Experimentiertag am Geschwister-Scholl-Gymnasium in Winterberg??? Lebensmittelkontrolle PCR-Nachweis verschiedener Fleischsorten 05.07.2012
Universität Kassel
Das Labor
ACHTUNG! Nicht! - Essen - Trinken -Schminken (Lippenstift usw.)
Lebensmittelkontrolle Zum Tagesablauf 1. DNA-Isolierung aus einer Fleischprobe 2. Vervielfältigung eines DNA-Abschnittes des Mitochondriengenoms durch eine speziesspezifische PCR 3. Auftrennung der kopierten DNA-Abschnitte durch Gelelektrophorese und Überprüfung der Vervielfältigung 4. Auswertung der Ergebnisse
Die Pipette: Werkzeug des Genetikers
Zur Funktion der Pipetten
1. Isolierung der mitochondrialendna aus einer Fleischprobe +350 µl Lyse- Puffer 55 C für 15 min 10 min auf Eis +150 µl NaCl- Lösung 500 µl Überstand in neues Eppi +4 µl RNase 5 min auf Eis 20.000 rcf, 10 min Pellet 37 C für 15 min +350 µl Isopropanol +500 µl Ethanol 55 C für 15 min +100 µl UV-Wasser 20.000 rcf, 20 min Überstand abgießen 16.000 rcf, 5 min Überstand abgießen ENDE!
Die Polymerasekettenreaktion(PCR) Der Erfinder www.karymullis.com Karry B. Mullis ½ Nobelpreis für Chemie 1993
Die Polymerasekettenreaktion(PCR) Die AbkürzungPCR stehtfür: Polymerasekettenreaktion engl.: polymerase chain reaction Sie ist eine Kopiermethode für DNA-Stücke. Thermocycler Innerhalb von ein bis zwei Stunden kann man von einervorlageetwa eine Million bis eine Milliarde Kopien herstellen.
Wie funktioniert die PCR? DNA als Doppelstrang Denaturierung: Doppelstränge schmelzen
Exkurs: Wasserstoffbrücken-Bindung A T G C http://www.coe.drexel.edu/ret/personalsites/2005/dayal/curriculum1_files/image001.jpg
Wie funktioniert die PCR? DNA als Doppelstrang Denaturierung: Doppelstränge schmelzen Annealing: Anlagern der Primer 35 mal Elongation: 2 neue Doppelstränge entstehen
Die Polymerasekettenreaktion(PCR) Bei dem ersten PCR-Zyklus entstehen aus einem Doppelstrang zwei Doppelstränge. In dem zweiten Zyklus entstehen aus diesen beiden jeweils wieder zwei, also insgesamt 4 Doppelstränge. Bei jedem PCR-Zyklus verdoppelt sich also die Anzahl der vorhandenen Doppelstränge. Für 4 Zyklen macht das: 1 2 2 2 2 = 2 4 = 16 Kopien Für 32 Zyklen ergibt das: 2 32 = 4,3 Milliarden Kopien!!!
Die Polymerasekettenreaktion(PCR) Welche DNA-Polymerase benötigen wir? Da eine hitzestabile DNA- Polymerase für die PCR große Vorteile hat, wird diese aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus gewonnen. http://de.wikipedia.org/wiki/bild:thermus_aquaticus.jpg So wurde sie unter dem Namen Taq-Polymerase weltberühmt.
Science Bridge 2009, Sara Müller DeLano, W. L. ( 2002). "The PyMOL Molecular Graphics System." Die DNA-Polymerase Molekulare Struktur der DNA-Polymerase Interaktion der Taq-Polymerase mit einem DNA-Strang
Was brauchen wir für die PCR? Nucleotide DNA 2 Primer Polymerase verschiedene Temperaturen
Welchen DNA-Abschnitt untersuchen wir? Wo findet man überall DNA in der Zelle? Mitochondrium Zellkern
Welche DNA weisen wir nach? Es wurde ein DNA-Gemisch isoliert. Es enthält je nach Probe: Anteile von genomischer DNA (gdna) Mitochondrien DNA (mtdna) von Pute Schwein Rind Wie ist es möglich, nur eine Fleischsorte in der Probe nachzuweisen? Durch PCR ist es möglich, nur eine DNA/ Fleischsorte nachzuweisen.
Warum haben Mitochondrien ein Genom? Endosymbiontentheorie ursprünglicher Prokaryot Zelle mit Zellkern und Membransystem Zelle mit Mitochondrien Einfalten der Membran Aufnahme eines aeroben, heterotrophen Prokaryoten
Das Mitochondriengenom Mitochondrien werden über die Mutter vererbt Mitochondrien können sich selbst duplizieren Sie haben ein ringförmiges Genom Meltonet al. 2012 Ihr Genom enthält innerhalb einer Art wenig Variation
DNA-Sequenzen der verschiedenen Arten sind variabel DNA-Sequenz (Ausschnitt DNA Polymerase b) Homo sapiens (Mensch) Pan troglodytes(bonobo) Macaca fascicularis(makak) Callithrix (Weißbüschelaffe) Canis familiaris(hund) Sus scrofa(schwein) Mus musculus(maus) Rattus norvegicus(ratte) Aminosäure-Sequenz (Ausschnitt DNA Polymerase b) Homo sapiens (Mensch) Pan troglodytes(bonobo) Macaca fascicularis(makak) Callithrix (Weißbüschelaffe) Canis familiaris(hund) Sus scrofa(schwein) Mus musculus(maus) Rattus norvegicus(ratte) Obwohl sich die DNA-Sequenzen zwischen den Arten unterscheiden, ist das entstehende Protein sehr ähnlich!
Obwohl sich die DNA-Sequenzen zwischen den Arten unterscheiden, ist das entstehende Protein sehr ähnlich! Es gibt mehrere Codons für eine Aminosäure. Diese Uneindeutigkeit des Codes wird als Wobbel bezeichnet. Die mit Serin beladene t-rna kann an die Codons UCU und UCC auf der m-rna binden G-U Basenpaarung ist in RNA recht häufig und ziemlich stabil
Wie funktioniert eine speziesspezifische PCR? speziesspezifisch= die PCR unterscheidet zw. DNA bestimmter Spezies (Tierart) Primer binden Primer binden nicht Polymerase hat eine Startpunkt Es werden viele Kopien hergestellt Keine Vervielfältigung
Die verwendeten Primer Passen nur zur mtdnaeiner bestimmten Spezies Tierart Keine Vervielfältigung Keine Vervielfältigung Schweine-DNA
Warum erkennen die Primer ihre komplementäre Sequenz so zielgenau? Diese Primer dienen dem Nachweis von Schweinefleisch 1. Primer (28 bp) 5 -GAAAAATCATCGTTGTACTTCAACTACA-3 2. Primer (22 bp) 5 -GGTCAATGAATGCGTTGTTGAT-3 Wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass es eine zweite zum 1. Primer komplementäre Sequenz gibt? Die Wahrscheinlichkeit, dass sich ein C an einer Stelle im Genom befindet, beträgt ¼. Die Wahrscheinlichkeit, dass auf ein Cein Tfolgt, beträgt ¼ x ¼usw. Die Wahrscheinlichkeit für eine zweite, zum 1. Primer komplementäre Sequenz: (¼) 28 = 1,4 x 10-17 = = Einzweiundsiebzigbilliardstel
Wie können wir die Vervielfältigung überprüfen und die PCR-Produkte sichtbar machen?
Agarosegelelektrophorese
Was ist Agarose? Was ist eine Elektrophorese? Agarose: Der Hauptbestandteil des Gels wird aus Algen gewonnen, ein mikroskopisch kleines 3D Gitter bildet. http://www.bulkfoods.com/pictures/gelidium.jpg http://de.wikipedia.org/wiki/bild:agar_plate.jpg Elektrophorese: Trennverfahren für biologische Moleküle, die elektrisch geladen sind, z. B. DNA. Diese Trennung erfolgt nach der Größe der Moleküle.
Exkurs: Ladung der DNA
Wie funktioniert das genau? - Das Gel ist durchlöchert. (Gitter der Agarose) Je kleiner ein DNA-Fragmente ist, desto schneller kann es im Gel wandern. DNA-Fragmente gleicher Länge wandern gleich schnell und bilden eine Bande. +
Agarosegelelektrophorese Der Farbstoff: SYBR gold Erscheint im Gel farblos und fluoresziert erst bei Schwarzlicht. Lagert sich in die DNA ein und leuchtet dadurch stärker. Das SYBR gold wird unseren PCR- Produkten zugesetzt.
Agarosegelelektrophorese http://www.fermentas.com/catalog/electrophoresis/images/generulersm0321.jpg Der Marker: 100bp + DNA-Marker Besteht aus einer Mischung von DNA-Fragmenten bekannter Größe. Im Vergleich dazu kann man die Größe der untersuchten DNA-Fragmente bestimmen. Die Größen sind in Basenpaaren (bp) angegeben.
Agarosegelelektrophorese Wie sieht so ein Gel aus?
Wie kann man die PCR (noch) einsetzen?
Unterscheidung verschiedener Arten (Artspezifische PCR) Unterscheidung verschiedener Individuen (Individuen-spezifische PCR) DNA- Abschnitt Mutations rate Für diese Art konserviert niedrig möglichst variabel hoch untersuchter DNA- Abschnitt z.b. Mitochondrien-DNA, bestimmte Gene z.b. DNA unbekannter Funktion, Mikrosatelliten PCR-Produkt vorhanden oder nicht Größe der Fragmente Anwendung Nachweis von Fleischsorten, Lebensmittelkontrolle Genetischer Fingerabdruck Vaterschaftstest Strafverfolgung
Einsatzgebiete der PCR Der genetische Fingerabdruck hilft......bei der Aufklärung von Gewaltverbrechen...bei der Rekonstruktion von Tathergängen...Vaterschaftstest Wichtig! Hier geht es um die Identifikation von Individuen!
Nachweis von Krankheitserregern Erreger-/Artspezifische Primer http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/thumb/c/c4/salmonelle.jpg/280px-salmonelle.jpg http://maria.nyus.de/meal/bilder/salat-spaghetti.jpg Salmonellen
Lebensmittelindustrie / Verbraucherschutz Ist da Rind Schwein oder Geflügel in der Wurst?
Nachweis gentechnisch veränderter Lebensmittel z.b. im Fall der Sojabohne Seit1945 istsiedie wichtigstepflanzefürdie Produktion von Öl und Eiweißen. Gentechnisch veränderte Pflanzen besitzen ein mittels gentechnischer Methoden eingefügtes Gen. Dies Gen verleiht den Pflanzen eine Resistenz gegen ein Herbizid. Glycine max
Maßgeschneiderte Medikamente bei Arzneistoffen, die bei bestimmten Genvarianten nicht wirken. http://www.gesundheitsverzeichnis24.de/index.php?page=55
Weitere Anwendungsmöglichkeiten der PCR Diagnose von Erbkrankheiten Bluterkrankheit(Hämophilie) ErblicheDiabetes Phenylketonurie(PKU) Multiple Sklerose(MS) Chorea Huntington
Was ist in meiner Suppe? Du bist Sachbearbeiter beim Lebensmittelamt und sollst den Fall Zur goldenen Pute Aktenzeichen (0816) bearbeiten. Der Küchenjunge Linguiniwurde angeklagt, weil der Restaurantkritiker Ego behauptet, in der Erbsensuppe der Restaurant sei Rattenfleisch verarbeitet worden. Linguiniist eine sehr tollpatschiger Menschen und hat auch in der Küche zwei linke Hände. Durch einen Zufall lernt er Remy, eine Meisterkochratte, kennen und arbeitet fortan mit ihm zusammen. Wie könntest du herausfinden, ob das Fleisch in der Erbsensuppe von einer Ratte stammt? Lässt sich herausfinden, ob die gefundene DNA-Spur durch Remy in die Suppe gelangt sein könnte?
Arbeitsmaterial 1: Auszug aus dem Gutachten: Die DNA-Isolation wurde vor Ort durchgeführt, um die Materialien möglichst zeitnah zu untersuchen. Anschließend wurde die Probe mittels PCR auf die Anwesenheit von Schweinefleisch, Rindfleisch und Rattenfleisch getestet. Das PCR-Produkt wurde mit UV-Licht bestrahlt, um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen.
Arbeitsmaterial 2: Wiederholung des Versuchs durch einen unabhängigen Gutachter Erbsensuppe Vergleichsbanden Schwein Rind Ratte Negativ-Kontrolle* *Besteht nur aus dem Mastermix und enthält keine isolierte DNA
Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit!