Trehalaseaktivität in der Wanderheuschrecke Locusta migratoria

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1 Einleitung F II Praktikum SS Locusta migratoria Die Wanderheuschrecke Locusta migratoria besitzt, wie die meisten Insekten, als Haupthämolymphzucker Trehalose. Trehalose ist ein nicht-reduzierendes Disaccharid, das aus zwei Glucosemolekülen in α-1-1-bindung besteht. Im Gegensatz zu der reduzierenden Glucose ist Trehalose nicht toxisch und kann in hohen Konzentrationen in der Hämolymphe (20mg pro ml Hämolymphe) vorliegen. Das Vorliegen hoher Trehalosekonzentrationen in der Hämolymphe ist notwendig, da besonders die Flugmuskeln von Wanderheuschrecken, die ausschließlich aerob arbeiten, eine sehr hohe Stoffwechselrate aufweisen. Denn durch den aeroben Stoffwechsel wird ATP fast ausschließlich durch die vollständige Oxidation der Substrate erzeugt. Die Sauerstoffversorgung ist durch das Tracheensystem sichergestellt. Die Trehalose wird im Fettkörper produziert und in die Hämolyphe sezerniert. Im Flugmuskel wird dann das Disaccharid durch das Enzym Trehalase in zwei Moleküle Glucose gespalten. Die Trehalase der Flugmuskulatur ist an Membranen gebunden und kommt in zwei Formen, nämlich als overte und als latente Form, vor. Die Aktivität der overten Form kann im Homogenat direkt gemessen werden, wohingegen die latente Form erst durch das Zerstören der Membranen durch Detergenzien, wie Triton-X 100, gemessen werden kann. Um zu zeigen, daß die latente Form für das Substrat (und damit auch für Inhibitoren) nicht zugänglich ist, wird der kompetitive Inhibitor Trehazolin in die Hämolymphe injiziiert. Daraufhin sollt bei der overten Form nur noch wenig Aktivität nachgewiesen werden können, wohingegen die latente Form der Trahalase kaum beeinträchtigt werden sollte. Material / Methoden Je zwei Versuchstiere wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn mit 10 µg Trehazolin in 5 µl Ringerlösung injiziert. Die zwei Vergleichstiere wurden dagegen nur mit 5 µl Ringerlösung injiziert. Außerdem wurden die Tiere zusätzlich mit Wasser versorgt, um eine relativ hohe Ausbeute an Hämolymphe zu erlangen. Die Entnahme der Hämolymphe erfolgte durch eine Mikrokapillare durch einen vorherigen Einstich an den weichen Gelenkhäuten der Sprungbeine des Tieres. Es wurde bei den vier Versuchstieren möglichst viel Hämolymphe entnommen. Danach wurden die Tiere dekapitiert, die Flugmuskulatur entnommen und homogenisiert mit 9 Teilen 50 mm Natriummaleat ph 6. Die Flugmuskulatur wurde zur Bestimmung der overten und latenten Trehalase verwendet. Sämtliche Bestimmungen erfolgten am Photometer bzw. am Multiskan Ascent. Für den Enzymvergleich von Flugmuskel und Srungmuskel der Heuschrecke wurden für die Tests 459 mg bzw. 594 mg Flugmuskulatur und 405 mg bzw. 486 mg Sprungmuskulatur eingesetzt. Seite 1 von 7

2 Durchführung siehe Skript Ergebnisse Legende für die nachfolgenden Tabellen: T 1: T 2: R 1: R 2: Versuchstier 1 mit Trehazolin Versuchstier 2 mit Trehazolin Vergleichstier 1 mit Ringerlösung Vergleichstier 2 mit Ringerlösung MW: Mittelwert; MW X: Mittelwert des entsprechenden Tieres TX 1: Versuchstier 1 mit Trehazolin und Triton X 100 RX 1: Vergleichstier 1 mit Ringerlösung und Triton X 100 K: Kontrolle ohne Trehalose Bestimmung der Glucosekonzentrationen durch Multiskan Ascent: Tabelle 1: Konzentration (in mm) an Glucose, die durch die overte Form der Trehalase gebildet wurde Probe Mittelwert Kontrolle (MW) 10µl / 20µl MW 10µl / 20µl MW X - MW X K T1 0,059 0,0245 0,0345 T 2 0,0575 0,0265 0,031 R 1 0, , , R 2 0, , , Tabelle 2: Konzentration (in mm) an Glucose, die durch die gesamte Trehalase gebildet wurde Probe Mittelwert Kontrolle MW 10µl / 20µl MW 10µl / 20µl MW X -MW X K TX 1 0, , , TX 2 0, , , RX 1 0, , , RX 2 0, , , Tabelle 3: Konzentration (in mm) an Glucose, die durch die latente Form der Trehalase gebildet wurde Probe latente und overte F overte F Gesamte Trehalase - Overte Form T1 0, ,0345-0,00133 T2 0, ,031-0,01264 R1 0, , , R2 0, , , Seite 2 von 7

3 Berechnung der Trehalaseaktivität anhand den obigen Glucosekonzentrationen und der Formel im Skript Seite 11 unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors (27,5): Tabelle 4: Trehalaseaktivität der Proben (in U/g Frischgewicht) Probe overte Trehalaseaktivität Latente Trehalaseaktivität Mittelwerte T 1 0,24 n.n n.n. T 2 0,21 n.n. R 1 0,24 0,93 1,185 R 2 0,16 1,44 Die Konzentrationsbestimmung der gesamten Kohlenhydrate in der Hämolymphe wurde durch den Anthrontest bestimmt, eine vorherige Erstellung einer Standardgeraden und Messung der Extinktionen der Versuchstiere T 1 und T 2, sowie der Vergleichstiere R 1 und R 2 wurde druchgeführt. Die Standardgerade zeigt die zur Berechnung notwendige Geradengleichung: 1,2 1,0 y = 0,0101x + 0,0126 R 2 = 0,9942 0,8 Extinktion 0,6 0,4 0,2 0, Trehalose[µl] Abbildung 1: Standardgerade für die Trehalosebestimmung Tabelle 5: Berechnete Konzentrationen der gesamten Kohlenhydrate (in mm) Probe Extinktion Trehalose in µl Gesamtkohlenhydrate [mm] Mittelwert [mm] R1 0,122 10,8 22,9 33,35 R2 0,222 20,7 43,8 T1 0,537 51,9 109,8 130,95 T2 0,739 71,9 152,1 Seite 3 von 7

4 Tabelle 6: Berechnung der Glucosekonzentration Probe Anfangsextinktion Endextinktion Extinktion Glucose [mm] Ø Glucose [mm] 5 µl R 1 0,056 0,065 0,009 0,145 0, µl R 2 (1:10 verd.) 0,023 0,068 0,045 3,42 2, µl R 2 (1:10) 0,045 0,13 0,085 2,29 10 µl T 1 0,241 0,338 0,097 0,78 0,76 5 µl T 1 0,115 0,161 0,046 0,74 10 µl T 2 0,285 0,272 n.n. n.n. n.n Tabelle 7: Berechnung der Trehalosekonzentration der Hämolymphe Probe gesamte Kohlenhydrate [mm] Ø Glucose [mm] Trehalose [mm] R 1 22,9 0,145 22,8 R 2 43,8 2,855 40,9 T 1 109,8 0,76 109,0 T 2 152,1 n.n. 152,1 Tabelle 8: Enzymaktivitäten von Flug- und Beinmuskel (SM) Enzymaktivität in U/g FG SM1 SM2 Ø SM FM1 FM2 Ø FM PFK 72,35 49,58 60,965 48,63 34,97 41,8 CS 24,49 18,94 21, ,08 133,33 133,205 HOADH 8, ,01 21,095 17,04 19,06 LDH 6,02 6,22 6,12 1,6 2 1,8 (HOADH und LDH-Daten wurden von einer anderen Gruppe übernommen) 1000 Enzymvergleich von Flug- (FM) und Beinmuskulatur (SM) (logarithmische Darstellung) Enzymaktivität in U / g FG PFK CS HOADH LDH 1 Ø SM Ø FM Abbildung 2: Enzymvergleich von Flug (FM)- und Beinmuskulatur (SM) der Heuschrecke (logarithmische Darstellung) Seite 4 von 7

5 Die Werte in Tabelle 1 zeigen, daß die Versuchstiere T 1 und T 2 die gleichen bzw. höhere Glucosekonzentrationen wie die Kontrolltiere R 1 und R 2 aufweisen. Bei der Messung der Glucosekonzentrationen (Tabelle 2), die durch die gesamte Trehalase gebildet wurde, ist zu erkennen, daß die Glucosekonzentration bei den Kontrolltieren R 1 und R 2 höher ist als die der Versuchstiere T 1 und T 2. Die Berechnung der durch die latente Form der Trehalase gebildete Glucosekonzentration erfolgte durch die Bildung der Differenz von der gesamten Trehalase gebildeten Glucosekonzentration und der durch die overte Form gebildeten Glucosekonzentration. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 ersichtlich. Da die Werte in Tabelle 1 und Tabelle 2 nicht aussagekräftig sind und die Werte der overten Form größer sind, als die der Gesamtaktivität, sind die Werte für die Versuchstiere T 1 und T 2 nicht nachweisbar (n. n.). Nach der Berechnung der Trehalaseaktivität (Tabelle 4) anhand der Glucosekonzentrationen kann für die Versuchstiere T 1 und T 2 keine Aussage gemacht werden. Bei den Kontrolltieren R 1 und R 2 dagegen ist ersichtlich, dass die Menge an latenter Trehalase höher sein muss, als die der overten Form. In Tabelle 5 sind die Konzentrationen der gesamten Kohlenhydrate der Hämolymphe gemessen worden. Man geht davon aus, daß die Hämolymphe ausschließlich Trehalose und Glucose beinhaltet. Bildet man nun die Differenz der Konzentrationen der gesamten Kohlenhydrate und die der Glucose (Tabelle 6), so erhält man die Trehalosekonzentration der Hämolymphe (Tabelle 7). Anhand der Ergebnisse kann festgestellt werden, daß die Trehalosekonzentrationen der Versuchstiere T 1 und T 2 gegenüber dem Kontrolltier R 2 stark angestiegen sind (Kontrolltier 1 sollte hier nicht betrachtet werden, ein Messfehler ist nicht ausgeschlossen.). Dagegen haben die Konzentrationen an Glucose abgenommen. Das Kontrolltier R 2 zeigt normale Glucosewerte. Betrachtet man neben dem Flugmuskel auch die Beinmuskeln fallen vom Enzymmuster Unterschiede auf, die auf die Funktion der Muskeln zurückzuführen sind. Es fällt auf, daß die Lactatdehydrogenase (LDH) nur eine geringe Ezymakivität pro Gramm Frischgewicht aufweist. Vergleicht man die Muskeltypen untereinander, so zeigt sich, daß die Flugmuskulatur eine geringere Enzymaktivität der LDH (1,8 U / g FG) besitzt als die Sprungmuskulatur (6,12 U / g FG). Ein umgekehrtes Bild zeigt sich bei der Betrachtung der HOADH. Die Enzymaktivität der HOADH ist beim Flugmuskel höher (19,06 U / g FG) als bei der Sprungmuskulatur (9,01 U / g FG). Die Enyzmaktivitäten der Citratsynthase (CS) unterscheiden sich extrem. Die Enzymaktivität der CS liegt beim Sprungmuskel bei 21,7 U / g FG, bei dem Flugmuskel dagegen bei 133,2 U /g FG. Seite 5 von 7

6 Die Enzymaktivität der PFK ist beim Flugmuskel (41,8 U / g FG) geringer als beim Sprungmuskel (60,965 U / g FG). Diskussion Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen nicht die erwarteten Werte, da die Versuchstiere T 1 und T 2 die gleichen bzw. höhere Glucosekonzentrationen wie die Kontrolltiere R 1 und R 2 aufweisen. Dies ist erstaunlich, da die overte Form der Trehalase in den Versuchstieren T 1 und T 2 durch Trehazolin gehemmt sein sollte. Bei den Vergleichstieren sollte die Trehalase ohne Einschränkungen die Reaktion katalysieren können. Dies ist bei den von uns gemessenen Ergebnissen nicht zu erkennen. Desweiteren sind auch die Ergebnisse der Tabelle 2 verwunderlich. Die Glucosekonzentrationen sollten ungefähr gleich hoch sein, da die latente Form der Trehalase nicht durch Trehazolin gehemmt wird. Außerdem ist die Menge an der latenten Form von Trehalose viel größer als die der overten Form. Eine Erklärung für die geringere Glucosekonzentration bei den Versuchstieren TX 1 und TX 2 kann auf eine Verunreinigung der Lösungen durch Trehazolin zurückgeführt werden. Dadurch wäre auch die latente Form der Trehalase gehemmt worden. Anhand Tabelle 7 und Nichtbeachtung der Ergebnisse des Kontrolltiers 1 können die Abnahme der Glucosekonzentration und der Anstieg der Trehalosekonzentration der Versuchstiere T 1 und T 2 darauf zurückgeführt werden, daß die Tiere nur Glucose verstoffwechseln können. Ist die Trehalase durch Trehazolin gehemmt, steigt die Konzentration an Trehalose an, die der lebenswichtigen Glucose dagegen fällt rapide ab (Tabellen 6 und 7). Ein weiteres Absinken der Glucosekonzentration führt schließlich zum Tod des Tieres. Diese Erklärung wird durch die Werte des Kontrolltiers R 2 unterstützt, da hier die verbrauchte Glucose durch die funktionierende Trehalase nachgeliefert wird. Die obige Betrachtung der Enzymmuster der Flug- und Sprungmukulatur lassen folgende Interpretationen zu: Die Flugmuskulatur ist für eine Dauerleistung ausgelegt, die Beinmuskulatur (Sprungmuskel) dagegen nur für ein Paar Sprünge. Die Flugmuskulatur arbeitet bei dieser Dauerbelastung ausschließlich aerob, was die geringere Enzymaktivität der LDH erklärt. Die Sprungmuskeln müssen dagegen auch anaerob arbeiten können, da die Versorgung an Sauerstoff nicht so stark wie bei der Flugmuskulatur garantiert ist, deswegen weist die FM eine geringere Aktivität der LDH auf. Diese Tatsachen lassen sich auch an der ß-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (HOADH) erkennen. Der Flugmuskel stellt die Energieversorgung wohl hauptsächlich aus Fettverbrennung sicher. Deswegen benötigt die FM auch eine hohe Aktivität der CS, die sich auch hier erkennen lässt. Dies läßt sich wohl auf die enorrme Flugleistung der Heuschrecken zurückführen. Die Beinmuskulatur dagegen arbeitet eher selten, dann schnell und kurz (LDH wird aktiv) und benötigt deswegen eine geringere CS-Aktivität. Seite 6 von 7

7 Die Unterschiede bei der Phosphofructokinase (PFK) lassen sich vielleicht dadurch erklären, daß der Flugmuskel die Energie (bei Langstreckenflügen) aus Fett gewinnt und da die Glykolyse zurückreguliert wird. Die Beinmuskulatur gewinnt die Energie durch die Glycolyse und dem nachgeschalteten Citratzyklus. Deswegen ist die PFK-Aktivität hier höher. Seite 7 von 7