PCR A B C. Update. Diagnostic. PCR bei IDEXX Vet Med Labor. Methodik und Relevanz für die tierärzliche Praxis. Polymerase Kettenreaktion

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1 Diagnostic Update Oktober 07 PCR bei IDEXX Vet Med Labor Methodik und Relevanz für die tierärzliche Praxis PCR (Polymerase Chain Reaction) Das Basisverfahren molekulargenetisch-diagnostischer Untersuchungen stellt die Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) dar. Zu diesen Untersuchungen gehören der Nachweis von Infektionserregern sowie genetische Mutationsanalysen. Die PCR ermöglicht den empfindlichen Nachweis geringster Antigen-Konzentrationen im Patientenmaterial durch in vitro-vermehrung definierter DNA- bzw. RNA-Genabschnitte. Der diagnostische Vorteil der PCR liegt in der Möglichkeit, aus der Vielzahl der in einer Probe enthaltenen Nukleinsäuren (DNA oder RNA) ein spezifisches Segment soweit zu vervielfältigen (amplifizieren), dass man es zum Nachweis messbar machen oder zur weiteren Identifizierung / Charakterisierung sequenzieren kann. Es handelt sich bei dem zum Infektionserregernachweis amplifizierten Nukleinsäuresegment um erregerspezifische DNA- oder RNA- Sequenzen oder beim Nachweis von Erbkrankheiten um Genabschnitte, auf denen eine entsprechende Veränderung (Mutation) lokalisiert ist. Zur Geschlechtsbestimmung bei Vögeln wird beispielsweise ein Genomabschnitt amplifiziert, der aufgrund von Sequenzpolymorphismen auf dem männlichen und dem weiblichen Geschlechtschromosom unterschiedlich zusammengesetzt ist. Technik der PCR Die PCR läuft in drei Reaktionsschritten ab: Im ersten Reaktionsschritt wird die zu vervielfältigende (amplifizierende) DNA durch Erhitzen auf eine hohe Temperatur (z. B. 94 C) in zwei komplementäre Einzelstränge aufgetrennt (denaturiert). Im zweiten Reaktionsschritt wird die Temperatur soweit abgesenkt, dass sich an jeden DNA-Einzelstrang (Template DNA) ein spezifisches, komplementäres Oligonukleotid (Primer) anlagern (hybridisieren) kann. Der Bereich der Template DNA zwischen den beiden Primern ist das DNA- Segment, das amplifiziert wird. Die Spezifität der Primer für den nachzuweisenden Genomabschnitt wird anhand von Homologievergleichen mit den in Datenbanken (GenBank/EMBL database) abgelegten Sequenzinformationen gewährleistet. Die Primer dienen als Anknüpfungspunkt für die hitzestabile DNA-Polymerase (z. B. Taq-Polymerase). In einem dritten Reaktionsschritt werden die Primer in Anwesenheit eines hohen molaren Überschusses an Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dntps) mit Hilfe der DNA-Polymerase Template-spezifisch verlängert. Es ent- PCR Polymerase Kettenreaktion Extraktion Blutprobe Blutzellen DNA í í Wiederholungszyklen zur exponentiellen Amplifikation Amplifikation Auftrennen der DNA-Doppelhelix in zwei komplementäre Einzelstränge (Denaturierung) { Zielspezifische Sequenz A B C Anbindung der Primer an zielspezifische Sequenz (Hybridisierung) Replizierte/ verdoppelte Zielsequenz

2 stehen dadurch zwei neue DNA-Doppelstränge. Das bei der Reaktion entstandene Verlängerungsprodukt dient wieder als Template für die ebenfalls im Überschuss vorhandenen Primer. Der Zyklus aus Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung wird so oft wiederholt, bis die für weiterführende Analysen notwendige Menge an Reaktionsprodukt (identische Kopien des Ausgangs-DNA-Segments) entstanden ist. Verschiedene Modifikationen im Testprotokoll erweitern den Einsatzbereich der PCR. Sie ermöglichen z. B. die Amplifikation von RNA für den Nachweis von RNA-Viren oder Genexpressionsprodukten die Erhöhung der Spezifität und Sensitivität durch Verwendung eines weiteren spezifischen Primerpaares in der sogenannten nested PCR die Quantifizierung der Ausgangs-DNA/-RNA durch die Verwendung interner Standards z. B. mittels real time-pcr Was ist der Unterschied zwischen konventioneller und real time-pcr? Konventionelle Block-PCR In einem konventionellen PCR-Test wird die DNA-Amplifikation in einem sogenannten Block-Thermocycler durchgeführt. Nach Abschluss der Reaktion muss die amplifizierte DNA vom PCR-Instrument entfernt und über eine Gelelektrophorese weiter prozessiert werden, um sie sichtbar zu machen. Die Entnahme des PCR-Produktes vom Reaktionsbehälter und die Gelelektrophorese sind zeitraubend und vergrößern die Gefahr einer möglichen DNA-Verschleppung und Ko ntamination; die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Ergebnisse ist erhöht. Aus diesem Grund wird bei IDEXX Vet Med Labor eine große Anzahl von Kontroll- und Sicherheitsmassnahmen (Extraktionskontrollen, Reagenzienkontrollen, Negativkontrollen, quantifizierte Positivkontrollen, Kontaminationsmonitoring in den Labors) durchgeführt, um die Kontaminationsgefahr zu überwachen und auf ein Minimum zu reduzieren. Die konventionelle Block-PCR ist seit dem Anfang der 1990er Jahre verfügbar, sie wird jedoch mehr und mehr durch die real time-pcr ersetzt werden. Vorteile der real time-pcr In einem real time-pcr-test beinhaltet die Reaktionsmischung zusätzlich zu den die Spezifität gewährleistenden Oligonukleotid-Primern eine ebenfalls hochspezifisch nur an die amplifizierte bzw. zu amplifizierende Target-DNA bindende fluoreszenzmarkierte Sonde. Die während der PCR freigesetzte Fluoreszenz ist direkt proportional zur vorhandenen Target-DNA-Menge und wird fortwährend über die Dauer der Amplifikationsreaktion durch das PCR-Instrument gemessen. Die amplifizierte DNA muss darum den Reaktionsbehälter nicht verlassen, Ergebnisse sind schnell verfügbar. Durch das geschlossene System ist die Gefahr einer Kontamination und DNA-Verschleppung erheblich reduziert bzw. fast auszuschließen. Neben ihrer hohen Sensitivität und Spezifität liegen die größten Vorteile der real time-pcr in ihrer Schnelligkeit und der Quantifizierung. IDEXX Vet Med Labor bietet sowohl eigenständige real Endpunktdetektion von PCR-Produkten mittels Agarose-Gelelektrophorese nach Abschluss einer konventionellen PCR. Fluoreszenz-Messung zur Detektion positiver PCR-Produkte nach Abschluss einer real time-pcr.

3 å å Denaturierung Die mit Fluoreszenz-Farbstoffen markierte sequenzspezifische Sonde bindet noch nicht an die DNA; der dem Reporterfarbstoff (rot) benachbarte Quencher-Farbstoff (grau) ç verhindert die Entstehung einer messbaren Fluoreszenz ç Annealing Primer und Sonde binden an DNA; der dem é Reporterfarbstoff (rot) benachbarte Quencher-Farbstoff (grau) verhindert weiterhin die Entstehung einer messbaren Fluoreszenz é+è Elongation Durch die 5-3 -Exonucleaseaktivität der è Taq-Polymerase Hydrolyse der Sonde; Reporter- und Quencher-Farbstoff werden voneinander getrennt, die Fluoreszenz des Reportesr-Farbstoffs wird messbar!. time-pcr-tests (IDEXX realpcr ) als auch Profile an, die aus mehreren real time-pcr-testsystemen bestehen und aus einer einzigen Patientenprobe durchgeführt werden können. IDEXX realpcr Testergebnisse sind in der Regel bereits wenige Stunden nach Probeneingang, spätestens jedoch Stunden nach Probeneingang verfügbar. Das geschlossene real time-pcr-system wie auch die konventionelle PCR in Kombination mit strenger Prozesskontrolle und konstantem Qualitätsmanagement gemäß unseren Akkreditierungsbestimmungen (DIN ISO 17025), der DIN und der MIQ (Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik) liefern Ihnen zuverlässige Resultate. Welche Bedeutung hat ein positives, welche ein negatives PCR-Ergebnis? Testinterpretation in der Erregerdiagnostik Ein positives PCR-Ergebnis zeigt an, dass die gesuchte Nukleinsäure im Untersuchungsmaterial vorhanden ist. Eine Aussage darüber, ob der dadurch nachgewiesene Erreger lebens- und vermehrungsfähig ist, kann nicht getroffen werden. Mit den üblichen PCR-Techniken (konventionelle Block-PCR) wird auch nicht bestimmt, in welcher Menge die Nukleinsäure in der Probe vorliegt. Quantitative PCR-Methoden sind aber für relevante Parameter durch die real time-pcr möglich. Es ist zu beachten, dass durch die hohe Sensitivität der PCR-Technik schon geringste Kontaminationen mit der gesuchten Nukleinsäure zu falsch positiven Ergebnissen führen. Daher ist ein steriles Vorgehen bei der Probenentnahme und -verpackung notwendig. Ein negatives PCR-Ergebnis zeigt an, dass zum Zeitpunkt der Untersuchung das gesuchte Nukleinsäure-Segment in der Probe nicht amplizifierbar war, entweder weil es nicht oder in zu geringer Menge in der Probe vorlag. Falsch negative Ergebnisse entstehen bei der Verwendung ungeeigneter Proben, Inhibitoren (z. B. Heparin) enthaltender Proben und bei unsachgemäßer Behandlung der Proben vor und während des Transportes (z. B. wiederholtes Einfrieren und Auftauen). Inhibitoren werden jedoch bei der PCR-Analyse erkannt und wenn möglich entfernt. Dadurch können durch Inhibitoren verursachte falsch negative Ergebnisse vollständig vermieden werden. Sollte eine Entfernung der Inhibitoren nicht möglich sein, wird das Ergebnis entsprechend kommentiert. Wann sollten Sie PCR als ein diagnostisches Werkzeug wählen? Die PCR ist ein ausgezeichnetes diagnostisches Mittel, um die Anwesenheit eines Infektionserregers in kranken Tieren zu bestätigen oder auszuschließen. Wie bei anderen diagnostischen Verfahren auch sollte die PCR nicht isoliert angewendet werden. Beziehen Sie immer klinische Anzeichen/Symptome und andere Testergebnisse in die Diagnose mit ein.

4 PCR in der tierärztlichen Praxis Die PCR ist eine Nachweismethode, bei der DNA / RNA mit hoher Spezifität und Sensitivität nachgewiesen wird. Dementsprechend ergeben sich für die Diagnostik andere Indikationsgebiete als beispielsweise bei einem Antikörpernachweis. Im Folgenden soll ein Überblick über einige Einsatzmöglichkeiten von molekularer Diagnostik mittels PCR in der tierärztlichen Praxis gegeben werden. Molekulargenetische Untersuchungen Bei sehr vielen heriditären Erkrankungen ist die Lokalisation des Gendefektes bekannt. Mit Hilfe der PCR kann in diesen Fällen eindeutig nachgewiesen werden, ob das getestete Tier Träger des Defektes ist und diesen an seine Nachkommen weitergeben kann bzw. selber Gefahr läuft, zu erkranken. Die gentechnischen Untersuchungen werden aus Schleimhautabstrichen oder EDTA-Blut durchgeführt. Die Probenentnahme ist also nicht oder minimal invasiv und kann auch bereits bei Welpen komplikationslos durchgeführt werden. Das Ergebnis ist eindeutig. Die genetischen Tests geben sowohl für die Zucht als auch für das Einzeltier eine wertvolle Auskunft. Geschlechtsbestimmung Bei Vögeln ist die Geschlechtsbestimmung häufig nur mit invasiven Mitteln (Endoskopie) möglich. Die PCR bietet eine nicht bzw. minimal invasive Diagnostik mit eindeutiger Aussage. Bereits eine Feder mit Federkiel oder ein Tropfen EDTA-Blut reichen für die Geschlechtsbestimmung aus. Selbst direkt nach dem Schlupf ist eine eindeutige Aussage über das Geschlecht durch die molekulare Analyse der Eischale (Eihaut) möglich. Die Geschlechtsbestimmung ist bei mehreren hundert Vogelarten möglich. Wenn Sie die Untersuchung einer exotischen Art wünschen, nehmen Sie bitte vorab Kontakt mit dem Labor auf. Erregernachweis Eine Infektionskrankheit kann mittels direktem Erregernachweis oder über Antikörper, die der Körper gegen den Erreger gebildet hat, diagnostiziert werden. Die Bildung von Antikörpern erfordert einige Zeit i. d. R. ca. 14 Tage, während derer einige Infektionen klinisch bereits bedeutsam sind. Ein großer Vorteil der PCR gegenüber serologischen Untersuchungen ist, dass Erreger häufig schon vor einer Serokonversion, d.h. innerhalb der ersten 10 bis 14 Tage einer Infektion nachweisbar sind. Mit Hilfe der PCR wird DNA / RNA detektiert. Im Falle einer Infektion wird das Virus, das Bakterium bzw. der Parasit direkt nachgewiesen. Ein positives Ergebnis ist also beweisend für die Anwesenheit des jeweiligen Erregers. Umgekehrt schließt ein negatives Ergebnis eine Infektion nicht 100%ig aus. Es bedeutet, dass zum Zeitpunkt der Untersuchung das gesuchte Nukleinsäure-Segment in der Probe nicht amplifizierbar war, entweder weil es nicht oder in zu geringer Menge in der Probe vorlag. Vor der Probenentnahme muss also überlegt werden, in welchem Material (z. B. Blut, Urin, Liquor, Organbioptat) sich der Erreger vermutlich in ausreichender Menge befindet. Außerdem sollte darauf geachtet werden, dass bei Abstrichen auch Zellmaterial gewonnen wird. Bei vielen Infektionen ist der Erreger zum Beispiel in der Fieberphase, die ja häufig mit einer Bakteriämie/Virämie/Parasitämie einhergeht, im Blut nachweisbar. Im Folgenden sollen einige Beispiele aus der Praxis die Einsatzmöglichkeiten der molekularen Diagnostik mittels PCR bei Infektionserkrankungen verdeutlichen. 1. Babesiose Bei einer akuten Babesiose muss so schnell wie möglich eine eindeutige Diagnose gestellt werden. Antikörper sind aber oft erst 10 bis 14 Tage p. i. nachweisbar. Die Babesia spp.-pcr aus dem EDTA-Blut gilt als Nachweismethode der Wahl. 2. Mycoplasma haemofelis Eine Infektion mit Mycoplasma haemofelis oder Candiatus M. haemominutum (ehemals Haemobartonellen) soll abgeklärt werden. Auch in diesem Fall eignet sich EDTA-Blut als Material für die PCR-Untersuchung. Der mikroskopische Nachweis ist möglich, weist aber eine deutlich niedrigere Sensitivität auf und ist daher nicht zu empfehlen. 3. Ehrlichiose/Anaplasmose Auch wenn die klinischen Erkrankungen Ehrlichiose und Anaplasmose sich unterscheiden, ist die Diagnostik ähnlich und wird daher parallel beschrieben: Bei einem Hund besteht der Verdacht auf eine Ehrlichiose oder Anaplasmose. Der Hund hat seit wenigen Tagen klinische Symptome. Eine Serokonversion findet bei einer Ehrlichiose häufig erst 28 Tage post infektionem statt. Zur Diagnosestellung wird eine PCR aus dem EDTA-Blut auf Ehrlichia canis bzw. Anaplasma spp. durchgeführt. Zusätzlich kann mittels PCR aus Milz- bzw. Knochenmarksbioptaten ein Erregernachweis durchgeführt werden. 4. Staupevirusinfektion Ein junger Hund hat Symptome, die verdächtig für eine akute Staupevirusinfektion sind. Der Hund ist vor 4 Wo-

5 chen zum ersten Mal gegen Staupe geimpft worden. Der Antikörpernachweis kann in diesem Fall nicht weiterhelfen, da Impf- und Feldinfektion nicht unterschieden werden können. Die PCR ist die Nachweismethode der Wahl. Welches Material geeignet ist, richtet sich nach den klinischen Symptomen: bei Durchfall - ein Rektumschleimhautabstrich, bei Augen- / respiratorischen Symptomen ein Konjunktival- bzw. Nasenabstrich, bei Fieber EDTA-Blut. Wichtig ist, dass Zellmaterial (und nicht nur Eiter) gewonnen wird. 5. Chlamydien-, Mycoplasmen-, Herpesvirusinfektion des Auges Bei einer Katze wird eine einseitige Konjunktivitis festgestellt, die nach Therapie mit Gentamicin Augensalbe zwar vorrübergehend besser wurde, dann aber wieder aufflammte. Inzwischen sind beide Augen betroffen. Die Katze zeigt konjunktivale Hyperämie, Chemosis und serösen Augenausfluss. Der Tierarzt möchte eine Chlamydieninfektion, sowie Infektionen mit Mycoplasmen und felinem Herpesvirus ausschliessen. Die Probenentnahme für eine PCR-Diagnostik von der Konjunktiva bzw. Kornea sollte mit Hilfe eines sterilen trockenen Tupfers oder einer Cytobrush erfolgen. Damit ausreichend Zellmaterial in der Probe vorhanden ist, muss diese (nach lokaler Anästhesie) unter leichtem Druck entnommen werden. 6. Felines Coronavirus Die FIP / Coronavirus-Infektion der Katze bedeutet für den praktischen Tierarzt nach wie vor eine diagnostische Herausforderung. Derzeit ist eine Unterscheidung zwischen Felinem Infektiösen Peritonitisvirus (FIPV) und Felinem Enteralem Coronavirus (FECV) selbst mittels PCR noch nicht möglich. Der Nachweis von Felinem Coronavirus (FCoV) in Punktat oder Liquor spricht für das Vorliegen einer FIP, vor allem wenn die Klinik und andere labordiagnostische Befunde (Serologie, klinische Chemie) in dieselbe Richtung weisen. Ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese der FIP- Infektion ist die Infektion von Monozyten und Makrophagen. Daher gilt der Nachweis von FCoV mittels PCR in der Monozyten/Makrophagenfraktion des EDTA-Blutes (Buffy Coat) als sehr spezifisch für eine FIP-Infektion. Im Kot hingegen gibt der PCR-Nachweis von FCoV lediglich einen Hinweis auf eine Coronavirusinfektion. Er dient der Identifizierung von Virusausscheidern. Da das Virus intermittierend ausgeschieden wird, kann die Sensitivität des Testes erhöht werden, indem Sammelkotproben untersucht werden. 7. Felines Immunodefizienzvirus (FIV) Bei Infektionen mit dem Felinen Immunodefizienzvirus (FIV) ist nach wie vor der Antikörpernachweis die Nachweismethode der Wahl. Mittels PCR können fraglich positive oder negative ELISA-Ergebnisse überprüft werden, denn in frühen Infektionsstadien können Antikörper noch nicht nachgewiesen werden und im Endstadium der Erkrankung sinken die Antikörper gelegentlich unter die Nachweisgrenze. Bei Katzenwelpen unter 6 Monaten Lebensalter können maternale Antikörper zu positiven serologischen Ergebnissen führen, aus denen nicht auf eine Infektion des Welpen geschlossen werden kann. In diesen Fällen eignet sich die PCR aus dem EDTA-Blut zum Nachweis des FIV-Progenoms. 8. Felines Leukämievirus (FeLV) Auch bei der Infektion mit dem Felinen Leukämievirus (FeLV) dient die PCR vor allem der Überprüfung von ELI- SA-Ergebnissen (Antigennachweis), die mit der Klinik des Tieres nicht korrelieren. Auf Grund ihrer hohen Spezifität kann die PCR bei fraglichen Ergebnissen vor allem bei latenten bzw. regressiven Infektionen als Bestätigungstest eingesetzt werden. Die Sensitivität der PCR aus dem EDTA-Blut ist von der Zahl der infizierten Zellen, dem sogenannten Provirus-load, abhängig. 9. Leptospirose Viele Tiere sind gegen Leptospirose geimpft, so dass im Falle eines Infektionsverdachtes der Antikörpernachweis den Tierarzt vor die Problematik stellt, Impf- und Infektionstiter zu unterscheiden. Zusätzlich kann eine klinische Erkrankung bereits vor dem Auftreten spezifischer Antikörper bestehen. In der akuten Krankheitsphase (in den ersten 2 Wochen) kann der Erreger am besten aus dem Blut, danach aus dem Urin mittels PCR nachgewiesen werden. Die Ausscheidung mit dem Urin kann Monate bis Jahre andauern. Mit Hilfe der PCR aus dem Urin können auch chronische Ausscheider identifiziert werden. Da die Ausscheidung intermittierend ist, kann eine Sammelurinprobe die Sensitivität der PCR Untersuchung steigern. 10. Parvovirose Wie bei den meisten Infektionen, gegen die routinemäßig geimpft wird, stellt sich auch bei der Parvovirose das Problem, dass Impf- und Infektionsantikörpertiter nicht unterschieden werden können. Auch in diesem Fall ist die PCR eine sehr sensitive und spezifische Nachweismethode. Sowohl beim Hund als auch bei der Katze kann das Virus aus Kot oder Rektalabstrichen nachgewiesen werden.

6 Diagnostic Update Beim Hund wird außerdem routinemäßig eine Differenzierung in Impfstamm CPV 2 und Wildstämme CPV 2a / CPV 2b durchgeführt. Dies ist von diagnostischem Interesse, da das Impfvirus 2 12 Tage nach der Impfung ebenfalls ausgeschieden werden kann. Die Ausscheidung von Feldvirus beginnt ca. 3 4 Tage p.i. und hält i.d.r Tage an. 11. Leishmaniose Die Leishmaniose ist eine Erkrankung, bei der die meisten Hunde, die klinische Symptome zeigen, auch Antikörper aufweisen. Tiere, welche asymptomatisch infiziert sind, haben häufig keine oder niedrige Antikörpertiter. Bei diesen Tieren ist der Nachweis mittels PCR hilfreich. Auch bei Tieren mit positivem Antikörpertiter kann mittels PCR aus Hautbioptaten überprüft werden, ob die jeweilige Veränderung Leishmanien-bedingt ist. Bei der Leishmaniose ist das zu untersuchende Material sehr wichtig. Geeignet sind bei Hautläsionen Hautbiopsien, bei Lymphadenopathie Lymphknotenpunktate oder -bioptate, bei Rhinitis Nasenabstriche. Ausserdem ist der Nachweis aus Knochenmark-, Leber- und Milzbioptaten sehr sensitiv. Auch aus Konjunktivaltupfern (beider Augen) können häufig Leishmanien mittel PCR isoliert werden. Der PCR Nachweis aus dem Blut ist ungeeignet. Die neuen PCR Profile Profil Material Profil Augeninfektionen Katze Abstrich Chlamydophila felis (Konjunktiva / Mycoplasma felis Kornea) Felines Herpesvirus (FHV 1) Profil Oberer Atmungstrakt Chlamydophila felis Felines Calicivirus Felines Herpesvirus Mycoplasma felis Mykoplasmen Profil Mycoplasma haemofelis Candidatus Mycoplasma haemominutum Candidatus Mycoplasma turicensis Zeckenprofil Babesia spp. Ehrlichia / Anaplasma spp. Borrelia burgdorferi sensu lato FSME Zeckenprofil Blut Babesia spp. Ehrlichia / Anaplasma spp. Abstrich (Rachen) EDTA Blut Zecke EDTA Blut Ab sofort verfügbar! Antragscheine Molekulare Diagnostik (PCR) Erregernachweise Mutationsanalysen Abstammungsnachweis Vogelprofil I Basic PBFD-Virus Polyoma-Virus Vogelprofil II Basic + Cp. psittaci Vogelprofil IlI Basic + Geschlechtsbestimmung Vogelprofil IV Basic + Cp. psittaci + Geschlechtsbestimmung + Abstrich / Kot + Abstrich / Kot Autoren: Jörg Balzer, Dr. rer. nat. Abteilungsleitung Molekularbiologie Maja Hirsch, Dr. med. vet. FTA Klein- und Heimtiere Literatur auf Anfrage Vet Med Labor GmbH Division of IDEXX Laboratories Mörikestraße 28/3 D Ludwigsburg Tel: +49 (0) Fax: +49 (0) D