1 Definition und Einteilung 5.5 Komplikationen E R I C H T 2 Die monoklonale Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) 5.5.1 Kryoglobuline und Kryoglobulinämie 3 4 2.1 Vorkommen 2.2 Kriterien 2.3 Verlauf der MGUS Ursprung und Immunphänotyp der Myelomzelle Chromosomenaberrationen beim Multiplem Myelom 6 5.6 Diagnose mittels Kriterien und Stadieneinteilung Labordiagnostik 6.1 roteindiagnostik in Stufen 6.1.1 Die Serumprotein-Elektrophorese als Suchstest 6.1.2 Immunfixation Mai 2002 68 5 Das Multiple Myelom 6.1.3 Nephelometrie und Turbidimetrie 5.1 Definition 5.1.1 Smouldering myeloma 5.1.2 lasmazell-leukämie 5.2 Epidemiologie 5.3 Ätiologie 7 6.1.4 ENCE-JONES-roteine und ihre Diagnostik 6.2 Empfehlungen zur Verlaufsanalytik 6.2.1 2 -Mikroglobulin Literatur 5.4 Symptome Diagnostik der monoklonalen Gammopathie Dr. med. Dipl.-iochem. Markus Linnemann 1 Definition und Einteilung Eine Erkrankung, die mit einer Vermehrung monoklonaler Immunglobuline oder deren Teile (Leicht- oder Schwerketten) einhergeht, wird als monoklonale Gammopathie bezeichnet. Sie entsteht durch unkontrollierte Vermehrung eines immunkompetenten -Lymphozyten. Zu den roteinen, die im Rahmen einer monoklonalen Gammopathie vermehrt auftreten, zählen: vollständige Immunglobulinmoleküle einer Klasse und eines Typs (z.. IgG- ) freie Leichtketten des Typs oder Ï, auch ENCE-JONES-roteine genannt eine Kombination von Immunglobulinmolekülen und freien Leichtketten freie Schwerketten, z..á-, -, Ì-Kette unterschiedliche Immunglobulinmoleküle, z.. di-, tri-, multiklonale Gammopathie Monoklonale Gammopathien können mit einer Reihe von Erkrankungen einhergehen, die praktisch alle zum Kreis der malignen hämatologischen Erkrankungen zählen. Über die Wertigkeit und den Verlauf der monoklonalen Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) [1] informiert das Kapitel 2. In diesem ericht sollen lediglich die MGUS und das multiple Myelom als die häufigsten Erkrankungen, die mit einer monoklonalen Synthese von Immunglobulinen oder deren Leichtketten parallel gehen, besprochen werden. Multiples Myelom (mit Unterformen) Maligne Erkrankung Monoklonale Gammopathie Mit unbestimmter Signifikanz (MGUS) Andere Erkrankungen Amyloidose Chronisch lymphatische Leukämie M. Waldenström Haarzellenleukämie rolymphozytenleukämie Abbildung 1 Formen der monoklonalen Gammopathien. Die MGUS ist als fakultativ maligne anzusehen.
E R I C H T 6 8 Seite 2 Abbildung 2 Häufigkeit von Krankheiten mit monoklonaler Gammopathie, ermittelt an 882 atienten an der MAYO-Klinik im Jahre 1995. Die Abbildung zeigt, dass eine Hauptaufgabe der Diagnostik in der Differenzierung zwischen monoklonalen Gammopathien unbestimmter Signifikanz (MGUS) und malignen Formen der monoklonalen Gammopathien liegt [2]. M. Waldenström (2 %) Solitäres Myelom (2 %) Andere (5 %) Smouldering Myeloma (3 %) Lymphoproliferative Erkrankungen (3 %) MGUS (55 %) Amyloidose (12 %) Multiples Myelom (18 %) Abbildung 3 Häufigkeit und Verteilung von monoklonalen Gammopathien, untersucht an 2906 Fällen. J steht für ENCE-JONES-rotein [3]. n = 2906 Fälle IgE 0,1 % IgD 0,3 % 60,3 % 17,8 % 14,1 % 5,4 % IgG ( /Ï = 3/2) IgA ( /Ï = 1/1) IgM ( /Ï = 4/1) J ( /Ï = 1/1) iklonal 1,8 % Die monoklonale Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS) 2.1 Vorkommen Die monoklonale Gammopathie unbestimmter Signifikanz ist mit einer Frequenz von etwa 55 % die häufigste Diagnose, die bei atienten mit monoklonaler Gammopathie gestellt wird. Sie stellt eine Ausschlussdiagnose dar, d. h. die Diagnostik zielt darauf ab, die primäre Amyloidose, Non-HODGKIN-Lymphome mit araproteinämie und das Multiple Myelom auszuschließen. Mit wachsendem Alter steigt auch die rävalenz der MGUS. Liegt die Häufigkeit im Alter unter 70 Jahren bei 0,1 bis 0,3 %, so beträgt sie jenseits des 70. Lebensjahres bereits 1 bis 3 %, oberhalb des 95. Lebensjahres sogar 19 %. Häufige Diagnosen bei atienten mit monoklonaler Gammopathie unbestimmter Signifikanz sind [1]: 2 Kardiovaskuläre Erkrankungen Autoimmunerkrankungen, z.. Systemischer Lupus erythematodes, Sklerodermie, rheumatoide Arthritis Entzündungen Maligne Erkrankungen, z.., KAOSI-Sarkom Hämatologische Erkrankungen, z.. Myelofibrose, akute Leukämie Colonpolypen, Schilddrüsenadenom Endokrine Erkrankungen, z.. Hyperparathyreoidismus oder Diabetes mellitus 2.2 Kriterien Die monoklonale Gammopathie unbestimmter Signifikanz ist eine klonale Expansion von lasmazellen ohne Zeichen der Malignität. Im peripheren lutbild ist sie meist unauffällig, in seltenen Fällen kann eine Geldrollenbildung auftreten. Das lutbild spielt daher keine Rolle bei den Kriterien für die MGUS nach DURIE: lasmazellanteil im Knochenmark < 10 % Konzentration des monoklonalen Immunglobulins konstant < 20 g/l beim IgA und < 35 g/l beim IgG
Seite 3 E R I C H T 6 8 ENCE-JONES-roteinurie < 0,5 g/24 h bei fehlender Amyloidose Fehlen von Osteolysen Fehlende Infiltration des Knochenmarks mit lasmazellen, Fehlen von solitären, extramedullären und medullären lasmazellherden sowie Lymphknotenbeteiligungen Verlaufskontrolle bei festgestellter monoklonaler Gammopathie unbestimmter Signifikanz soll folgende Auflistung dienen [4]. Alle 3 Monate werden durchgeführt: quantitative estimmung des M-roteins in der Serumprotein-Elektrophorese quantitative estimmung der Immunglobulinklassen im 24 h-harn Fehlen von Symptomen 2.3 Verlauf der MGUS ei der Mehrzahl der atienten mit MGUS bleibt diese ohne klinische Relevanz, d. h. sie versterben an anderen Ursachen. ei einem ausreichend langen eobachtungszeitraum entwickelt sich die MGUS jedoch in etwa 25 % der Fälle zu einem Multiplem Myelom, einem Non-HODGKIN- Lymphom oder zu einer Amyloidose (Abb. 4). Sie ist daher als räkanzerose aufzufassen und verlangt nach einer kontinuierlichen Verlaufskontrolle, um frühzeitig Komplikationen (pathologische Frakturen, Organschäden durch Amyloidose) entgegenwirken zu können. Als Vorschlag für eine ENCE-JONES-rotein-Ausscheidung im 24 h-harn Messung der lutsenkungsgeschwindigkeit (SG) kleines lutbild Alle 12 Monate, je nach Symptomen: radiologische Untersuchung des Skeletts Knochenmarkshistologie bzw. -zytologie 2 -Mikroglobulin im Serum (6.2) 26 % Multiples Myelom Non-HODGKIN-Lymphome Amyloidose Abbildung 4 Verlauf der monoklonalen Gammopathie nach längeren Zeiträumen [2]. 10 % araprotein > 30 g/l 12 11 1 10 2 9 3 8 4 7 5 6 12 % Leben mit MGUS 24-38 Jahre 52 % Tod mit MGUS aus anderen Ursachen MGUS 3 Ursprung und Immunphänotyp der Myelomzelle Abb. 5 zeigt die Entwicklung eines -Lymphozyten, wobei auch der Darstellung seiner immunphänotypischen Differenzierung Rechnung getragen wird. Die somatischen Mutationen der Immunglobulingene in Myelomzellen legen nahe, das die Ausgangszelle Antigenkontakt hatte und sich entweder von den -Gedächtniszellen oder terminale lasmablasten/lasmazellen (also nach Durchlaufen der Keimzentrumsreaktion, siehe Abb. 5) ableitet [5]. Es wird daher angenommen, dass die entscheidenden transformierenden Ereignisse in den Myelomzellen erst nach dem normalen Differenzierungsprozess zu langlebigen lasmazellen eintritt [6].
E R I C H T 6 8 Seite 4 St HLA-DR TdT lymphoide Stammzelle ro- frühe rä- späte rä- Y Y IgM IgM Antigenstimulation unreife -Zelle Sekundäre lymphatische Gewebe lasmoblast reife -Zelle Lymphfollikel (Keimzentrum) Antigenkontakt Gedächtnis--Zelle Aktive Hypermutation Selektion hochaffiner Ig mittels AC und T H -Zellen (CD 40/CD 40-Ligand) lasmazelle lasmoblast Y Y IgA/G/E/D Y IgA/G/E/D IgA/G/E/D TdT HLA-DR CD 34 CD 10 Vpre/λ5 Ig CD 22 CD 19 CD 20 CD 21 CD 23 CD 38 cyt cyt CD 22 svpre/λ5 cyt µ slgm slgm/slgd Knochenmark Knochenmark Abbildung 5 Im Knochenmark entwickelt sich aus der lymphoiden Stammzelle eine unreife -Zelle, die ihre Gene für die Synthese schwerer und leichter Immunglobulinketten rearrangiert hat. Ausdruck dessen ist die Existenz von oberflächengebundenem IgM, dem sigm (s wie surface; cyt steht dagegen für cytoplasmatisch). Als reifer -Lymphozyt, der jetzt auch IgD auf seiner Zelloberfläche aufweist, besiedelt die Zelle sekundäre lymphatische Gewebe wie Lymphknoten, Milz oder EYER-laques. Dort kommt es nach Antigenkontakt und folgender Stimulation zur roliferation und Differenzierung in -Gedächtniszellen und lasmoblasten. Diese sezernieren nur IgM, welches aber eine geringe Antigenaffinität besitzt. Daher wandern sie in die Keimzentren der Lymphfollikel ein, wo eine aktive Hypermutation der rearrangierten Ig-Gensequenzen in den jetzt Zentroblasten genannten -Zellen stattfindet. Hierbei kann eine Affinitätssteigerung des Immunglobulins zum Antigen erreicht werden. Die Zentroblasten erlangen jetzt die Fähigkeit, von der IgM-Synthese auf die anderer Klassen (IgG, IgA, IgE, IgD) umzuschalten ( Antikörper-Switch ), wobei verschiedene Zellen nun Antikörper einer Klasse mit unterschiedlicher Affinität zum Antigen synthetisieren. Als Zentrozyten wandern sie in die sogenannte helle Zone des Keimzentrums, wo sie mit Hilfe der dort ansässigen Antigen präsentierenden Zellen (AC), den follikulären dendritischen Zellen, anhand ihrer Affinität zum präsentierten Antigen selektiert werden. Nur diejenigen Zellen, die Antikörper mit hoher Affinität synthetisieren, werden nicht apoptotisch. Von den T H -Zellen der hellen Zone bekommen die Zentrozyten via CD 40/CD 40-Ligand ein weiteres antiapoptotisches Überlebenssignal. Die anderen fallen der Apoptose anheim. Zentrozyten mit hochaffinen Antikörpern durchlaufen erneut als Zentroblasten das Zentrum des Follikels (dunkle Zone) und können durch weitere Mutationen und Selektionen immer mehr ihre Antigenaffinität steigern, bis sie schließlich im Knochenmark zu langlebigen lasmazellen (Lebensdauer etwa 30 d) differenzieren.
Seite 5 E R I C H T 6 8 Myelomzellen weisen immunphänotypisch große Ähnlichkeiten mit der normalen lasmazelle auf (Abb. 5). Einen Vergleich zeigt die folgende Tabelle 1: 4 Zelle Immunphänotyp Normale, reife lasmazelle CD 38, CD 138 (Syndecan-1), Subpopulation mit CD 19/20/10 Myelomzelle CD 38, CD 138 (Syndecan-1), CD 20/10, CD 56 Chromosomenaberrationen beim Multiplem Myelom Die konventionelle Zytogenetik ermöglicht in 30-50 % der atienten mit Multiplem Myelom den Nachweis chromosomaler Anomalien, wobei diese aber nicht für das Multiple Myelom spezifisch sind. Zumeist handelt es sich um hyperdiploide Zellen, seltener um hypodiploide. Typisch sind Trisomien der Chromosomen 3, 5, 7, 9, 11, 15 und 19 sowie die Monosomie 13. Strukturelle Aberrationen findet man häufig auf dem Chromosom 1 (p- und q-arm) und dem Chromosom 14, auf dem dann der Genlocus der Ig- Schwerketten (IgH) betroffen ist. ei Verwendung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) steigt die Anzahl der atienten mit mindestens einer Aneupoidie auf 88,9 %, bei 66 % sind es 3 oder mehr [7]. Eine Übersicht zu Chromosomenaberrationen beim Multiplem Myelom zeigt die Tabelle 2. Tabelle 1 Immunphänotypenvergleich von Myelom- und (normaler) lasmazelle. Demnach ist CD 56 am ehesten geeignet, zwischen den beiden Zellen zu differenzieren, daneben ist die Myelomzelle in der Regel CD 19 negativ. 5 Das Multiple Myelom 5.1 Definition Das Multiple Myelom/lasmozytom ist ein Non- HODGKIN-Lymphom und wird in dieser Gruppe maligner lymphatischer Erkrankungen nach dem Klassifikationsvorschlag der WHO von 1999 [8] wie folgt eingeordnet: Aberation Genlocus Häufigkeit Kommentar 14q-Translokation IgH 6-25 % (FISH 75 %) edeutung derzeit unklar Deletion von 13q 15 % (FISH 45 %) Ungünstige rognose Deletion von 17p p53 < 5 % (FISH ca. 25 %) Ungünstige rognose 11q-Aberrationen CL-1 3-5 % (FISH ca. 10 %) Multiples Myelom/lasmozytom in der Gruppe der reifzelligen (peripheren) -Zellen-Neoplasien Das Multiple Myelom/lasmozytom Umfaßt Deletionen und die Translokation t(11; 14) (q13; q32) hat seinen Ursprung in einem Klon maligner transformierter lasmazellen befällt das Knochenmark diffus oder multilokulär, selten extramedullär verdrängt die normale lutbildung im Knochenmark (Anämie) zerstört Cytokin-vermittelt den Knochen durch Osteolyse bildet Immunglobuline (Ig) sowie freie Leichtketten eines Idiotypen (monoklonale Ig) Tabelle 2 Chromosomale Aberrationen beim Multiplem Myelom. Die Häufigkeiten beziehen sich auf die konventionelle Zytogenetik von Metaphasezellen, in Klammern sieht man die Ergebnisse der Interphase-Zytogenetik mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH). Die höhere Sensitivität von FISH ergibt sich daraus, dass diese Methode nicht auf Metaphasezellen angewiesen ist, die aufgrund der niedrigen roliferationsaktivität der Myelomzellen in vitro seltener auftreten [7].
E R I C H T 6 8 Seite 6 5.1.1 Smouldering myeloma Ein smouldering ( schwelendes ) Myelom erfüllt die diagnostischen Kriterien eines Multiplem Myeloms, bleibt jedoch über einen längeren Zeitraum, d. h. einige Jahre klinisch stationär. Es ist daher als Unterform des Multiplem Myeloms anzusehen. Der Anteil der atienten mit smouldering Myelom liegt bei 2 %. Nach derzeitiger Auffassung bedarf ein smouldering Myelom keiner spezifischen Therapie. Der Übergang in ein Multiples Myelom muss mit einer engmaschigen klinischen Kontrolle überwacht werden. Die Kriterien für ein smouldering myeloma lauten [2]: lasmazellanteil im Knochenmark > 10 %, aber < 20 % Konzentration des monoklonalen Immunglobulins > 20 g/l beim IgA und > 35 g/l beim IgG ENCE-JONES-roteinurie > 1,0 g/24 h bei fehlender Amyloidose Fehlen von Anämie, Hypercalcämie, Osteolysen (Knochenläsionen), Niereninsuffizienz 5.1.2 lasmazell-leukämie Von einer lasmazell-leukämie spricht man, wenn mehr als 2 x 10 9 lasmazellen pro Liter im peripheren lut gezählt werden oder der lasmazellanteil im lutausstrich > 20 % wird. Sie tritt bei ca. 1 % aller Myelompatienten auf und geht mit einer schlechten rognose (mediane Überlebenszeit von 2 bis 6 Monaten) einher [2, 4]. 5.2 Epidemiologie Die Inzidenz liegt bei 3-4/100.000 ersonen pro Jahr bei leichter evorzugung des männlichen Geschlechts (1,2 : 1) [9]. Die rävalenz in der undesrepublik Deutschland beträgt 10-20/100.000 Einwohner, die Mortalität 2/100.000 Einwohner pro Jahr (Saarländisches Krebsregister). Der Häufigkeitsgipfel liegt im 7. Lebensjahrzehnt, 87 % der Fälle sind bei Erstdiagnose älter als 50 Jahre. Das Multiple Myelom ist der häufigste Tumor des Knochenmarks und der Knochen. Es macht 10 % der hämatologischen Erkrankungen aus [9]. 5.3 Ätiologie Weitgehend unbekannt, eventuell genetische Faktoren, estizide, Metalle und ionisierende Strahlen. 5.4 Symptome Unspezifische Rückenschmerzen und Knochenschmerzen sind das Leitsymptom des Multiplem Myeloms. Ein schleichender, progredienter eginn ist häufig, wobei der Schmerz aber auch einschießen kann, z.. infolge einer Wirbelkörper-Kompressionsfraktur beim Heben eines schweren Gewichts. Die Lokalisation der Knochenläsionen gibt Abb. 6 wieder. Daneben sind die Folgen der damit einhergehenden Hypercalcämie aufgelistet. Die ebenfalls häufig auftretende Müdigkeit (etwa 70 % der atienten) sowie die Leistungsminderung und Schwäche sind primär auf die normochrome, normozytäre Anämie im Rahmen der Knochenmarksinfiltration zurückzuführen. Ein Großteil der auftretenden Symptome sind ein Ausdruck der Komplikationen, die bei diesem Lymphom auftreten können. So sind beispielsweise neurologische Symptome auf das Hyperviskositätssyndrom oder die Hypercalcämie zurückzuführen, Infektionen sind Folge der Immunschwäche, eine olyneuropathie tritt nach Wurzelkompression im Rückenmark auf, Vaskulitiden oder das RAYNAUD-Syndrom wiederum können durch die Kryoglobulinämie bedingt sein. Abb. 6 listet synoptisch die wichtigsten Symptome beim Multiplem Myelom auf. 5.5 Komplikationen Mögliche Komplikationen eines multiplen Myeloms sind: Knochenfrakturen infolge Osteopathie, Knochenmarkdepression infolge Zytokinsekretion und Verdrängung, Infektanfälligkeit, Zweittumoren, insbesondere AML, Hyperviskositätssyndrom infolge olymerenbildung durch IgA, IgG 3 und IgM (hier fast nur beim M. WALDENSTRÖM) und ENCE-JONES-roteinen, AL-Amyloidose durch Ablagerung von Leichtketten, besonders vom Typ Ï, Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen, Nephrotisches Syndrom, olyneuropathie, Hepatomegalie, Nephropathie (Myelomniere) durch Nephrocalcinose, Hyperurikämie und Ablagerung von Leichtketten, besonders vom Typ Ï, olyneuropathie infolge Rückenmarksläsion, Wurzelkompression, Amyloidose, Hyperviskositätssyndrom und direkter Kreuzreaktion (IgM) mit Nervengewebe, Kryoglobulinämie mit Vaskulitiden (Komplementaktivierung), Arthritis, Glomerulonephritis und RAYNAUD-Syndrom.
Seite 7 E R I C H T 6 8 Calciumerhöhung Übelkeit/Erbrechen olyurie/olydipsie Muskelschwäche Dehydratation Hyporeflexie Verwirrtheit EKG-Veränderung > 100 mm/h Schädel rustwirbelsäule 45 % 51% 35 % Femur Fieber Nachtschweiß Gewichtsverlust Hautinfektionen Lähmungen arästhesien Schwindel Netzhautblutung 23 % Clavicula 41% Rippen 51% Lendenwirbelsäule 38 % ecken 20 % Sacrum Multiples Myelom Schwäche, Müdigkeit Leistungsminderung Appetitlosigkeit Leitsymptom Knochenschmerz Abbildung 6 Das Leitsymptom des Multiplen Myeloms bzw. lasmozytoms sind Knochenschmerzen. Oben ist die Häufigkeitsverteilung des Knochenbefalls wiedergegeben [10]. Die untere Hälfte zeigt weitere Symptome, die weitgehend unspezifisch sind und bei anderen Erkrankungen ebenfalls gefunden werden. Typisch ist auch die stark beschleunigte lutkörperchensenkungsgeschwindigkeit, deren Werte nicht selten über 100 mm in der ersten Stunde liegen können. Das Hyperviskositätssyndrom, welches man insbesondere bei IgA- und IgG 3 -Myelomen und dem M. Waldenström (IgM) findet, kann Schwindel, Koma, Ataxie, Kopfschmerzen sowie Schleimund Netzhautblutungen mit Sehverlust verursachen. olyneuropathien und das Karpaltunnelsyndrom (Amyloidablagerungen an den eugesehnen des Handgelenks) sind weitere neurologische Manifestationen. Treten Hautläsionen und endokrinologische Veränderungen (Impotenz, Amenorrhoe) auf, so kann ein sogenanntes OEMS-Syndrom (olyneuropathie, Organomegalie, Endokrinopathie, monoklonales rotein, Skin [Hautläsionen]) vorliegen. 5.5.1 Kryoglobuline und Kryoglobulinämie Das Auftreten von Kryoglobulinen gilt als Komplikation von monoklonalen Gammopathien, namentlich beim M. WALDENSTRÖM und bei IgG 3 -Myelomen. Sie treten aber nicht ausschließlich bei diesen auf, sondern werden auch bei chronischen Infektionen (z.. mit HCV) oder Autoimmunerkrankungen gefunden. Kryoglobuline sind Immunglobuline, die folgende Eigenschaften aufweisen [11]: Spontane und reversible Ausfällung bei Kälte (Kältepräzipitation) Gelierung oder Viskositätssteigerung bei niedrigen Temperaturen Selten ildung nadelförmiger seudokristalle bei Kälte Alle hänomene können bei einem Serum kombiniert oder isoliert auftreten und zeichnen sich dadurch aus, dass sie bei Temperaturen über 37 C reversibel sind. Wie schon erwähnt, handelt es sich bei den Kryoglobulinen um Immunglobuline oder estandteile von ihnen, z.. ENCE- JONES-roteine, wobei IgM und IgG bzw. Komplexe aus beiden dominieren. Kryoglobulineigenschaften werden aber auch Fibrinogen (Kryofibrinogenämie), Fibronektin und -Lipoproteinen zugeschrieben. Je größer die Kryoglobulinkonzentration, desto höher ist die Temperatur, bei der die Kältefällung stattfindet.
E R I C H T 6 8 Seite 8 Tabelle 3 Einteilung der Kryoglobuline nach ROUET [12]. Die roteinzusammensetzung entscheidet über die Zugehörigkeit zu einer der drei Kryoglobulintypen. Typ/Häufigkeit Ig-Klasse/-Typ Assoziierte Erkrankungen I IgM Multiples Myelom ein monoklonales Ig IgG (IgG 3, IgG 2 ) WALDENSTRÖM ca. 25 % IgA (selten) Chronisch-lymphatische Leukämie ENCE-JONES-roteine II IgM Autoimmunerkrankungen ein mono- und ein (selten zwei) IgG (IgG 3 ) Multiples Myelom polyklonale(s) Ig IgA (selten) M. WALDENSTRÖM ca. 25 % Chronisch-lymphatische Leukämie III IgM-IgG-Komplexe Autoimmunerkrankungen zwei polyklonale Ig IgM-IgG-IgA-Komplexe Virushepatitis ca. 50 % Infektiöse Mononukleose, Cytomegalie Lepra Idiopathisch Streng von den Kryoglobulinen zu trennen sind die Kälteagglutinine, bei denen es sich um Autoantikörper (häufig vom Typ IgM) handelt, die sich gegen Erythrozyten richten und somit eine hämolytische Anämie induzieren. 5.6 Diagnose mittels Kriterien und Stadieneinteilung Um MGUS und Myelom in Hinblick auf eine Therapie voneinander abzugrenzen, wurden bereits 1975 [13] für das Myelom klare Diagnosekriterien von DURIE und SALMON aufgestellt, die später von DURIE [14] weiterentwickelt wurden: Hauptkriterien: 1. lasmazellanteil im Knochenmark > 30 % 2. Histologisch gesicherter Myelomnachweis ossär oder extraskeletal 3. M-Gradient in der Serumelektrophorese mit c(igg) > 35 g/l, c(iga) > 20 g/l oder ENCE-JONES- rotein > 1 g/24 h Nebenkriterien: 4. Knochenmarkinfiltration mit 10-30 % lasmazellen 5. Monoklonale Immunglobuline im Serum und/oder ENCE-JONES-roteine im Harn, jedoch unter den in den Hauptkriterien genannten Grenzwerten (siehe unter 3.) 6. Osteolyse 7. Sekundärer Antikörpermangel Gesicherte Diagnose: 1 Hauptkriterium + 1 Nebenkriterium oder 3 Nebenkriterien, wobei 4. und 5. inkludiert sein müssen.
Seite 9 E R I C H T 6 8 Stadium Tumorzellmasse Kriterien c(hb) > 100 g/l Calciumkonzentration im Serum normal Radiologisch normales Skelett oder nur ein solitäres im Knochen lokalisiertes lasmozytom I Geringe monoklonale Immunglobulinkonzentrationen < 0,6 x 10 12 Zellen/m 2 IgG < 50 g/l IgA < 30 g/l Ausscheidung leichter Ketten im Harn < 4 g/24 h Tabelle 4 Stadieneinteilung des Multiplen Myeloms nach DURIE und SALMON [13]. II Weder zu Stadium I noch zu Stadium III passend c(hb) < 85 g/l Calciumkonzentration im Serum erhöht Fortgeschrittene osteolytische Knochenveränderungen III Hohe monoklonale Immunglobulinkonzentrationen > 1,2 x 10 12 Zellen/m 2 IgG > 70 g/l IgA > 50 g/l Ausscheidung leichter Ketten im Harn > 12 g/24 h Zusatz A: normale Nierenfunktion Zusatz : eingeschränkte Nierenfunktion 6 Labordiagnostik 6.1 roteindiagnostik in Stufen Geringe Wahrscheinlichkeit für monoklonale Gammopathie Immunfixation Serum/24 h-harn Leichtketten Kein M-Gradient Hochauflösende Elektrophorese (Agarosegel) Hohe Wahrscheinlichkeit für monoklonale Gammopathie Immunfixation Serum/24 h-harn IgG/A/M/D/E und Leichtketten M-rotein > 1,5 g/l Immunfixation 24 h-harn Turbidimetrie IgG/A/M Serum M-Gradient Abbildung 7 Übersicht für die Stufendiagnostik der roteinanalytik bei monoklonaler Gammopathie [15]. Die Elektrophorese fungiert hierbei als Suchtest, die Immunfixation dient der Differenzierung und estätigung. Als M-Gradient (von monoklonal) wird ein schmalbasiges Kurvenmaximum im Densitogramm verstanden. positiv Immunfixation IgG/A/M/D/E Immunfixation IgG/A/M und Leichtketten Immunfixation IgD, IgE, falls notwendig negativ Artefaktsuche Gespräch mit Kliniker
E R I C H T 6 8 Seite 10 6.1.1 Die Serumprotein-Elektrophorese als Suchtest Die hochauflösende Agarosegel-Elektrophorese gilt als Suchtest bei Verdacht auf eine monoklonale Gammopathie [16]. Ihre eurteilung erfordert Erfahrung und sollte unbedingt visuell vorgenommen werden, da die Interpretation des Gelmusters bei niedrigkonzentrierten M-Komponenten sensitiver als das maschinell erstellte Densitogramm ist [16, 17]! Auch die Differenzialdiagnostik gegenüber dem nephrotischen Syndrom, Anämien, Fibrinogenverunreinigungen und auch polyklonalen Gamma- Globulinvermehrungen kann mitunter schwierig sein [18]. Siehe hierzu auch bioscientia Labor Aktuell von JANSEN aus dem Jahr 2001 [19]. Zu- oder Abnahmen der Myelomproteinkonzentration im Serum ermöglichen, von wenigen Ausnahmen einmal abgesehen, Rückschlüsse auf Tumorzellmassenänderungen. Die Konzentration des M-roteins ist somit als Verlaufsanalyt für monoklonale Gammopathien geeignet. Sie wird aus der Gesamtproteinkonzentration und der planimetrischen Ausmessung (die Integration des Gradienten erfolgt heute elektronisch am Serumprotein-Elektrophoresegerät) des M-Gradienten (das polyklonale Grundrauschen muss, falls noch vorhanden, dabei abgezogen werden!) in der Serumprotein-Elektrophorese [10] ermittelt. Die so berechnete Fläche wird dann ins Verhältnis mit der Gesamtfläche des Kurvenzugs, die wiederum die Summe aller Serumproteine repräsentiert, gesetzt: c (M-rotein) = c (Gesamtprotein) Fläche des M-Gradienten Gesamtfläche der Densitogrammkurve Die so definierte Konzentration c des M-roteins wird dann in g/l ausgewiesen. Abbildung 8 Serumprotein-Elektrophorese bei Multiplem Myelom. Man findet einen schmalbasigen Gipfel, den so genannten M-eak oder M-Gradienten (von monoklonal oder Multiplem Myelom) in der γ-fraktion. Er entsteht durch die dominierende Immunglobulinsynthese desjenigen malignen lasmazellklons, der die physiologische Antikörperproduktion der gesunden Zellen (siehe rechter Teil der γ-fraktion) verdrängt. ei ENCE-JONES-Myelomen kann aufgrund der schnellen Eliminierung der freien Leichtketten (M r = 22.000, also frei filtrierbar) über die Nieren ein M-Gradient fehlen. Es kann bei gleichzeitiger Knochenmarksdepression sogar eine Hypogammaglobulinämie existieren! ENCE-JONES- roteine lassen sich dann aus dem 24 h-harn mittels hochauflösender Harnelektrophorese nachweisen. + 6.1.2 Immunfixation Die Immunfixation, bereits 1969 von ALER und JOHNSON beschrieben [20], hat die Immunelektrophorese, deren Anwendung nicht mehr empfohlen wird [16], praktisch völlig verdrängt. Mit einer Nachweisgrenze von bis zu 0,25 g/l gilt die Immunfixation gegenüber der hochauflösenden Elektrophorese als sensitiver [21]. Die Immunfixaton kann als zweistufiger rozess betrachtet werden (Abb. 9), bei dem einer elektrophoretischen Trennung der roteine im Agarosegel eine Immunpräzipitation in situ durch monospezifische Antisera schmalbasiger M-Gradient 1 2 (gegen die Schwer- bzw. Leichtketten) folgt. Nicht präzipiterte roteine werden durch Waschen und Abblotten des Gels entfernt. Immunpräzipitate müssen durch Färbung, z.. mit Säureviolett, sichtbar gemacht werden. Eine elektrophoretische ahn wird als Referenz für die ordnungsgemäße Trennung der roteine mitgeführt. Auf dieser ahn erfolgt im Gegensatz zum oben beschriebenen Fixationsprinzip keine Immunreaktion mit Antiseren, sondern eine Fixation der aufgetrennten roteine (nicht Immunkomplexe!) mittels Denaturierung und anschließender Färbung [22]. Á
Seite 11 E R I C H T 6 8 - + 1. Auftragen der atientenproben 2. Elektrophorese aller ahnen monoklonales rotein (ungefärbt) 1. Auftragen von spezifischen Antiseren gegen IgG/A/M sowie gegen die beiden Leichtkettenklassen 2. Inkubation 3. Waschen Abbildung 9 Arbeitsgang bei der Serumimmunfixation. Man beachte, dass die linke ahn ( SE ) lediglich eine Trennung mittels Serumprotein-Elektrophorese darstellt, d. h. hier erfolgt im Gegensatz zu den restlichen fünf ahnen keine Immunreaktion mit Antiseren. Die separierten roteine werden nach der Trennung nur gefärbt, wobei natürlich alle Serumproteine durch entsprechende anden dargestellt werden, während in den übrigen ahnen nur diejenigen anden visualisiert werden können, die das (spezifische) Antiserum erkennt und zu anfärbaren Immunkomplexen präzipitiert. Die Antiseren für Κ- und λ- Ketten detektieren übrigens sowohl gebundene als auch freie Leichtketten. 1. Färben 2. Interpretation ei der Immunfixation gehorcht die Immunpräzipitation der aufgetrennten Immunglobuline bzw. Leichtketten der HEIDELERGER-Kurve, d. h. bei Antigenüberschuss (wenn große Mengen monoklonalen roteins vorhanden sind) kommt es an der Stelle der erwarteten ande zu Auslöschphänomenen (rozonen-effekt), d. h. die ande wird nur andeutungsweise oder gar nicht mehr sichtbar. Dies ist bei der eurteilung von Immunfixationen, die durch erfahrene eurteiler erfolgen sollte, stets zu beachten. Die Immunfixation ist immer dann indiziert, wenn ein vermeintlicher oder tatsächlicher M-Gradient in der Serumprotein-Elektrophorese beobachtet wird. Sie ist aber auch bei fehlendem M-eak anzuwenden, wenn der Verdacht auf ein ENCE-JONES- oder auf ein seltenes IgD- oder IgE- Myelom nicht sicher ausgeräumt ist (Abb. 7). ei einer eindeutig polyklonalen Vermehrung der Immunglobuline in der Serumprotein-Elektrophorese sollte keine Immunfixation folgen. Eine einmal durchgeführte Immunfixation soll nicht wiederholt werden, es sei denn, dass sich das Elektrophoresemuster verschoben hat, ein neuer M-Gradient auftaucht oder aber eine estätigung für die komplette Remission nach Therapie erforderlich ist [16]. Mit der Immunfixation ist es auch möglich Kryoglobuline zu charakterisieren. Das zu untersuchende Serum darf während des Transports vom atienten zum Labor auf gar keinen Fall eine Temperatur von 37 C unterschreiten! Um dies zu gewährleisten, wird die robe in einem entsprechend temperierten Thermogefäß transportiert. Es wird
E R I C H T 6 8 Seite 12 im Labor bei 37 C zentrifugiert, dann der Überstand abgehoben, dieser über mehrere (bis 7) Tage kryopräzipitiert (Kühlschrank, Eisbad), gereinigt und dann der Immunfixation zugeführt. 6.1.3 Nephelometrie und Turbidimetrie Um den Umfang der noch vorhandenen Konzentration physiologischer Immunglobuline und damit eine Säule der Immunabwehr einschätzen zu können, sollte bei atienten mit monoklonaler Gammopathie stets eine Messung der Ig-Konzentrationen vorgenommen werden. Diese wird in der Regel durch Turbidimetrie oder Nephelometrie erfolgen. Zur Messung des M-rotein-Konzentration (6.1.1) eignen sich beide Methoden nicht, da Antikörper und Kalibratoren für das Spektrum normaler Immunglobuline entwickelt wurden, nicht jedoch für monoklonale Immunglobuline, deren antigene Determinanten häufig von denjenigen physiologischer Immunglobuline abweichen. Dabei kann es dann zur Über- oder Unterschätzung der eigentlichen M-rotein-Konzentration kommen [16, 17]. 6.1.4 ENCE-JONES-roteine und ihre Diagnostik Aufgrund ihrer Nierengängigkeit (relative Molekülmasse M r = 22.000) lassen sich monoklonale Leichtketten im Harn nachweisen, sobald die tubuläre Rückresorptionskapazität erschöpft ist. Freie Leichtketten besitzen die Tendenz, mit sich selbst indungen einzugehen, wobei Dimere (Abb. 10) oder in seltenen Fällen auch Oligomere (z.. Tetramere) entstehen können. ei allen atienten mit einer monoklonalen Gammopathie sollte initial eine Immunfixation und eine Elektrophorese aus 24 h-harn erfolgen, der zuvor aufkonzentriert wurde (Faktor 100-150) [23]. esteht auch nur ein Verdacht auf ein Multiples Myelom, einen M. WALDEN- STRÖM, eine primäre Amyloidose oder Schwerkettenerkrankungen, so ist ebenfalls gleichermaßen vorzugehen. Dies gilt auch, wenn in der Serumprotein-Elektrophorese kein M-Gradient oder sogar eine Hypogammaglobulinämie zu beobachten ist (Nierengängigkeit von Leichtketten!) sowie bei negativem roteinfeld im Harn-Teststreifen [15] (sie zeigen ENCE-JONES-roteine nicht an!). Die estimmung der M-rotein-Konzentration im Harn erfolgt analog derjenigen im Serum (siehe Gleichung in 6.1.1), wobei ihr jetzt natürlich eine Harnprotein-Elektrophorese und eine Gesamtproteinbestimmung im 24 h-harn zugrunde liegen muss. Leichtketten sind nephrotoxisch, daher ist eine Kontrolle der Nierenfunktion bei Verdacht auf monoklonale Gammopathie unumgänglich [24], zumal eine Nierenschädigung mit einer schlechteren rognose korreliert. Neben der Creatininbestimmung im Serum, der Ermittlung der Creatinin-Clearance, und der quantitativen Erfassung der Harnproteine mittels Nephelometrie/Turbidimetrie ist die SDS-olyacrylamidgel-Elelektrophorese (SDS- AGE) des Harns ein probates Mittel, um eine roteinurie qualitativ zu erfassen (Abb. 10). Anhand der roteinmuster kann auch entschieden werden, ob einerseits eine glomeruläre und/oder tubuläre, andererseits ob eine selektive (Ausscheidung von Albumin, keine Ausscheidung von Immunglobulinen) oder unselektive roteinurie (mit Ausscheidung von Immunglobulinen) vorliegt. Alternativ zur olyacrylamidgel-elelektrophorese kann ein Agarosegel genutzt werden (SDS-AGE). Die SDS-AGE-Methode hat bei einer der Harnimmunfixation ähnlichen Sensitivität für ENCE-JONES-roteine von 97 % den Vorteil, dass eine Aufkonzentrierung des Harns vor der elektrophoretischen Trennung entfällt [25]. Abbildung 10 Da das roteinfeld des Teststreifens ( Harnstatus ) freie Leichtketten eines Multiplem Myeloms nicht erfasst, sind andere Methoden der Detektion von ENCE-JONES-roteinen notwendig. Die SDS-olyacrylamidgel-Elektrophorese erlaubt den qualitativen Nachweis der freien Leichtketten, die mitunter als Dimere oder sogar in seltenen Fällen als Tetramere auftreten können. Die Abbildung zeigt die relative Lage der anden zum Albumin bzw. Transferrin, wobei eine genaue Maßstabstreue hier jedoch nicht gegeben ist. - + Marker, roteine mit bekannter relativer Molekülmasse 150.000 100.000 75.000 50.000 35.000 15.000 Selektive glomeruläre roteinurie 80.000 Transferrin 69.000 Albumin 22.000 J 44.000 Monomer des ENCE-JONES- roteins (freie Leichtketten) J-Dimer 22.000 J Multiples Myelom V L leichte Kette H 3 N + COO - C L
Seite 13 E R I C H T 6 8 6.2 Empfehlungen zur Verlaufsanalytik Ein einmal detektiertes M-rotein sollte bei behandelten atienten mit Multiplem Myelom, M. WALDEN- STRÖM, Schwerkettenkrankheit oder primärer Amyloidose mittels hochauflösender Elektrophorese im Serum und/oder Harn alle 1 bis 2 Monate kontrolliert werden. atienten mit MGUS werden in Intervallen von 1 Jahr auf die gleiche Weise beobachtet [16]. Wichtig für die Verlaufsbeurteilung sind neben der roteinanalytik [9]: Calcium (Hypercalcämie) lutbild (Anämie, Thrombozytenaggregation, lasmazell-leukämie) Eisen, Transferrin, Ferritin, Erythropoetin (Anämie, Eisenmangel) CR (Infektion, rognosefaktor) Harnstatus/Harnsediment, Creatinin im Serum und Creatinin-Clearance (Nierenschädigung) Gerinnungsstatus (Thrombozytenaggregationsstörung, Komplexbildung mit Faktoren) 2 -Mikroglobulin (rognosefaktor, siehe 6.2) ggf. Harn- und lutkultur (Infektionen) ggf. virologische Diagnostik (Infektionen) 6.2.1 2 -Mikroglobulin Das 2 -Mikroglobulin ist als Leichtkettenbestandteil des HLA-Klasse-I-Antigens (MHC I) auf den Zellmembranen aller kernhaltigen Zellen nachweisbar. Aufgrund seiner relativen Molekülmasse von 11.800 wird es glomerulär frei filtriert und tubulär resorbiert. Erhöhte Serumkonzentrationen werden daher auch bei Niereninsuffizienz gemessen, jedoch besitzt 2 -Mikroglobulin daneben unabhängig von einer bestehenden Nierenfunktionseinschränkung prognostische Signifikanz. Die Serumkonzentration repräsentiert eine Gleichgewichtseinstellung zwischen Ausscheidungs- und ildungsrate [4]. Sie liegt bei 0,8-2,4 mg/l, ist unabhängig von Geschlecht und Gewicht und steigt mit dem Alter an (über 60 a gilt ein Referenzbereich von 3,0 mg/l). ei allen Erkrankungen, die von einer Aktivierung des Immunsystems begleitet werden, ist die Konzentration des 2 -Mikroglobulins erhöht. Hauptsyntheseort sind Lymphozyten. Daraus ergibt sich, dass auch bei viralen und bakteriellen Infektionen sowie Autoimmunerkrankungen (z.. rheumatoide Arthritis) mit pathologischen Werten zu rechnen ist. 2 -Mikroglobulin ist in Hinblick auf das Multiple Myelom ein Indikator für die Tumorlast und gilt als wichtiger rognosefaktor, der unabhängig von der Immunglobulinkonzentration bewertet werden kann. 2 -Mikroglobulin-Konzentration Mittlere Überlebenszeit < 3 mg/l 64 Monate 3 5 mg/l 29 Monate Tabelle 5 2 -Mikroglobulin- Konzentration als rognosefaktor und mittlere Überlebenszeit. > 5 mg/l 11 Monate
E R I C H T 6 8 Seite 14 Die folgende Tabelle zeigt weitere rognosefaktoren für das Multiple Myelom auf, wobei hier der Schwerpunkt auf labomedizinisch relevante arameter gelegt wurde. Nicht erwähnt ist daher der prognostisch wichtige lasmazell-labeling-index (CLI), der den prozentualen Anteil der Myelomzellen in der S-hase (also DNA-Synthesephase) des Zellzyklus wiedergibt. Seine estimmung erfolgt mittels 3 H-Thymidin- oder romodeoxyuridin-einbau. Sie wird routinemäßig nicht durchgeführt. Ein CLI > 1 % gilt als prognostisch ungünstig. Tabelle 6 rognosefaktoren beim Multiplen Myelom. rognosefaktor Lebenserwartung länger Lebenserwartung kürzer Allgemeinzustand gut schlecht Tumorzellmorphologie gut differenziert schlecht differenziert c(hämoglobin) in g/l > 100 < 100 Thrombozytenzahl in G/l > 150 < 150 c(calcium) in mmol/l < 2,60 > 2,60 c(creatinin) in mol/l < 120 > 120 c(albumin) in g/l > 37 < 37 ENCE-JONES-rotein nein ja Tumorzellmasse in 10 12 Zellen/m 2 < 1,20 > 1,20 Knochenmarkinfiltration in % < 50 > 50 CR normal erhöht LDH normal erhöht
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E R I C H T 6 8 Seite 16 Regionallabors Labor erlin Grabbeallee 34 13156 erlin Telefon (0 30) 48 52 60 Telefax (0 30) 48 52 6111 Labor Frankfurt im ürgerhospital Frankfurt e. V. Nibelungenallee 37-41 60318 Frankfurt am Main Telefon (0 69) 9 71 25 30 Telefax (0 69) 9712 53 10 Labor Hamburg apenreye 63 22453 Hamburg Telefon (0 40) 55 78 10 Telefax (0 40) 5 57 81 25 Labor Ingelheim Konrad-Adenauer-Straße 17 55218 Ingelheim Telefon (0 61 32) 78 10 Telefax (0 61 32) 78 12 14 Labor Jena Orlaweg 2 07743 Jena Telefon (0 36 41) 4 01 30 Telefax (0 36 41) 4013 33 Labor Kaiserslautern Maxstraße 7 67655 Kaiserslautern Telefon (06 31) 4147 00 Telefax (06 31) 4147 01 Labor Karlsfeld Liebigstraße 14 85757 Karlsfeld Telefon (0 8131) 59 40 Telefax (0 8131) 5 9 41 09 Labor Mainz ahnhofplatz 2 55116 Mainz Telefon (0 61 31) 5 76 0810 Telefax (0 61 31) 2115 03 Labor Moers Zum Schürmannsgraben 30 47441 Moers Telefon (0 28 41) 10 60 Telefax (0 28 41) 10618/35 Labor Wermsdorf Sachsendorfer Straße 15 O4779 Wermsdorf Telefon (03 43 64) 8 8612/13 Telefax (03 43 64) 8 8614/25 Labor Wiesbaden Aukammallee 33 65191 Wiesbaden Telefon (0611) 4 47 8710 Telefax (0611) 4 47 8720 Herausgeber: bioscientia Institut für Laboruntersuchungen Ingelheim Verantwortlich: rof. Dr. med. ernd Heicke, D Dr. med. Jochen Decker Autor: Dr. med. Dipl.-iochem. Markus Linnemann Facharzt für Laboratoriumsmedizin im ürgerhospital Frankfurt Nibelungenallee 37 41 60318 Frankfurt am Main Redaktionsassistenz: Nadja Franzen