Klassifikation des von-willebrand-syndroms. Klinik für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie, Universitäts-Klinikum Hamburg-Eppendorf

27/37 2004 Schattauer GmbH Klassifikation des von-willebrand-syndroms R. Schneppenheim 1, U. Budde 2 1 Klinik für Pädiatrische Hämatologie und Onkologie, Universitäts-Klinikum Hamburg-Eppendorf 2 Gerinnungslabor Prof. Arndt und Partner, Hamburg Schlüsselwörter Von-Willebrand-Syndrom Zusammenfassung Das von-willebrand-syndrom (VWS) ist bekannt für seine ausgesprochene Heterogenität, die sich in der klinischen Symptomatik und Pathophysiologie ausdrückt. Grundlage der phänotypischen Differenzierung sind quantitative und qualitative Unterschiede des von-willebrand-faktors (VWF) sowie seine multimere Struktur. Nach Einführung der Multimeranalyse des VWF wurden eine Vielzahl verschiedener Subtypen des VWS beschrieben, die sich im elektrophoretischen Wanderungsverhalten der VWF-Multimere unterschieden. Eine erste Klassifikation von Ruggeri und Zimmerman 1987 war mehr eine Sammlung der verschiedenen Phänotypen als eine systematische Einteilung, da die zu Grunde liegenden Strukturanomalien des VWF nicht bekannt waren. Die genauere Beschreibung diverser funktioneller Defekte des VWF ermöglichte dann eine Revision der ersten Klassifikation durch Sadler 1994, die vor allem das Ziel einer Vereinfachung der Klassifikation hatte und auf die klinisch relevanten Unterschiede fokussierte. Zu diesem Zeitpunkt waren jedoch viele molekulare Ursachen des VWS nicht bekannt. Die Einführung molekularer Techniken und die Analyse des VWF ermöglicht seitdem exakte Genotyp/Phänotyp-Korrelationen, die eine sichere Basis für eine verbesserte Klassifikation des VWS bieten. Das von Willebrand-Syndrom (VWS) wurde bereits von Erik Adolf von Willebrand 1926 als heterogene Blutungsneigung beschrieben. Diese Heterogenität manifestierte sich in den klinischen Symptomen sowie in den Laborparametern (51). Bis es 1971 Zimmermann und Mitarbeitern gelang, das so genannte Faktor-VIII-assoziierte Antigen, Keywords Von Willebrand disease Summary Von Willebrand disease (VWD) is known for its marked heterogeneity which was already recognized by von Willebrand in 1926. The basis of phenotypic differentiation are quantitative and qualitative or functional differences between the different types and subtypes of VWD. One of the most important tools in the classification of VWD is multimer analysis that visualizes many of the structural abnormalities of mutant VWF. The introduction of multimer analysis was followed by the identification of an increasing number of different VWD phenotypes that were first reviewed in 1987 by Ruggeri and Zimmerman, thus forming a first classification of the disease. However, the detection of additional phenotypes required a revision of the nomenclature at a time point when only a few types of VWD had already been analyzed on the molecular level. Consequently, the molecular data only played a minor role in the revised classification published by Sadler in 1994. The advent of molecular techniques provided the opportunity for genotype/phenotype studies which recently helped not only to elucidate or confirm important functions of VWF and its steps of post-translational processing but also many disease causing defects. The reproducible correlation between certain phenotypes and particular mutations can now be used for a molecular approach towards a soundly based classification of VWD, equally useful for the clinician and for research requirements. Classification of von Willebrand disease Hämostaseologie 2004; 24: 27 36 das später VWF-Antigen (VWF:AG) genannt wurde, nachzuweisen (56), beruhten Beschreibungen der Erkrankung im wesentlichen auf der klinischen Symptomatik. Verschiedene Bezeichnungen für das VWS, wie Pseudohämophilie (51), konstitutionelle Thrombozytopathie (50) und vaskuläre Hämophilie (48) reflektierten nicht nur die zunehmenden Erkenntnisse über die Erkrankung, sondern auch die Kenntnis verschiedener Phänotypen. Das VWS kann auf der Basis der Schwere und Qualität der klinischen Symptome unterschieden Verschiedene genetische Varianten und eine Unterscheidung zwischen quantitativen und qualitativen Defekten wurden zuerst durch Holmberg und Nilsson beschrieben (15). Die Ära der biochemischen Charakterisierung des VWS, die in den 1970er Jahren begann, bot eine differenziertere Diagnose der Erkrankung und eine erste umfassende Klassifikation auf der Basis quantitativer, struktureller und funktioneller Defekte des VWF, des Proteins, das beim VWS defizient ist (30, 33). Wir wissen inzwischen, dass die Heterogenität des VWS auf der Eigenschaft des VWF als multifunktionellem Protein beruht. Hinzu kommen eine komplexe Biosynthese mit umfangreicher posttranslationaler Modifikation und das Vorhandensein verschiedener Wege des intrazellulären Transports und der Sekretion des VWF.Auf all diesen verschiedenen Ebenen von der Transkription zur Sekretion können Fehler auftreten und als spezielle Typen eines VWS manifest Die Klonierung und Sequenzierung der VWF-cDNA durch vier verschiedene Arbeitsgruppen im Jahre 1985 (13, 21, 35, 49), die Entdeckung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Publikation der genomischen Struktur des VWF 1989 (23) bot die notwendigen Informationen und Werkzeuge für die molekulare Analyse des VWS. Seitdem waren Phänotyp/Genotyp- Analysen bei Patienten mit verschiedenen Typen des VWS möglich, welche die Grundlage für eine Korrelation der Struktur und Funktion des VWF boten. Jetzt ist die komplette genomische Sequenz des VWF-Gens verfügbar, so dass sämtliche Exons mit ihren Exon/Intron-Grenzen auf

28/38 Schneppenheim, Budde Kandidatenmutationen untersucht werden können. Die Bedeutung dieser Mutationen für einen speziellen Phänotyp kann durch Expressionsstudien überprüft Eine umfangreiche Sammlung der Genotypdaten von präzise beschriebenen VWS-Phänotypen, Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den verschiedenen Typen und Subtypen des VWS können ausgiebig analysiert Dies bietet einen neuen Ansatz, die verschiedenen Typen des VWS und deren Subtypen auf der molekularen Ebene zu klassifizieren, was schließlich zu einer besseren Klassifikation des VWS führen könnte. Diese sollte idealerweise phänotypische und molekulare Daten enthalten. Diagnostik Phänotypische Charakterisierung VWF-Antigen (VWF:Ag): Quantitative Defekte des VWF können durch Bestimmung des VWF:Ag nachgewiesen Dieses wird im wesentlichen durch einen ELISA oder durch andere immunologische Methoden bestimmt (24). Der Ristocetin-Cofaktor (VWF:RCo) ist ein indirektes Maß für die Affinität der VWF-Bindungsregion für Thrombozyten- Glykoprotein Ib (GpIb). Die Affinität kann bei mehreren Typen des VWS erniedrigt sein, jedoch auch erhöht bei einem bestimmten Subtyp, dem Typ 2B (32, 53). Die Ristocetin-induzierte Plättchenagglutination (RIPA) wird bei verschiedenen Konzentrationen von Ristocetin im patienteneigenen plättchenreichen Plasma gemessen. Durch Bestimmung der Schwellendosis Ristocetin, die gerade noch eine Plättchenagglutination durch VWF auslöst, können VWF-Varianten mit einer höheren Affinität für GpIb identifiziert werden (32, 34). Die Kollagenbindungsaktivität des VWF (VWF:CB) wird zunehmend genutzt, um den Verlust oder die Verminderung der hochmolekularen VWF-Multimere nachzuweisen, wofür diese Methode sehr sensitiv ist. Die Präsenz eines normalen Anteils hochmolekularer Multimere des VWF ist eine Notwendigkeit für dessen Funktion in der primären Hämostase (4). Die FVIII-Bindungsaktivität des VWF (VWF:FVIIIB) wird gemessen, um spezielle Varianten des VWS, die durch einen Defekt der FVIII-Bindung des VWF charakterisiert sind, zu entdecken. Dieser spezielle Defekt ist schwer von einer Hämophilie A zu unterscheiden. Die Bindung von rekombinantem FVIII an immobilisierten VWF wird mittels eines chromogenen Essays in Relation zur Menge des VWF gemessen. Die FVIII-Aktivität (FVIII:C) im Plasma korreliert mit der Menge des VWF als Bindungspartner und zusätzlich mit der FVIII-Bindungsaktivität des VWF (38). Ein Fehlen des VWF oder der FVIII-Bindungsaktivität führt zur Pseudohämophilie (VWS Typ 2N). Die Multimeranalyse des VWF mittels einer denaturierenden (SDS-)Elektrophorese im Agarosegel ist die wichtigste Methode für die Typisierung und Subtypisierung des VWS, obwohl sie recht zeitaufwändig ist. Unglücklicherweise ist diese Methode auch schlecht standardisierbar. Die Validität der Ergebnisse ist sehr von der Expertise der Labors in Bezug auf Technik und Interpretation abhängig. Dies resultiert aus den Problemen der Trennung eines weiten Spektrums unterschiedlich großer VWF-Multimere und deren Visualisierung. Die früher benutzte Methode der Autoradiographie (31) ist in vielen Labors durch Immunoblot-Techniken kombiniert mit kolorimetrischen (26) oder lumineszenten Nachweismethoden der Multimere ersetzt worden. Allerdings ist ein Nachteil dieser Blotting-Methoden der ineffiziente Transfer, vor allem der größten Multimere, die dann vermindert oder sogar fehlend nach unzureichendem Transfer erscheinen. Da die Typisierung des VWS auf der Anoder Abwesenheit dieser großen Multimere beruht, ist ein homogener, quantitativer Transfer aller Multimergrössen eine absolute Notwendigkeit für eine zuverlässige Klassifikation. Der Vorteil der Blotting- Techniken liegt in der Vermeidung von radioaktiven Methoden. Hinzu kommen eine bessere Auflösung der VWF-Multimere und die bessere Möglichkeit der Quantifizierung beim Einsatz lumineszenter Methoden in Verbindung mit Foto-Imaging (45). Molekulargenetische Methoden Für den Nachweis großer Insertionen oder Deletionen des VWF-Gens ist die Southern-Blot-Analyse immer noch die Methode der Wahl. Familienuntersuchungen polymorpher Regionen des VWS und die Gendosisanalyse sind gegebenenfalls notwendig, um heterozygote Deletionen zu erkennen. Kleine Deletionen oder Insertionen und Punktmutationen werden nach PCR- Amplifikationen einzelner Exons durch anschließendes Sequenzieren identifiziert. Bekannte Mutationen, die relativ häufig in der Population vorkommen, können außerdem mit Screening-Verfahren (z. B. Restriktionsenzymverdau oder Allel-spezifische PCR bzw. denaturierende High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) nachgewiesen Ein besonderes Problem ist die Existenz eines Pseudogens auf Chromosom 22, das den Exons 24 bis 34 des VWF-Gens entspricht und zu mehr als 90 Prozent homolog ist. Hier müssen spezielle PCR-Primer verwendet werden, die zwischen Gen und Pseudogen unterscheiden können. Kandidatenmutationen, die auf diese Art und Weise identifiziert werden, können dann durch rekombinante Expressionen weiter analysiert werden, um ihre pathogene Natur nachzuweisen. Klassifikation des VWS Der primäre klinische Parameter zur Unterscheidung des VWS ist die Schwere der Blutungssymptome. Charakteristisch für das VWS sind Schleimhautblutungen und Neigung zu Hämatomen. Gelenk- und Muskelblutungen, die Hauptsymptome der Hämophilie, sind selten und treten überwiegend bei Patienten mit schwerem VWS Typ 3 auf, die neben dem Fehlen des VWF eine sehr niedrige FVIII- Konzentration aufweisen. Hierzu gehören außerdem Patienten mit einem isolierten Defekt der FVIII-Bindung, den man beim VWS-Typ Normandie (VWS 2N) nachwei-

29/39 VWS-Klassifikation sen kann. Somit kann bereits durch Beschreibung des Spektrums der Blutungssymptome bei einem Patienten zwischen Defekten der primären Hämostase, solchen der sekundären Hämostase oder kombinierten Störungen von sekundärer und primärer Hämostase unterschieden Die Hauptklassifikation des VWS in drei Haupttypen hat sich über Jahre nicht geändert. Die Differenzierung zwischen Typ 1 mit einem niedrigen VWF:Ag, Typ 3 mit praktisch völligem Fehlen des VWF und Typ 2 mit qualitativen Defekten, unabhängig von der Menge an VWF:Ag wird allgemein akzeptiert. Darüber hinaus basierten die Versuche einer Subklassifizierung immer noch auf einer unzureichenden Information über die biochemischen und molekularen Grundlagen der Varianten und sogar der relativ häufigen Typen und Subtypen des VWS. Eine umfassende und stark differenzierende Übersicht verschiedener Subtypen des VWS wurde 1987 publiziert (30, 33). Obwohl sie eher eine Liste der bekannten Varianten des VWS darstellte, die in eine bestimmte Struktur integriert wurde, wurde sie doch die Basis für die gebräuchliche Klassifikation (Tab. 1). Die meisten Subtypen wurden mittels Multimeranalyse beschrieben. Neben quantitativen und funktionellen Parametern ist diese immer noch die Methode der Wahl, um bestimmte bekannte oder noch unbekannte Subtypen des VWS einzuordnen. Ein Nachteil dieser Klassifikation war jedoch die Beschränkung auf phänotypische Daten mit nur geringem Einblick in die zu Grunde liegenden Mechanismen. Auf der anderen Seite war die Menge verschiedener Subtypen in dieser Klassifikation, obwohl sie ideal für weitere biochemische und später molekulare Untersuchungen war, viel zu komplex für den Kliniker, der Patienten mit VWS betreut. Hinzu kamen neue funktionelle Defekte des VWF, die nicht mit einer aberranten Multimerstruktur korrelierten, so dass eine Erweiterung der Klassifikation um diese neuen qualitativen Defekte notwendig wurde. All diese Probleme wurden in einer Neufassung der Klassifikation durch Sadler (36) angesprochen. Neben den Typen 1 und 3 als quantitativen Defekten wurde der Typ 2 in vier Untergruppen unterteilt: VWS Typ 2A bezieht sich auf Varianten mit gestörter plättchenabhängiger Funktion auf der Basis eines Verlustes oder einer relativen Verminderung der hochmolekularen Multimere, die funktionell die aktivsten in der primären Hämostase sind. Varianten mit einer erhöhten Affinität für Thrombozyten-GpIb wurden als VWS Typ 2B bezeichnet, der den Phänotyp mit einem Fehlen der großen VWF-Multimere, aber auch solche mit einem normalen Multimermuster einschließt. Das VWS Typ 2M schließt Varianten mit plättchenabhängigen funktionellen Defiziten des VWF ein, allerdings sind bei dieser Form die großen Multimere vorhanden. Patienten mit einer defekten FVIII- Bindung des VWF wurden als VWS Typ 2N diagnostiziert (Tab. 1). Die Häufigkeit der verschiedenen Typen und Subtypen muss aktuell auf Grund verbesserter Diagnostik neu erhoben In der Vergangenheit wurde der Typ 1 mit ca. 70-80% als der häufigste angesehen. Es folgte der Typ 2 mit ca. 20-30%, während der Typ 3 sehr selten ist. Nach unseren Daten muss die Häufigkeitsverteilung jedoch entsprechend Abbildung 1 revidiert werden: Danach ist der Typ 2 am häufigsten. Diese neuen Ergebnisse sind auf verbesserte Multimeranalyse und Phänotyp/Genotyp-Korrelationen zurückzuführen. Kritische Betrachtung der aktuellen Klassifikation Die ideale Klassifikation sollte gleichermaßen für Kliniker, Genetiker und Molekularbiologen geeignet sein. Dies ist nur schwer erreichbar. Jedoch nimmt unser Wissen der pathophysiologischen Mechanismen der VWF-Mutationen und ihr Einfluss auf die Struktur und die Funktion des VWF genauso wie deren Umsetzung in einen speziellen, klinischen Phänotyp sehr schnell zu. Die inzwischen möglichen Phänotyp/Genotyp-Korrelationen erlauben und fordern daher eine etwas differenzierte Klassifikation des VWS mit Typen und Subtypen, die dementsprechend genau definiert sind. Die (noch) gültige Klassifikation jedoch basiert hauptsächlich auf der phänotypischen Beschreibung. VWS Typ 1 Die Diagnose eines VWS Typ 1 gehört mit zu den schwierigsten Problemen. Voraussetzung ist ein rein quantitativer Defekt des VWF bei normaler Multimerstruktur. Hier ist die Qualität der Multimeranalyse von besonderer Bedeutung. Ein nicht Abb. 1 Häufigkeit der VWS-Typen bei 483 Patienten, ermittelt aus den Zusendungen an ein Labor (UB) im Jahr 2002

30/40 Schneppenheim, Budde VWS Typ 3 Abb. 2 Standardisierte Multimeranalyse des VWF verschiedener Patienten: Je ein Patient mit VWS-Subtyp 2A, bzw. 2B lässt sich am Verlust der großen Multimere und der verstärkten Proteolyse erkennen. Beachte, dass die Multimeranalyse nicht zwischen diesen beiden Subtypen unterscheidet, sie aber klar vom normalen Multimermuster der übrigen Patienten abgrenzt. außen links und rechts: Thrombozytenlysate (Thr) zur Darstellung besonders hochmolekularer Multimere; Position 5: Normalplasma (NP) homogener Transfer, der vor allem die großen Multimere betrifft, kann zur Fehldiagnose eines VWS Typ 2A führen. Viel häufiger werden jedoch verminderte Konzentrationen der großen Multimere bei nicht optimalen Multimeranalysen als normal angesehen. Dieses führt zum Übersehen der Diagnose VWS Typ 2A mit lediglich relativer Verminderung der großen Multimere. Dieses Problem kann durch die Einführung bestimmter Qualitätskriterien gelöst werden (Abb. 2): Die Patientenproben sollten zu Vergleichszwecken zusammen mit einem Standard von normalem Poolplasma auf das Gel aufgetragen Um den Einfluss eines ungleichen Elektrotransfers zu vermeiden, sollten die Referenzproben am Anfang und in der Mitte des Elektrophoresegels aufgetragen Die hochmolekularen Multimere sollten vorhanden sein und sollten sogar mit einer verstärkten Intensität im Vergleich zu den kleineren Multimeren erscheinen. Einzelne Triplets im niedrigen Molekulargewichtsbereich sollten voneinander gut getrennt sein. Eine Referenzprobe von normalem Thrombozytenlysat wird benötigt, um besonders hochmolekulare VWF-Multimere darzustellen. Als Standardmethode sind dabei Gele einer mittleren Auflösung (1,5% Agarose) am besten geeignet. Gele höherer Auflösung sind vor allem zur Analyse der Tripletstruktur der individuellen VWF-Multimere notwendig. Unabhängig davon kann selbst unter physiologischen Bedingungen und unabhängig von der VWF-Konzentration die Menge der hochmolekularen Multimere, bedingt durch stimulierte Sekretion des VWF schwanken, wobei durchaus ein Fehlen oder zumindest ein relativer Verlust großer Multimere maskiert werden kann. In der Vergangenheit waren solche Fälle schwer zu erfassen und erforderten wiederholte Diagnostik mit allerdings häufig widersprüchlichen Ergebnissen. Hier können heutzutage die molekularen Methoden den Genotyp erfassen, der dann auf den Phänotyp schließen lässt. Dieser Ansatz der Analyse phänotypischer und genotypischer Merkmale bei Patienten mit der Verdachtsdiagnose VWS Typ 1 führte in einer gerade im Abschluss befindlichen großen europäischen Studie zu dem überraschenden Ergebnis, dass mehr als 50% dieser Patienten als Typ 2 diagnostiziert wurden (5). Dabei war der kritische Test die Multimeranalyse. Diese schwerste Form des VWS ist leicht zu diagnostizieren, da sie mit einem Fehlen des VWF:Ag und damit auch dessen Funktion korreliert. In den meisten Fällen findet man große und kleine Deletionen sowie Nonsense-Mutationen (17-21). Auch wurden einige Missense-Mutationen beschrieben (19, 20, 22, 23). Im klinischen Spektrum finden sich jedoch keine signifikanten Unterschiede. VWS Typ 2 Wie bereits in der Beschreibung des Typ 1 dargestellt, ist die Abgrenzung zwischen Typ1 und Typ 2 oft schwierig. Während die klassische Form des Subtyp 2A kaum der Diagnose entgeht, können andere Phänotypen mit fast normaler Struktur der VWF- Multimere leicht als Typ 1 fehlinterpretiert Leicht zu identifizieren ist ein isolierter FVIII-Bindungsdefekt, allerdings nur, wenn die entsprechende Diagnostik etabliert ist. VWS Subtyp 2A Hierzu gehören alle Phänotypen mit verminderter plättchenabhängiger Funktion, verursacht durch ein Fehlen oder relativen Verlust großer VWF-Multimere, wie die früher als Subtypen beschriebenen Formen, die in Tabelle 1 aufgeführt sind. Dabei sind die molekularen Mechanismen, die zum Fehlen oder Verlust der großen Multimere führen, sehr unterschiedlich und auch der Erbgang ist variabel. Das Fehlen großer Multimere kann durch Sekretionsdefekte für große Multimere verursacht sein (22) oder aus einer höheren Empfindlichkeit des mutanten VWF für die VWF-spezifische Protease ADAMTS13 resultieren (8, 14). Schließlich können Defekte der posttranslationalen Modifikation des VWF, wie Dimerisierung (37, 39) und Multimerisierung (11, 16, 42, 44, 46) vorliegen und mit einem Fehlen großer Multimere und der damit verbundenen Störung der primären Hämostase korrelieren.

31/41 VWS-Klassifikation VWS Subtyp 2B Mittels Durchführung des RIPA-Testes lässt sich dieser Subtyp sehr zuverlässig diagnostizieren. An seiner Einordnung als definierter Subtyp besteht auf Grund des charakteristischen Phänotyps, der besonderen therapeutischen Konsequenzen dieser Diagnose und der klaren Phänotyp/Genotyp-Korrelation (7, 29, 52) kein Zweifel. VWS Subtyp 2M Bei gleichen funktionellen Defekten wie beim Subtyp 2A kann der Subtyp 2M nur mit der Multimeranalyse vom Subtyp 2A abgegrenzt Hier existieren die gleichen Probleme wie bei der Differenzierung zwischen Subtyp 2A und dem Typ 1. Eine insensitive Multimeranalyse wird das Fehlen großer Multimere eventuell nicht detektieren und zur Fehldiagnose Subtyp 2M führen. Bisher wurden Mutationen vor allem in der A1-Domäne des VWF gefunden (25). Der Phänotyp 2M Vicenza ist mit einer einzigen Mutation (R1205H) in der D3- Domäne assoziiert (40). Es ist aber noch unklar, ob die Klassifikation der bisherigen Patienten mit VWS Typ 2M korrekt war. Tatsächlich musste bei Patienten, bei denen zuvor die Diagnose VWS Typ 1 oder Subtyp 2M gestellt worden war, anlässlich einer Nachuntersuchung die Diagnose zum Subtyp 2A korrigiert werden (28). Daher erscheint eine sorgfältige Analyse aller Patienten mit einer Diskrepanz zwischen VWF:Ag und VWF:CB notwendig. VWS Subtyp 2N Dieser Subtyp lässt sich durch die Bestimmung der FVIII-Bindungsaktivität des Patienten-VWF eindeutig diagnostizieren. Die häufige Fehldiagnose Hämophilie A ist im Wesentlichen auf das Unterlassen des notwendigen Testes zurückzuführen. Die Diagnosestellung ist jedoch wegen der therapeutischen Konsequenzen von großer Bedeutung. Der Phänotyp lässt sich klar auf den Genotyp zurückführen (6, 12, 20, 38). Die Einordnung als spezifischer Subtyp ist daher wohl begründet. Einige Mutationen verändern auch die Multimerstruktur (1, 18, 19, 43). Tab. 1 Vergleich der alten (45), aktuellen (52) und der vorgeschlagenen Klassifikation Vorschlag einer integrativen Klassifikation Aufgrund der geschilderten Problematik der Diagnostik und im Hinblick auf neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie des VWS im Zusammenhang mit molekulargenetischen Daten sollten die inzwischen verfügbaren validen Kriterien als Grundlage einer verbesserten Klassifikation des VWS benutzt Nicht eindeutige phänotypische Daten können durch den molekulargenetischen Befund überprüft und eingeordnet Dies betrifft vor allem den Subtyp 2A. Unsere Daten können in den meisten Fällen die ursprünglich etablierten Phänotypen IIA, IIC, IID, IIE und IIF, die heute alle dem Subtyp 2A zugeordnet werden, bestätigen und auf die pathophysiologische und molekulare Basis zurückführen. Klassifikation nach therapeutischen Aspekten Wichtige Eckpunkte einer Klassifikation sind für Kliniker und Patienten vor allem die Optionen zur Prophylaxe und Therapie von Blutungen. Hierzu gibt es zwei Möglichkeiten: die Substitution des fehlenden VWF durch VWF-haltige Konzentrate, die Freisetzung körpereigenen VWF aus Speicherorganellen des Endothels, den so genannten Weibel-Palade-Bodies (WPB) mit dem ADH-Analogon DDAVP. Während die Substitution prinzipiell bei jedem Patienten möglich ist, ist für die Wirksamkeit von DDAVP zunächst einmal das Vorhandensein von VWF in den WPB Voraussetzung. Auch muss der VWF funktionell intakt sein. Patienten mit dem schweren VWS Typ 3 besitzen definitionsgemäß keinen oder nur VWF in Spuren.

32/42 Schneppenheim, Budde Daher ist DDAVP für diese Patienten keine Option. Die klassische Indikation für DDAVP liegt bei dem relativen Mangel an VWF bei VWS Typ 1 vor. Per Definition ist der Defekt rein quantitativ. Ein Anstieg des VWF nach DDAVP gewährleistet bei diesen Patienten in den meisten Fällen eine ausreichende Hämostase. Bei Patienten mit VWS Typ 2 ist die Indikation für DDAVP von dem vorliegenden funktionellen Defekt abhängig. Liegt ein VWF mit schwerem funktionellen Defekt vor, wird die zusätzliche Freisetzung aus WPB durch DDAVP kaum zu einer Verbesserung der Hämostase führen. Eine solche Verbesserung könnte aber bei einem leichten funktionellen Defekt und ausreichendem Speicher-VWF erwartet Somit ist für den Patienten die Charakterisierung des funktionellen Defektes, also die Zuordnung zu den verschiedenen VWS-Typ-2-Subtypen und die Antwort auf DDAVP von entscheidender Bedeutung. In vielen Fällen lässt sich durch die Bestimmung des Subtyps die Reaktion auf DDA- VP vorhersagen. Klassifikation nach Erbgang Beim VWS sind autosomal-dominante und rezessive Erbgänge beschrieben worden. Rezessiv vererbt werden das schwere VWS Typ 3, der Subtyp 2N mit defekter FVIII-Bindung und der Phänotyp IIC (alte Klassifikation) des Subtyps 2A. Alle übrigen Typen und Subtypen werden dominant vererbt, wobei sehr selten Ausnahmen eines rezessiven Erbgangs beobachtet Verlust großer Multimere, der charakteristisch für das VWS Subtyp 2A ist, korreliert mit einem kombinierten Defekt der thrombozytenabhängigen Hämostase, der die Bindung an GpIb, an Kollagen und GpIIb/IIIA umfasst. Die FVIII-Bindung ist in der Regel nicht betroffen, so dass bei ausreichend hohem VWF:Ag die FVIII-Konzentration im Referenzbereich liegt. Daneben gibt es isolierte Defekte der Kollagenbindung. Isolierte Defekte der GpIb-Bindung ohne Beeinträchtigung der Kollagenbindung oder isolierte Defekte der GpIIb/IIIa-Bindung wurden nicht beschrieben. Die erhöhte Affinität des VWF für GpIb beim VWS Subtyp 2B ist mit einer gewissen spontanen Thrombozytenaggregation in der Zirkulation und damit einem Verbrauch von hochmolekularen VWF und Thrombozyten verbunden. Vermutlich bewirkt die durch den mutanten VWF vermittelte Thrombozytenaggregation einen erleichterten Zugang der von-willebrand- Faktor-spaltenden Protease ADAMTS13 zur proteolytischen Stelle des VWF mit der Folge verstärkter Proteolyse, die durch die Multimeranalyse sichtbar gemacht werden kann. Die defekte FVIII-Bindung des VWF beim Subtyp 2N führt zu einer fehlenden Schutzfunktion des VWF für FVIII und damit zu dessen Reduktion im Plasma. Es wurden FVIII-Spiegel bis hinunter zu 1% beobachtet (38). Klassifikation auf Basis der Multimeranalyse Neben dem Nachweis des Fehlens oder Vorhandenseins großer Multimere kann mittels Multimeranalyse auch eine aberrante Struktur des VWF nachgewiesen Typisch ist z. B. der Nachweis vermehrter ADAMTS13-vermittelter Proteolyse beim VWS Subtyp 2A, Phänotyp IIA (nach früherer Klassifikation). Diese ist an der Betonung von Satellitenbanden, die proteolytische Fragmente des VWF darstellen und Bestandteil der Tripletstruktur einzelner VWF-Oligomere sind, unschwer zu erkennen. Auch beim Subtyp 2B fällt dieses Muster auf (Abb. 3). Eine weitere, klar erkennbare Aberration ist der Nachweis von zusätzlichen Banden (Abb. 3) zwischen den einzelnen Triplets beim VWS Typ 2A Phänotyp IID (nach früherer Klassifikation). Diese Zwischenbanden sind auf Multimere mit einer ungeraden Anzahl von VWF-Monomeren zurückzuführen, bedingt durch einen Dimerisierungsdefekt am carboxyterminalen Ende des VWF (37). Klassifikation nach funktionellen Parametern Die verschiedenen funktionellen Eigenschaften des VWF können kombiniert oder auch isoliert gestört sein, in Abhängigkeit von der Art des molekularen Defektes. Der Abb. 3 Verbesserte Multimeranalyse verschiedener Phänotypen mit Verlust großer Multimere NP: Normalplasma (betont große Multimere); IB: relative Verminderung großer Multimere bei normaler Tripletstruktur; IIA: Phänotyp mit verstärkter Proteolyse (erkennbar am Verlust großer Multimere und den betonten Satellitenbanden der Triplets); 2B: Subtyp mit erhöhter Affinität zu GpIb und dem gleichen Multimermuster (wie IIA); IIC: Phänotyp mit gestörter Multimerisierung, fehlenden großen Multimeren und fehlenden proteolytischen Fragmenten; IID: Phänotyp mit gestörter Dimerisierung, reduzierten großen Multimeren und Zwischenbanden als Hinweis auf Multimere mit ungerader Anzahl von Monomeren; IIE: Phänotyp mit gestörter Multimerisierung, reduzierten großen Multimeren und reduzierter Proteolyse; IIAv: Phänotyp mit reduzierten großen Multimeren und verwaschener Struktur der Multimerbanden

33/43 VWS-Klassifikation Weitere Besonderheiten sind eine verminderte Proteolyse bei einer Reihe weiterer Phänotypen des VWS Subtyp 2A. Hierzu gehören die Phänotypen IIC, IID, IIE und IIF (nach früherer Klassifikation). Es ist unklar, ob der mutante VWF in diesen Fällen resistenter gegenüber einer Proteolyse ist oder ob die Proteolyse auf Grund der eingeschränkten funktionellen Kapazität des VWF vermindert ist. Ein Phänotyp, den man bisher auf artifiziell veränderte Multimere zurückgeführt hatte, ist durch eine verwaschene Struktur der einzelnen VWF-Oligomere gekennzeichnet und hat einen signifikanten Anteil am VWS Subtyp 2A (Abb. 4, 5). Der Phänotyp IB ist durch einen nur relativen Verlust großer Multimere charakterisiert und ist ebenfalls nicht selten (Abb. 4, 5). Klassifikation auf Basis gestörter posttranslationaler Modifikation des VWF Ein Fehlen oder eine relative Verminderung großer Multimere kann auch durch Störungen der posttranslationalen Biosynthese des VWF bedingt sein. So führen Störungen der Dimerisierung am Carboxyterminus des VWF auch zu einer defekten Multimerisierung und damit zu einem Überwiegen der kleineren Multimere wie beim Phänotyp IID. Auch in der Multimerisierungsregion in der D3-Domäne des VWF sind eine Reihe von Defekten beschrieben, die die weitere Polymerisierung der VWF-Dimere zu den großen Multimeren behindern (44). Einen ähnlichen Effekt haben Mutationen in der D1- und D2-Domäne des VWF-Propeptids (11, 46). Hier sind katalytische Regionen (Disulfidisomerase- Konsensussequenzen) lokalisiert, die für die Disulfidbrückenbildung in der D3- Domäne notwendig sind. Klassifikation auf molekulargenetischer Grundlage Die Vielzahl beschriebener Mutationen bei verschiedenen VWS-Typen ermöglicht eine zunehmend zuverlässigere Phänotyp/ Genotyp-Korrelation. Aus der Art und Lokalisation des genetischen Defektes lässt sich daher oft auch auf den besonderen funktionellen Defekt schließen. So finden sich, wie bereits beschrieben, bei isolierten funktionellen Defekten Mutationen in den zugehörigen Domänen z. B. bei defekter FVIII-Bindung Mutationen in der FVIII-Bindungsregion, der D -Domäne, bei defekter Kollagenbindung Mutationen in der A3-Domäne, der Kollagenbindungsregion. Strukturelle Defekte auf Basis von Dimerisierungs- und Multimerisierungsstörungen lassen sich auf Grund von Mutationen in der Dimerisierungsregion (CK-Domäne) bzw. D1-, D2- und D3- Domäne vorhersagen. Mutationen, die zum Verlust oder Gewinn eines Cysteinrestes führen, gehen generell mit einer großen Wahrscheinlichkeit aberranter Multimerisierung einher. Mutationen am aminoterminalen Ende der A1-Domäne lassen auf ein VWS Subtyp 2B schließen und solche in der A2-Domäne auf ein VWS Typ 2A mit verstärkter Proteolyse (Phänotyp IIA). Homozygote oder compound-heterozygote Mutationen, die Null-Allelen entsprechen, führen zu einem Typ 3. Zum Typ 1 gab es bisher keine eindeutigen Genotyp/Phänotyp-Korrelationen. Hierzu sind in Kürze neue Erkenntnisse im Rahmen einer europäischen Studie zu erwarten. Integrative Klassifikation des VWS Die Heterogenität des VWS kann nicht durch nur einen der dargestellten Klassifikationsansätze allein abgebildet Nur ein integrativer Ansatz führt zu einer gleichermaßen für den Patienten, den betreuenden Arzt und den mit VWS befassten Wissenschaftler geeigneten Klassifikation. Über die Einteilung in die drei Haupttypen besteht weiterhin Einigkeit. Lediglich die Unsicherheiten in der Diagnostik nicht jedoch in der Klassifikation können zu falscher Zuordnung führen. Das Hauptproblem der Klassifikation ist der Typ 2. Wie bereits dargestellt, sind einige Subtypen (2B bzw. 2N) klar definiert. Hier ergibt sich ein relativ einheitliches Bild von klinischer Symptomatik, hämostaseologischen Parametern, formaler und molekularer Genetik sowie therapeutischen Optionen. Hingegen ist über den Subtyp 2M bisher wenig bekannt, was größtenteils vermutlich auf die Problematik der korrekten Diagnose mittels Multimeranalyse zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu gibt es über Subtyp 2A den häufigsten Subtyp vom Typ 2 Abb. 4 Häufigkeit der Subtypen von VWS Typ 2 bei 247 Patienten, ermittelt aus den Zusendungen an ein Labor (UB) im Jahr 2002: Mit Abstand am häufigsten ist der Subtyp 2A.

34/44 Schneppenheim, Budde 2. Für den Subtyp 2M gibt es bisher keine klare Phänotyp/Genotyp-Korrelation. Auch muss in vielen Fällen eine Fehldiagnose angenommen Subtyp 2M deswegen aus der Klassifikation zu streichen, wäre allerdings verfrüht. Weitere Erkenntnisse über das Spektrum der 2M-Phänotypen und die molekulare Basis sollten über den Status als valider Subtyp entscheiden. 3. Der Subtyp 2N mit klarem Phänotyp und eindeutiger Phänotyp/Genotyp- Korrelation bleibt als valider Subtyp erhalten. Abb. 5 Häufigkeit der Phänotypen von VWS Subtyp 2A bei 199 Patienten, ermittelt aus den Zusendungen an ein Labor (UB) im Jahr 2002: Neben dem klassischen Typ 2A (früher IIA) finden sich signifikant häufig Phänoytpen, die früher nur vereinzelt beschrieben wurden, z. B. Phänotyp IIE, der am häufigsten erscheint, der Phänotyp mit der verwaschenen Multimerstruktur (2Av) und Phänotyp IB mit seinen verschiedenen Phänotypen eine Vielzahl alter und neuer Daten, die zur Klassifikation herangezogen werden können. Abbildung 4 gibt die Verteilung der verschiedenen Subtypen des Typs 2, Abbildung 5 die verschiedenen Phänotypen des Subtyps 2A wieder, die in unserem Labor (UB) erhoben wurden. Auffällig ist der hohe Anteil früher lediglich an Einzelfällen beschriebener Phänotypen, z. B. Phänotyp Ib und IIE. Eine eindeutige Phänotyp/Genotyp-Korrelation lässt sich für folgende Phänotypen belegen (römische Ziffern: frühere Bezeichnung): Phänotyp IIA mit verstärkter Proteolyse und Nachweis kausaler Mutationen in der A2-Domäne des VWF (8), Phänotyp IIC mit verminderter Proteolyse, Defekten der Multimerisierung, rezessivem Erbgang und Mutationen in der D1- und D2-Domäne (11, 46), Phänotyp IID mit Defekten der Dimerisierung und Mutationen in der carboxyterminalen CK-Domäne (37, 39), Phänotyp IIE/IIF mit verminderter Proteolyse, Defekten der Multimerisierung und Mutationen in der D3-Domäne (44). Für andere Phänotypen (z. B. IB und 2A ohne verstärkte Proteolyse) sowie Phänotypen mit verwaschener Multimerstruktur gibt es keine klare Phänotyp/Genotyp-Korrelation. Aus den dargestellten Charakteristika und klaren Phänotyp/Genotyp-Korrelationen lässt sich folgender Vorschlag für eine integrative Klassifikation ableiten (Tab. 1): 1. Als valide Subtypen von Typ 2 werden folgende (früher mit römischen Ziffern bezeichnete) Phänotypen, bei denen ein relativer oder absoluter Verlust der großen Multimere vorliegt, erhalten bzw. mit arabischen Ziffern wieder neu aufgenommen: Subtyp 2A: verstärkte Proteolyse, Mutationen in der A2-Domäne, Subtyp 2B: verstärkte Affinität zu GpIb, Mutationen in der A1-Domäne, Subtyp 2C: verminderte Proteolyse, Mutationen in der D1- und D2-Domäne mit rezessivem Erbgang, Subtyp 2D: Dimerisierungsdefekte, Mutationen in der CK-Domäne und Subtyp 2E: Multimerisierungsdefekte mit Mutationen in der D3-Domäne, mit oder ohne Beteiligung des VWF in Thrombozyten. Hingegen sollten andere Phänotypen mit Verlust großer Multimere, die auf keine der genannten Subtypen passen, zunächst als Subtyp-2A-Varianten (2Av) bezeichnet Bei der Vielzahl möglicher struktureller und funktioneller Defekte des VWF und den sich daraus ergebenden Kombinationsmöglichkeiten wird klar, dass auch eine revidierte Klassifikation nicht als endgültig zu betrachten ist. Mit den vorgeschlagenen Subtypen existiert jedoch eine solide Grundlage, die auf den verschiedenen Ebenen validiert ist. Wichtig für die Zukunft ist die problemlose Erweiterungsmöglichkeit, sollten erneut definierte Subtypen identifiziert Literatur 1. Allen S, Abuzenadah AM, Blagg JL et al. Two novel type 2N von Willebrand disease-causing mutations that result in defective factor VIII binding, multimerization, and secretion of von Willebrand factor. Blood 2000; 956: 2000-7. 2. Allen S, Abuzenadah AM, Hinks J et al. A novel von Willebrand disease-causing mutation (Arg273Trp) in the von Willebrand factor propeptide that results in defective multimerization and secretion. Blood 2000; 962: 560-8. 3. Bahnak BR, Lavergne JM, Rothschild C et al. A stop codon in a patient with severe type III von Willebrand disease. Blood 1991;78: 1148-9. 4. Brown JE, Bosak JO. An ELISA test for the binding of von Willebrand antigen to collagen. Thromb Res 1986; 43: 303-11. 5. Budde U, Castaman G, Peake I et al.an improved multimeric analysis identifies a subgroup of patients with Type 1 von Willebrand disease characterized by reduced VWF:RCo/Ag ratio. Thromb Haemost 2003; 1 (Suppl 1): P0088. 6. Cacheris PM, Nichols WC, Ginsburg D. Molecular characterization of a unique von Willebrand disease variant. A novel mutation affecting von Willebrand factor/factor VIII interaction. J Biol Chem 1991; 266: 13499-502. 7. Cooney KA, Nichols WC, Bruck ME et al. The molecular defect in type IIB von Willebrand disease. Identification of four potential missense mutations within the putative GpIb

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