transportproteine auf der Organebene erfüllen, zelluläre Prozesse, die den Einbau dieser Proteine in bestimmte Membranabschnitte zu Grunde liegen und die molekularen Mechanismen, mit denen sie Ionen durch Membranen transportieren. Ein weiterer Schwerpunkt ist die Pathophysiologie von Erkrankungen, die durch Störungen des Membrantransportes verursacht werden, wie erbliche Formen der Epilepsie, der Schwerhörigkeit oder bestimmte Nierenfunktionsstörungen. Forschungsprojekte Anionenkanäle als integraler Teil neuronaler Glutamattransporter Neuronen im zentralen Nervensystem kommunizieren über spezialisierte Zellkontakte miteinander. Die Informationsübertragung an diesen Synapsen beginnt mit der Freisetzung eines Neurotransmittels an der präsynaptischen Zelle, dieser diffundiert dann durch den synaptischen Spalt und bindet an einen spezialisierten Rezeptor an der postsynaptischen Zelle. Diese Rezeptoren sind liganden-gesteuerte Ionenkanäle, sie sind in der Abwesenheit des Neurotransmitters geschlossen, und öffnen, wenn die Konzentration für den Neurotransmeter in dem synaptischen Spalt auf eine bestimmte Konzentration ansteigt. Die Selektivität dieser neurotransmitter-aktivierten Ionenkanäle bestimmt die Wirkung der synaptischen Aktivität. Die Aktivierung kation-selektiver Kanäle durch Glutamat, ATP oder Acetylcholin führt zur Erregung der postsynaptischen Zelle, während anionenselektive GABA- oder Glyzin-Rezeptoren die postsynaptische Zelle in der Regel inhibieren. Glutamat ist der wichtigste exitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem des Menschen. Eine Voraussetzung für eine effektive und zeitlich genau gesteuerte synaptische Übertragung an glutaminergen Synapsen ist, dass Glutamat gleich nach der Freisetzung MHH Forschungsbericht

2 wieder durch spezialisierte Transportprozesse aus dem synaptischen Spalt entfernt wird. Dies geschieht durch eine Klasse von Membranproteinen, die drei Natriumionen, ein Kaliumion, ein Proton und ein Glutamat im festen Verhältnis zueinander zusammen durch die Membran transportieren. Diese Proteine, excitatory amino acid transporters (EAATs), sind damit gekoppelte Transporter, sie bewegen verschiedene Substrate entlang ihres chemischen Gradientens, um Glutamat gegen seinen elektrochemischen Gradienten transportieren zu können. Die besondere Kopplung der neuronalen Glutamattransporter erlaubt, die extrazelluläre Glutamatkonzentration unter Ruhebedingungen auf Werte von nur 2 nm zu reduzieren und so eine neurotoxische Wirkung dieses Transmitters zu verhindern. EAAT Glutamattransporter weisen noch einen zweiten Transportprozess auf, sie sind nicht nur sekundär-aktive Glutamattransporter, sondern auch anionen-selektive Ionenkanäle und verbinden so zwei fundamental gegensätzliche Transportprozesse in einem einzigen Protein. Glutamattransporter-assoziierte Anionenkanäle sind in den letzten Jahren intensiv untersucht worden, allerdings ist trotz vielfältiger Bemühungen ihre physiologische Bedeutung bislang unklar geblieben. Es gibt fünf EAAT-Isoformen im zentralen Nervensystem des Menschens, davon weisen EAAT4 und EAAT5 eine sehr hohe Anionenleitfähigkeit auf. Für EAAT4 konnte anhand eines knock-out Maus-Modells gezeigt werden, dass die physiologische Bedeutung von EAAT4 nicht im Transport von Glutamat liegt. EAAT4 wird fast ausschließlich in den dendrititischen Dornfortsätzen von Purkinje-Neuronen des Kleinhirns exprimiert. Seine Funktion ist aus diesen Gründen in nativen Zellen nicht zu untersuchen, und wir haben aus Abb. 1: Stromantworten von Zellen, die EAAT4 heterolog exprimieren, auf die angegebenen Spannungsprotokolle (aus: Melzer et al. (2005). Proc Natl Acad Sci USA 102: ). Jedes Experiment wurde zunächst in der Abwesenheit und dann in der Anwesenheit von Glutamat durchgeführt. diesem Grunde EAAT4 heterolog in einer menschlichen Tumorzelllinie exprimiert und mit der patch-clamp Methode untersucht. EAAT4-Anionenkanäle sind sowohl in der Abwesenheit als auch in Anwesenheit von 38 MHH Forschungsbericht 2005

3 Glutamat aktiv. Sie zeigen ein spannungsabhängiges Schaltverhalten (Abb. 1) das durch Glutamat moduliert wird. In der Abwesenheit von Glutamat führt ein Sprung von einem negativen Haltepotential auf ein positives Testpotential zunächst zu einem Ansteigen der Stromamplitude, die dann von einer langsameren Abgabe der Stromamplitude gefolgt wird (Fig. 1A und C). Die Applikation von Glutamat vergrößert die Stromamplitude und verändert die Zeitabhängigkeit des Anionenstromes. Nach Applikation von Glutamat führt das Anlegen einer positiven Spannung beim Rücksprung auf ein negatives Potential zu einer langsamen und zeitabhängigen Zunahme des Stromes, (Fig. 1B und D). Abb. 2: Depolarisationen in der Anwesenheit von Glutamat machen den EAAT4-assoziierten Anionenkanal unselektiv. A, Stromantworten auf ein so genanntes Rampenprotokoll. B Bestimmung des Umkehrpotentials nach depolarisierenden Vorpulsen unterschiedlicher Dauer. C, Zeitabhängigkeit der Selektivitätsveränderung des EAAT4-Anionenkanals bei einer extrazellulären Glutamatkonzentration von 500 µm. Die Ursache für diese zeitabhängige Stromzunahme ist eine Veränderung der Selektivität des Kanals. Während in der Abwesenheit von Glutamat EAAT4-assozierte Anionenkanäle ideal anionenselektiv sind und keine Permeation von Kationen ermöglichen, kommt es in der Anwesenheit extrazellulärem Glutamat zu einer spannungs- und zeitabhängigen Zunahme der relativen Kationenpermeabilität (Abb. 2). Es existiert also ein spannungsabhängiger und glutamatabhängiger Schaltprozess, der den EAAT4-assozierten Anionenkanal von anionenselektiv zu praktisch unselektiv umwandelt. Diese dynamische Ionenselektivität gibt EAAT-assoziierten Anionenkanäle eine physiologische Bedeutung und zeigt einen neuen Mechanismus auf, mit dem neuronale Exzitabilität reguliert werden kann. In der Abwesenheit von Glutamat wirken EAAT4-assozierte Anionenkanäle inhibitorisch, während in der Anwesenheit von Glutamat nach elektrischer Aktivität auch Kationen durch den EAAT4-assozierte Anionenkanal permeieren können und damit die Zelle erregen. EAAT-Glutamat-Transporter haben damit zwei Wirkungen: Sie sind zum einen für die Kontrolle der extrazellulär Glutamatkonzentration und damit für die Beendigung der glutaminergen synaptischen Übertragung verantwortlich. Darüber hinaus haben sie selbst einen Einfluss auf die Zellerregbarkeit. Diese Rolle auf die Zellerregbarkeit hängt von der MHH Forschungsbericht

4 elektrischen Aktivität der Zelle ab. Nach repetitiver elektrischer Erregung wirkt der Glutamattransport erregend, bei einer ruhenden Zelle wirkt er hemmend. Wir haben damit einen neuen Mechanismus neuronaler Plastizität identifiziert und erstmals einen physiologischen Prozess benennen können, bei dem die kanalvermittelte Anionenleitfähigkeit von neuronalen Glutamat-Transportern eine wichtige Funktion hat. Projektleiter: Christoph Fahlke. Mitarbeiter: Delany Torres-Salazar, Nico Melzer. Förderung: DFG Forschergruppe FOR 450. Weitere Forschungsprojekte Molekulare Mechanismen von ClC Anionenkanälen und Transportern Projektleiter: Christoph Fahlke. Mitarbeiter: Alexi Alekov, Audrey Janssen, Martin Fischer, Ute Scholl. Förderung: DFG Forschergruppe FOR 450. Struktur und Funktion des Carboxy-Terminus von ClC Kanälen Projektleiter: Christoph Fahlke und Patricia Hidalgo. Mitarbeiter: Martin Fischer, Jennie Garcia Olivares. Förderung durch die Muscular Dystrophy Association. Struktur und Funktion eines prokaryotischen Glutamattransporters Projektleiter: Christoph Fahlke und Patricia Hidalgo. Mitarbeiter: David Ewers, Ivanna Shcherbyna; Förderung: DFG Forschergruppe FOR 450. Funktion eines membranständigen Motorproteins, Prestin Projektleiter: Christoph Fahlke. Mitarbeiter: Sonja Meyer zu Berstenhorst. Molekulare Mechanismen der Regulation von spannungsabhängigen Kalziumkanälen durch zytoplasmatische akzessorische Untereinheiten Projektleiter: Patricia Hidalgo. Mitarbeiter: Erick Miranda Laferte; Förderung: DFG Forschergruppe FOR 450. Originalarbeiten M. Fischer, S.S. Schäfer (2005). Effects of changes in ph on the afferent impulse activity of isolated cat muscle spindles. Brain Res. 1043: S. Hebeisen, Ch. Fahlke (2005). Carboxyterminal truncations modify the outer pore vestibule of muscle chloride channels. Biophys J 89: MHH Forschungsbericht 2005

5 N. Melzer, D. Torres-Salazar, Ch. Fahlke (2005). A dynamic switch between inhibitory and excitatory currents in a neuronal glutamate transporter. Proc Natl Acad Sci USA 102: Abstracts 2005 wurde 1 Abstract publiziert. Weitere Tätigkeiten in der Forschung Christoph Fahlke: Sprecher der DFG Forschergruppe FOR 45O, Gutachter für DFG und diverse Zeitschriften. MHH Forschungsbericht