V1: Methoden der Proteinbestimmung

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Emma Voss
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1 V1: Methoden der Proteinbestimmung Methodik: Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford sowie der Korrekturverfahren nach Warburg & Christian sowie Kalb & Bernlohr UV-Spektren von Protein- und Nukleinsäurelösungen Photometrie (altgr. φῶς phos Licht und μετρεῖν metrein messen ) Messverfahren im Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichtes mit Hilfe eines Photometers (Wikipedia) Spektroskopie (klassisch) (lat. spectrum Erscheinung und altgr. σκοπεύω sehen ) Die Untersuchung der Lichtemission bzw. -absorption von Molekülen und Atomen mit Hilfe von Gitter- und Prismenspektrometern. 1

2 Anwendungsbereiche der Photometrie Direkte Konzentrationsbestimmung von Chromophoren (Proteine, Nukleinsäuren, Coenzyme...) Versuche 1 und 4 Indirekte Konzentrationsbestimmung nach Bindung farbiger Liganden: Eichkurve notwendig (Proteinbestimmung nach Bradford) Versuch 1 Abschätzung der Partikeldichte einer Suspension: Eichkurve bzw. Erfahrungswert notwendig (Bakteriendichte) Versuch 6 Enzymkinetik (farbiges oder chromogenes Substrat, evtl. Hilfsreaktion) Versuche 2 und 3 Nutzen der quantitativen Proteinbestimmung: Beurteilung von Zellaufschlüssen Beurteilung von Proteinreinigungsverfahren Bestimmung von Enzymaktivitäten 2

3 Aufbau eines (Spektro)-Photometers 3

4 Proteinbestimmungsmethoden Trübungsmessungen Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung) Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen) UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer sches Gesetz, Korrekturverfahren) Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc. Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse 4

5 Proteinbestimmungsmethoden Trübungsmessungen Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung) Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen) UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer sches Gesetz, Korrekturverfahren) Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc. Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse 5

6 BCA assay Pierce Chemical Company The bicinchoninic acid (BCA) assay procedure. Addition of copper (II) ions to a protein solution in an alkaline medium reduces the copper (II) ions to copper (I). BCA added to the solution chelates copper (I) in a 2:1 stoichiometry. The BCA- Cu + complex produces a strong purple color.

7 Proteinbestimmungsmethoden Trübungsmessungen Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung) Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen) UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer sches Gesetz, Korrekturverfahren) Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc. Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse 7

8 Proteinbestimmung nach Bradford Struktur des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 Spektrum des Protein-Farbstoff-Komplexes (595 nm) Farbstoff allein (465 nm) Bindung an positiv geladene Seitenketten 8

9 Proteinkonzentration über Komplexbildung E linearer Bereich Komplexzerfall Sättigung c Komplexbildung bei Farbreaktionen Spezifität und Nachweisempfindlichkeit können durch Komplexbildung und/oder Farbstoffbindung erhöht werden Darstellung: Extinktion gegen Konzentration (M oder mg/ml) Messung nicht über den gesamten Konzentrationsbereich linear: Eichkurve notwendig! Als Eichprotein wird meist Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) verwendet 9

10 Proteinbestimmungsmethoden Trübungsmessungen Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung) Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen) UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer sches Gesetz, Korrekturverfahren) Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc. Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse 10

11 Beer-Lambert Gesetz I 0 I Sample, conc c I is the light transmitted by the strip l l constant of proportionality The amount of light transmitted depends on the sample length and concentration 10

12 Estinktionskoeffizient 10 Extinktion spezifische Extinktionskoeffizient Die gängige Einheit des Extinktionskoeffizienten ist L mol 1 cm 1. From

13 UV-Messungen zur Proteinbestimmung Extinktionsmessung bei 280 nm zur Quantifizierung von Proteinen Aromatische Verbindungen (Aminosäuren, Nukleotide) absorbieren wegen der leichten Anregbarkeit der - Elektronensysteme im UV-Bereich ( = nm) In Proteinen wird die Absorption überwiegend durch Tryptophan und Tyrosin bestimmt; dafür wird eine Messung bei 280 nm durchgeführt Aminosäuren Nukleinsäuren Aminosäuren E = -log 10 (I / I 0 ) = ε c d 13

14 Korrekturverfahren zur Proteinbestimmung Vermeidung von Fehlmessungen bei Rohextrakten Problem: Nukleinsäuren, Nukleotide und Coenzyme absorbieren im selben Spektralbereich wie die aromatischen Aminosäuren Korrekturmöglichkeit: Rechnerische Berücksichtigung eines möglichen Nukleinsäurebeitrags (E 260 ), oder Einbeziehung der Absorption der Peptidbindung zur Quantifizierung (E 230 ) 230 nm 260 nm Warburg & Christian: c Protein (mg/ml) = 1,55 E 280 0,76 E 260 Kalb & Bernlohr: c Protein (µg/ ml) = 183 E ,8 E 260 DNA 280 nm Protein 14

DNA Konzentrationsbestimmung DNA Konzentration: -> E 260 (möglich um E 320 zu korrigieren (Trübung der Lösung) -> dabei entspricht E 260 von 1.0 = 50µg/ml pure dsdna.

15 DNA Konzentrationsbestimmung DNA Konzentration: -> E 260 (möglich um E 320 zu korrigieren (Trübung der Lösung) -> dabei entspricht E 260 von 1.0 = 50µg/ml pure dsdna. -> Konzentration (µg/ml) = (E 260 ) dilution factor 50µg/ml DNA Reinheit wird bestimmt durch (A 260 /A 280 ) = (E 260 ) (E 280 ) -> saubere DNA hat ein E 260 /E 280 Verhältnis zwischen Molekularbiologie 06/15

16 Messungen am Photometer Messküvetten müssen absolut sauber und fettfrei sein (Fingerabdrücke!) Blindwert (Photometer-Nullpunkt) ist das im Versuch benutzte Verdünnungsmittel Messprobe und Verdünnungsmittel bzw. Farbstoffreagenz werden in einem geeigneten Reaktionsgefäß gründlich gemischt und anschließend in die Küvette pipettiert Glas- bzw. Quarzküvetten sind sehr empfindlich, werden nur für den jeweiligen Versuch ausgegeben und müssen nach Versuchsende sorgfältig gereinigt zurückgegeben werden. Nur Messbereich zwischen 0,1 und 1 ist verlässlich! 16

17 Versuch 1 - Methoden der Proteinbestimmung 1. Erstellen einer Eichkurve nach der Bradford-Methode 8 Konzentrationen RSA, Eichkurve durch Millimeterpapier Tip: GUT MISCHEN!!!! 2. Proteinbestimmung anhand der Bradford-Eichkurve ADH, Lysozym, RSA - je 3 x Note: alle nach der gleichen Reaktionszeit messen! 3. UV-Spektren ausgewählter Proteinlösungen Bestimmung von Messung von 1:10 UND 1:20 verdünnten Lösungen + Vergleich Note: Direkt in die Küvette pipettieren Nach jedem Spektrum Name von dem File gleich merken!!! 4. UV-Spektrum einer Nukleinsäurelösung DNA Probe, Konzentration und Reinheit bestimmen DNA-Spektren mit Protein-Spektren überlagern Note: Nach jedem Spektrum Name von dem File gleich merken!!! Um Überraschungen zu vermeiden Gleich am Tag der Messung rechnen!!!!

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