F-I Molekulare Zoologie: Teil I: Expressionsanalysen Expressionsanalyse mittels RT-PCR Inhalt: Seite I. Generelles 1 II. RNA-Aufreinigung mit EZNA Total RNA Kit (PeqLab)...2 III. Umschreiben von RNA in cdna mit M-MLV RT (Promega oder PeqLab).3 IV. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)...4 V. Kontrolle der RT-PCR via Agarose-Gel-Elektrophorese 7 I. Generelles Bei den folgenden Experimenten wird mit RNA gearbeitet. Da diese sehr schnell zerfällt bzw. von überall gegenwärtigen RNasen (an der Haut) verdaut wird, sollten folgende Arbeitsmaßnahmen berücksichtigt werden: o Während der Arbeiten immer Handschuhe tragen, sich nicht mit diesen durch die Haare streichen usw. Für Arbeiten mit Ethidium Bromid die Nitril-Handschuhe verwenden. o Gestopfte Spitzen für Pipetten verwenden. o Möglichst alles auf Eis aufbewahren, um etwaige RNase Aktivität zu hemmen. o Um die Enzyme (Taq, RNase Inhibitor, M-MLV RT) zu schonen, diese aus dem -20 C Gefrierschrank nur im eisernen, gekühlten Eppiständer transportieren und auch in diesem während des Pipettierens belassen. 1
II. RNA-Aufreinigung mit EZNA Total RNA Kit (PeqLab) Die RNA wird selektiv an eine Silica-Membran in einer Säule gebunden. Proteine und andere Zellbestandteile durch Waschen entfernt und die RNA mit H 2 O eluiert. Vorbereitungen: o Eis in einer Eisbox, Zentrifuge auf 4 C stellen o H 2 O(RNase frei) im Heizblock auf 70 C erwärmen o Unter Abzug TRK-Puffer komplettieren (20 µl Mercaptoethanol pro ml TRK Puffer muss frisch komplettiert werden) 1. Auf max. 50 mg Gewebe 400 µl komplettierten TRK Puffer geben (in 2ml-Epis). 2. Mit Microhomogenisator im Eppi homogenisieren. 3. + 400 µl 70% Ethanol (RNase frei), vortexen, 13'000 rpm 1 min zentrifugieren. 4. Überstand auf Säule geben, 1 bis 2 min zentrifugieren, 13'000 rpm (je nach Durchfluss durch Säule) 5. + 750 µl RNA Waschpuffer I auf Säule geben, 1 bis 2 min zentrifugieren, 13'000 rpm, alte Sammeltube verwerfen. 6. + 500 µl RNA Waschpuffer II auf Säule geben, 1 min zentrifugieren, 13'000 rpm. 7. Schritt 6 wiederholen. 8. Durchlauf verwerfen, nochmals zentrifugieren 1 min, max. Geschwindigkeit (max. rpm) 9. Säule auf frisches Eppi, + 50µl erwärmtes H 2 O(RNase frei), 5 min inkubieren. 10. Zentrifugieren für 1 min, max. rpm: RNA im Durchlauf. 11. Photometrische Bestimmung der Reinheit und der Konzentration der isolierten RNA: 90 µl H 2 O + 10 µl Probe = 100 µl Messung: OD 260 = RNA/DNA OD 280 = Protein OD 260 /OD 280 = Reinheit der RNA/DNA (sollte einen Wert zwischen 1,7 und 2,0 haben). OD 260 mit Verdünnungsfaktor multiplizieren, dann bei RNA x 0,04, bei DNA x 0,05. 2
III. Umschreiben von RNA in cdna mit M-MLV RT (PeqLab) Die Reverse Transcriptase aus dem Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV RT) ist eine RNA-abhängige DNA Polymerase, die besonders für lange RNA Templates geeignet ist (>5kb). Zusätzlich wurde dem Enzym die natürlich vorkommende RNase H Aktivität deletiert. 1. Steriles Wasser, Oligo[dT] Primer, 5x RT-Puffer, dntp-mix auf Eis stellen. 2. In RNase-freies PCR-Tube bis max. 13 µl RNA-Lösung (1 ng bis 1 µg) und 1 µl Oligo[dT] Primer (0.5 µg/µl) pipettieren. Um ein Volumen von 14 µl zu erreichen, unter Umständen die entsprechende Menge steriles Wasser dazu pipettieren. 3. Im Cycler auf 65 C 10 min erhitzen, um die Sekundärstruktur zu reduzieren. Anschließend 5 min auf Eis stellen. 4. Pipettieren sie folgende Reagenzien dazu: 1 µl RNase Inhibitor, 5 µl 5x RT-Puffer, 1,25 µl dntp-mix, und 1 µl M-MLV Reverse Transkriptase. Mit sterilem Wasser auf das Volumen von 25 µl auffüllen. 5. Vorsichtig zentrifugieren und im Cycler inkubieren: 10 min bei 40 C und 50 min zwischen 42 und 50 C stehen lassen. Anschließend auf Eis stellen. 6. Die RNA ist zu cdna umgeschrieben. Es sollte mit der PCR innerhalb der nächsten 2 h begonnen werden, weil die cdna sehr instabil ist. 3
IV. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Geschichte: Die Polymerase-Kettenreaktion wurde in den frühen 1980er Jahren von Kary Banks Mullis entwickelt. Nur sieben Jahre nachdem er seine Idee veröffentlicht hatte, wurde Mullis hierfür der Nobelpreis für Chemie verliehen. Seine Idee war es, ein Verfahren zu entwickeln, das DNA durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Polymerase künstlich vervielfältigt. DNA-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor, sie verdoppelt die DNA vor der Zellteilung. Sie bindet an einen einzelnen DNA-Strang und erzeugt einen dazu komplementären Strang. Bereits in Mullis' ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro (in einer kontrollierten, künstlichen Umgebung) verwendet. Die doppelsträngige DNA wurde durch Erhitzen auf 96 C in zwei Einzelstränge aufgeteilt. Bei dieser Temperatur wurde die DNA-Polymerase zerstört und musste daher nach jedem Erhitzen erneuert werden. Mullis' ursprüngliches Verfahren war sehr ineffizient, da es viel Zeit, große Mengen DNA- Polymerase und ständige Aufmerksamkeit erforderte. Später wurde der PCR-Prozess verbessert, indem man die DNA-Polymerase von thermophilen (Hitze liebenden) Bakterien verwendete, die bei über 110 C in Geysiren leben. Die DNA-Polymerase dieser Lebewesen ist thermostabil (stabil bei hohen Temperaturen) und wurde daher beim Erhitzen während der PCR-Zyklen nicht zerstört. Da nicht mehr ständig neue DNA-Polymerase hinzugefügt werden musste, konnte der Vervielfältigungs-Vorgang erheblich vereinfacht und automatisiert werden. Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus Thermophilus aquaticus gewonnen und Taq genannt. Taq-Polymerase erfährt gegenwärtig breite Anwendung. Ein Nachteil der Taq-Polymerase liegt darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNA produziert, was zu Mutationen (Fehlern) in der DNA-Sequenz führt. Polymerasen wie Pwo oder Pfu, die aus Archaea gewonnen werden, haben einen Korrektur-Mechanismus, der die Anzahl der Mutationen in der kopierten DNA erheblich senkt. Das Prinzip der PCR basiert auf der Denaturierung eines doppelsträngigen DNA-Templates (dsdna), an welches sich am 5 - und am 3 -Ende des zu amplifizierenden Bereiches spezifische Oligonukleotidmoleküle (Primer) anlagern. Diese Primer werden von einer DNAabhängigen DNA-Polymerase in Anwesenheit freier Desoxy-Nukleosid-TriPhosphate (dntp s) bei einer Temperatur von 68-72 C verlängert. Die DNA-Polymerase elongiert den entstehenden DNA-Doppelstrang solange, bis sie von der DNA getrennt wird. Dieser Abbruch wird durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 94 C verbunden mit einer Denaturierung der dsdna erreicht. Kühlt man den Ansatz in Anwesenheit freier Primer wieder auf 50-60 C, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (Tm-Wert) an die komplementären Sequenzen des Templates. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann jetzt wiederholt werden. 4
Die PCR bietet in Kombination mit einer thermostabilen DNA-Polymerase den Vorteil, dass alle Komponenten (Enzym, Template, Primer, dntp s) in einem Reaktionsgefäß zusammengeführt und die DNA in einem Thermocycler vollautomatisch amplifiziert werden kann. Die Effizienz bzw. Sensitivität dieses Systems zeigt sich schon bei der Durchführung von 25 PCR-Zyklen, da aus einem Zielmolekül bereits 3.2x10 7 Kopien synthetisiert werden. Bei 30 Zyklen erhält man eine Milliarde Kopien! Schematische Darstellung des PCR-Zyklus 5
Durchführung PCR-Cycler anstellen, auf 80 C hochheizen lassen Mastermix auf Eis ansetzen (hier Angaben für einen Ansatz) Mastermix für einen Ansatz: Puffer mit MgCl 2 (10x) 5 µl x? dntps 1 µl x? Taq DNA Polymerase 0,5 µl x? Aqua bidest. ad 46 µl x? Gesamtvolumen entsprechend der Anzahl der Ansätze herstellen (plus Verlustzuschlag) Primer Forward 1 µl Primer Reverse 1 µl Template (cdna) 2 µl Je 1 µl Primer (Primer Forward und Reverse) sowie 2 µl Template (cdna in diesem Fall) in jedes PCR-Tube geben. Zu jedem Ansatz anschließend 46 µl des Mastermix hinzugeben. Überführung der Eppis in den PCR-Cycler und Programm starten. Dauer für 35 Zyklen ca. vier Stunden. Sub-Cell GT Agarose Gel Gelkammer und Gelschlitten von BIO-RAD 1kB DNA-Marker der Firma Gencraft 6
V. Kontrolle der RT-PCR via Agarose-Gel-Elektrophorese Ziel: Die Größe und der Zustand der entstandenen PCR-Fragmente soll bestimmt werden. DNA wird nach Größe durch Anlegen einer elektrischen Spannung in einer Gelmatrix aufgetrennt. Material und Reagenzien: Es werden eine Gelkammer mit Gelschlitten und Kamm, eine Spannungsquelle und DNA- Größenmarker benötigt. Lösungen: Laufpuffer Stammlösung 5xTAE 24,2 g/l Tris-HCl 5,7 ml/l Eisessig 10 ml/l 0,5 M EDTA 6xProbenpuffer 0,25% Bromohenolblau (5 ml 0,5 % Lösg.) 30% Glycerin (3 ml 87 % Lösg.) 2 ml H 2 O Laufpuffer 1xTAE Außerdem werden bidestilliertes Wasser, Agarose und Ethidiumbromid (10 mg/ml) benötigt. Vorgehensweise: 1. Schmelzen von 5 g Agarose in 500 ml 1xTAE durch Erhitzen in der Mikrowelle. Abkülen auf 60 C. 2. Vorbereitung des Schlittens. Ausgießen von ca. 45 ml Agaroselösung in ein 50 ml Falcon. Zugabe von 1 µl Ethidiumbromidstammlösung. Gießen der Gellösung in Gelschlitten. 3. Nach Polymerisierung Einsetzen des Gelschlittens in die Elektrophoresekammer (Laufpuffer: 1xTAE) und Entnahme des Kamms. 4. Zugabe von 1 µl Probenpuffer zu je 5 µl PCR Probe. Pipettieren von 1 µl Größenmarker in die erste und der Proben in die folgenden Geltaschen 5. Gel-Elektrophorese: 75 V ca. 30-60 min. 6. Foto der fluoreszierenden DNA im UV-Licht. 7