Vermehrung oder Eliminierung antibiotikaresistenter Bakterien in Biogasanlagen? Prof. Dr. Dr.-Ing. Peter Kämpfer Institut für Angewandte Mikrobiologie Justus-Liebig-Universität Gießen Potentieller Transfer antibiotikaresistenter Bakterien aus der Landwirtschaft Eingangsproben: Gülle und Festmist aus intensiver Tierhaltung Pharmazeutika (Antibiotika) Futtermittelrückstände (Cu, Zn) Pathogene Bakterien Bakterielle Sporen Antibiotiaresistente Bakterien Resistenzgene Viren Biogasanlagen als technologische Barriere für pathogene und antibiotikaresistente Bakterien?? Ausgangsproben: Fermentierter Rückstand aus Biogasanlagen Pharmazeutika (Antibiotika) Futtermittelrückstände (Cu, Zn) Pathogene Bakterien Bakterielle Sporen Antibiotiaresistente Bakterien Resistenzgene Viren 1
Dargestellte Ergebnisse aus Untersuchungen von: 15 Biogasanlagen 2012-2014 (BGA001-BGA015) Untersuchungen im Rahmen des BMBF Projektes RiskWa 11 Biogasanlagen 2013 (BG1-BG11) Untersuchung in Kooperation mit Prof. Breves, Tierärztliche Hochschule Hannover Eingangsproben/Gärsubstrat (nur Gülle/Festmistanteil) Ausgangsproben/Gärrest Vorkommen potentiell humanpathogener antibiotikaresistenter Bakterien in der Großtierhaltung Extended-Spectrum- Beta- Lactamase (ESBL)-tragende Enterobacteriaceae > Gram-negative Gammaproteobacteria > Klinisch relevant: Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) > Gram-positive Firmicutes > Klinisch relevant: Staphylococcus aureus Vancomycin-resistente Enterococcus (VRE) saureus.mlst.net > Gram-positive Firmicutes > Klinisch relevant: Enterocccus faecalis, Enterococcus faecium efaecalis.mlst.net 2
ESBL tragende Enterobacteriaceae CHROMagar ESBL (www.mast-diagnostica.com) Genomische DNA Plasmid mit ESBL Gen Multiplex-PCR (Parallele Detektion verschiedener Gene) blashv (747 bp) blactx-m (593 bp) blatem (445 bp) Monstein et al. (2007) APMIS 115, 1400-1408 ESBL Extended-Spectrum-Beta-Lactamasen Beta-Laktamasen: bakterielle Enzyme, hydrolysieren Laktam-Ringstrukturen der Antibiotika Punktmutationen in den enzymcodierenden Genen können Effektivität der Enzyme erhöhen (=Extended-Spectrum Beta-Laktamasen; ESBL) -> Hydrolysieren Cephalosporine (1. 4. Generation) Erstes ESBL Auftreten: SHV-2 in 1983 Klebsiella ozeanae Bisher 9 Familien an Beta-Laktamasen bekannt: TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, GES, TLA, BES, OXA SHV-2 CTX-M CTX-M Paterson and Bonomo (2005) Clin. Microbiol. Rev. 218(4): 657-686 Dominierend nach TEM und SHV Zum ersten Mal beschrieben in 1992 Erfolgreiche/schnelle Verbreitung ->110 CTX-M Typen sind bekannt 3
ESBL E. coli Populationen bei Mensch, domestizierten Tieren und Wildtieren ESBL tragende E. coli gleicher Sequenztypen wurden bei Menschen, Wildtieren und domestizierten Tieren detektiert Möglicher Transmission: Großtierhaltung Mensch Genomische DNA Plasmid mit ESBL Gen 1. E. coli Stamm 1 E. coli Stamm 1 Gunther et al. (2011) Frontiers in Microbiology 2(246): 1-13 2. E. coli Stamm 1 E. coli Stamm 2 Detektionprinzip - ESBL, MRSA, VRE Detektion Direktplattierung vs. spezifischer Voranreicherung 10 g 1x Eingangs/Ausgangsproben 10 g 10 g 1x 1 g 2x 0.1 g 3x Serielle Verdünnung in 0.9% NaCl 1. Selektive Voranreicherung (Selektivmedium mit Antibiotika) 24 Stunden, 37 C Plattierung auf CHROMAgar TM ESBL, VRE, MRSA 24 Stunden, 37 C 2. Vereinzelungsausstrich CHROMAgar TM ESBL, VRE, MRSA 24 Stunden, 37 C 3. Screening einzelner Kolonien Nachweis von Resistenzgenen (Multiplex-PCRs) Phylogenetische Identifizierung: 16S rrna Gen 4
13.11.2014 Ergebnisse der Direktplattierung auf CHROMAgar E. coli E. coli Direktplattierung auf CHROMAgar ESBL Erfassung koloniebildender Einheiten (KBE) Ergebnisse von 5 BGAs Beprobt 2012 Konzentration auf CHROMAgar ESBL kultivierbare Bakterien waren in Eingangsproben deutlich höher als im Gärrest. ESBL-E. coli (pink-gefärbte Kolonien) wurden nur in Eingangsproben detektiert. Phylogenetische Identifizierung: Pink gefärbte Kolonien: Spezifisch ESBL-E. coli Blaue Kolonien: Citrobacter, Enterobacter, aber auch Aeromonas (unspezifisch) Braun/Beige Kolonien: Größtenteils Pseudomonaden, Acinetobacter FAZIT: Spezifischer Nachweis, aber geringe Detektionseffizienz bei der Direktplattierung Vergleich Direktplattierung Voranreicherung zur Detektion von ESBL E. coli auf CHROMAgar ESBL Pinke Kolonien repräsentieren ESBL-E. coli -> Obwohl der Nachweis bei der Direktplattierung nicht möglich war waren fast alle Proben nach Voranreicherung positiv. 5
ESBL E. coli Nachweis Vergleich der Direktplattierung und nach Voranreicherung February 2013/2014 April July/ August October BGA 001 CTX-M+TEM CTX-M TEM SHV SHV+TEM CTX-M+TEM CTX-M TEM SHV SHV+TEM DP 1 10 g 11 4 7 1 g 5 2 2 0.1 g 4 DP 3 10 g 6 1 6 5 1 g 7 1 1 8 0.1 g 6 DP 3 10 g 5 1 1 g 3 0.1 g 1 2 DP 3 10 g 1 4 2 1 g 2 0.1 g 4 Untersuchung von zwei BGAs (BGA001 und 015) zwischen Februar 2013 und Februar 2014 (4 Probenahmen) DP: Direktplatterung (aus 10 g) 10 g, 1g, 0.1 g = Mengen an Ausgangsmaterial das in den die Voranreicherung eingesetzt wurde Nummern in den Kästchen repräsentieren die Anzahlen von E. coli Kolonien die die oben genannten ESBL Gene trugen. Den Hauptanteil machten CTX-M Gene aus, zusätzlich detektierten TEM Gene sind vermutlich keine ESBL sondern chromosomal codierte TEM-1 Gene (vereinzelt bestätigt mit Sequenzdaten) Abundanz verschiedener ESBL Gentypen bei E. coli Isolaten (BGA001 und BGA015) Fraction of E. coli with respective ESBL genes (%) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% n=72 n=40 n=57 n=8 2 25 44 BGA001 27 13 BGA001 3 4 41 9 BGA015 7 1 BGA015 SHV+TEM SHV TEM CTX-M Zusammenfassung aller isolierten und gescreenten E. coli Isolate aus BGA001 und BGA015 der Untersuchungen zwischen Februar 2013 und Februar 2014 Total: 176 Isolate 6
Auftreten verschiedener CTX-M Gruppen Zusammenfassung der Daten von BGA001 und BGA015 Analyse basiert auf 66 sequenzierten CTX-M Genen CTX-M-2 2% CTX-M-9 15% CTX-M-9 6% CTX-M-2 5% CTX-M-9 12% CTX-M-2 3% Total CTX-M-1 83% CTX-M-1 89% CTX-M-1 85% n= 48 CTX MGene n= 18 CTX MGene n= 66 CTX MGene CTX-M Gene der isolierten E. coli wurden waren aus der CTX-M-1 Gruppe (>80%), CTX-M-9 und 2 wurden mit geringer Abundanz nachgewiesen. Nachweis Methicillin resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) CHROMagar MRSA (www.mast-diagnostica.com) Multiplex-PCR Poulsen et al. (2003) 7
MRSA Nachweis (BG 1 10) 10 g 1 g 0,1 g MRSA a b a b c Resistenzgen 1E + + + + + + n.d. 1A + + + + + + n.d. 2E + + + + + + n.d. 2A + + + + + + n.d. 3E + + + + + + n.d. 3A + + + + + + n.d. 4E + + + + + + n.d. 4A + + + + + + n.d. 5E + + + + + + n.d. 5A + + + + + + n.d. 6E + + + + + + n.d. 6A + + + + + + n.d. 7E + + + + + + n.d. 7A + + + + + + n.d. 8E + + 2(3) + + + meca 8A + + + + + + n.d. 9E 1 2 + 2 + + meca 9A + + + + + + n.d. 10E + + + + + + n.d. 10A + + + + + + n.d. - Kein Wachstum + Wachtsum Resistenzgennachweis: Anzahl positive Kolonien nach Vorscreening (Isolate mit Resistenzgenen nach Vereinzelung) Kein MRSA detektiert, In 2 Eingangsproben meca tragende andere Staphylococcus spp. E: Eingangsprobe/ Gärsubstrat A: Ausgangsprobe/ Gärrest Phylogenetische Identifizierung Staphylococcus cohnii Staphylococcus hominis Staphylococcus lentus 8
Nachweis Vancomycin resistenter Enterokokken (VRE) CHROMagar VRE (www.mast-diagnostica.com) Multiplex-PCR 1: E. faecalis mit vana 4: E. faecium mit vanb Kariyama et al. (2008) VRE Detektion (BG 1 bis 10) 10 g 1 g 0,1 g VRE a b a b c Resistenzgen 1E + + + + + + n.d. 1A - - - - - - n.d. 2E + + + + + + n.d. 2A + + + + 2 + vana 3E + + + + + + n.d. 3A - - + + + + n.d. 4E + + + + + + n.d. 4A + + - + - 1 vana+vanc1 5E 1 + + 1(0) + + vana 5A + 1 + 1 + 1 vanc1 6E + + + - + 1(2) vanc1 6A + + 1(0) + 1(0) + vanc1 7E + + + + + + n.d. 7A + + + + + + n.d. 8E + + + + 1(0) + vanc1 8A + + + + + + n.d. 9E + + + + + + n.d. 9A 1(0) 1 + - + - vanc1 10E - - - - - - n.d. 10A + + + + + + n.d. - Kein Wachstum + Wachtsum Resistenzgennachweis: Anzahl positive Kolonien nach Vorscreening (Isolate mit Resistenzgenen nach Vereinzelung) VRE Nachweis in 3 Eingangs- und 5 Ausgangsproben E: Eingangsprobe/ Gärsubstrat A: Ausgangsprobe/ Gärrest 9
Phylogenetische Identifizierung der VRE Isolate Enterococcus faecium Enterococcus mundtii Enterococcus pseudoavium/ Enterococcus viikkiensis Enterococcus cassilifalvus Direkter kultivierungsunabhängiger Resistenzgennachweis ESBL Gene der CTX-M Gruppe Direkte DNA Extraktion aus der Umweltprobe Test der Nachweiseffizienz für ESBL Gene mittels spiking -Experiment Resistenzgen- Nachweis über PCR 1, Multiplex-PCR (CTX-M, TEM, SHV) 2, QPCR (CTX-M-1 Gruppe) Marker 10 3 cells 10 3 cells 10 5 cells 10 5 cells 10 7 cells 10 7 cells NaCl NaCl mix mix E. Coli SHV E. coli TEM E. coli CTX-M Mix Marker Mit ESBL E. coli gespikte Proben (Spiking vor der DNA Extraktion) Nicht gespikt Reinkulturen (Positivkontrolle) DNA Extraktion aus 250 mg Probe 10 3 ESBL E. coli Zellen Schwaches Signal 10 5 ESBL E. coli Zellen Starkes Signal 10
Direktnachweis von Resistenzgenen aus Eingangs- /Ausgangsproben (Kultivierungsunabhängig) für ESBL und MRSA und VRE Gene Standard B1E B1A B2E B2A B3E B3A B4E B4A B5E B5A B6E B6A B7E B7A B8E B8A B9E B9A B10E B10A Referenz NTC Standard B: Biogasanlage 1-10 E: Eingang A: Ausgang Referenz: Positivekontrolle NTC: No-Template Kontrolle MRSA ESBL + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + meca nuc SHV CTX-M TEM 16S rrna Gen (Amplifiktionskontrolle) -> ESBL Gene waren in Eingangs- und Ausgangsproben detektierbar (in 2 von 10 Eingängen waren CTX-M Gene detektierbar, nicht in Gärresten) -> meca Gene wurden in 4 von 10 Eingangs- und Ausgangsproben detektiert -> VRE: vana, vanb, vanc1 konnten nicht detektiert werden Ergebniszusammenfassung Biogasanlagen eliminieren ESBL und VRE nicht vollständig Probenabhängig wurden ESBL-tragende E. coli und VRE in Eingangs- und Ausgangsproben von Biogasanlagen detektiert ESBL Gene wurden in Eingangs- und Ausgangsproben auch Kultivierungsunabhängig detektiert. VRE: klinisch relevante Enterococcus faecalis wurden nachgewiesen MRSA konnten nicht nachgewiesen werden: meca tragende Staphylokokken wurden kultivierungsabhängig nur in zwei Eingangsproben nachgewiesen; kultivierungsunabhängig wurden meca Gene in Eingangs- und Ausgangsproben detektiert sample sample 11
Projektpartner Prof. Dr. Peter Kämpfer IAM Institut für Angewandte Mikrobiologie Stefanie Glaeser Thorsten Schauss Steffen Wohlgemuth Olivia Sovinsky Jana S. Brunner Alexandra Gütschow Tina Wings Prof. Dr. Gerd Hamscher Astrid Spielmeyer Prof. Dr. Wolfgang Dott ILL Institut für Lebensmittelchemie und biotechnologie IHU Institut für Hygiene und Umweltmedizin 12