Phytochemisches Screening der Blüten von Aloe vera (L.) BURM. f. (Aloe barbadensis MILL.) und Bestimmung ihrer antioxidativen Kapazität DISSERTATION zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades des Departments Chemie der Universität Hamburg vorgelegt von Shirin Keyhanian aus Hamburg Hamburg 2008
1. Gutachterin: Prof. Dr. Elisabeth Stahl-Biskup 2. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard Lieberei Tag der Disputation: 04.07.2008
Berichte aus der Pharmazie Shirin Keyhanian Phytochemisches Screening der Blüten von Aloe vera (L.) BURM. f. (Aloe barbadensis MILL.) und Bestimmung ihrer antioxidativen Kapazität Shaker Verlag Aachen 2008
Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar. Zugl.: Hamburg, Univ., Diss., 2008 Copyright Shaker Verlag 2008 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN 978-3-8322-7486-3 ISSN 0945-0939 Shaker Verlag GmbH Postfach 101818 52018 Aachen Telefon: 02407 / 95 96-0 Telefax: 02407 / 95 96-9 Internet: www.shaker.de E-Mail: info@shaker.de
Aloe-vera-Blüten; Foto: Santaverde Gesellschaft für Naturprodukte mbh
DANKSAGUNG Diese Arbeit entstand unter der Anleitung von Frau Prof. Dr. Elisabeth Stahl-Biskup. Meiner Doktormutter möchte ich ganz herzlich für die hervorragende Betreuung dieser Arbeit, für die vielen wertvollen Diskussionen und ihren unermüdlichen und engagierten Einsatz danken. Des Weiteren gilt mein Dank Frau Sabine Beer und Herrn Kurt Beer (Santaverde Gesellschaft für Naturprodukte mbh) für die freundliche Bereitstellung der Aloe-vera-Blüten, des Bildmaterials und für die Möglichkeit, die Aloe-vera-Plantage in Andalusien (Spanien) besuchen zu dürfen sowie für ihr fortwährendes Interesse an dieser Arbeit. Meinem Mitdoktoranden Herrn Dr. Michael Heldmaier danke ich ganz herzlich für das angenehme Arbeitsklima, für wertvolle fachliche Diskussionen sowie für seine freundschaftliche Unterstützung während dieser Promotion. Herrn Prof. Dr. Reinhard Lieberei, Biozentrum Klein Flottbek, Abteilung für Pflanzenökologie und Nutzpflanzenbiologie, danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens. Den Arbeitskreisen von Herrn Prof. Dr. D. Geffken, Prof. Dr. B. Meyer und Prof. Dr. Dr. h. c. mult. W. Francke sowie der Eurofins Analytik GmbH danke ich für die Unterstützung bei der Aufnahme der LC-MS-Spektren und IR-Spektren, Herrn M. Preuße für die Aufnahme der GC-MS-Spektren, Herrn Dr. V. Sinnwell für die Aufnahme der NMR-Spektren und Herrn Priv.-Doz. Dr. W. Schultze für die freundliche Bereitstellung der semi-präparativen HPLC- Anlage. Der Abteilung Lebensmittelchemie möchte ich für die Möglichkeit danken, am Fluorimeter Messungen durchgeführt haben zu können. Dem Arbeitskreis von Prof. Dr.-Ing. W.- M. Kulicke danke ich für die freundliche Bereitstellung der Gefriertrocknungsanlage. Bei Herrn K. Haacker bedanke ich mich für die technische Assistenz. Allen Wahlpflichtpraktikanten danke ich für ihr Interesse an diesem Thema und ihren Einsatz während des Praktikums. Bei allen Mitarbeitern des Instituts, vor allem bei Frau Sabine Badziong, sowie bei allen Doktoranden der benachbarten Arbeitskreise, besonders den Doktoranden des Arbeitskreises Heisig, möchte ich mich sehr herzlich für die freundliche und hilfsbereite Atmosphäre bedanken. Frau Dr. Cimin Keyhanian, Herrn Dr. Benjamin Wenzke und Herrn Dr. Björn Timmerbeil danke ich für das Korrekturlesen dieser Arbeit. Zu guter Letzt gilt mein besonderer Dank meiner Familie und meinen Freunden, die mich während der Promotion begleitet und stets moralisch unterstützt haben.
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AAPH 2,2 -Azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid Abb. Abbildung ABTS 2,2 -Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) antiox. antioxidativ AUC Area under the Curve bspw. beispielsweise CAM Crassulacean Acid Metabolism COSY Correlated Spectroscopy CV Coefficient of Variation (Verfahrensvariationskoeffizient) DAD Dioden-Array-Detektor DC Dünnschichtchromatographie dem. demineralisiert DEV nativ d.h. EI engl. ESI et al. etc. EU EWG FD FDA FID FL FSME GC h HAT HMBC HPLC Hrsg. HSQC Droge-Extrakt-Verhältnis das heißt Electron Impact (Ionisation) Englisch Electrospray Ionisation et alii (und andere) et cetera Europäische Union Europäische Wirtschaftsgemeinschaft Freeze-dried (gefriergetrocknet) Food and Drug Administration Flammenionisations-Detektor Fluorescein-Natrium Fettsäuremethylester Gaschromatographie Stunde Hydrogen Atom Transfer(-Mechanismus) Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Performance Liquid Chromatography (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) Herausgeber Heteronuclear Single Quantum Coherence i. d. Internal diameter (innerer Durchmesser) INCI International Nomenclature of Cosmetic Ingredients IR Infrarot Konz. Konzentration LC Liquid Chromatography (Flüssigchromatographie) Me Methyl-Gruppe min Minuten I
MS Massenspektrometrie NG Nachweisgrenze NMR Nuclear Magnetic Resonance (Spektroskopie) Nr. Nummer ORAC Oxygen Radical Absorbance Capacity OTC Over-the-counter-(Präparat) p-hb p-hydroxybenzoesäure Ph. Eur. Pharmacopoea Europaea (Europäisches Arzneibuch) PMMA Polymethylmethacrylat PS Polystyrol Ref. Referenzlösung rel. Relativ Rf Retentionsfaktor RMCD Randomly Methylated -Cyclodextrin ROS Reactive Oxygen Species (reaktive Sauerstoffverbindungen) RP Reversed Phase (Umkehrphase) rpm Revolutions per Minute (Umdrehungen pro Minute) Rt Retentionszeit S. Seite SET Single Electron Transfer(-Mechanismus) sh shoulder (Schulter im UV-Spektrum) SPE Solid Phase Extraction (Festphasenextraktion) Stabw. Standardabweichung syn. synonym Tab. Tabelle TE Trolox Equivalent (Trolox-Äquivalent) TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity tbme tert-butylmethylether TLC Thin Layer Chromatography TMS Trimethylsilyl TMSO Trimethylsilylether-Rest TMSOH Trimethylsilanol TS Trockenschrank u. a. unter anderem Unt. Untersuchungslösung usw. und so weiter u. U. unter Umständen UV Ultraviolett UV/VIS Ultraviolet/Visible Vol.-% Volumen-Prozent WD Wasserdampf WHO World Health Organisation II
INHALTSVERZEICHNIS A. ZIEL DER ARBEIT...1 B. EINLEITUNG...5 1. ALOE ALS NUTZPFLANZE...6 1.1 Verbreitung und botanische Beschreibung...6 1.2 Aloe in der Pharmazie...8 1.3 Aloe-vera-Gel...12 1.3.1 Inhaltsstoffe...13 1.3.2 Analytik...14 1.3.3 Wirkungen...14 2. ALOE-BLÜTEN...18 2.1 Aloe-Blüten in der wissenschaftlichen Literatur...18 2.2 Die Blüten von Aloe vera dieser Arbeit...23 3. UNTERSUCHTE STOFFKLASSEN...24 3.1 Phenolcarbonsäuren und ihre Ester (C6-C3-Verbindungen)...24 3.2 Hydroxybenzoesäure-Derivate (C6-C1-Verbindungen)...25 3.3 Flavonoide...25 3.4 Fettsäuren...26 3.5 Sterole, Triterpene und Tocopherole...27 3.6 Carotinoide...29 3.7 Wasserdampfflüchtige Inhaltsstoffe...31 3.8 Saponine...31 3.9 Alkaloide...32 3.10 Anthranoide...33 4. ANTIOXIDATIVE KAPAZITÄT...34 C. ERGEBNISSE...39 1. EXTRAKTIONSSCHEMA...40 2. PHENOLCARBONSÄUREN UND IHRE ESTER (C6-C3-Verbindungen)...43 2.1 Identifizierte Strukturen...43 2.2 DC...44 2.3 HPLC...46 2.4 Identifizierung der 5-Caffeoylshikimisäure...53 3. FLAVONOIDE...55 3.1 Identifizierte Strukturen...55 3.2 Identifizierung von Isoorientin und Isovitexin in Extrakt A...56 3.2.1 DC...56 3.2.2 HPLC...57 3.3 Zusammenfassung der analytischen Daten der Substanzen in Extrakt A...61 3.4 Flavon- bzw. Flavonol-Aglykone in Extrakt B...62 3.4.1 DC...62 III
3.4.2 HPLC...63 3.5 Identifizierung von Isoorientin-7-O-glucosid (Lutonarin), Isovitexin-7-O-glucosid (Saponarin) und Isovitexin-2 -O-glucosid in Extrakt C...65 3.5.1 DC...65 3.5.2 HPLC...66 4. HYDROXYBENZOESÄURE-DERIVATE (C6-C1-VERBINDUNGEN) UND ZIMTSÄURE.71 4.1 DC...71 4.2 HPLC...72 5. FETTSÄUREN...73 5.1 Identifizierte Strukturen...73 5.2 GC...73 6. STEROLE, TRITERPENE UND ANDERE LIPOPHILE KOMPONENTEN...75 6.1 Identifizierte Strukturen...75 6.2 GC...76 7. CAROTINOIDE...80 7.1 Identifizierte Strukturen...80 7.2 DC...80 7.3 HPLC...81 8. WASSERDAMPFFLÜCHTIGE INHALTSSTOFFE...87 8.1 Identifizierte Strukturen...87 8.2 DC...87 8.3 GC...88 9. SAPONINE...94 10. ALKALOIDE...94 11. ANTHRANOIDE...95 11.1 Identifizierte Strukturen...95 11.2 Identifizierung von Aloeresin B und Aloeemodin in Extrakt D...97 11.2.1 DC...97 11.2.2 HPLC...98 12. ISOLIERUNG UNBEKANNTER ANTHRANOIDE...103 12.1 Isolierung von Anthranoid 1 und Anthranoid 2...106 12.2 MS-Analyse von Anthranoid 1 und Anthranoid 2...108 12.3 IR-Spektroskopie von Anthranoid 1 und Anthranoid 2...108 13. QUANTITATIVE BETRACHTUNGEN...114 13.1 Polyphenole...114 13.2 Flavonoide...114 13.3 Droge-Extrakt-Verhältnis (DEV nativ )...115 13.4 Anthranoide...116 13.5 Sterole und Triterpene...117 13.6 Carotinoide...117 14. ANTIOXIDATIVE KAPAZITÄT...118 14.1 Hydrophile antioxidative Kapazität...118 14.2 Lipophile antioxidative Kapazität...120 IV
D. DISKUSSION...121 E. MATERIAL UND METHODEN...133 1. PFLANZENMATERIAL...134 1.1 Aloe-vera-Blüten...134 1.2 Weiteres Pflanzenmaterial...134 2. INSTRUMENTELLE ANALYTIK...135 2.1 HPLC...135 2.2 GC...137 2.3 Optische Geräte...138 2.4 EI-MS (Electron Impact Mass Spectrometry)...138 2.5 Sonstige Laborgeräte...138 3. BERECHNUNG DER ABGESCHÄTZTEN NACHWEISGRENZE...138 4. ANALYTIK DER STOFFKLASSEN...139 4.1 Phenolcarbonsäuren und ihre Ester (C6-C3-Verbindungen) sowie Flavonoide...139 4.1.1 Extraktion der Aloe-vera-Blüten...139 4.1.2 Extraktion der Referenzsubstanzen...139 4.1.3 Hydrolyse der Flavonoidglykoside...139 4.1.4 DC...140 4.1.5. HPLC...141 4.1.6 Identifizierung der fluoreszierenden Zone unterhalb der Kaffeesäure...143 4.1.7 Isolierung der 5-p-cis-Cumaroylchinasäure aus Aloe-vera-Blüten...144 4.1.8 Gehaltsbestimmung der Flavonoide...144 4.2 Hydroxybenzoesäure-Derivate (C6-C1-Verbindungen), Zimt- und Rosmarinsäure...144 4.2.1 Extraktion...144 4.2.2 DC...145 4.2.3 HPLC...145 4.3 Fettsäuren...145 4.4. Sterole, Triterpene und andere lipophile Komponenten...146 4.4.1 Extraktion...146 4.4.2 GC...146 4.4.3 Quantifizierung der Sterole...147 4.5 Carotinoide...147 4.5.1 Isolierung von Lutein aus Tagetes erecta-oleoresin...147 4.5.2 Aufreinigung des Tagetes erecta-oleoresins zur Verwendung für die HPLC.147 4.5.3 Isolierung von Zeaxanthin aus orangen Physalis-Kelchblättern...147 4.5.4 Extraktion...148 4.5.5 DC...148 4.5.6 HPLC...148 4.5.7 Quantifizierung der Carotinoide...149 4.6 Wasserdampfflüchtige Inhaltsstoffe...149 4.6.1 Destillation...149 V
4.6.2 DC...150 4.6.3 GC...150 4.7 Saponine...150 4.8 Alkaloide...150 4.9 Anthranoide...151 4.9.1 Extraktion...151 4.9.2 DC...151 4.9.3 HPLC...151 4.9.4 Quantifizierung der Anthranoide...152 4.10 Isolierung unbekannter Anthranoide ( Anthranoid 1 und Anthranoid 2 )...152 5. BESTIMMUNG DES TROCKNUNGSVERLUSTES...153 6. BESTIMMUNG DES DROGE-EXTRAKT-VERHÄLTNISSES (DEV nativ )...153 7. QUANTIFIZIERUNG DER POLYPHENOLE...153 8. ANTIOXIDATIVE KAPAZITÄT...154 8.1 Trolox Equivalent Antioxidative Capacity (TEAC)-Test...154 8.1.1 Hydrophile antioxidative Kapazität...154 8.1.2 Lipophile antioxidative Kapazität...154 8.2 Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)-Test...155 8.2.1 Hydrophile antioxidative Kapazität...155 8.2.2 Lipophile antioxidative Kapazität...155 F. ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY...157 G. ANHANG...163 H. LITERATURVERZEICHNIS...215 VI