Grundlagen der Zellulären Biochemie Replikation, Sequenzierung und PCR Vorlesung zum Modul BCB P07 im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover Prof. J. Alves, Institut für Biophysikalische Chemie, MHH http://www.mh-hannover.de/bpc_grundzellbc.html
1958 Das Meselson-Stahl Experiment: Bakterien über eine Generationen mit N 15 als Stickstoffquelle wachsen lassen. Dann N 14 als Stickstoffquelle anbieten. Die DNA einer jeden Generation aufreinigen und im CsCl-Gradienten zentrifugieren. Art der DNA-Verdoppelung 3 5 3 5 konservativ dispersiv semikonservativ
BAKTERIEN Enzym Funktion DNA Polymerasen DNA Pol I DNA-Reparatur DNA Pol II DNA-Reparatur DNA Pol III Replikation (Strangverlängerung) + 2 ungenaue DNA-Polymerasen SÄUGER Enzym Funktion Ort DNA Pol Replikation (Initiation der Synthese) Nukleus DNA Pol Replikation (Strangverlängerung) Nukleus DNA Pol Replikation (Strangverlängerung) Nukleus DNA Pol DNA-Reparatur Nukleus DNA Pol Replikation (Strangverlängerung) Mitochondrien + 9 ungenaue DNA-Polymerasen
DNA-Synthese läuft in 5 3 Richtung ab: Ein neues Nukleotid (Triphosphat) 5 P P P P OH 3 5 PPP OH3 wird eingepasst 3 5 P P P P P P P P P und eingebaut. PPi 5 P P P P P OH3 Das Ende ist bereit für einen neuen Einbau. 3 5 P P P P P P P P P
Viele DNA-Polymerasen haben eine 3 5 Exonuklease 5 3 Synthese DNA polymerase Nukleotidfehleinbau Falsches Nukleotid Polymerase hebt Fehler durch die 3 5 Exonukleaseaktivität auf Fortsetzung der 5 3 Synthese Sowohl Pol III als auch Pol und Pol haben eine Exonukleasedomäne.
Das DNA-Polymerase III Holoenzym 5 3 5 3 lagging leading 3 5 Das DNA-Polymerase III Holoenzym ist die primäre replikative DNA-Polymerase in E. coli. enthält 10 verschiedene Untereinheiten. dabei kommt die DNA-Polymerase mindestens zweifach vor: eine mit dem leading Strang assoziiert, die andere mit dem lagging Strang. die weiteren Untereinheiten steigern die Reaktionsgeschwindigkeit auf ~1000 Nukleotide/Sekunde und die Prozessivität auf > 5 x 10 5 Nukleotide/Bindungsereignis.
Bildung von Okazakifragmenten am lagging strand 5 5 3 Am leading strand kann kontinuierlich synthetisiert werden. 3 5 Primase synthetisiert RNA primer am lagging strand. Replikative Polymerasen verlängern Primer in Okazakifragment.
Okazakifragment-Synthese (Fortsetzung) Neues Okazakifragment RNAse H oder Pol I bzw. Flap-Endonuklease bauen Primer ab Die Lücke wird durch DNA-Ligase geschlossen
An der Replikation beteiligte Aktivitäten DNA-Polymerasen verknüpfen an einem bestehenden DNA-Einzelstrang Desoxynukleotide zu einem langen komplementären Einzelstrang. Exonukleasen: 3 5 zur Korrektur, 5 3 zur Bereinigung von flaps. Gleitende Klammer erhöht die Prozessivität DNA-Helikasen schaffen den Einzelstrangbereich, an dem eine DNA- Polymerase arbeiten kann. Die Primase synthetisiert ein sehr kurzes RNA-Stück (Primer), das von den replikativen DNA-Polymerasen verlängert wird. Einzelstrang-DNA-Bindungsproteine schützen einzelsträngige DNA- Bereiche vor einem vorzeitigen Rehybridisieren und vor einem Nukleaseangriff. DNA-Pol I (in Konkurrenz mit RNAse H) bzw. Flap Endonuklease beseitigen die RNA-Primer wieder. DNA-Ligase verknüpft gebildete Einzelstrangfragmente zu langen Ketten. Topoisomerasen bereinigen topologische Probleme bei der Replikation.
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Gleitende Klammer Die Struktur des PCNA zeigt, wie es die DNA-Polymerase an der DNA halten kann. Alle bisher charakterisierten DNA-Polymerasen, die die Replikation großer Genome durchführen, haben eine ähnliche gleitende Klammer ( -UE der Pol III). Sie ist aber auch Andockstelle für viele andere Enzyme, die an neu synthetisierter DNA arbeiten sollen.
Helikasen Helikasen sind ATPasen, die doppelsträngige Nukleinsäuren in die beiden Einzelstränge aufspalten. Sie sind dabei in der Regel spezifisch für DNA oder RNA. Helikasen sind essentiell für die Replikation. An der Replikationsgabel arbeiten hexamere Helikasen. Die Arbeitsrichtung einer Helikase definiert sich durch die Orientierung des Einzelstrangs, auf dem sie sich entlang bewegt. Gängige Testsubstrate dafür sind:
Ersetzen der Primer der Okazakifragmente Das Herausschneiden der RNA-Primer und das Auffüllen der entstehenden Lücke gehen Hand in Hand. Bei Prokaryonten arbeiten entweder zwei Enzyme RNAse H und DNA- Polymerase, oder DNA Pol I nutzt ihre 5-3 Exonukleaseaktivität. 5 3 Bei Eukaryonten verdrängt die replizierende Polymerase den Primer und die Flap-Endonuklease spaltet den Überhang ab. RNA primer Flap-Endo Nick wird von der DNA-Ligase geschlossen
Topoisomerasen Die Arbeit der Helikasen an der Replikationsgabel führt zu einem topologischen Problem: Helixwindungen werden vorne zusammengeschoben (+ sc) und sind dahinter zu wenig (- sc). Typ I Einzelstrangbruch Durchschieben des anderen Einzelstrangs - Schließen der Lücke Relaxiert ein vorhandenes Supercoil Typ II Doppelstrangbruch Durchschieben eines Doppelstrangs (vorzugsweise der gleichen DNA) - Schließen der Lücke Relaxiert ein vorhandenes Supercoil Bereinigt Catenane DNA Gyrase in Bakterien erzeugt unter ATP-Verbrauch negatives Supercoil
Arbeitsweise einer Topoisomerase II ADP Die Wahl und Positionierung des Transfer-Doppelstrangs entscheidet über Supercoiling, Relaxierung eines Supercoils oder Katenanauflösung oder bildung.
Proteine an der eukaryontischen Replikationsgabel Lagging strand (Okazakifragment) 5 3 5 3 Leading strand Parental DNA 3 5 + Flap Endonuklease + Ligase + Topoisomerasen DNA Helikase Single-stranded binding (SSB) Protein Primase (DNA Pol ) RNA primer DNA Pol DNA Pol
Replikationsgabel in E. coli
Start der Replikation an speziellen Origins Bakterielles Chromosom ori Eukaryontisches Chromosom ori ori ori Origin-Erkennungsproteine (dnaa in E.coli, MCM-Proteine in Eukaryonten) binden, schmelzen einen benachbarten DNA-Bereich auf und bereiten den Replikationsstart vor.
Initiation der Replikation in E. coli
Hefe Initiation der Replikation Initiatorbindung E. coli Initiation Bildung eines Präkomplexes Initiation Umbau Helikaseaktivierung Einsetzen der Polymerase
Didesoxysequenzierung nach Sanger Nach Denaturierung der DNA werden die Primer hybridisiert. P P P O N Dann wird die Polymerisationsreaktion mit den 4 dntps und einem ddntp gestartet. Sie stoppt nach dem zufälligen Einbau des ddnmp. H H ddntp Didesoxyribonukleotid X X X X dntps und ddatp (X)
Ergebnis einer Teilreaktion der Sequenzierung X X X X X X X Unterschiedlich lange Fragmente mit Adenosin am Ende
Klassischer Ablauf einer DNA-Sequenzierung 4 Reaktionen: Auftrag: DNA + Primer + Polymerase + dntps + ddatp DNA + Primer + Polymerase + dntps + ddctp DNA + Primer + Polymerase + dntps + ddgtp DNA + Primer + Polymerase + dntps + ddttp Auftrennung nach Länge: Resultat: Vier Lösungen enthalten Fragmente mit definierten Enden: alle haben das gleiche 5 -Ende (Primer) und unterschiedliche 3 -Enden (je nach ddntp). Diese Lösungen werden in einer Gelelektrophorese nach der Länge der enthaltenen Fragmente aufgetrennt. Lesen der Sequenz C T C T A G C G G T A A
Automatisierung der DNA-Sequenzierung Eine Reaktion mit allen vier ddntps, die jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, resultiert in Fragmenten, die durch ihre Farbe zu erkennen geben, welches ddnmp an ihrem Ende eingebaut wurde. Sie werden in einer Gellaufspur aufgetrennt. Eine spezielle optische Apparatur erlaubt ein Auslesen der Sequenz, die direkt im Computer gespeichert wird.
Pyrosequenzierung aus: Nature Methods 2 (2005), doi 10.1038/nmeth800 DNA-Polymerase DNA n + dntp DNA n+1 + PP i ATP-Sulfurylase PP i + APS ATP + SO 2-4 ATP + O 2 Oxiluciferin + Licht Luciferase + Luciferin + AMP + PP i + H 2 O + CO 2 Apyrase dntp dndp + P i Apyrase dndp dnmp + P i Apyrase ATP ADP + P i
Hochdurchsatzmethode: 454 Sequenzierung 454 Sequenzierung stellt eine hochparallele Pyrosequenzierung an Beads dar. DNA wird fragmentiert, am Ende mit Primerbindungsstellen ligiert, an Beads gebunden, in einer Öl-Wasser-Emulsion mit PCR amplifiziert, auf ein Lochraster verteilt und dort sequenziert. Gesamtsequenzen von ca. 400 000 000 Nukleotiden pro Ansatz www.454.com schrittweise Pyrosequenzierung ca. 800 Nukleotide Leselänge
Polymerasekettenreaktion (PCR) Ausgehend von einer sehr geringen Menge DNA wird ein definierter DNA-Bereich nahezu exponentiell vermehrt. Vorteile der PCR-Methode sehr schnell wenig Probenmaterial erforderlich sehr sensitiv automatisierbar Nachteile der PCR-Methode teilweise zu sensitiv bei großer Probenzahl teuer
Polymerasekettenreaktion (PCR) Man nehme: die zu untersuchende DNA 2 Primer (Oligodesoxynukleotide, 15-35mere) eine hitzestabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) dntp s, Puffer etc. 3 5 Sense-Primer Antisense-Primer 5 3
Temperatur Temperaturzyklus einer PCR-Reaktion Um eine ausreichende Amplifikation der DNA zu erreichen, muss die Synthese ausgehend von beiden Primern vielfach wiederholt werden. Dazu müssen die DNAs immer wieder durch Erhitzen denaturiert werden, damit beim Abkühlen die Primer binden können. 95 C Denaturierung 72 C Synthese 55 C Hybridisierung Zeit 1 Zyklus 25-40 x 3 min
Produktbildung in der PCR 1. Zyklus 2. Zyklus 3. Zyklus 1000 bp Ab dem 3. Zyklus treten Produkte auf, deren Länge nur durch die Position der Primer bestimmt wird. Sie werden exponentiell vermehrt. Lange Syntheseprodukte auf der Ausgangs-DNA dagegen werden nur linear vermehrt.
Anzahl Kopien 3.0 10 07 2.0 10 07 1.0 10 07 Amplifikation theoretisch Ausbeute der PCR Die Ausbeute wird begrenzt durch Enzymmenge dntp-menge Rehybridisierung der Produkte Der letzte Faktor lässt sich nicht umgehen. Agarose-Gel 0.0 10-00 0 5 10 15 20 25 30 Anzahl Zyklen Amplifikation 3.0 10 07 praktisch Anzahl Kopien 2.0 10 07 1.0 10 07 1000 bp 0.0 10-00 0 5 10 15 20 25 30 Anzahl Zyklen Die Ausbeute reicht für eine Gelanalyse.