Versuchsprotokoll 3: 3.1 Einleitung Der Versuch ` soll aufzeigen, wie groß die Menge an Lipiden und wie hoch der Cholesterinanteil in und im Kälberserum ist. Dabei untersuchen wir Zellen von E. coli, Leberzellen und fötales Kälberserum. Am Ende des Versuchs werden die in verschiedenen biologischen Materialien gefundenen Lipide durch eine Dünnschichtchromatographie charakterisiert. begrenzen eine Zelle oder eine Zellorganelle von dem Außenmedium oder dem Cytoplasma. Somit wird durch die Membran ein Reaktionsraum begrenzt. bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, in die Proteine eingebettet sind. Die Doppelschicht der Membran ist flüssig, man spricht von einem Flüssig-Mosaik-Modell. Durch diese Fluidität kann im Inneren der Membran eine vertikale und/oder horizontale Bewegung von Molekülen stattfinden. Liegen viele ungesättigte Fettsäuren vor, dann steigt die Fluidität der Membran. Auch die Menge an Cholesterin, die in vorkommt, beeinflusst die Fluidität einer Membran. Eine steigende Konzentration an Cholesterin in der Lipiddoppelschicht senkt die Fluidität der Membran. Durchführung und Auswertung 3.2.1. Durchführung: Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford Der Bradford-Dye wird vor Gebrauch 1:5 verdünnt. Somit werden 6 ml Dye und 24 ml Wasser zusammengegeben. Für die Bestimmung der Proteinmengen wird vorerst eine Eichgerade aus einer BSA- Konzentrationsreihe erstellt (BSA = bovine serum albumin). Hier werden nun die eingesetzten Mengen tabellarisch dargstellt: Fertige BSA-Lösung: 0,5mg/ml Protein-Konzentration (µg / 50µl H 2 O) BSA Lösung (µl) H 2 O (µl) 0 0 50 2 4 46 4 8 42 6 12 38 8 16 34 Tab. 1: Herstellung einer verdünnten 10 20 30 BSA-Lösung für Eichgerade Seite 1 von 8
Für die unterschiedlichen Membranproben werden Verdünnungsreihen angelegt, um die Proteinkonzentration bzw. Lipidkonzentration zu ermitteln. Material Geschätzte Proteinmenge 1. Verdünnung 1:20 2. Verdünnung 1:100 3. Verdünnung 1:500 Serum 10 mg/ml Zellen : H 2 O 1:20 10 µl : 190 µl 1. Ver.: H 2 O 1:5 50 µl : 200 µl 2. Ver. : H 2 O 1:5 50 µl : 200µl Leberzellmembran 10 mg/ml s. o. s. o. s.o. E. coli Membran 10 mg/ml s. o. s. o. s. o. Tab. 2: Verdünnungsreihen 3.2.2. Auswertung: Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford Die erste Verdünnung wird vernachlässigt, da die Lösungen zu hoch konzentriert sind und somit eine Konzentrationsmessung per Photometrie nicht möglich ist. Dies liegt an der besonders starken Färbung der Lösung mit dem Farbstoff, die eine aussagekräftige Photometerbestimmung unmöglich macht. Somit werden für die folgenden Ergebnisse nur die Verdünnungen 1:100 und 1:500 verwendet. Hier sind die Ergebnisse der Doppelbestimmungen dargestellt. Art der Membran Absorption bei 595nm Konzentration in µg / 50 µl Konzentrationsdurchschnitt in µg / 50 µl Serum 1:500 0.095 3.172 Serum 1:500 0.094 3.140 3.16 Serum 1:100 13.88 13.88 Serum 1:100 14.25 14.25 14.1 Leberzellen 1:500 1.304 1.304 Leberzellen 1:500 1.71 1.71 1.51 Leberzellen 1:100 13.13 13.13 Leberzellen 1:100 13.87 13.87 13.5 E. coli 1:500 1.058 1.058 E. coli 1:500 0.875 0.875 0.97 E. coli 1:100 5.777 5.777 E. coli 1:100 5.666 5.666 5.7 Tab. 3: Durchschnittliche Konzentrationen der Materialien Seite 2 von 8
Berechnung der Proteinkonzentration (mg/ml) anhand eines Beispiels einer 1:500- Verdünnung: [Protein] = [Durchschnitt] x 20 x 500 mg 1000 ml Für das Kälberserum ergibt sich somit eine Konzentration von: [Kälberserum (1:500)] = 1,51 x 20 x 500 mg = 15,1 mg/ml 1000 ml Berechnungsergebnisse: Art der Membran Konzentration der Verdünnung in mg/ml Konzentrationsdurchschnitt in mg/ml Serum 1:500 31 Serum 1:100 28,2 29,6 Leberzellen 1:500 15,1 Leberzellen 1:100 27 21,05 E. coli 1:500 9,7 E. coli 1:100 11,4 10,55 Tab. 4: Insgesamter Konzentrationsdurchschnitt der Verdünnungsreihen Proben Proteingehalt Serum 29,6 mg/ml Leberzellmembran 21,05mg/ml E. coli Membran 10,55mg/ml Tab. 5: Proteingehalt der Proben 3.3.1. Durchführung: Bestimmung des Cholesteringehalts in den Lipidextrakten Bevor man den Cholesteringehalt bestimmen kann, muss man die Lipide aus den Proben extrahieren. Dafür nimmt man 300µl Serum, 283µl E.coli-Membran-Gemisch + 117µl Wasser bzw. 142µl Leberzellmembran + 158µl Wasser. Die weitere Durchführung wird nach Skript Seite 74 bis 75 durchgeführt. Das Cholesterin wird durch die Cholesterinoxidase und Katalse letztendlich in einen Lutidin- Farbstoff umgewandelt. Seite 3 von 8
Diese Farbstoffkonzentration wird durch ein Photometer durch Absorption bei 405nm bestimmt. Das Verhältnis zwischen Cholesterin und Farbstoff liegt bei 1 : 1! In folgender Tabelle sind die Ergebnisse der Photometrie aufgezeigt: Messung Membran Absorption bei 405nm 1 E. coli - 0,011 2 Standard 0,792 3 Leberzellen 0,309 4 Kälberserum 0,034 Tab. 6: Ergebnisse der Photometrie bei 405nm 3.3.2. Auswertung: Bestimmung des Cholesteringehalts in den Lipidextrakten Durch die in 3.3.1. angegebenen Absorption kann man nach dem Lambert schen Gesetz die Konzentration des Cholesterin in den vier Proben bestimmen. Die Berechnung der Konzentration wird anhand eines Beispiels aufgezeigt die restlichen Ergebnisse jedoch nur in der nachfolgenden Tabelle beschrieben. E c = ------------, wobei E = Extinkion (7,4 l/mmol x cm, ε = Extinktionskoeffizient von ε x d Cholesterin, d = 1 cm (Schichtdicke) Serum: c = 0,034 / 7,4 l / mmol x cm = 0,0046 mmol x cm / l m = n x M, wobei n(cholesterin) = 368,64 g / mol m = 368,64 g / mol x 0,0046 mmol / l = 1,7 mg / l = 1700 µg/ l Berechnung der Cholesterinmengen in µg / mg Protein anhand den Proteinkonzentrationen unter 3.2.2 Tab. 5) Messung Membranen Cholesterin (in µg/ l) Cholesterin (in µg/mg Protein) 1 E. coli 0 0 2 Standard 39454,44 --------------------------------- (Literaturangabe: 20 µg / 80 µl) 3 Leberzellen 15393,2 0,73 4 Kälberserum 1700 0,057 Tab. 7: Berechnung der Cholesterinkonzentration Seite 4 von 8
Anhand dieser Tabelle (Tab. 7) lässt sich folgendes aufzeigen: An den Ergebnissen ist auffällig, daß bei E. coli kein Cholesterin vorhanden ist. Dagegen weisen die Fraktionen der Leberzellen und des Kälberserums Cholesterinkonzentrationen auf. Die Konzentration an Cholesterin der Leberzellen ist jedoch viel höher als die des Serums. Da der Proteingehalt des Serums bzw. der Leberzellen relativ nahe beieinander liegen, ist auch der hohe Unterschied zwischen der Cholesterinmenge in µg / mg Protein vorhanden. Weiterhin ist auffällig, daß die Konzentration des Standards ca. doppelt so hoch ist, wie in der Literatur angegeben. 3.3.2. Diskussion: Diese Ergebnisse lassen sich wie folgt erklären: Bakterien, auch E. coli, besitzen kein Cholesterin in ihrer Membran. Ausschließlich Eukaryoten besitzen Cholesterin. Der Grad der Fluidität wird durch ungesättigte Fettsäuren bestimmt. Umso mehr ungesättigte Fettsäuren vorhanden sind, desto größer ist die Fluidität. Auch das Kälberserum weist nur geringe Mengen an Cholesterin auf. Dies ist auf die Definition von dem Begriff Serum` zurückzuführen. Als Serum bezeichnet man nur die flüssige Phase von geronnenem Blut. (Koolmann, J. und Röhm, K.-H.,Taschenatlas der Biochemie (1994) Seite 245) Bei dem hier gemessenen Cholesterinkonzentration handelt es sich somit um gelöstes Cholesterin, daß im Blut in Form von LDL transportiert wird und hier ausschließlich für die Cholesterinkonzentration verantwortlich ist. Die Leberzellenmembran beinhaltet nach den obigen Ergebnissen die höchste Cholesterinkonzentration. Dies ist durch den Aufbau der eukaryotischen Membran zu erklären, in die für den Grad der Fluidität Cholesterin verantwortlich ist und somit in der Membran vorkommt. Außerdem besitzt die Leber, also auch die Leberzellen, die Aufgabe der Cholesterinbiosynthese. Dadurch ist die hohe Konzentration an Cholesterin hauptsächlich zu erklären. Dass die gemessene Konzentration des Standards doppelt so hoch, als die Angabe im Skript, läßt sich wohl nur durch einen Fehler beim Pipetieren erklären. 3.4.1. Durchführung: Fraktionierung der Lipid-Extrakte über DC Die Durchführung dieses Versuchsteils findet man auf den Seiten 75 bis 77 im Skript. Das Laufmittel für die Dünnschichtchromatographie ist ein Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser im Verhältnis 65 : 25 : 4. Für die Menge von 15 ml Laufmittel müssen somit 10,4ml Chloroform, 4ml Methanol und 0,6ml Wasser gemischt werden. Seite 5 von 8
3.4.2. Ergebnis Für die DC hat man folgende Ergebnisse photographisch festgehalten, wobei Std für Standard, E für E. coli, S für Kälberserum und L für Leberzellen steht. 1) Aufnahme unter sichtbarem Licht: 2) Aufnahme unter UV-Licht Abb. 1 Abb. 2 Zu bemerken ist, dass sich die Abfolge der Proben bei der Aufnahme unter UV-Licht verändert hat. Auf den äußeren Spuren befindet sich der Standard, der von unten nach oben Sphingomyelin (SM), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylethanolamin (PE), Cholesterin (C) und Cholesterinpalmitat (CP) aufweist. Die Spur L tritt am auffälligsten in Erscheinung. Die gesamte Spur weist eine starke Färbung auf. Größtenteils ist auch ein großer Schlieranteil vorhanden. Alle vom Standard repräsentierten Lipide sind auch bei der L -Spur zu erkennen. Vergleicht man die Spur L mit der Spur S ist auffällig, daß bei der L -Spur die Konzentration des Cholesterins höher ist, als die des Cholesterinpalmitats. Bei der S -Spur ist dies genau umgekehrt. Die S -Spur weist im Gegensatz dazu eine geringere Allgemeinfärbung auf. Markante Übereinstimmungen erhält man bei Cholesterin und Cholesterinpalmitat. Aber auch bei Sphingomyelin (SM), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylethanolamin (PE) sind Färbungen zu erkennen. Seite 6 von 8
Die Spur E weist bei Sphingomyelin (SM) und Phosphatidylserin (PS) keinerlei Spuren auf. Bei Phosphatidylethanolamin (PE) ist die stärkste Färbung zu erkennen. Jedoch sind hier auch minimale Anzeichen von der Anwesenheit von Cholesterin und Cholesterinpalmitat vorhanden. 3.4.3. Auswertung: Fraktionierung der Lipid-Extraktion über DC Für die Leberzellen ist das Vorhandensein der bei der DC aufgezeigten Lipide genau wie die der Literaturdaten (Grafik, Taschenatlas der Biochemie, 1994, Seite 203) Der Anteil des Sphingomyelins ist auch bei der DC-Platte entsprechend hoch. Besonders hervorzuheben ist auch die Cholesterinbande. Sie ist sehr stark ausgeprägt. Sie zeigt, daß die Leberzellen sehr viel Cholesterin besitzen. Einerseits in ihrer Membran (siehe Abbildung), andererseits natürlich auch als Produkt der Biosynthese in den Zellen. Bei der Spur des Kälberserum (S) sind nur geringe Mengen an Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin vorzufinden. Die Konzentration von Cholesterin und Cholesterinpalmitat ist jedoch dagegen relativ hoch. Dies lässt sich mit den Ergebnissen von 3.3.2. erklären. Cholesterin wird im Blut unter anderem in Low densitiy Lipoproteinen (LDL) transportiert. Diese LDL besitzen eine einschichtige Phospholipidmembran, die einen Kern aus Triacylglyceriden und Cholesterinestern einschließt. In der einschichtigen Phospholipidmembran ist außerdem noch freies Cholesterin eingelagert. Durch den Aufbau der LDL-Partikel kann nun das Ergebnis der DC bei der Spur des Kälberserums erklärt werden. Die geringen Mengen der Phospholipide (Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin) bauen die einschichtige Membran der LDL auf. Da Cholesterin im Blut hauptsächlich als Cholesterinester transportiert wird, ist auch die große Menge an Cholesterinpalmitat (Cholesterinestern) bei der DC zu erklären. Die Menge an Cholesterinester bei LDL im Blut beträgt 35 40 %. Die Menge an freiem Cholesterin liegt bei ca. 15-20% (Voet, J. und Voet, J.G., Biochemistry (2004) 3rd Editon Seite 439, Tab. 12-6). Auch die Tatsache, daß die Konzentration des Cholesterinpalmitats höher ist als die des Cholesterins kann somit auch anhand der DC nachvollzogen werden. Seite 7 von 8
Die E.coli Membranen weisen so gut wie kein Cholesterin auf (stimmt mit den Ergebnissen von 3.3.2. überein). Auch Spuren von Cholesterinpalmitat sind zu erkennen, deren Vorkommen nicht nachvollziehbar ist. Einen großen Anteil des E. coli Lipids macht das Phosphatidylethanolamin aus. Dies ist bei der starken Bande bei der DC und den Literaturwerten übereinstimmend. Dies gilt auch für das Phosphatidylserin, was im Gegensatz dazu jedoch nur in geringen Mengen vorkommt. 3.5. Diskussion Im Grunde stimmen die Ergebnisse mit den Literaturwerten überein. Nur das Vorhandensein des Cholesterinpalmitat und Spuren von Cholesterin bei E. coli Membranen unter 3.4.3. ist nicht zu erklären. Die Vorkommen lassen sich wohl nur auf Verunreinigungen der Proben zurückführen und könnten nur durch eine erneute Durchführung des Versuchs verhindert werden. Auffällig ist, daß es massive Unterschiede in den E. coli- und Leberzellenproben gibt. Betrachtet man das Cholesterin und geht man davon aus, daß E. coli keinerlei Cholesterin besitztist dies wohl der größte Unterschied zwischen den Membranen bzw. Zellen von pro- und eukaryotischen Individuen bezogen auf die Lipide der Zellen. E. coli ist nicht in der Lage Cholesterin zu synthetisieren, weil dem Bakterium die entsprechenden Enzyme fehlen. Zum Ausgleich wird die Membranfluidität von der Einlagerung ungesättigter Fettsäuren gesteuert. Nachdenklich zu betrachten, ist die Färbung bei Cholesterin der Kälberserum Spur. Betrachtet man Tab. 7 und vergleicht sie mit dem UV-Bild der DC-Platte, so läßt sich fragen, warum die gefundene niedrige Cholesterinkonzentration in Tab. 7 einen so starken und intensiven Spot auf der UV-Licht DC-Platte hinterläßt. Dies läßt sich jedoch hier nicht beantworten. Anlagen: Orginale der Proteinbestimmung, Ergebnisse der DC Seite 8 von 8