-APP-A Serologische Diagnose der Schweine-Ple anhand eines indirekten ELISAs spezifisc Antikörper gegen das ApxIV RTX Toxin
Übersicht Der Erreger Epidemiologie Diagnostik CHEKIT-APP-Apx-IV
Der Erreger Actinobacillus pleuropneumoniae Gramnegatives Bakterium 1960 erstmals in England, in Kalifornien und in Australien Früher der Gruppe Heamophilus zugeordnet: H. H. Im 1983 wird eine Verwandtschaft zwischen H. pleuropne beschrieben Variable Virulenz je nach Serotyp hoch virulen Das Schwein ist der einzige Wirt für APP Weltweite Verbreitung mit massgeblichem wirtschaftliche Schweineindustrie 15 verschiedene Serotypen
Der Erreger Virulenzfaktoren Exotoxine Lipopolysacharide (Fennwick and Osburn, 1986) Bakterielle Kapsel (Jnzana et al, 1993; Ward et al. 1998 Adhesionsfaktoren (Dom et al. 1994) Urease (Bosse and McInnes, 1997)
Der Erreger Toxine Exotoxine: RTX Toxine APX: Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxine Apx-I Apx-II Apx-III Neu Apx-IV
Der Erreger APX RTX Toxine a b Secreted toxins Biovar Serotype ApxI ApxII ApxIII 1 2 2 3 4 5a 5b 6 7 7 8 9 9 10 11 12 13 14 15 Cross reaction A.suis A.suis A.rossii - A.porcitonsillarum
Epidemiologie Hochansteckende Krankheit Übertragung durch infizierte Tiere Bei akuten Infektionen rasche Verbreitung im Stall (aerog Virulenz abhängig von: - Serotyp hoch virulen - Prim. /sekundäre Infektionen (PRRS, Cir - Stallmanagement Schwache Widerstandsfähigkeit in der Umwelt
Epidemiologie Problematik Trägertiere ohne klinische S
Diagnostik Diagnostische Mittel Klinik Pathologie Serologie Erregernachweis Bakteriologie/PCR
Diagnostik Serologie KBR Vorteil: Keine Kreuzreaktion mit H. Nachteil: Schlechte Sensitivität Schwierige Standardisieru Arbeitsaufwendige Technik
Diagnostik Serologie Indirekte Hämaglutination Vorteil: Keine Kreuzreaktion mit H. p Nachteil: Schlechte Sensitivität Schwierige Standardisierung Arbeitsaufwendige Technik
Diagnostik Serologie ELISA mit Kapselantigene oder zelluläres Lipopolys Vorteil: Schnelle Methode Einfache Standardisierung Nachteil: Leistungsmerkmale abhängig vo Nicht serotypenspezifisch (z.b. 1 Mehrere Tests notwendig um al Kreuzreaktionen mit anderen Ke
Diagnostik Serologie ELISA mit ApxI, ApxII und/oder ApxIII Antigen Vorteil: Schnelle Methode Einfache Standardisierung Nachteil: Leistungsmerkmale abhängig vo Mehrere Tests notwendig um al Kreuzreaktionen mit anderen Ke - E.coli - A. porcitonsilla - A. suis - A. rossi
Diagnostik Serologie ELISA mit ApxIV Vorteil: Schnelle Methode Einfache Standardisierung Erfassung aller 15 Serotypen APP spezifisch Differenzierung von geimpften u (Schaller et al. 2001)
Diagnostik Produktion und Reinigung von rekombinantem ApxIV Expression in E. coli B Stamm BL21(DE3) Affinitätschromatografische Reinigung mit Ni2+ 1 200 400 600 800 1000 1200 pjffrok7 hydrophobic domains repeated glyc ApxIV 6xHis ApxIV-N Apx 6xHis 6xHis ApxIV
Control + ApxIV-N ApxIV-C experimentell und natürlich APP i Schweine A. suis 1 2 3 4 5a 5b 6 7 8 9 10 11 12 88-1368/3 88-1209/14 88-1209/58 88-1356/657 88-1209/35 1925 Bre 1926 Bre 1930 Bre 1935 Bre 1765 Jen Experimentelle Infektion mit 12 APP Serotypen Natürliche Infektion mit APP1 Schaller et al. (1999) Natürliche Infektion mit APP2 S A S
175-83 - 62-47.5-32.2 - Antigenetische Spezifität von vo Schaller et al. (1999) std ApxIVA serotype 1 serotype 2 ApxI ApxII ApxIII ApxI ApxIVA ApxII ApxIVA ApxIII kda anti - ApxIVA Ak anti- ApxI Ak anti- ApxII Ak anti- ApxIII Ak
kda 175 83 47 32 ApxIV wird nur während der Infek Serotyp 1 Serotyp 5 Sero 1 2 3 4 5 6 7 14 0 120 14 0 120 14 0 120 14 0 120 0 14 120 0 14 120 0 120 14 Schaller et al. (1999)
ApxIV Zusammenfassung a b Secreted toxins Biovar Serotype ApxI ApxII ApxIII 1 2 2 3 4 5a 5b 6 7 7 8 9 9 10 11 12 13 14 15 Cross reaction A.suis A.suis A.rossii - A.porcitonsillarum
-APP-A
2 Platten Kit 2 Stück 1 x 0.6 ml 1 x 0.9 ml 1 x 0.9 ml 1 x 100 ml 1 x 100 ml 1 x 100 ml 1 x 60 ml -APP-ApxIV 10 Platten Kit "Bulk" Ware 2 x 5 Stück à 5 Stück CHEKIT-APP-ApxIV Testplatten, Antigen beschichtet. 1 x 0.6 ml à 1.2 ml CHEKIT-Anti-Schwein-IgG-PO-K markiert mit Meerrettichperoxidas 2 x 0.9 ml à 0.9 ml CHEKIT-APP-ApxIV-Kontrollseru konserviert mit 0.1 % Natriumazid 2 x 0.9 ml à 0.9 ml CHEKIT-APP-ApxIV-Kontrollseru konserviert mit 0.1 % Natriumazid 1 x 100 ml à 100 ml CHEKIT-APP-ApxIV Probenverd 3 x 100 ml à 500 ml CHEKIT-10x-Konzentrat, nicht g 2 x 100 ml à 100 ml CHEKIT-TMB-Substrat, gebrauch 1 x 60 ml à 60 ml CHEKIT-TMB-Stopplösung, gebr
-APP-ApxIV Testablauf Verdünnung der Proben und Kontrollen: 1:10 Verdünnung 100 µl/well Inkubation: 60 Minuten bei 37 C Waschen der Platte: 3 x 300 µl Wasch-& Verdünnerlösung Konjugat Verdünnung: 1:400, 100 µl/well Inkubation: 60 Minuten bei 37 C = ApxIV Antigen = anti-apxiv AKs Wasch 3 Wasch-&
ROC Kurve n = 208 111 negative Proben 97 positive Proben -APP-ApxIV 100 APP 80 60 40 Sensitivity 20 0 0 20 40 60 80 100-Specificity
-APP-ApxIV Verteilung 900 Positive Negativ 800 700 600 500 400 300 200 CHEKIT-APP-ApxIV (S/P in %) 100 0-100 APP Diagnosis=1 APP Diagnosis
Spezfität 80 70 67-60 50 40 30 20 20 20 10 1 3 0 < -5-5 - 0 0-5 5-10 10-15 15-20 20-25 25-30 CHEKIT-APP-ApxIV % classes Number of samples 111 Proben von SPF Tieren und von Herden ohne APP Vorgeschichte (Western Blot negativ) -APP-ApxIV
Nicht pathogener Actinobaci Gottschalk et al., University of Montréal, 2003 Zwei atypische Actinobacillus Stämme (9953L55 and 0347 h Isoliert von Schweinen: - Ohne klinische Symptome e - Keine pathologischen Verän - Historisch kein APP im Bes h Ursprünglich antigenetisch und biochemisch als APP h Mit allen phänotypischen Eigenschaften von APP Experimentelle Infektion: beide Stämme sind nicht pat Phylogenetische Analyse (16S rrna) : Stämme unters Ak gegen 9953L55 kreuzreagieren mit App S1-9 -11 s
Non-pathologische Actinoba Stamm 953L55 führt zu Kreuzreaktionen in konventionelle ELISA (Gottschalk et al., 2003) Gottschalk et al. (2003)
-APP-ApxIV Spezifität 200 180 160 140 120 100 80 60 40 CHEKIT-APP-ApxIV (%) 20 0 1 2 3 4 1 = APP negative Schweine, n = 134 2 = APP/6 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., n 3 = APP/7 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., n 4 = APP/10 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., 5 = A. porcitonsillarum experimentell infizierte Schweine 5
-APP-ApxIV Analytische Sensitivität Experimentelle Infektion - aerosol - 10 Wochen alte SPF Tiere - APP Serotyp 6, 7 and 10. - Euthanasie nach 5 Wochen - Alle Tiere zeigten - Infektionskeim wurde aus Läsionen isoliert 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Figure 2a. +? - APP Seroty CHEKIT- APP- ApxIV (%) 10 dpi 0-1 3 7 10 14 dpi
140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -APP-ApxIV APP Serotype 6 +? - +? - 1 2 3 4 5 6 7 dpi CHEKIT- APP - ApxIV (%)
300 250 200 150 100 50 0 -APP-ApxIV APP Serotype 10 0 3 6 10 13 17 20 24 27 31 dpi CHEKIT- APP- ApxIV (%)
-APP-ApxIV Analytische Sensitivität 100 APP/2 KBR Referenzserum (VLDIA070, SW-APP2, AHS, Deventer, NL). Titer 1/320 5-10x höhere Sensitivität verglichen mit der KBR 90 80 70 60 50 40 30 20 CHEKIT-APP-ApxIV (%) 10 0 1/1.25 1/5 1/20 Dilutio
-APP-ApxIV Differenzierung zwischen geimpften (Porcilis APP) Impfung Infektio ApxIV negativ
Porcilis APP trial Group 1 (Control) 15.0 10.0 5.0 0.0 Titer (LOG2) -5.0-10.0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Age (week) 15.0 10.0 5.0 0.0-5.0-10.0
15.0 10.0 5.0 0.0-5.0-10.0 Porcilis APP trial Group 2 (Lot vaccin 70405 A) 15.0 15.0 10.0 10.0 5.0 0.0 5.0 0.0-5.0-10.0-10.0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Pig age (week) Group 3 Titer (LOG2) PP (%) Titer (LOG2) -5.0 1st vacc. 2nd vacc. 6 7 8 1st vacc. P Apx I (titer) Apx II (titer) Apx III (titer) OMP (titer) Apx IV (%)
-APP-ApxIV Bestätigungsmethode: Western-blot Use of recombinant ApxIV in serodiagnosis of Actinoba infections; development and prevalidation of the A A. Dreyfus a, A. Schaller b, S. Nivollet b, R.P.A.M. Segers c, M. Kobisch Hüssy a, R. Miserez a, W. Zimmermann g, F. Inderbitzin h and J. F a Institute of Veterinary Bacteriology, University of Berne, Laenggass-Strasse 1 b Bommeli Diagnostics, Stationsstr. 12, CH-Liebefeld, Bern, Switzerland c Intervet International, P.O. Box 31, NL-5830 AA Boxmeer, The Netherlands. d Unité de mycoplasmologie bactériologie, AFSSA, BP 53, F-22440 Ploufragan e Laboratoire de développement et d'analyses des Côtes d'armor, BP 54, F-2244 f Danish Veterinary Institute, Bülowsvej 27, DK-1790 Copenhagen V, Denmark g Clinic for Swine Diseases University of Berne, and pig health service, Bremga h SBAG Schlachtbetrieb SG AG, CH-9015 St. Gallen, Submitted (2003)
-APP-ApxIV Zusammenfassung Spezifität: 99% - 100% Sensitivität: 95% - 100 % Einzige serologische Methode welche alle Serotype Keine Kreuzreaktionen mit anderen Keimen Differenzierung zwischen geimpften (Porcilis APP) a
-APP-ApxIV