Elektrophoretische Trennverfahren erste Elektrophorese in den 30iger Jahren von Arne Tiselius (Nobelpreis Chemie1948) Auftrennung menschlichen Serums in 4 Hauptkomponenten (Albumin,,, Globuline) Abb. Prinzip von elektrophoretischen Trennungen: Ausnutzung der Ionenwanderung im elektrischen Feld Theoretische Grundlagen Elektrophorese Transport von Ionen in einer Lösung unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes, wobei die wirkende elektrische Kraft F e definiert ist: F R F e + + r Fe z i Ladungszahl der Komponente i = zi e0 E e 0 Elementarladung [C] E elektrische Feldstärke [V/cm] 100
in einem viskosen wäßrigen Medium wirkt F e die Reibungskraft F R entgegen: k Konstante [cm] (6r für sphärische Partikel FR = k v i (Stokesches Gesetz)) Viskosität der Lösung [Pas] v i Wanderungsgeschwindigkeit der Komonente i [cm/s] daraus folgt für die Geschwindigkeit einer Komponente i in einem konstanten elektrischen Feld (F e = F R ): v i = z i e 0 6 r E r hydrodynamischer Radius des hydratisierten Ions (ungleich Ionenadius) daraus ergibt sich unter definierten experimentellen Bedingungen eine Stoffkonstante der Komponente i, die elektrophoretische Mobilität µ i : µ i = v i E = zi e0 6 r [cm 2 V 1 s 1 ] nur Trennung geladener Analyten, Trennung beruht auf Unterschieden der Molekülgröße (r) und Ladung z i elektrophoretische Verfahren stellen daher zunächst einmal keine chromatographischen Methoden dar (keine Verteilung zwischen einer mobilen und stationären Phase) aber: sehr ähnliche Instrumentierung (Kapillarchromatographie) als auch Mischformen (s.u. micellare elektrokinetische Chromatographie) 101
Kapillarelektrophorese Instrumentierung Hochspannungsversorgung bis 30 kv meist unbeschichtete Quarz (Fusedsilica)Kapillaren aber auch Teflonkapillaren Kapillarinnendurchmesser 10 100 µm Kapillarlängen 20100 cm UVVISDetektoren (oncolumn detection) Enstehung von Joulscher Wärme (Stromfluss) kleine Kapillardurchmesser zur besseren Wärmeabfuhr Probengefäß Kapillare Puffergefäß Hochspannungsquelle Detektor + Probenaufgabe (Graphik oben) hydrodynamische Injektion (ÜberdruckInjektionsseite, UnterdruckDetektorseite) elektrokinetische Injektion Grundlagen der elektrophoretischen Trennungen Elektroosmose (elektroosmotischer Fluß, EF): eine Vielzahl von Materialien (Glas, Quarz, Teflon) bilden aufgrund von berflächenladungen (Quarz bzw. Glas Dissoziation der SiH Gruppen) bei Kontakt mit einer Elektrolytlösung eine elektrochemische Doppelschicht aus Innenseite der Kapillare: negativ geladen positiv geladene Flüssigkeitssäule Elektroosmose tritt auf wenn ein elektrisches Feld an das flüssige Elektrolytsystem angelegt wird 102
positiv geladene Flüssigkeitssäule bewegt sich im elektrischen Feld in Richtung Kathode EF Transport der Flüssigkeit ähnlich einer mechanischen Pumpe Anode + + + + + + + + + + + + + + + + + + resultierender EF Kathode Kapillare + + + + + + + + + + + + + + + + + in Gegensatz zu einem hydrodynamischen Fließprofil (parabelförmig) ist das Profil des EF annähernd stempelförmig + Abb. Fließprofil eines elektrophoretisch betriebenen (oben) und eines Druckbetriebenen Systems (unten) P flaches Fließprofil beim EF hat vernachlässigbare Bandenverbreierung zur Folge ( EF trägt nicht zur Peakverbreiterung bei N th ) Einflussfaktoren EF bei hohen phwerten ist der EF deutlich grösser als bei niedrigen, da der Dissoziationsgrad der Silanolgruppen zunimmt (bei ph > 9 =1) Abb. phabhängigkeit des EF (fusedsilica Kapillare) 103
mit steigender Ionenstärke nimmt der EF ab (Beeinflussung der Doppelschicht) zu der oben definierten elektrophoretischen Mobilität einer Komponente i (µ i ) addiert sich folglich der EF Elektopherogramm Anode v EF + µ v + net µ + v net Kathode Signal kationische Komponente neutrale Komponente EF Marker anionische Komponente Kapillarzonenelektrophorese (CZE, capillary zone electrophoresis) Zeit Trennung der Analytionen aufgrund von Mobilitätsunterschieden gleiche Puffer in beiden Reservoiren (Grundelektrolyt) durch seine relativ hohe Konzentration im Verleich zum Analyten bestimmt der Grundelektrolyt Leitfähigkeit als auch den ph in der Kapillare 104
Abb. Zonenelektrophoretische Trennung eines tryptischen Verdaus (enzymatische Spaltung mittels Trypsin (bei Arginin und Lysin) eines Proteins) ptimierung der Trennung am einfachsten durch phwert Änderung (Pufferzusammensetzung) Beeinflussung des Dissoziationsgrads der Analyten / starke Mobilitätsänderung am pkwert des Analyten Peakverbreiterung nur durch longitidunale Diffusion wichtig: scharfe Anfangszone bei der Probenaufgabe (ca.1nl) Anwendungen der CZE speziell in der biochemischen und klinischen Anlytik (Aminosäuren, Proteine, Nucleinsäuren) Vorteile (gegenüber der klassischen Gelelektrophorese): hohe Trennstufenzahlen (Fliessprofil) ca. 1.000.000 pro Meter, schnelle Trennungen Nachteile: schwierige Detektion (Detektorvolumen < 0.5 nl) Kapillargelelektrophorese (CGE, capillary gel electrophoresis) bei sehr großen Analyten sind die Unterschiede in ihren elektrophoretischen Mobilitäten gering zusätzliche Einführung eines Gels in die Kapillare um die Trennung zu verbessern (Siebmatrix) 105
meist synthetische Polymere (vernetzte Polyacrylamidgele), Polymerisations und Vernetzungsgrad bestimmt die Selektivität Abb. Polymerisationsreaktionen zur Herstellung von PolyacrylamidGelen (Verhältnis von Starter, Monomer und crosslinker bestimmt Kettenlänge und den Vernetzungsgrad) die geladenen Analyten wandern durch das Polymernetzwerk, welches die Wanderung entsprechend der Molekülgrösse der Analyten behindert grosse Analyten wandern langsamer als kleine Überlagerung von zwei Trennmechanismen bei der CGE extrem hohe Trennstufenzahlen (bis zu 10 Mio. pro Meter) 106
Abb. Beispiel einer CGE, Trennung einer Polymermischung (Unterschied in den Kettenlängen jeweils ein Monomer) Exkurs: Anwendung der CGE zur Entschlüsselung des menschlichen Genoms Das Humangenomprojekt offizieller Start ktober 1990 2003 (> 1000 Wissenschaftler, ca. 40 Nationen) Träger USA: NIH National Institute of Health DE Department of Energy (Atomic Energy Commission), z.b. Untersuchung strahlungsinduzierter Mutationen seit 1995 auch deutsche Beteiligung (DFG, BMBF) 1998 private Unternehmen (Celera Genomics) greifen in das Rennen um die Entschlüsselung ein (Craig Venter) 107
Ziel: komplette Sequenzierung des menschlichen Genoms: Kartierung von 3 Millarden Basenpaaren Identifizierung von 100.000 Genen in 24 Chromosomen WatsonCrick Basenpaare NH 2 N N N N R Adenin (A) AT NH N R Thymin (T) DNA Desoxyribonucleinsäure N NH N N NH 2 R Guanin (G) GC NH 2 N N R Cytosin (C) Phosphat Desoxyribose Basen PurinDerivate PyrimidinDerivate Wasserstoffbrücken 3.4 nm ZuckerPhosphatGerüst 3 10 % des Genoms trägt proteincodierende Sequenzen (Exons) Abb. Molekülmodell der DNA Doppelhelix 108
Chromosomen die 3 Millarden Basenpaare sind auf 24 Chromosomen verteilt 22 Autosomen und 2 GeschlechtsChromosomen Chromosom 1 YChromosom ca. 250 Millionen BP ca. 50 Millionen BP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Abb. Chromosomenkarte (Karyogramm) 109
Prozeßablauf der DNASequenzierung Isolation der Chromosomen 150.000.000 Zerschneiden in ca. 50150 kbfragmente (Restriktionsenzyme) 150.000 Vervielfachung der Fragmente (mittels Klonierungsvektoren, z.b. Hefen) zufälliges Aufbrechen in kleinere Fragmente 0.52 kb (Ultraschall) 2.000 Vervielfachung der Fragmente (mittels Klonierungsvektoren (Bakteriophagen M13)) CTGACTGACTGA Sequenzierung Erstellung von Datenbanken Analytik Zusammensetzen der DNASequenz aus den Einzelfragmenten (shotgun approach) 110
langer DNAAbschnitt (50150 kb) zufälliges Aufbrechen (0.52 kb) Fragment 1 CTGACTGACTGA mehrfache Erfassung jedes Sequenzbereichs TGTGTG CTGACTGACTGA TGTGTG Fragment 2 Fragment 3 Abb. Strategie des shotgun approach überlappende Sequenzbereiche DNA Sequenzierung nach Sanger (DidesoxyVerfahren) auch Kettenabbruchverfahren ausgehend von einer bekannten Startsequenz (primer) wird durch Zugabe eines Nucleotidgemisches und einer DNA Polymerase die Synthese eines komplementären DNA Stranges initiiert die Reaktion wird in 4 parallelen Ansätzen gleichzeitig gestartet, jeweils mit nur einem Typ eines Didesoxy Nucleotids (Terminator) 111
3 unbekannte Sequenz 3 A CTGGA TGAC A CTGGA TGACC 5 H C 5 H T PPP H Desoxynucleotid PP PPP H NH 2 N Enzym (Polymerase) 5 CH 2 3 H N 3 3 A CTGGA TGAC A CTGGA TGACC 5 H C 5 H T PPP H PPP H Didesoxynucleotid PP NH 2 N 5 CH 2 N 3 H Abb. Synthese eines DNAStranges mit Einbau eines normalen Bausteins (Desoxynucleotid)(oben) und eines Terminators (Didesoxynucleotid)(unten) Verhältnis Desoxynucleotid : Didesoxynucleotid bestimmt die Länge der Produktkette (typisch 200:1) 112
Primer (kurzes ligonuclotid) GCTCTCAG CGAGAGT C unbekannte Sequenz + 4 dntps + Polymerase + ddatp + ddctp + ddgtp + ddttp GCTCTCA GC G GCT GCT C GCTCTCAG GCT CT GCTCTC A C G T Elektrophorese G A C T C T C G Leserichtung Abb. Prinzip des Kettenabbruchverfahrens nach Sanger 113
die unterschiedlichen langen sysnthetisierten Produkte können gelelektrophoretisch getrennt werden Rekonstruktion der Basenabfolge (Sequenz) zeitlimitierender Arbeitschritt ist die Trennung durch spezielle Primermarkierung können alle 4 Produkttöpfe vereint und gemeinsam gelelektrophoretisch getrennt werden 3` 5` unbekannte Sequenz + 4 dntps + Polymerase 3` 5` 3` 5` 3` 5` 3` 5` + dda + ddc + ddg + ddt dda ddc ddg ddt dda ddc ddg ddt dda ddc ddg ddt pool Elektrophorese Laser Detektor Intensität Zeit T C A C G C Abb. Primermarkierung 114
Durchbruch beim HGP Einführung der Kapillargelektrophorese Vorteile: (gegenüber klassischen Gelelektrophorese) kürzere Trennzeiten (höhere elektrische Feldstärken) online Detektion leichtere Automatisierung geringere Analytmengen P CH 2 Base P CH 2 Base Kapillarinnendurchmesser 10 100 µm Kapillarlängen 20 100 cm P CH 2 Base H Polyacrylamidgel F P Z B P Z B P Z B F P Z B P Z B + aufgrund der mit zunehmender Länge zunehmenden Ladung lassen sich unterschiedlich lange Sequenzabschnitte nicht ohne eine Siebmatrix trennen 115
4 Farben Fluoreszenz MultikapillarElektrophorese (Capillary Array Electrophoresis; CAE) Computer >590 nm 580 nm PMT Spektralfilter Laser (488 nm) bjektiv beweglicher Tisch Kapillaren Filter Linse 525 nm 555 nm Breitbandfilter dichromatischer Strahlteiler Spiegel dichromatischer Strahlteiler Detail des Focusbereichs Hochspannungsversorgung Abb. Aufbau einer 4FarbenFluoreszenzMultikapillarElektrophorese Apparatur 116
Abb. MultikapillarElektrophorese Apparatur ohne bewegliche Komponenten Weitere Möglichkeit zur basenspezifischen Detektion zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung 117
630 nm > 650 nm Farbstoff 1 5 Primer3 h Vorteile: eine Anregungswellenlänge (auch Laserdioden) eine Emissionswellenlänge (hier Filter/Photodiode) h Farbstoff 2 5 Primer3 h Farbstoff 3 5 Primer3 Intensität [counts] 100000 10000 1000 100 10 1 1 2 3 4 0 500 1000 1500 2000 Zeit [ps] Farbstoff 4 5 Primer3 h Sauer et al., Anal. Chem. (1998) Abb. Zeitaufgelöste Fluoresezenzmessung zur basenspezifischen Detektion 118
Photodiode Filter Strahlteiler Pulsgeber gepulste Laserdiode bjektiv Kapillare Abb. Aufbau zur zeitaufgelösten Fluoresezenzmessung Fluoreszenzintensität [counts/s] 50000 40000 30000 20000 10000 3.5 3.0 2.5 2.0 Lebensdauer [ns] G T A C 1690 1700 1710 1720 1730 Zeit [s] Abb. Zuordnung der Basen anhand der Fluoreszenzlebensdauer 119
Fluoreszenzintensität [counts/s] 1000 2000 3000 400 300 100 200 4000 500 A C T G 5000 6000 Zeit [s] Abb. Elektropherogramme eines DNASequenzierungslaufs (Sauer et al., Anal. Chem. (1998)) 1000 Buchstaben pro Seite (Abb. Rechts) 300 Seiten pro Buch insgesamt 10.000 Bände Potentielle medizinische Anwendungsgebiete in Zusammenhang mit dem HGP Tests zur genetischen Prädisposition genombasierte molekulare Diagnostik evidence based medicine Vorhersehbarkeit von Krankheiten führt zu zielgerichteten Therapien 120
Micellare elektrokinetische Kapillarchromatographie (MECC) Erweiterung elektrophoretischer Trenntechniken auf ungeladene Analyten (Trennung geladener und ungeladener Analyten) Prinzip: oberflächenaktive Substanzen werden in den Pufferlösungen gelöst, wobei die Konzentrationen der Tenside oberhalb der kritischen micellaren Konzentration liegen müssen (Schwelle zur Bildung von Assoziationskolloiden) V mp V wp Anode Kathode Analyt Micellen meistens Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) als Micellenbildner Micellengröße zwischen 40 und 100 SDS Einheiten (36 nm) hohe negative Ladung auf den berflächen der Micellen (anionischer Micellenbildner) elektroosmotischer Fluß muß größer sein als elektrophoretische Mobilität der Micellen Puffergemisch besteht aus einer sich schnell fortbewegenden wäßrigen Phase und einer langsameren micellaren Phase (hydrophob) injizierte neutrale Analyten verteilen sich zwischen den beiden Phasen, wobei der Verteilungskoeffizient von der Polarität der Analyten abhängt (analog der ReversedPhase HPLC) 121
Trennung beruht auf unterschiedlichen Verweilzeiten in der micellaren Phase (der sogenannten pseudostationären Phase) Abb. Der Trennprozess bei der MECC unter Verwendung anionischer Tenside (z.b. SDS), P = sehr polare Stoffe, P = polare Stoffe, U = unpolare Stoffe, U = sehr unpolare Stoffe neben diesem Trennmechanismus besteht weiterhin die elektrophoretische Trennung geladener Analyten (Überlagerung von zwei Trennprinzipien) 122
Abb. Vergleich von MECC und HPLCTrennungen von Sprengstoffrückständen Vorteile (gegenüber der HPLC): einfaches Austauschen der pseudostationären Phase schnelle Einstellung der Gleichgewichte zwischen den zwei Phasen höhere Säuleneffizienzen (2 Trennmechanismen) Nachteile Injektionsvolumina sehr gering Detektion und Identifizierung in Gegenwart des Micellenbildners schwieriger 123
Chirale MECC neben der pseudostationären Phase wird in das Pufferssystem zusätzlich eine enantioselektive Phase (z.b. Cyclodextrine) eingebracht Abb. Prinzip der chiralen MECC Enantiomerengemische verteilen sich zwischen dem enantioselektiven CDInneren und dem Inneren z.b. einer SDSMicelle (unterschiedliche Verteilung der beiden optischen Isomeren) durch die negative Ladung der SDSMicelle ist die stärker mit ihr wechselwirkende Form langsamer als die spezifisch mit CD interagierende Form 124
Abb. Chirale Trennung von D und LAminosäuren (SDS & CD) Kapillarisotachophorese (ITP) Prinzip: Verwendung eines diskontinuierlichen Elektrolytsystems: die Kapillare und kathodenseitiges Pufferreservoir sind mit einem sogenannten Leitelektrolyten gefüllt, dessen Kationen (Anionen) die höchste elektrophoretische Mobilität von allen im System vorkommenden Kationen (Anionen) besitzen müssen das Anodenreservoir (Kathodenreservoir) ist mit einem Folgeelektrolyten gefüllt, dessen Mobilität die niedrigste von allen Kationen (Anionen) ist die Analyten befinden sich zwischen Leit und Folgeelektrolyt (auch die elektrophoretischen Mobilitäten der Analytionen liegen zwischen denen der Leit und Folgeelektrolyten) 125
Anode F A B C L Kathode F C B A C B A L F C B A L E X [cm] Abb. Prinzip der ITP, L = Leitelektrolyt, F = Folgeelektrolyt) Auftrennung der Analyten A, B und C je nach elektrophoretischer Mobilität bis zur vollständigen Trennung danach sind alle Zonen gezwungen sich mit gleicher Geschwindigkeit (isotacho) durch die Kapillare zu bewegen nach Trennung der Analyten ändert sich die elektrische Feldstärke (E) stufenförmig über die Kapillarlänge (je nach Leitfähigkeit der Zone) durch Diffusion von Ionen z.b. in einen Bereich niedrigerer Feldstärke wird deren Geschwindigkeit verringert Zurückfallen in anschliessende Zone (und umgekehrt) xalsäure Weinsäure Zitronensäure DLIsoZitronensäure Hippursäure Bernsteinsäure Benzoesäure Essigsäure Adipinsäure Propionsäure Zonenschärfungseffekt (rechteckiges Konzentrationsprofil) aber auch: 126
Konzentrationseffekt ( Zusammenschieben der Zonen) die Konzentration des Analyten in seiner Zone adaptiert sich an die des Leitelektrolyten (Beschreibung durch Kohlrauschs beharrliche Funktion, siehe elektrochemische Monographien) verdünnte Proben können angereichert werden (Konzentrationsfaktoren bis zu 10 4 ) Isoelektrische Fokussierung (CIEF, capillary isoelectric focussing) insbesondere zur Proteinanalytik (Trennung der Analyten anhand ihrer unterschiedlichen isoelektrischen Punkte (pi Werte charakteristisch für die Aminosäurekomposition) zur Erinnerung: piwert gibt an, bei welchem phwert eine amphotere Substanz nach aussen hin elektrisch neutral ist Prinzip der CIEF: Erzeugung eines phgradienten entlang der Kapillare und Anlegen einer Spannungsdifferenz Wanderung der Analyten bis zu dem Punkt, an dem der ph ihrem isoelektrischen Punkt entspricht zur Erzeugung der phgradienten werden verschiedene amphotere Substanzen (z.b. Aminocarbonsäuren mit unterschiedlichen Verhältnissen an Amino und Carbonsäuregruppen) gemischt Abb. Aliphatische oligoaminooligocarbonsäuremischungen zur Erzeugung der phgradienten 127
nach Anlegen der Spannung wandern die Ampholytmoleküle bis zu dem Punkt, an dem sie ihren isoelektrischen Punkt erreichen (z.b. ein Ampholyt mit 10 Carbonsäuregruppen und einer Aminogruppe wird zunächst in Richtung Anode wandern und erst im stärker sauren elektrisch neutral, ein Molekül mit 10 Aminogruppen und einer Carbonsäuregruppe wird zunächst in Richtung Kathode wandern und erst im stärker basischen neutral werden) Abb. Schematische Darstellung der CIEF (AA, BB usw.: Ampholyte mit unterschiedlichen piwerten, Symbole: Analyten (z.b. versch. Proteine)) üblicherweise werden belegte Quarzkapillaren verwendet um den EF zu reduzieren bzw. zu unterdrücken (Vermeidung der berflächenladungen durch Dissoziation der Silanolgruppen) Probenaufgabe für die Kapillarelektrophorese aufgrund der geringen Injektionsvolumina (0,5 50 nl) ist die Probenaufgabe für alle CETechniken ein grosses Problem 3 Injektionstechniken hydrostatische Injektion DruckInjektion elektrokinetische Injektion 128
Abb. Prinzip der hydrostatischen Injektion Abb. Prinzip der DruckInjektion Überdruck auf der Injektions oder Unterdruck auf der Detektorseite Abb. Prinzip der elektrokinetischen Injektion Probleme durch Diskriminierung von Probenkomponenten (verursacht durch Unterschiede in den elektrophoretischen Mobilitäten verschiedener Substanzen) 129
KapillarElektrochromatographie (CEC, capillary electrochromatography) CEC ist eine chromatographische Technik, bei welcher der Fluss der mobilen Phase durch die chromatographische Trennphase durch Elektroosmose hervorgerufen wird und nicht durch Druckdifferenz wie in der konventionellen Flüssigchromatographie Abb. Übersicht über stationäre Phasen für die CEC (aus: Jiskra et al., J. Sep. Sci. 2003, Vol. 26, 1305 1330) Animationen CE und CEs 130
Miniaturisierung von CESystemen (microchip electrophoresis) aufgrund verschiedener Aspekte der Kapillarelektrophorese bietet sich der Einsatz sogenannter MicrochipTechniken an ( Labonachip ) HV HV Ground HV HV 0.5 HV 0.5 HV Ground Abb. ElektrophoreseMicrochip (links), eine typische Kanal Anordnung für eine elektrophoretische Trennung (oben links) und die Elektrodenschaltung zur Probeninjektion (oben rechts) 131
Abb. Aufbau eines Microchipsystems mit Laserinduzierter Fluoreszenz Detektion Abb. Beispiel einer CE Trennung mittels Microchips (Kontrolle einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) zur Vervielfältigung von DNA Abschnitten) (a) (d): unterschiedliche PCRZyklen (15 30 Zyklen) Animationen Film2 & Film3 132