E. Märtlbauer Antikörperbasierte Biosensoren zum Multimykotoxinnachweis
Mykotoxine: Ergotismus im Mittelalter 1000 1900 2
Mykotoxine im letzten Jahrhundert Während u. nach dem 2. Weltkrieg: Alimentary toxic aleukia in Russland Trichothecene? 1961: Turkey X disease : Aflatoxikose (C. C. Wannop, Avian Diseases, 5, 371-381) 1965: Ochratoxin A (Van der Merve et al., Nature 205, 1112-1113) 1930 2000 1988: Fumonisine (Gelderblom et al., Appl Environ Microbiol 54: 1806-1811) 1962: Aflatoxin B & G (Nesbitt et al., Nature 195, 1062-1063) 1946: Glutinosin (Verrucarin A & B) (Brian & McGowan, Nature 157, 334) 3
Chronologie markierter Immunoassays 1959 RIA Radioimmunoassay 1971 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay IgG-ELISA Engvall & Perlmann 1976 LIA Luminescence immunoassay 1950 2000. und viele weitere 1976 FPIA Fluorescence polarization immunoassay 1970 FIA Fluorescence immunoassay 4
Anfangsjahre der Immunoassays für Mykotoxine 1975 RIA Ochratoxin A 1976 RIA Aflatoxin B1 1977 EIA Aflatoxin B1 1979 RIA T-2 toxin 1983 RIA Zearalenon 1984 RIA Diacetoxyscirpenol 1988 EIA Deoxynivalenol 1988 EIA Roridin A 1992 EIA Fumonisin 5
Mykotoxine und Antikörper O H 1 nm O O H 10 Å O O O 6
Immuntests zum Nachweis von Mykotoxinen Mikrotiterplatte Mikrochip Partikel Enzym Gold Nanopartikel Quantumdots HRP ELISA Heterogener Test Markierte Reagenzien Frei: FP Homogener Test Keine Markierung Fluoreszenzpolarisation Gebunden: FP SPR 7
Biosensor (IUPAC Definition) z.b. Antikörper Rezeptor Signaltransduktion Signal Reversibles Signal On-off Reaktion Mehrfachmessung Kompakt, verbunden und klein z.b. Elektrochemisch Piezoelektrisch Optisch Surface plasmon resonance(spr) Total internal reflection ellipsometry (TIRE) Optical waveguide light spectroscopy (OWLS) Surface enhanced Raman scattering (SERS) Fluoreszenz/ Lumineszenz Magnetisch (Giant Magnetoresistance) etc. 8
Publikationen Literaturauswertung: Web of Science Juli Biosensor: 31 810 & food: 1 500 & mycotoxin 150 400 300 200 100 0 USA China Italien Span. D Biosensor & food 387 185 127 90 82 Biosensor & mycotoxin 27 13 16 14 8 FEI April 2008
Einzeltoxinnachweis: z.b. Potentiometrischer Biosensor Referenz Elektrode Mess-Elektrode: H 2 O 2 + p-hppa Rameil et al. 2010. Analytica Chimica Acta 661:122-127. 10
Multimykotoxin-Immunosensoren: Microspheres Laser Durchflußzytometer Fluoreszenzintensität Label Partikelidentifizierung Development of a multiplex flow cytometric microsphere immunoassay for mycotoxins and evaluation of its application in feed. Mycotox Res (2011) 27:63 72 AFB1, OTA, DON, FUM, ZEA, T-2 11
Multimykotoxin-Immunosensoren: Label-free Imaging surface plasmon resonance for multiplex microassay sensing of mycotoxins. Anal Bioanal Chem (2011) 400:3005 3011 SPR (DON und ZEA) Development of a microcantilever-based immunosensing method for mycotoxin detection. Biosensors and Bioelectronics 40 () 233 239 MC-Resonanz (AFB1 und OTA) 12
Entwicklung eines Biosensorarrays zur schnellen Bestimmung von Mykotoxinen in Getreide AiF 381 ZN Forschungsstelle 1: Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Tierärztliche Fakultät, (E. Märtlbauer, R. Dietrich) Forschungsstelle 2: Lehrstuhl für Analytische Chemie, (R. Nießner, D. Knopp, S. Oswald) 13
Toxin-Array H 2 O 2 + Luminol Oswald et al. () Automated regenerable microarray-based immunoassay for rapid parallel quantification of mycotoxins in cereals. Analytical and Bioanalytical Chemistry: 1-11. HRP AiF 381 ZN 14
Mykotoxin-Derivate Immunogenherstellung Chipherstellung Deoxynivalenol (Di)-Hemisuccinat Fumonisin B1 HT-Toxin -COOH Ochratoxin A Zearalenon Oxim AiF 381 ZN 15
Monoklonale Antikörper Mykotoxin MAk Subtyp Aflatoxin 1F2 IgG 2a Deoxynivalenol 1H8 IgG 1 Zearalenon 1B11 IgG 2a KLH Fumonisin 1E5 IgG 1 1H4 IgG 1 T-2/HT-2 Toxin 2A12 2E7 IgG2a IgG2b Ochratoxin A 1G8 3A3 IgG 1 NH Zu Projektbeginn vorhanden Während des Projektes entwickelt AiF 381 ZN 16
Mikroarray O NH Glaschip: silanisiert und funktionalisiert OH NH AiF 381 ZN 17
Probenvorbereitung Mahlen Extraktion Analyse 25 g Probe (Hafer) + 100 ml (80% MeOH) + 5 g NaCl 5 min mixen im Eisbad Filtration Verd. auf 20% MeOH Gesamtdauer der Probenvorbereitung: 7 min Dauer eines Messzyklus (am MCR3): 11 min Summe: 18 min AiF 381 ZN 18
Validierung: Referenzproben DON Matrix 1 DON Konz. [µg/kg] Gefundene Konz. [µg/kg] WF [%] Weizen 1400 ± 100 1223 ± 18 87 ± 2 Weizen 100 32 ± 7 - Weizen 400 ± 100 343 ± 37 86 ± 9 Hafer 100 23 - Hafer 500 ± 100 452 ± 43 91 ± 9 1 Triology Reference Materials (R-Biopharm), IRMM und Biopure AiF 381 ZN 19
Validierung: Labor- und Methodenvergleich DON - Konzentration [µg/kg] Matrix LC-MS Aokin MCR 3 EIA (n = 3) (n = 1) (n = 6) (n = 2) Weizen 1 1 270 ± 23 647 487 ± 57 517 ± 12 Weizen 2 2542 ± 190 1843 1485 ± 47 1475 ± 184 Weizen 3 1300 ± 79 958 518 ± 158 890 ± 89 Weizen 4 536 ± 32 886 561 ± 71 520 ± 82 Weizen 5 404 ± 31 428 346 ± 44 282 ± 43 Weizen 6 813 ± 83 421 312 ± 60 548 ± 226 Weizen 7 99 ± 10 347 223 ± 44 255 ± 17 Weizen 8 650 ± 35 582 627 ± 104 910 ± 119 1 Korn, Proben: Rosenmühle Landshut AiF 381 ZN 20
Chemilumineszenz [a.u.] Regenerierbarkeit Multiplex-Messung von 50 Zyklen mit blank-matrix (Weizen, Roggen, Mais, Hafer) 10000 8000 5000 4000 3000 2000 OTA AFB1 DON FB1 T-2 Negativkontrolle 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Anzahl der Regenerationszyklen Mykotoxin CL nach 50 Zyklen 1 Aflatoxin B1 102.14 ± 8.87 Ochratoxin A 96.55 ± 1.80 Deoxynivalenol 90.58 ± 6.90 Fumonisin B1 92.82 ± 4.60 T-2 Toxin 106.93 ± 13.74 1 MW(Messung 48,49,50)/MW(Messung 2,3,4)*100%; in verschiedenen Matrizen AiF 381 ZN 21
Zusammenfassung Generierung und Charakterisierung neuer Antikörper Stabiler, regenerierbarer Mikroarray für 5 Mykotoxine Einfache Extraktionsmethode Gesamttestdauer: 18 min To do: Zearalenon HT-2 Auf dem Chip Konformationsänderung? Chipbeschichtung mit Zearalenon-analog Antikörper nicht desorbierbar (auch nicht nach PEGylierung: Kettenlänge 4 bzw. 8 Atome) Verwendung von Fab-Fragmenten AiF 381 ZN 22
Ausblick Microtitertests Schnelltests Biosensoren 2010 Einzelsensoren 2010 Schnelltests Mycotoxinarrays 2015 Lab on a Chip 2020 2020? 23
Vielen Dank 24