Katalytische Wirkung des blaugrünen Lichts auf den Energieumsatz bei der Photosynthese

Prüfungen der Kögischen Befunde keineswegs hinfällig geworden ist. Die Anwendung der Isotopentechnik hat sich als die wohl fruchtbarste Methode auf fast allen Gebieten der Biochemie erwiesen. Eine komplexe biologische Fragestellung wird jedoch durch die Anwendung einer einzigen überaus exakten Methodik nicht gelöst. Die Diskussion über das Vorkommen von d-glutaminsäure in Tumorproteinen und deren physiologische Bedeutung erfolgt z. Zt. auf der Grenzlinie naturwissenschaftlicher Argumentation. Es erscheint notwendig, durch weitere Experimente unter Anwendung möglichst vieler moderner Verfahren der Proteinchemie die biologische Bedeutung von d-aminosäuren zu ermitteln. Katalytische Wirkung des blaugrünen Lichts auf den Energieumsatz bei der Photosynthese Von OTTO WARBURG, GÜNTER KRIPPAHL u n d W A L T E R SCHRÖDER Aus dem Max-Planck-Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem (Z. Naturforschg. 9 b. 667 673 [954]; eingegangen am 9. September 954) In blaugrünem Licht entsteht in Chlorella aus einem Proferment ein Ferment der Photosynthese, das bei Fortnahme des blaugrünen Lichts wieder zu Proferment zurückgebildet wird. Voraussichtlich wird sich aus diesen Versuchen eine Methode entwickeln, um aus der Wirkung verschiedenfarbigen Lichts das Absorptionsspektrum eines Photosynthese-Ferments zu bestimmen. K ompensiert man die Atmung von Chlorella durch weißes Licht und entwickelt dann weiteren Sauerstoff durch monochromatisches grünes oder rotes Licht, so ist die Energieausbeute, bezogen auf das monodiromatische Licht, sehr gut. Die Atmung kann dabei durch das monochromatisdie Licht mehrfadi überkompensiert werden und die Versuche können beliebig lange ausgedehnt werden; während monochromatisches Licht ohne das weiße Kompensationslicht gute Energieausbeuten nur für niedrige Lidit-Intensitäten und kurze Versuchszeiten ergab. Die Kompensationsmethode, nadi dem Vorbild der elektro-physikalischen Meßmethoden entwickelt \ war also ein großer methodischer Fortschritt in der Energetik der Photosynthese. Trotzdem haben wir immer wieder versucht, ob es nicht möglich ist, auf das weiße Kompensationslicht zu verzichten. Aber je reiner unser monochromatisdies Licht wurde, um so sdilechter wurden, bei langen Versuchen, unsere Ausbeuten. Sie waren merkwürdigerweise im Winter oft schlechter als im Sommer. Im vergangenen Winter hatten wir Zellen in Händen, die in reinem monochromatischem Licht der Wellenlänge 644 mu sogar in kurzen en nicht mehr imstande waren, Sauerstoff zu entwickeln. So wurde es notwendig, die Wirkungsweise des weißen Lichts näher zu untersuchen 2. Wir fanden, daß es nicht notwendig war, mit dem O. W a r b u r g u. D e a n B u r k. Arch. Biochemistry 25. 4 [95], weißen Licht die Atmung vollständig zu kompensieren. Sehr wenig weißes Licht genügte bereits, um die Ausbeute im Grün oder Rot zu verbessern; und von diesem wenigen weißen Licht war nur ein kleiner Teil, vor allem der blaugrüne Teil des Spektrums, wirksam, das ist derjenige Spektralteil, in dem die gelben Farbstoffe stark absorbieren. Tatsächlich genügte von dem Lidit der blaugrünen Cadmiumlinien so wenig, daß es energetisch gegen das grüne oder rote Meßlicht nicht in Betracht kam. Die Wirkung des blaugrünen Lichts tritt bei Zusatz des Lidits allmählich auf und verschwindet bei Fortnahme des blaugrünen Lichts wieder allmählich. es Licht ist also hierbei nicht direkt an der Photosynthese beteiligt, sondern durch Erzeugung einer zur Photosynthese notwendigen Substanz, die bei Fortnahme des blaugrünen Lichts allmählich wieder verschwindet (Abb. ). Nennen wir diese Substanz ein Ferment, weil sehr wenig blaugrünes Licht sehr große photochemische Umsätze erzeugt, so haben wir in blaugrünem Licht die reversible photochemische Reaktion mit Pro ferment -<Ferment () ohne in der die Geschwindigkeit der Rückreaktion variieren mag und in Winterzellen" größer sein mag als in Sommerzellen". - Vorläufige Mitteilung O. W a r b u r g, G. K r i p p a h l, W. S c h r ö d e r, W. B u c h h o l z u. E. T h e e l, Z. Naturforschg. 9 b, 64 [954], Dieses Werk wurde im Jahr 23 vom Verlag schrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.v. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3. Deutschland Lizenz. This work has been digitalized and published in 23 by Verlag schrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3. Germany License. Zum..2 ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung Keine Bearbeitung ) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. On..2 it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition no derivative works ). This is to allow reuse in the area of future scientific usage.

O. WARBURG, G. KRIPPAHL UND W. SCHRÖDER 25 c5«<>> ß 2 5 ' ' 2' 8' 2HO' ' 3' H2' Minuten Abb.. Wirkung von blau grünem Licht auf die Photosynthese. Belichtung mit 644 mu, J = 6,7 mm 3 Quanten pro Minute. Belichtung mit, J =,3 mm :i Quanten pro Min. \cp Mole Quanten absorbiert / Mole 2 entwickelt. Wenn ll<p = 3 ist, beträgt im Rot der Gewinn an chemischer Energie etwa 9%. Von der Reaktion () ist ferner zu sagen, daß sie eine durch Schwermetall katalysierte Reaktion ist. Denn Blausäure, in der äußerst kleinen Konzentration von n/35, hemmt die Wirkung des blaugrünen Lichts vollständig. Das Endprodukt der Reaktion (), das Ferment, ist in demjenigen Teilvorgang der Photosynthese wirksam, in dem die Kohlensäure reduziert wird. Denn bei Zusatz des blaugrünen Lichts steigt zuerst die C 2-Aufnahme und erst später die Oo-Entwicklung; und bei Fortnahme des blaugrünen Lichts sinkt zuerst die C 2-Aufnahme und erst später die CL-Entwicklung. Von der Ausgangssubstanz der Reaktion (), dem Proferment, nehmen wir wegen des Wirkungsspektrums an, daß es ein Carotinoid ist. Statt () schreiben wir also mit Blau grün Carotinoid *- Lumino-Carotinoid (2) ohne Zugunsten dieser Gleichung spricht die lange bekannte Tatsache, daß Carotinoide durch Licht isomerisiert werden können, eine Eigenschaft, von der die lebende Natur im Sehprozeß Gebrauch macht. Wie George Wald entdeckt hat 2a, ist der Sehpurpur ein Carotinoid und beruht die Ausbleichung des Sehpurpurs auf einer reversiblen Carotinoid- Isomerisierung. Wir vergessen dabei nicht, daß zu den im absorbierenden Farbstoffen der Chlorella auch Flavine gehören. Aber dem Entdecker der Flavine, insbesondere des Luminoflavins 2 b, sind keine reversiblen photochemischen Flavinreaktionen bekannt, die hier als Modellreaktionen angeführt werden könnten.. V e r s u c h s a n o r d n u n g Chlorella, suspendiert in ihrem Kulturmedium, dessen pn 4 bis 5 ist, wurde in Manometriegefäßen gemäß den neuen Vorschriften 3 kontinuierlich mit dem monochromatischen Meßlicht" belichtet. Als Lichtquellen dienten Quecksilberhochdrucklampen mit oder ohne Cadmiumzusatz, aus deren Strahlung mit Blenden, Linsen, Farbfiltern, Interferenzscheiben und teil-durchlässigen Spiegeln zwei fast parallele Strahlen gewonnen wurden, deren Intensität bolometrisch gemessen und bolometrisch auf gleiche Intensität justiert wurde. Der von den Zellen absorbierte Bruchteil des eingestrahlten Lichts wurde mit Hilfe der Ulbrichtschen Kugel gemessen 4, in der die Manometriegefäße, vor Beginn der manometrischen Messungen, wie bei den manometrischen Messungen bewegt wurden. Die Zelldichte war so klein, daß nicht mehr als 5 % des eingestrahlten Lichts, meistens aber wesentlich weniger, in den Manometriegefäßen absorbiert wurde. Das Meßlicht war so stark, daß die Atmung der Zellen vernachlässigt werden konnte. Es wurde also, gemäß unsern neuen Vorschriften, nur der Überschuß der Photosynthese über die Atmung gemessen, d. h. der tatsächlich aus den Zellen entwikkelte Sauerstoff; daraus und aus dem Licht wurde der Quantenbedarf berechnet. Mole Quanten absorbiert (f Mole Oo entwickelt absorbierten 2 a G.Wald. Amer. Sientist 42, 73 [954], 2l» O. Warburg u. W. Christian, Naturwissenschaften 2. 98 [932]. 3 O. Warburg, G. Krippahl, W. Buchholz u. W.Schröder, Z. Naturforschg. 8 b. 675 [953], 4 O. Warburg u. G. Krippahl, Z. Naturforsdig. 9 b. 8 [954],

Außer den Quellen des Meßlichts war eine zweite Lichtquelle für das katalysierende Licht notwendig. Als solche diente ein -Watt-Cadmium-Leuditrohr der Firma Heraeus-Hanau, das als Jupiterlampe" in den Handel gebracht wird und das, abgedeckt durch ein Blauglas, in m Abstand von den Manometriegefäßen aufgestellt wurde. Die durch das Blauglas durchgehenden Cadmiumlinien (44) 468, 48 und 59 m/u belichteten dann diffus die Zellen in den Manometriegefäßen. In den 5 bis 7 Stdn. dauernden Versuchen wurde mit dem Meßlicht kontinuierlich belichtet, während das katalysierende Licht in Abständen von ganzen oder halben Stdn. zugesetzt und wieder fortgenommen wurde. Die Intensität des katalysierenden Lichts wurde aktinometrisch gemessen, indem in den Manometriegefäßen die Zellsuspensionen durch aktinometrische Flüssigkeit gleichen Volumens ersetzt wurde. Die eingestrahlte blaugrüne Intensität wurde so im Mittel gleich,3 cm 3 Quanten pro Minute gefunden, während die eingestrahlte Intensität des Meßlichts bis 7 mm 3 Quanten pro Minute betrug ( ^amol Quanten = 22,4 mm 3 ). 2. D i e Reinheit der Spektralbezirke D a sehr wenig blaugrünes Lidit zur Erzeugung der katalytischen Wirkung genügt, war hier besonders darauf zu achten, daß das Meßlicht frei von blaugrünem Licht war. Das Meßlicht 644 m/u erhält man hinreichend rein aus dem Licht der Cadmium-Quecksilber-Hochdrucklampe mit Hilfe einer Interferenzscheibe, in Verbindung mit einem Rotglas von Schott. Zur Gewinnung des Meßlichts 546 mu darf keine Cadmium-Queck- silberlampe, sondern soll eine Quecksilberlampe mit 3. D i e L i c h t a b s o r p t i o n der gelben Farbstoffe 923 haben wir mit dem König-Martensschen Spektralphotometer für verschiedene Wellenlängen gemessen 5, welcher Bruchteil des Lidits in einem methylalkoholischen Chlorella-Extrakt von den gelben Farbstoffen absorbiert wird. Zur Abtrennung des Chlorophylls aus dem Farbstoffgemisch bedienten wir uns dabei der Methode von W 7 illstaetter, bei der das Chlorophyll zu Chlorophyllinen verseift und dadurch wasserlöslich gemacht wird. Wir haben die Messungen für unsern heutigen Chlorellastamm wiederholt und, dieses Mal mit lichtelektrischer Absorptionsmessung, die in Tab. angeführten Werte gefunden. Wellenlänge [m fi] 644 546 48 436 923 nachkönig-martens [ /ol fast 45 3 954 lichtelektrisdi [%] 48 29 Tab.. Prozentualer Anteil der gelben Farbstoffe an der Lichtabsorption. 4. D a s Wirkungsspektrum Das Wirkungsspektrum des katalysierenden Lichts liegt noch nicht vor. Wir können nur soviel sagen, daß 644 m ^ und 546 m/u unwirksam sind und daß 436 m/u wahrsdieinlidr wesentlich schwächer wirkt als die blaugrünen Cadmium-Linien. Die blaugrünen Cadmium-Linien haben wir noch nicht getrennt untersucht. möglichst reiner Quecksilberfüllung verwendet werden. Auch in dem Licht solcher Lampen sahen wir oft eine Linie um 5 m/u. Seit 954, seit die spektrale Reinheit für uns von entscheidender Bedeutung geworden ist, entfernen wir 5 m/u, indem wir das früher vorgeschriebene Orangeglas 4 durch das Orangeglas von Schott ersetzen. Zur Gewinnung des Meßlichts 436 m/u sollten gleichfalls nur Lampen mit Quecksilberfüllung, ohne Cd-Zusatz, verwendet werden. Die Entfernung von 5 m/u kann nicht mit einem Blauglas allein bewerkstelligt werden, sondern es muß eine Interferenzscheibe zu dem Blauglas hinzugefügt werden. Näheres über die Meßlicht-Filter findet man in den speziellen Protokollen. 5. D e r Chlorophyllgehalt Bei Messungen der Ausbeuten ist darauf zu achten, daß der Chlorophyllgehalt der Chlorella nicht zu hoch ist, da man bei hohen Chlorophyllgehalten schlechtere Ausbeuten erhält. Ein Anfangschlorophyllgehalt von etwa 4 %, der im Lauf der Versuche auf 4, 5 % steigen mag, ist erlaubt. Sokhe Chlorophyllgehalte hatten unsre 24-stdg. Kulturen, wenn die Zelldichte etwa mm 3 pro cm 3 betrug. Bei längerer Kulturdauer stieg der Chlorophyllgehalt bis in die Nähe von 8 %. Da der Chlorophyll5 O. W a r b u r g u. E. N e g e l e i n, Z. physik. Chem. 6, 9 [923],

gehalt der Grana ein Mehrfaches davon betragen muß, ist vielleicht bei hohen Chlorophyllgehalten ein Teil des Chlorophylls als Reservechlorophyll" nicht an der Photosynthese beteiligt. 6. Der photosynthetische Umsatz Durch wenig Zellen, große Lichtintensitäten und lange Versuchsdauern wurde erreicht, daß die photosvnthetischen Umsätze pro Zelle in der Versuchszeit sehr groß waren. In der Tat waren sie so groß, daß aus gravimetrischen Gründen als einzige Energiequelle die absorbierte Lichtenergie in Betracht kam. Für die so gewonnene größere Sicherheit der Ausbeute-Berechnungen mußte etwas von der Einfachheit der Versuche geopfert werden. Bei langen Versuchen mit großen Umsätzen nimmt mit dem Chlorophyllgehalt die Lichtabsorption zu, und so genügte es nicht, die Lichtabsorption am Anfang der Versuche zu messen, sondern sie mußte auch am Ende gemessen werden. Die Lichtabsorptionen für die Zwischenzeiten wurden dann durch lineare Interpolation gefunden. Auch an die Konstanz der Lichtquellen, die alle an Spannungsgleichhaltern lagen, mußten bei den langen Versuchen größere Anforderungen gestellt werden; Versuche, bei denen sich die Lichtintensitäten während der Versuche wesentlich änderten, wurden verworfen. 7. Protokolle In den Protokollen am Ende dieser Arbeit findet man genaue Angaben über die Kultur der Zellen, über die Isolierung der Wellenlängen und über die manometrischen Ablesungen, so daß jeder die Fehler beurteilen, die Ausbeuten aus den beobachteten Drucken und Lichtabsorptionen berechnen und die Versuche selbst wiederholen kann. 8. Ergebnisse Ein Versuch mit Rot als Meßlicht, dessen Daten man in Protokoll III findet, ist in Abb. graphisch dargestellt. Wie man aus der Abbildung sieht, beträgt nach Zusatz von blaugrünem Licht der Quantenbedarf nach 2 Stdn. 4,4, das entspricht einer Ausbeute an chemischer Energie von %. W T urde dann das fortgenommen, so stieg der Quantenbedarf alsbald auf unendlich, d. h. die Energieausbeute sank auf Null. Wurde dann das wieder zugegeben, so sank der Quantenbedarf auf 3,6, d. h. die Energieausbeute stieg auf 75%. W 7 urde dann das wieder fortgenommen, so stieg der Quantenbedarf auf 7, d. h. die Energieausbeute sank auf 6%. W'urde dann das wieder zugegeben, so sank der Quantenbedarf auf 3,2, d. h. die Energieausbeute stieg auf 83%. Wurde dann das wieder fortgenommen, so stieg der Quantenbedarf auf 2, d. h. die Energieausbeute sank auf 22%. Im ganzen war also die Ausbeute an chemischer Energie bei Abwesenheit von sehr schlecht und wurde bei Zusatz von sehr gut. Würde man, was wir nicht getan haben, den veratmeten CL zu dem durch das Licht entwikkelten 2 addieren, so würde man für die beiden letzten -Perioden im Mittel einen Quantenbedarf von 2,85 finden, was einer Ausbeute an chemischer Energie von 93% der absorbierten Lichtenergie entsprechen würde. Weiterhin beachte man in der Abbildung den zeitlichen Verlauf der Zunahmen oder Abnahmen der Photosynthese bei Zugabe oder Fortnahme des blaugrünen Lichts ein Verhalten, das für die Deutung der Versuche wesentlich gewesen ist. Ein entsprechender Versuch mit Grün als Meßlicht ist in Protokoll II mit allen experimentellen Daten mitgeteilt. 9. Der Quotient C 2/ 2 Bei dem allmählichen Auftreten und Verschwinden der Wirkung des blaugrünen Lichts ist stets das erste, was man sieht, eine Änderung des Quotienten C 2/ 2. Nimmt man das fort, so sinkt zunächst die CCL-Aufnahme und erst dann sinkt die 2-Entwicklung. Setzt man das zu, so steigt zuerst die C 2-Aufnahme und erst dann steigt die 2-Entwicklung. Zum Beleg diene die folgende Tabelle, die aus den Daten der Protokolle II und III zusammengestellt ist (s. Tab. 2). Wir erinnern uns dabei an das Modell der Reduktion der C 2 6, bei dem die C 2 von Pentosephosphat unter Bildung von Hexonsäurephosphat aufgenommen wird und bei dem dann das Hexonsäurephosphat zu Glucosephosphat reduziert wird. Beim ersten Schritt wird die C 2 zur Stufe der Ameisensäure reduziert, beim zweiten Schritt wird sie zur Stufe von Kohlenhydrat reduziert. Jeder der beiden Schritte verbraucht 2 Atome H, entwickelt also ein halbes Molekül 2, so daß also C 2/ 2 für den ersten Schritt gleich 2 und für den zweiten Schritt gleich ist. Das von dem blaugrünen Licht erzeugte 6 O. Warburg u. G. K r i p p a h, Photosynthese- Fermente. Z. angew. Chemie 66. 493 [954],

Meßlicht 644 m,a l<p* = Quanten/O, CO,/ o, 65 4 9.4 4.4 oo 5.8 3.6 7 4.6 3. 7.8 2.2..6..9.9.23.'> -.69 M e ß i c h t 54 6 mit - J / l'p = Quanten/O, 4.66 4.2 6.6 8.8.6 5.6 4.7 4. 5.5 25 CO 2/ o 2.4.22.4.84.65..6.23.9.89.7 Quanten Ig, = Tab. 2. Zusammengestellt aus Daten der Protokolle II und III. Ferment würde also, da es primär die CCL-Aufnahme hemmt, ein Ferment sein, das die erste Stufe der CCL-Reduktion bewirkt.. und Blau als Meßlicht Wegen der katalytischen Wirkung des blaugrünen Lichts war es interessant, auch als stöchiometrisches Meßlicht zu prüfen. Wir fanden (Protokoll IV) einen mittleren Quantenbedarf von 6,5. Dieser Quantenbedarf ist etwa doppelt so groß wie im Rot oder Grün unter Zusatz von wenig. Bedenken wir, daß im die Hälfte des Lichts von den gelben Farbstoffen absorbiert wird, so war der Quantenbedarf für das von dem Chlorophyll absorbierte Licht l/cp = 6,5-,5 = 3,25, also ebenso groß wie der Quantenbedarf im Rot oder Grün. Ein ähnliches Ergebnis erhielten wir für 436 m/u als Meßlicht, von dem die gelben Farbstoffe % absorbieren. Wir fanden (Protokoll V), auf die Gesamtabsorption bezogen, im Mittel /<P = 5,3, und nur auf die Chlorophyllabsorption bezogen, l/cp = 5,3-,7 = 3,7, also wiederum nahezu dasselbe wie für rotes oder für grünes Meßlicht. Wenn wir 923 fanden 5, daß der Quantenbedarf im Rot und im Gelb 4,4, im Blau aber, bezogen auf die Gesamtabsorption, 5, war, so könnte man dies jetzt durch die Annahme erklären, daß im Rot und Gelb das katalysierende Licht zur Erzielung der maximalen Ausbeute fehlte. Bezogen auf die Chlorophyllabsorption betragen die Werte von 923 im Rot und im Gelb l/cp = 4,4, im Blau aber l/cp = 5,-,7-3,6. Es ist also nunmehr, nach der Entdeckung der katalytischen Wirkung des blaugrünen Lichts, zweifelhaft geworden, ob die von den gelben Farbstoffen absorbierte Lichtenergie auch zur Reduktion der Kohlensäure oder ob sie nur zur Bildung des Luminoferments benutzt wird.. Sommerzellen Die katalytische Wirkung des blaugrünen Lichts wurde im Januar dieses Jahres entdeckt. In einer fast ununterbrochenen Versuchsserie bis Ende Juli wurde diese Wirkung immer wieder gefunden, mit Ausnahme einer Periode von 3 Wochen im Juni. Es ist in diesem Zusammenhang erwähnenswert, daß die im Jahre 953 veröffentlichten Versuche 3, bei denen in monochromatischem Rot, ohne Kompensation durch weißes Licht, gute Ausbeuten erhalten wurden, nach Ausweis der veröffentlichten Protokolle, Mitte Mai und Ende Juni ausgeführt worden sind; und daß die im Jahre 953 veröffentlichten Versuche, bei denen im Grün, ohne Kompensation mit weißem Licht, gute Ausbeuten erhalten wurden, zwar im März ausgeführt worden sind, aber mit Grün, das mit Orangeglas 4 isoliert war und deshalb noch 5 m/u als Verunreinigung enthielt. Wie bereits in der Einleitung angedeutet, erklären wir die Unterschiede zwischen den Sommer- und Winterzellen bei gleichen spektralen Reinheiten des Meßlichts durch die Annahme, daß die Rückbildung des Lumino-Carotinoids den Sommerzellen langsamer verläuft. zu Carotinoid in 2. Hemmung durch n/35 -HCN Autotrophe Chlorella gehört zu denjenigen Organismen, deren Atmung durch HCN nicht spezifisch gehemmt wird 7. Es mag sein, daß HCN in Chlorella verbrennt. Aber diese Verbrennung ist jedenfalls eine sehr langsame, da der respiratorische Quotient C 2/ 2 der Chlorella Atmung, der um ist, sich 7 O. Warburg, Biochem. Z., 2 [99],

bei Zusatz von HCN, deren C 2/ 2 = 2 ist, nicht ändert. Verbrennungsquotient Anders als die Atmung ist die Photosynthese 7 der Chlorella in weißem Licht gegen HCN sehr empfindlich und wird durch n/2-hcn um 5% gehemmt. Noch viel empfindlicher gegen HCN ist, wie wir fanden, die Wirkung des blaugrünen Lichts, die bereits durch n/35 -HCN vollständig gehemmt wird. Bei den Versuchen war darauf zu achten, daß die Zellsuspensionen in den Manometriegefäßen zuerst mit den vorgeschriebenen Gasmischungen gesättigt wurden und daß erst dann die HCN zugesetzt wurde, da andernfalls die zugesetzte HCN schon vor Beginn der Versuche wieder ausgetrieben worden wäre. Zu 7 cm 3 Zellsuspensionen in Kulturlösung, enthaltend 8 mm 3 Zellen, setzten wir,2 cm 3 ~ 4 n-hcn und belichteten mit der Wellenlänge 644 mp als Meßlicht (7 = 23 mm 3 Quanten pro Minute) unter Zusatz oder Fortnahme von (/ =,3 mm 3 Quanten pro Minute). In einem Versuch am 6. Juli dieses Jahres fanden wir: üb" H C N Ohne HCN l<p CO,/ o. l Iv CO2/ o. metall beteiligt ist. Aus dem folgenden Abschnitt ergibt sich, daß dieses Schwermetall in einem festen Komplex gebunden sein muß. 3. n/35 OOO-a-a'-Phenanthrolin Während HCN sowohl mit festen Schwermetallkomplexen (wie Haeminen) reagiert, als auch, bei neutraler und alkalischer Reaktion, mit freien Schwermetall-Ionen, reagiert a-a'-phenanthrolin nicht mit festen komplexen, sondern nur mit freien Schwermetall-Ionen, und zwar in sauren wie in neutralen Lösungen. Phenanthrolin ist also das Reagenz auf freie Schwermetall-Ionen oder lose gebundene Komplexe, denen es die Schwermetall-Ionen entziehen kann. n/35 -Phenanthrolin hemmt bei pn 5 die Photosynthese in Chlorella um etwa 33 %. Die 67 % Photosynthese, die übrig bleiben, reagieren auf blaugrünes Licht genau wie Zellen derselben Kultur, denen kein Phenanthrolin zugesetzt worden ist. Zu 7 cm 3 Zellsuspension in Kulturlösung, die 5 mm 3 Zellen enthielten, gaben wir,2 cm 3 n/-salzsaures Phenanthrolin und belichteten mit der Wellenlänge 644 mp als Meßlicht (/ = 27 mm 3 Quanten pro Minute) unter Zusatz und Fortnahme von (J =,3 mm 3 Quanten pro Minute)! Wir fanden in einem Versuch am 2. Juli dieses Jahres: ** 85 9 Nach Entfe rnung der I ICN d urch Gas d urchle itung 4 9. 5.7 4.9 * ( ) ohne, ** ( ) = mit.4.3.96.98.8. 9 2 6 5.9 4.8 9. 8.8.44.76.2..84.89 Ohne Phenantrolin l Iv 4. 4.2 7. 7. 4.5 " Til m Phenantrolin oouuu 9 I<P 6.3 8.2.2 7.6 6.5 Wenn also die Ausbeute durch Mangel an schlecht geworden war, so konnte sie in n/35-hcn durch Zugabe von nicht wieder verbessert werden, während die Ausbeute nach Entfernung der HCN oder in einer von Anfang an blausäure-freien Kontrolle derselben Zellkultur bei Zugabe von allmählich wieder anstieg. Aus derartigen Versuchen folgt, daß an der Fermentbildung durch blaugrünes Licht ein Schwer- Wenn also, in n/35 -Phenanthrolin, die Ausbeute durch Mangel an schlecht geworden ist, kann sie, anders als in HCN, durch Zusatz von wieder verbessert werden. Es folgt daraus, daß in der Fermentkette der Photosynthese mindestens 2 Schwermetalle mitwirken, eine feste Komplexverbindung, die mit HCN, aber nicht mit Phenanthrolin reagiert, und lose gebundene oder freie Schwermetall-Ionen, die mit Phenanthrolin reagieren.

Protokoll I Allgemeines C h l o r e l l a : Pyrenoidosa. Stamm von Professor H a r d e r, Göttingen. K u l t u r l ö s u n g K: 5 g MgS 4-7H 2,5 g KH 2 P 4 f 2 g NaCl 2 g KN 3 g Ca(N 3 ) 2-4H 2 cm 3 aus Quarz dest. Wasser, pg ist etwa 4,2 und geht bei der Kultur auf etwa 5,2. D i e L i c h t a b s o r p t i o n A als F u n k t i o n der Z e l l k o n z e n t r a t i o n c: Aus der Gleichung der Lichtabsorption in Lösungen,, A = io i - = e ßcd folgt für kleine Werte von c A = ß c d, d. h. bei kleinen Werten von c ist die Lichtabsorption proportional der Farbstoffkonzentration c, wenn der I : 5 mg F e S 4 7 HaO mg Fe(N 3 ) 3 9 HaO Lichtweg d konstant gehalten wird. In den Zellsuspen mg HB 3 2 mg MnS 4 4 H.O 22 mg sionen jedoch nimmt, wegen der Zerstreuung, der LichtZn S 4 7 HaO 8 mg CuS 4 5 HoO 2 mg (NH4)6 weg d mit der Zellkonzentration c zu, und deshalb findet man bei kleinen Zellkonzentrationen, daß da/dc nicht MO724 4 HAO cm3 " - H 2 S 4. ^ konstant ist, sondern zunimmt. II: 5mg CoS 4 7 HoO 5mg NiS 4 7 HaO 5 mg M a n o m e t r i e. Die Versuche waren so angeordnet, Na 2 W 4 5 mg CrK(S 4 ) 2 2H a O 5 mg VOSO, daß die Atmung vernachlässigt werden konnte. In der 2 H 2 cm 3 ^ -H 2 S 4. ganzen 5- bis 7-stdg. Versuchszeit konnte also ohne Unterbrechung, ohne die Atmung zu messen, kontinuierlich III*: 5 mg V S 4-2 H 2 5 cm3 Wasser (,cm 3 mit dem Meßlicht belichtet werden. Der große metho=,27 ^g Vanadium). dische Fortschritt dieses Verfahrens ist in dieser 3 Vor der Beimpfung der Zuchtkolben werden je 2 cm I schrift 8 b, 675 [953], erläutert. Auch wegen Bolometrie, cm3 II,. cm 3 III zu 25 cm K" gegeben. Optik und Manometrie wird diese Arbeit und die Arbeit A n o r d n u n g d e r K u l t u r : Abbildung in W a r diese schrift 9 b, 3 [954] hier als bekannt vorb u r g und M i t a r b b., diese schrift 7 b, 42 [952] ausgesetzt. (dort aber andere Kulturlösung). A k t i n o m e t r i e. Zur aktinometrischen Messung des T e m p e r a t u r b e i d e r K u l t u r : 25 C. diffusen blaugrünen Lichts wurden die Zellsuspensionen B e i d e r K u l t u r d u r c h g e e i t e t e s G a s : in den Manometriegefäßen durch je 7 cm3 aktinometrische Flüssigkeit ersetzt, die die Zusammensetzung 5 Vol% C 2, Vol% O a, Rest Argon. hatte: 2 mg Äthylchlorophyllid 2 mg Thioharnstoff B e l i c h t u n g : Südfenster mit Sonnenschutz. 2in 7 cm3 Pyridin reinst von Merck. Wenn im Gasraum Watt-Metallfadenlampe in etwa 25 cm Abstand von den Luft war was am bequemsten ist s o wurden die Zuchtkolben. absorbierten mm3 O, durch,65 dividiert, um die mm3 3 V e r m e h r u n g : Einsaat etwa mm, Ernte nach absorbierten Quanten zu erhalten. Vgl. auch W a r b u r g 24 Stdn. 2 bis 25 mm3, nach 48 Stdn. 5 bis und S c h o c k e n, Archives of Biochemistry 2, 363 [949]. 3 8 mm Zellen. C h l o r o p h y l l b e s t i m m u n g in C h l o r e l l a. V o r b e r e i t u n g z u m V e r s u c h : -tägige KulChlorella wurde in dest. Wasser gewaschen und dann turen wurden direkt verwendet, 2- oder mehrtägige Kulmit trockenem Methanol extrahiert, bis der Rückstand turen wurden 2-mal auf der Zentrifuge mit K"-Lösung nicht mehr rot fluoreszierte. Dann wurde die Lichtgewaschen. Die Zelldichte wurde im Haematokriten beschwächung iji für die Wellenlänge 546 m^ und den stimmt und gab einen ungefähren Anhaltspunkt für die Lichtweg d cm bestimmt und daraus die ChlorophyllMenge der Versuchszellen. Durch Multiplikation mit dem konzentration c mit ß = 9,3 cm2/mg erhalten: Faktor,25 erhält man aus dem Zellvolumen in K" die Trockensubstanz. In l In -y mg t E i n f ü l l e n in d i e M a n o m e t r i e g e f ä ß e : C ~~ ßd ~ 93 Je 7 cm 3 Zellsuspension mit etwa je 7 mm3 Zellen wurden in zwei Gefäße von gleicher Form aber ungleichem P r o t o k o l l II. V e r s u c h v o m 9. 2. 9 5 4 Volumen eingefüllt. Dann wurde weiter nach den VorX 5 4 6 als M e ß l i c h t ± B l a u g r ü n schriften der 2-Gefäß-Methode verfahren. -tägige Kultur. Vermehrung von 4 25 mm3. M e s s u n g d e r L i c h t a b s o r p t i o n : Die Licht7 cm 3 ( = 7 mm3 Zellen) in jedes Manometriegefäß einabsorption wurde in den bewegten Manometriegefäßen gefüllt. Anfangsabsorption 7,2%. Endabsorption nach am Anfang und am Ende der Versuche mit der Ulbricht6-Stdn.-Versuch,5%. -Absorption etwa 5%. schen Kugel gemessen und daraus die Lichtabsorption für die Zwischenzeiten durch lineare Interpolation be2. Gasraum 5 C 2, Oo, Argon. v' = 6,88, v = 2,35 cm 3, rechnet. Näheres über die Kugel bei W a r b u r g und ü' f = 7,, vf = 7, cm 3. K r i p p a h l, diese schrift 9 b, 8 [954], Mikroelemente n a c h D. A r n o n : * Auf Grund der Mitteilung von D. A r n o n in Nature [London] 72, 39 [953], xqo = H ' - 8,5 H,24 [mm 3 ], _ H',49 H 6,57 [mm 3 ].

46 ^blaugrün eingestrahlt [mm 3 Quantenl [ pro Minute j 49.8 49.8 7 7 7 7 Hi H /<P = Quanten/ mm positiv. Druck] 2 3 3 2.5 3.5 3.5 3.5 29.5 8.5 9.5 3 4 3 6. 5.5 6.5 8. 8.5 6.5 3 3.5 3.5/ 5.5 6./ 7.5 7.5 [O] CO2/ o2 *4.66.4 4.2.22 6.6.4 8.8.84.6.65 5.6. 4.7.6 4..23 5.5.9.89 25.7 * l 546 aus 5-Watt-Hg-Lampe mit 2 cm 2% CuSO, 5 H 2, 2 mm Orangeglas (Schott), 2 mm Didymglas : -Watt-Jupiterlampe 2m B.G. 23 in cm Entfernung von Manometrie-Gefäßen. Protokoll III. Versuch vom 2. 4. 954 / 644 als Meßlicht ±. X 644: mit Interferenzfilter aus Cd-Hg-Lampe. : - Watt - Jupiterlampe 2 mm B.G. 23, cm von den Manometrie-Gefäßen. -tägige Kultur. Vermehrung 25 mm'. 7 cm-"* = 7 mm 3 Zellen in jedes Manometriegefäß eingefüllt. Anfangsabsorption für 644 m«22,4%, Endabsorption nach 6V2 Stdn. 28,9%. Blau grün-absorption etwa 5%. 2. Gasraum C 2, 2, Argon. v' =6,88, v = 2,35 cm 3, ü' f = 7,, u F = 7, cm 3. x > = H' 8,5 H,24 [mm 3 ], x co = H',49 H 6,57 [mm 3 ]. hu J blau^rün H' H /<P = 7 = eing estrahlt [mm 3 Quanten] Quanten/ 2 o2 L P Minute j [posit.] m DruckeJ RO [C)] CO2/ [ m 6.7 5.45 9.4. 6.7 65 7 7.63 4.4.6 6.7 2.5 9.8 6.7 4 2. 6.55 5.8. 6.7. 4.36 3.6.9 6.7 6.5 4.36 7 6.7 9. 3.82 4.6.9 6.7. 4.36 3..23 6.7 8.5 4.9 7.8.9 6.7 7. 4.36 2.2.69 Protokoll IV. Versuch vom 25.3.954 als Meßlicht ± Jupiterlampe. Meß licht: Cd-Hg-Lampe 4 Watt, als Filter 2 cm % CuS 4 5H 2 2 mm Blauglas 28 (Schott) 2 mm Gelbglas 5 (Schott); oder an Stelle von Blauglas Guineagrünlösung mg/cm 3, cm Schichtdicke. Ergibt Gemisch von 468 und 48 und 59 mu, Mittel 487 m/u-, N -h-v Mittel 58 2 cal. Jupiterlampe: Watt cm, entweder mit Blauglas 23 (Schott) 2 mm oder mit Rotglas 2 (Schott) 2 mm. Ergibt 487 mu (Mittelwert) oder 644 nut. Beide J, eingestrahlt in Manometergefäße, etwa,3 mm 3 Quanten pro Minute. -tägige Kultur. Vermehrung 25 mm 3 Zellen. 7 cm 3 = 7 mm 3 Zellen in jedes Manometergefäß eingefüllt. Anfangsabsorption für Meßlicht 29,8%, Endabsorption 38,3%. ^487 J Jupiterlampe H' H ein gestrahlt mm [mm Quanten] [posit. Drucke [ pro Minute j I/T [Oj 7 = CO 2/ o2. ; /. 487. 5. 6.2. 2 ; A 487 9.5 5.5 9.4.87 2 ; l 487 8.5 4. 7.. 2 ; /. 487 8.5 4. 7.. 2 ; /. 644 3.5 3 5.7.2 5.9 ; A 644 5. 2. 6.4.23 2 ; /. 644 9.5 4. 6.3.2 2.5 4. 5.3.24 2.5 4. 5.3.24 Mittel 6.5 2. Gasraum C 2, O a, Argon. v' = 6,88, v = 2,35, v' F = 7,, ü f = 7,. Xq = H' 8,5 H,24 [mm 3 ], x co L-H'-,49 H 6,57 [mm 3 ]. Da bei /. 487 etwa 5% des Lichts von den gelben Farbstoffen absorbiert werden, ist der Quantenbedarf des vom Chlorophyll absorbierten Lichts jq> - 3,25. Protokoll V. Versuch vom. 4. 954 /436 als Meßlicht ±. I 4 36: aus Cd-Hg-Lampe 4 Watt isoliert mit 2 cm 2% Cu S 4 5 H., 2 mm B.G. 2 (Schott) Interferenzscheibe. Kein 45 m/< und nur Spuren.

B l a u g r ü n : Jupiterlampe Watt 2 mm B.G. 23 (Schott), cm von Manometergefäßen entfernt. -tägige Kultur. Vermehrung 24 mm3 Zellen. 7 cm 3 = 6 mm3 Zellen in jedes Manometergefäß eingefüllt. Anfangsabsorption /. 436 54,3% und Endabsorption nach 9V2 Stdn. 65,6%. -Absorption etwa 5%. 2. Gasraum CO a, 2, Argon. v' = 6,88, v = 2,35 cm3, 7,, Ü f = 7, cm3. 'F = xa xc2 = H' 8,5 H,24 [mm 3 ], = H',49 H 6,57 [mm 3 ]. Da 34% der Wellenlänge 436 mfx von den gelben Farbstoffen und 66% von dem Chlorophyll absorbiert werden, so war der Quantenbedarf des von dem Chlorophyll absorbierten Lichts l<p = 5, 3 X, 6 6 = J436 /blaugrün H' H eingestrahlt m m [mm3 Quanten] [posit. Drucke [ pro Minute j [ 7 = CO,/ /9» = Quanten/ o2 o2 [( 8.4 8.4 8.4 8.4.3.3.3 7.9... 4.7 75 2 8. 7.5 7.5 8. 3. 3. 3.5 7.5 4.5 4. 4.5.5 3.5 3.5' 3.5 3.5 4.9. 7 4.9. 3 6. 5.5 3.5 6. 6. 6.5. 46.5 5.7.4 5..9 5.8.6 Mittel 5.3 3,5. Über den Nachweis der Carboxyl-Endgruppe im Tabakmosaikvirus durch Spaltung mit Hydrazin Von GERHARD BRAUNITZER Aus dem Max-Planck-Institut für Virusforschung, Biochemische Abteilung, Tübingen (Z. Naturforschg. 9 b,675 678 [954]; eingegangen am 28. Juli 954) Durch Versuche an verschiedenen Peptiden und Eiweißstoffen wird bestätigt, daß das von A k a b o r i angegebene Verfahren zur Bestimmung der carbonyl-endständigen Aminosäure durch Spaltung mit Hydrazin sehr zuverlässige Werte liefert. Beim nativen Tabakmosaikvirus und ebenso bei dem nucleinsäure-freien Virusprotein ergab die Hydrazinolyse Threonin als einzige Carboxy-Endgruppe. Die Zahl der Endgruppen betrug 27 je Mol. TMV, was die Ergebnisse der Spaltung mit Carboxypeptidase bestätigt. Da die Zahl der Amino-Endgruppen etwa gleich groß ist, steht nunmehr fest, daß ein Mol. TMV etwa 25 Peptidketten enthält, die in ihren Anfangs- und Endgliedern übereinstimmen. I m Tabakmosaikvirus (TMV) läßt sich nach Entfernung der Nucleinsäure Prolin als einzige AminoEndgruppe der Peptidketten ermitteln ^ 2. Die Nucleinsäure wurde entweder mit warmer, verdünnter Trichloressigsäure oder in schwach alkalischer Lösung vom ph bei abgespalten. Bei der zweiten Art der Behandlung wird das Protein nicht denaturiert. Die Zahl der Amino-Endgruppen beträgt etwa 2 je Mol. TMV. Über die Natur der Aminosäure am Carboxylende der Peptidkette gaben zuerst Versuche von H a r r i s und K n i g h t 3 Aufschluß. Bei der Einwirkung von Carboxypeptidase auf das native Nucleoproteid wer G. S c h r a m m u. G. B r a u n i t z e r, Z. Naturforschg. 8b, 6 [953], 2 G. S c h r a m m, G. B r a u n i t z e r u. J. W. S c h n e i d e r, Z. Naturforschg. 9 b, 28 [954], den 2 2 2 bis 2 7 3 Mol. Threonin abgespalten. Die Übereinstimmung mit der Zahl der Amino-Endgruppen ist sehr befriedigend, doch sind diese enzymatischen Versuche nicht eindeutig, denn es ist bekannt, daß durch Carboxypeptidase bestimmte Aminosäuren nur sehr schwer abgespalten werden, so daß sie nicht erfaßt würden. Andererseits wäre es denkbar, daß einzelne Peptidketten am Ende mehrere Threoninreste besitzen, die schnell nacheinander freigesetzt werden 3. Um die Einheitlichkeit der Peptidketten hinsichtlich ihres Anfangs- und Endglieds völlig zu sichern, schien es uns wünschenswert, die Aminosäure am Carboxylende mit einer chemischen Methode quan3 J. I. H a r r i s, 7, 63 [952]. C. A. K n i g h t, Nature [London]