Institut für Forstzoologie und Waldschutz Universität Göttingen, Deutschland Bozen, 27.10.2008 Geruchssinn der Insekten: von ökologischen Interaktionen zu molekularen Aspekten Dr. Sergio Angeli Trompete (Ger.), trumpet (Eng.), tromba (It), = from ld High Germanic Trumba Wasser (Ger.), water (Eng.), acqua (It) Aqua dest - Destilliertes Wasser Kneipe (Ger.), pub (Eng.), bar (It.) Kneipe = from Latin cauponula (= capanna, It) Prost (Ger.), cheers (Eng.), evviva (It.) Prost = from Latin prosit (= for your benefit) 1
Kartoffel (Ger.), Potato (Eng.), Patata (It.) wild types till 1960 In 1565: potatoes were sent to the Spanish King Italy: tartufolo (It.) (Trüffel, truffle) Germany first: Tartuffel Germany later: Kartoffel today Wechselwirkung Pflanze-Pathogen Pathogen Talking Trees und Crying for help Warum Insektengeruchssinn? Duftkodierung der Insekten Insekten: Perirezeptor-Ereignisse und Zentrale Prozesse dorant Binding Proteins (BPs) und Chemosensory Proteins (CSPs) Insektenantennen als Biosensoren 2
Pflanzen ChemoÖkologische Antworten Schadinsekten Prädatoren /Parasitoide Talking Trees (Sprechende Bäume) Crying for help (Hilferufe) Talking Trees Baldwins Experiment Verletzte Pflanzen Versuchspflanzen VCs Luft Kontrollpflanzen Phenole erhöht in verletzten Pflanzen und Kontrollpflanzen. Populus und Acer zeigen den gleichen Effekt. Baldwin I.T. and. Schultz. J.C 1983. Rapid changes in tree leaf chemistry induced by damage: evidence for communication between plants. Science 221: 277-279. 3
Planzliche Signale Lokal Systemisch Talking Trees Planzliche Reaktion auf Befall mit Pathogenen und Schädlingen Verletzte Tomatenblätter synthetisieren PRSYSTEMIN (200 aa) Prosystemin wird verarbeitet zu SYSTEMIN (= 18 aa) Systemin wird im verletzten Blatt freigesetzt und durch das Pholem transportiert. In Zielzellen bindet Systemin vermutlich an Stellen der Plasmamembran und bewirkt die Biosynthese von JASMNSÄURE (=C12) Ruiz-Medrano et al., 2001, Cur pi Plant Biol 4, 202-209; Scheer et al., 2002, PNAS, 99, 9585-9590 4
Jasmonsäure Hat eine zentrale Rolle in der Regulierung der systemischen Pflanzenabwehr bei nahezu allen Pflanzenarten It is an elicitor-inducer, entsteht über Abbau von C18- Fettsäuren (Linolensäure und Linolsäure) in: - C6-Verbindungen wie Grünblattgerüche (VCs), z.b. (Z)-3-Hexenal, Hexanal, (Z)-3-Hexenol, (Z)-3-Hexenylacetat -eine C12-Verbindung, genannt Traumatin oder Wundhormon, das interne Abwehrfunktionen aktiviert Zheng et al. 2006 Plant Physiology 41(4):1400-13; Engelberth et al., 2004 PNAS 101(6): 1781 1785. Crying for help Bei Befall durch herbivore Insekten emittieren Pflanzen Düfte, die Parasitoide oder Prädators anlocken. Diese Chemikalien werden induzierte Synomone genannt. Tabakpflanzen emittieren bei Nacht Duftstoffe, die nachtaktive Falter auf der Suche nach Eiablageplätzen abschrecken. Ryan C.A. 2001 Nature, 410 (29):530-31. 5
!!"#$ Diabrotica virgifera 6
β-caryop. Untergrund-lfaktometer Here we report the first identification of an insect-induced belowground plant signal, (E)-β-caryophyllene, which strongly attracts an entomopathogenic nematode. Turlings group, 2005 «Recruitment of entomopathogenic nematodes by insect-damaged maize roots» Nature 434: 732-737 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 von Schwerdtfeger F., 1939 7
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Warum Insektengeruchssinn? Geruchssinn ist der älteste Sinn der Lebewesen Hauptaufgabe des olfaktorischen Systems ist die Detektion tausender Duftmoleküle Gerüche sind multidimensional, werden aber als Einheit wahrgenommen. Einige generelle Fragen Wie löst das olfaktorische System das komplizierte Problem der Mustererkennung? Nutzt der Geruchssinn viele spezifische Rezeptoren oder wenige, die auf viele Duftstoffe reagieren? Welche Moleküle detektieren die Duftstoffe? Chemosensorische Wahrnehmung bei Säugetieren Nasenhöhle olfaktorische Wahrnehmung (Geruchssinn) bei Insekten farnesene Mundhöhle Gustatorische Wahrnehmung (Geschmackssinn) Coccinellin H H N + CH 3 H (S)-(-) α pinene 9
Duftmoleküle +, - C H 3 H 2 C H C H 2 N S 1-octen-3-ol benzaldehyde allyl Isothiocyanate Zahl der Insekten und Evolution 2 mil Homo sapiens 195 mil ältestes Säugetier Collembola 400 mil (älteste landlebende Tiere) 80% aller Spezies sind Insekten 10
Der Seidenspinner, Bombyx mori )* +, # ( & -. / 0 % 1 2 ' 3 4 C H 3 H )! 11
. / (E,Z)-6,11-esadecadienil acetato Antherea polyphemus (E,Z)-6,11-esadecadienale Antherea polyphemus H (E,Z)-10,12-esadecadienolo Bombyx mori H (E,Z)-10,12-esadecadienale Bombyx mori, Manduca sexta H (E,E,Z)-10,12,14-esadecatrienale Manduca sexta H (7R,8S)-7,8-epossi-2-metil octadecano Lymantria dispar (Z)-11-esadecenale Heliothis virescens H esadecanale Heliothis virescens H (Z)-6-eneicosen-11-one rgia pseudosugata (Z)-13-esadecen-11-inil acetato Thaumetopoea pityocampa (Z)-11-esadecenil acetato Mamestra brassicae (Z)-9- esadecenil acetato Mamestra brassicae (Z)-5-decenil acetato Agrotis segetum (Z)-7-dodecenil acetato Agrotis segetum (Z)-9-tetradecenilacetato Agrotis segetum Wenn ein Schmetterling einen Elefanten liebt! Kelly, Chem. Bio., 1996 12
ElektroAntennoGraphie (EAG) (Schneider, 1959) Dietrich Schneider, 30/7/1919 10/5/2008 von Franke W. Gaschromatographie Massenspektroskopie und Elektroantennographische Detektion (GC-MS/EAD) aus Weissbecker B. et al. 2004 13
Gaschromatographie Massenspektroskopie und Elektroantennographische Detektion (GC-MS/EAD) Antenne von Cis boleti (Coleoptera) Antenne von Suillia mikii (Diptera) 1 1 Antennenreaktion von Cis boleti auf Pilzdüfte GC-MS/EAG EAD 0.05 mv CH 3 H 2 C H GC 1 0 1 5 2 0 Thakeow et al., 2008 Chemical Senses Time (min.) 14
from Franke W. 15
Chemoperzeption von Insekten Struktur eines Insekten-Sensillums Wirbeltier Neuron Neuron Sensillenlymphe Auxillarzellen Steinbrecht et al. 1995; Rogers et al. 2000 16
Sensillentypen in der Antenne von S. gregaria Sensillentypen in der Antenne von S. gregaria s. trichodeum s. basiconicum s. s. chaeticum s. coeloconicum lfactorische Signaltransduktion bei Insekten 1) Perirezeptor-Ereignisse Antennallobus 2) Zentrale Prozesse Keller A, Vosshall L.B (2003) Decoding lfaction in Drosophila Curr. pin. Neurobiol. 17
Antennallobus von D. melanogaster Antennallobus von Drosophila beinhaltet ~43 Glomeruli Aus der The Hing s Lab: laboratory of olfaction development Internetseite Richard Axel Linda Buck From R. Axel, Nobel Prize (www.nobelprize.org) 18
Antennallobus von Apis mellifera Verarbeitung olfaktorischer Reize im Antennallobus der Honigbiene H 1- ctanol octanol Heptanal heptanal 2- heptanone Heptanon H From G. Galizia, Koeln Univ. 19
Geruchskodierung Lösliche Globular-Proteine Membran-Proteine -Niedriges Molekulargewicht (14-20 (14-20 kda) kda) --Sauer Sauer (pi (pi = 4-5) 44-5) --Hoch Hochkonzentriert in in der der Sensillenlymphe (10 (10mM )) lfactory Receptors (Rs) 1) 1) dorant-binding Proteins (BP) --6 Cysteine in in konservierter Position 2) 2) Chemosensory Proteins (CSP) --Bindungskapazität wurde wurdegemessen --in in der derlymphe olf. olf. Sensillen lokalisiert --4 Unterklassen: : PBP, PBP, GBP1, GBP2 GBP2 und und ABPX ABPX --dreidimensionale Struktur wurde wurdevor vor kurzem kurzemerforscht --4 Cysteine in in konservierter Position --Bindungungskapazität nur nurin in einem einemfall gemessen --lokalisiert in in der derlymphe of of gustatorischer und und olfaktorischer Sensillen --weniger wenigergut gut charakterisiert Zellaußenraum Duft-Signaltransduktion Sensillen-Cuticula dorant Binding Protein (BP) Sensillenlymphe Phospholipase C Rezeptor 1 Rezeptor 2 Chemosenosry Protein (CSP) Adenylat-Cyclase PIP 3 PLC R1 R2 AC IP 3 α α β γ γ β α α camp IP 3 Cytosol G-Protein-Komplex camp APT IP 3 IC 1 IC 2 IC 3 camp Anregungskanal (depolarisierend) Inhibitorischer Kanal (hyperpolarisierend) Schematische Darstellung biochemischer Aspekte der Geruchs-Signaltransduktion von Arthropoden: Parallele Anregungs- (IP 3 ) und inhibitorische (camp) Kanäle. camp cyclic-3,5 -adenosyl-monophosphate, DAG diacyl glycerol, G-protein complex, IP 3 inositol trisphosphate and PIP 2 phosphatidylinositol-4,5-sphosphate (von Vogt, 1995; modifiziert). 20
BPs von Bombyx mori PBP = Pheromone Binding Proteins GBP = General dorant Binding Proteins PBP-1 MSIQGQIALALMVNMAVGSVDASQEVMKNLSLNFGKALDECKKEMTLTDAINEDF GBP-1 MWKLVVVLTVNLLQGALTDVYVMKDVTLGFGQALEQCREESQLTEEKMEEF PBP-1 YNFWKEGYEIKNRETGCAIMCLSTKLNMLDPEGNLHHGNAMEFAKKHGADETMAQ GBP-1 FHFWNDDFKFEHRELGCAIQCMSRHFNLLTDSSRMHHENTDKFIKSFPNGEILSQ PBP-1 QLIDIVHGCEKSTPANDDKCIWTLGVATCFKAEIHKLNWAPSMDVAVGEILAEV GBP-1 KMIDMIHTCEKTFDSEPDHCWRILRVAECFKDACNKSGLAPSMELILAEFIMESEADK Strukturanalyse von zwei Bombyx mori BPs NH 2 CH Scaloni A., Monti M., Angeli S. and Pelosi P. (1999) Structural analysis and disulfide-bridge pairing of tow odorant-binding proteins from Bombyx mori. Biochemical and Biophysical Research Communication 266, 386-391 21
3-D Struktur von Bombyx mori PBP 3-D Struktur von Bombyx mori PBP Sandler B.H., Nikonova L., Leal W.S. and Clardy J. (2000) Sexual attraction in the silkworm moth: structure of the pheromone-binding-protein-bombykol complex. Chem. Biol. 7(2):143-51 B-form, X-ray N N C ph 4.5 C C Horst et al., PNAS USA 98, 14374 (2001), Leal et al., A-form, NMR N Bombyx PBP 22
Arbeit mit BPs/CSPs: Der Anfang.. Muster löslicher Proteine von Schistocerca gregaria Männchen Weibchen SDS-PAGE 66 kda 45 kda 29 kda 20 kda 14 kda Native-PAGE H T A W L An Mo H T A W L An Mo 23
Biochemische Characterisierung des löslichen Proteins p14 SDS-PAGE Native-PAGE 66 kda 45 kda 29 kda 20 kda 14 kda IEF 14 kda pi 5.1 3,5 µg/antenne N-terminale Aminosäuresequenz (34 aa) NH 2 -EEKYTTKYDNVNLDEILANDRLLNKYVQQLLEXD Klonierung von Schistocerca gregaria p14 RT-PCR: based on on proteins N-terminal sequences we we have have designed degenerate primers and and amplified specific cdna sequences Degenerierter Primer gargaraartayacnac Proteinsequenz NH NH 2 -E D- 2 -E E K Y T T K Y D N V N L D- CSP-sg1 CSP-sg1 EEKYTTKYDNVNLDEILANDRLLNNYVKCLLEDGEANCTVDGKELKKAVPDALSNECAKCNDKQKEGTKKVLK EEKYTTKYDNVNLDEILANDRLLNNYVKCLLEDGEANCTVDGKELKKAVPDALSNECAKCNDKQKEGTKKVLK CSP-sg2 CSP-sg2 EEKYTTMFDNVNLDEILANDRLLNNYVKCLLEDGEANCTADGKELKKAVPDALSNECAKCNDKQKEGTKKVLK EEKYTTMFDNVNLDEILANDRLLNNYVKCLLEDGEANCTADGKELKKAVPDALSNECAKCNDKQKEGTKKVLK CSP-sg3 CSP-sg3 EEKYTTKYDNVNLDEIIANDRLLNKYAQCLLENDDTNCTDDGKELKSVIPDALSNECAKCNEKQKEGTKKVLK EEKYTTKYDNVNLDEIIANDRLLNKYAQCLLENDDTNCTDDGKELKSVIPDALSNECAKCNEKQKEGTKKVLK CSP-sg4 CSP-sg4 EEKYTTKYDNVNLDEILANDRLLNKYVQCLLEDDESNCTADGKELKSVIPDALSNECAKCNEKQKEGTKKVLK EEKYTTKYDNVNLDEILANDRLLNKYVQCLLEDDESNCTADGKELKSVIPDALSNECAKCNEKQKEGTKKVLK CSP-sg5 CSP-sg5 EEKYTTKYDNVNLDEILANDRLLNKYVQCLLEDDESNCTADGKELKKDIPDALSNECAKCNEKQKEGTKKVLK EEKYTTKYDNVNLDEILANDRLLNKYVQCLLEDDESNCTADGKELKKDIPDALSNECAKCNEKQKEGTKKVLK * * * * CSP-sg1 CSP-sg1 HLINHKPDIWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDKEKELHE HLINHKPDIWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDKEKELHE CSP-sg2 CSP-sg2 HLINHKPDIWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDKEKELHE HLINHKPDIWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDKEKELHE full mature sequence CSP-sg3 CSP-sg3 HLINHKPDIWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDREKELHQ HLINHKPDIWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDREKELHQ 109 aminoacids, CSP-sg4 CSP-sg4 HLINHKPDVWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDREKELHQ HLINHKPDVWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDREKELHQ 4 cysteins in conserved positions CSP-sg5 CSP-sg5 HLINHKPDVWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDREKELHQ HLINHKPDVWAQLKAKYDPDGTYSKKYEDREKELHQ 24
Polyklonale Polyklonale Antikörper Antikörper gegen gegen Sgre-CSP, Sgre-CSP, Ecar-CSP Ecar-CSP and and CmorCSP CmorCSP Western Blot SDS - PAGE anti -S Western blot anti -E anti -C 66 kda 45 kda 29 kda 20 kda 14 kda M S S : Schistocerca gregaria ( tarsi ) E C S E C E : Eurycantha calcarata ( tarsi ) S E C S E C C : Carausius morosus ( tarsi ) Immunozytochemische Immunozytochemische Lokalisierung Lokalisierung von von Sgre-CSP Sgre-CSP Immunofärbung von Sensillen an Antennen (A), Maxillarpalpen (P) und Tarsen (T) mit polyklonalem Antiserum gegen CSP-sg4. Kontakt-Sensillen sind stark gefärbt, lfaktorische Sensillen nicht (nicht gezeigt). Angeli S, Ceron F, Scaloni A, Monti M, Monteforti G, Minnocci A, Petacchi R, Pelosi P (1999) Purification, structural characterization, cloning and immunocytochemical localization of chemoreception proteins from Schistocerca gregaria Eur. J. Biochem. Jun;262(3):745-54. 25
Chemosensory Proteins von Eurychanta calcarata (Phasmida) Marchese S, Angeli S, Andolfo A, Scaloni A, Brandazza A, Mazza M, Picimbon J, Leal WS, Pelosi P. (2000) Soluble proteins from chemosensory organs of Eurycantha calcarata. Insect Biochem Mol Biol. 30: 1091-1098. Chemosensory Proteins von Carausius morosus (Phasmida) Monteforti G, Angeli S, Petacchi R, Minnocci A. (2002) Ultrastructural characterization of antennal sensilla and immunocytochemical localization of a chemosensory protein in Carausius morosus Brünner (Phasmida: Phasmatidae) Arthropod Structure and Development 30 (3), 195-205 Identifizierung, Aufreinigung und Klonierung zweier CSPs von Bombyx mori GBP-2 CSP-1 PBP B. B. mori moricsp-1 DDKYTDKYDKINLQEILENKRLLESYMDCVLGKGKCTPEGKELKDHLQEALETGCEKCTEAQEK GAETSIDYLIKNELEIWKELTAHFDPDGKWRKKYEDRAKAKGIVIPE B. B. mori moricsp-2 QDKYEPIDDSFDASEVLSNERLLKSYTKCLLNQGPCTAELKKIKDKIPEALETHCAKCTDKQKQ MAKQLAQGIKKTHPELWDEFITFYDPQGKYQTSFKDFLES Picimbon JF, Dietrich K, Angeli S, Scaloni A, Krieger J, Breer H, Pelosi P. (2000) Purification and molecular cloning of chemosensory proteins from Bombyx mori. Arch Ins. Biochem Physiol. 44:120-129 26
Tribolium castaneum: das erste Genome eines Coleopteren Grün fluoreszierende Protein (GFP) eingefügt ins Tribolium-Genome mrna cdna RT-PCR Insgesamt 47 BPs und 19 CSPs von Tribolium wurden identifiziert - 29-3-2008: 2008:..., Robertson H.M., Angeli S., Forêt S.,... (2008) The genome of the developmental model beetle and pest Tribolium castaneum, Nature, 452(7190): 949-955. 955. Zukünftige Ziele RNA-Interferenz EAG, GC-MS-EAD 27
51 1 7 3 6 $ Danke für Ihre Aufmerksamkeit " $ 8 01 23 4-5 6 7'7 -,, 7' 28