Semmelweis Universität Institute für Medizinische Mikrobiologie Allgemeine Virologie Dr. Béla Kocsis kocsis.bela@med.semmelweis-univ.hu 2014.11.10.
Virus Ein Virus ist ein mindestens aus Proteinen und Nukleinsäure zusammengesetztes Partikel, mit der Größe zwischen 20-400 nm. sichtbar in Elektronenmikroskop Größe: 20 nm: Parvovirus 400 nm: Poxvirus Die Viren brauchen ein Wirtzell und bindene zu mit specifisch Rezeptor auf der Oberfläche sie können in dem Zell überleben Virion: außer die Zellen infektive Agent Vegetativ Virus: in der Zellen, replikativ forma
Virus
Struktur - Nukleinsäure Nukleinsäure: DNA oder RNA einzelsträngig: RNA (zb.: Ebola) + RNA (zb: Flaviviren, HIV) doppelsträngig linear (zb: Herpes) zirkulär (zb: Hepatitis B) 8 segmentiertes RNA Genom zb: Influenza A Antigen Shift: zwei verschiedene Influenza Viren infizieren die gleich Zelle, wo sie die Segmenten tauschen können Antigen Drift: Punktmutation
Variabilität der Inlfuenza Viren Antigen Shift (Reassortment) zwei Influenza Viren mit verschiedene segmentierte Genom infizieren die gleich Zelle Segment umwechsel in der Zelle neue Reassortmente Viren (hybrid Viren)
Variabilität der Inlfuenza Viren
Struktur - Kapsid 1) helikale Symmetrie Tabakmosaikvirus 2) kubische Symmetrie Icosaeder Herpes virus Peplon: oberflaeche Antigen 3) Komplex: bakteriofag (helicale + icosaeder) Enzimen: für Replikation DNS polimeráz Nuklease Ligase
Helikale Symmetrie Nukleinsäure Protein Ebola
Kubische Viren Herpes Virus mit Hülle Herpes Virus ohne Hülle
Komplex Symmetrie Bakteriofagen
Hülle Einige Viren anziehen eine zelluläre Membran(Kern oder Zellmembran) um die Kapsid, wenn sie durch diese Strukturen frei werden Zellkodierte und virale Ag-e Hülle (Peplon) mit oberfläche Antigenen
DNS und RNS Virus Replikation Replikation der DNS Viren ist in Nukleus stattfinden. Virus DNS Molekülen in der Eukaryont Genom. Replikation der RNS Viren ist in Zytopasma stattfinden. auf der Ribosomen
Replikation Erkennung, Bindung an der CD4, CXCR4, CCR5 Corezeptoren Fusion, Penetration: GP41 Decapsidation Revers Transkription Die Integration in Wirts- DNA, Latenz Transkription: neue Genom-RNA, mrna Translation: neuer Proteine Versammlung Budding
Züchtung Lebendige zellen oder Tieren zb: in Neugeborene Maus Muskulatur infizieren wir die Viren zb: coxsackie A Virus, coxsackie B Virus führt zum Lähmung
Hühnerembrio für Influenza Influenza Viren sind in Eier für der Vakcina gezüchtet
Zellkulturen: Flüßigenährstoff Hela, Hep Zellen (Wirtzellen) Antibiotika (gegen die bakterielle Infektion) Vitaminen
Hühne Embrio Fibroblast Zellkulturen
Maus Fibroblast Zellkulturen
Niere Zellkultur
Zytopathogener Effekt (sichtbar in Lichtmikroskop) Konsequenzen einer viralen Infektion für die Wirtszelle 1) Zell Tod Degeneration Aggregation 2) Inklusion Körper in Zytoplasma oder in Zellkern 3) Syncytium: Riesezellen 4) Oberfläche Antigen veränderung Haemadsorption (haemagglutinin Expression)
a: Maus fibroblast Zelle b: Human fibroblast Zelle c: Hühne fibroblast Zelle
Zytopathogener Effekt (CPE) In nativen Lichtmikroskopischen Präparaten Abrunden und Loslösen der Zellen von ihrer Unterlage( Adenov., HSV, Rhinov.) Bildung von mehrkernigen Riesezellen (Syntitium)(Paramyxov., CMV) Tumortransformation (Polyomaviren)
Zytopathogener Effekt Zell degeneration, Zell Tod c Inklusion Körper in Zellkern Riese Zellen und Inklusion Körper in Zytoplasma
Zytopatische effekte(cpe) In gefärbten Präparaten Einschlußkörperchen Im Zellkern( HSV, Adeno) In der Zytoplasma (POX, Paramyxo, Rheo, Rhabdo) Überall(Morbilli, CMV
Diagnostik der Virusinfektionen Erreger Bestimmung Nachweis der Virus selbst Nachweis Virus Ag-en Nachweis Virus Nukleinsäure Serologische Reaktionen Nachweis der antivirus Antikörper
Ebola endemische Gebiete
Entnahme des Untersuchungsmaterials Von akuter Infektion Schnell, nach dem Vorkommen der klinische Symptomen die Menge der Viren sinken schnell Lokale Infektionen Abkratzung Ausscheidung von Nase, Rachen Systemische Erkrankungen Biopsie von Leber, Niere, Hirn Blut Von latenter Infektion Biopsie
Transport und Verarbeitung des Untersuchungsmaterials Transport in Virus Transport Medium Mit neutraler ph Proteinen,sacharose, AB,AF Auf 4 oder -70 C Verarbeitung Übrigens sterile Untersuchungsmaterialen Liquor, Blut direkte Züchtung Andere Untersuchungsmaterialen Bakterien und Heffe Filtrierung
Virusisolierung durch Anzüchten Versuchstier Säuglingsmäusen haben Muskelnekrose von Coxsackie A, Encephalitis von Coxsackie B Hühnerembryo ( 10 tage bebrütete Hühnerei ist immunologisch inaktiv) Auf der Chorioallantois Membrane POX, HSV In der Allantois und Amnionhöhle Influenza, Mumps In dem Embryo Gelbfieber In Zellkulturen Monolayer Zellkulturen sind an Objektträgerglas adhäriert Morphologische Veränderungen ( CPE)
Indirekt Virusnachweis Nach der Züchtung Ag Bestimmung mit IFA ELISA
Indirekt Virusnachweis Interferenz Auf Affenieren Zellkulturen züchten Rubeola Viren ohne CPE Auf dieser Zellkulturen die Echo Viren macht CPE Die früher geimpfte Rubeola Viren hemmen die CPE von Echo Viren
Schnell, direkt Virusnachweis Mikroskopische Nachweis des Untersuchungsmaterials Riesezellen in Abkratzung der Herpes, VZ Blasen Negri Körperchen in Hirnzellen in Rhabies (Tollwut) Bestimmung der Virus Ag-e IFA ELISA Western Blot Bestimmung der Virus Nukleinsaure Souden Blot Northen Blot PCR
Western blot technika
PCR Nested PCR RT PCR
Serologische Reaktionen Virusinfektion führt zu humoraler Immunität, die Ak Menge steigt an IgM ist Beweisend für das Vorliegen einer frischen Primärinfektion IgG bedeutet Immunität von einer früheren Erkrankung, vierfacher Titeransteig beweist die frische Infektion
Serologische Reaktionen Hemmung der Hämagglutination Hemmung der Hämadsorption IFA RIA ELISA
Serologie Haemagglutination: Influenza, Parainfluenza, Mumps Viren mit haemagglutinin Molekül bindene die Hühnererythrozyten Haemadsorption: Influenza, Parainfluenza, Mumps infizirte Wirtszellen bildene Haemaglutinin Moleküle auf der Oberfläche der Zelle, wo sie die Hühnererythrozyten binden können Virusinterferencia Infektion von Rubeola und Echo11 Viren zusammen in Affeniere Zellen machen kein Zytopathogener Effekt
Hemaglutination Indirekt Virusnachweis Die Ag-e der Influenza Viren kommen während der Züchtung in Amnion und Allantois Flüssigkeit vor Diese Ag-e bilden mit RBZ einen Netz Ohne Ag-e die RBZ setzen sich auf dem Boden der Rohr ab Haemagglutination Netzbildung: Negative Haemagglutination: die RBZ hinunter gehen
Zell-Virus Interaktion Heamagglutination: Virus Erythrozyta Interaktion Kontroll Virus Reiheverdünnung + gleich Anzahl Blutzellen dazu geben b Virus Haemagglutinations Titer Virus Haemagglutinatins Titer
Hemadsorption Indirekt Virusnachweis Auf der Oberfläche der Zellkulturen erscheinen die Ag-e der Viren, die in der Zellen leben Diese Ag-e kleiben RBZ auf der Oberfläche Die Reaktion ist mit Orthomyxo und Paramyxoviren +
Haemagglutination Hemmung (HAH) Während verdünnte Erythrozyten in einer Mikrotiterplatte normalerweise zu Boden sinken und eine knopfförmige Struktur bilden, nehmen Erythrozyten, die mit Influenzaviren vermischt werden, eine flächenförmige Form an Fügt man der Mischung aus Erythrozyten und Virus jedoch ein Serum mit virusspezifischen Antikörpern hinzu, wird diese Agglutination gehemmt und die Erythrozyten zeigen wieder die knopfförmige Struktur, die, wenn man die Mikrotiterplatte schräg hält, zu eine "Nase" ausläuft.
Haemagglutinationshemmtest (HAH) Antikörper Nahcweis a. Reiheverdünnung der Serum b. Virussuspensio zu geben c. inkubatio c. Erythrozyten Suspensio zu geben Haemagglutinationshemm titer der Serum : Am größten Verdünnung von Serum, wo die Hemmung noch zustande kommt positiv HAH: Erythrozyten vermehren unter spezifische Antikörper negativ HAH : Agglutination ohne spezifische Antikörper
a HAH b c Serologie für Virus Nachweis a: Hemagglutinationshemmtest: Serum Verdünnung + Virus + Blutzellen HAH titer untersuchung b: direkt IF (vírus antigen Nachweis) c: indirekt IF (Antikörper Nachweis)
Neutralisation: Die Antikörperen können die Zytopathogener Effekten der Viruen neutralizieren Virus Suspensio + Serum Inkubation beimpfung in Wirtszellen Inkubation Wirtszellen sichtbar mit Lichtmikroskop
Serologische Reaktionen ELISA IF
Antigen Nachweis a) protein direkt IF ELISA Latex-agglutination Komplement Bindung Test b) DNS, RNS Nachweis in situ hibridizáció Southern blot analysis Northern blot analysis PCR RT-PCR: reverse-transcriptase PCR RNA Viren (retroviren: zb.: HIV)
Antikörper Nachweis IgM primer infekció IgG chronicus infekció 4-mal titer Veraenderung Serumpaar
Andere serologische Methoden Komplement Bindung Test ELISA: HIV Test Western-blot: HIV positiv ELISA zu überprüfen
Schutzimpfungen gegenüber Virusinfektionen MMR: Mumps, Morbilli, Rubeol: lebendige attenuirte Viren (obligatorisch vorgeschrieben) IPV: inaktive Polyomyelitis Virus (Totimpfstoff) (obligatorisch vorgeschrieben) HBsAG: Oberfläche Antigen schützt gegen Hepatits B und Hepatitis D Viren (obligatorisch vorgeschrieben Rekombinant Schutzimpfung) Influenza: inaktivierte Viren (für Risikogruppe jeden Jahr) HAV: gegen Hepatitis A virus Totimpstoff (in Katastrophagebieten, Reisende in endemische Länder zb: India) HPV: Virus Kapsid antigen (wahlfrei, Totimpfstoff) Gelbfieber: Lebendimpfstoff (Reisende in endemische Länder zb: Zentr. Afrika) FSME: Totimpfstoff (wahlfrei, auch in Europa) Rotavirus: lebendige attenuirte Viren (für Risikogruppe) Tollwut Impfung für Menschen inaktive Lyssa Virus postexpositionelle Schutzimpfung Tollwut Impfung für Tieren lebendige attenuierte Viren per os präexpositionelle Impfung
Antivirale Chemotherapie Adsorption Hemmung: polisulfat, polisulfonat gegen HIV Moleküle bindene an der gp120 und hemmen die adsorption zu die CD4 Rezeptoren
Antivirale Chemotherapie Hemmung von Penetration und Dekapsidation: Amantadin gegen Influenza Virus Die Zielstruktur is M2 Matrix protein Amantadin Rimantadin
Antivirale Chemotherapie Nukleozid Analogen gegen Herpes Viren Acyclovir ist ein Guanozin analoge Subtrate für Timidinkinase des HSV1 DNA-Polymerase des HSV1 haben höher Affinität für dise Substrat führt zum inkompletten DNS Moleküle
Antivirale Chemotherapie Nukleozid Reverse Transkriptase Inhibitors Azidothymidin eine Thymidinanaloge in Elongation Phase die Nukleotid wird nicht gebildet Nicht Nukleozid Reverse Transkriptase Inhibitors: Delavirdin, Nevirapin : bindene nicht in der Bindungstelle, binden an der RT und entsteh ein Komplex hemmt die Elongation
Antivirale Chemotherapie Ribavirin: Guanozin Nukelozid Analog Wirksam gegenüber RNA Viren: HIV, HAV, Guanylyltranferase Hemmung
Antivirale Chemotherapie Protease Inhibitor: Indinavir gegenüber HIV, Die posttranslationale Herstellung ist hemmt. Oseltamivir: hemmen die virale Neuraminidase oberfläche Antigene Interferon α: in persistierte HBV, HCV Infektionen
Pox viren 1) Morfologie Am größten Viren: 400 nm ds DNA Nukleokapsid:,,brick shaped oder Ovale Kapsid Peplon auf der Oberfläche
Pox viren 2) Züchtung Eier der Hühne 3) Serologie: IF, ELISA, Haemagglutinations Hemmung
4) Klinik: Pocken Pox viren Übertragung mit Tröpfchen Infektion oder mit direkt Kontakt Atemweg Viraemia Haut lesionen macule papule vesicula pustula Überalle dem Körper Vesicula und Blutung
Pocken
Pox viren Diagnosis: Virus Nachweis aus Vesiculen Züchtung in Eier Serologische Nachweis IF, ELISA, Haemagglutinations Hemmung
Hörnchenpox Affenpoxvirus
Pox viren Schutzimpfung: 1796 E. Jenner Lebendige Attenuirte Virus (Vacciniavirus) intrakutane Immunisierung In 1980 die Welt ist frei von Human Pox virus Pox viren kommen wie Biologische Waffen vor. Mutation in Affenpoxvirus führt zum Human Erkrankung? Klimaveränderung hielft neue Pockenerkrankungen zu vorkommen. Die frostige Kirchhofen in Siberia sich abschmelzen, in frostige Poxinfizierte Leichname können die Pox Viren vorkommen. (Viren können auch im Frostigenland überleben)