Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern Projektpräsentation Ressourcenschonende Herstellung von Feinchemikalien Christoph Mähler, Dr. Kathrin Castiglione, Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz Technische Universität München Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Inhaltsverzeichnis Bedeutung chiraler Moleküle Asymmetrische Reduktion von Alkenen Ziele des Forschungsvorhabens Arbeitsprogramm 2
Inhaltsverzeichnis Bedeutung chiraler Moleküle Asymmetrische Reduktion von Alkenen Ziele des Forschungsvorhabens Arbeitsprogramm 3
Bedeutung chiraler Moleküle Chiralität Chirale Moleküle verhalten sich wie Bild und Spiegelbild zueinander. Die Spiegelbildisomere werden auch als Enantiomere bezeichnet. 4
Bedeutung chiraler Moleküle Biologische Effekte von Enantiomeren (R)-Enantiomere (S)-Enantiomere Orangenaroma Zitronenaroma süß bitter Limonen Asparagin Carvon Minzgeruch Kümmelgeruch 5
Bedeutung chiraler Verbindungen Anwendungsgebiete Chirale Verbindungen sind wichtige Ausgangsstoffe für die Synthese von Pharmazeutika Lebensmittelzusätzen Agrochemikalien Futtermittel Die Optimierung von Herstellungsprozessen für chirale Verbindungen ist daher von großem wirtschaftlichen Interesse 6
Inhaltsverzeichnis Bedeutung chiraler Moleküle Asymmetrische Reduktion von Alkenen Ziele des Forschungsvorhabens Arbeitsprogramm 7
Asymmetrische Reduktion von Alkenen Cis- und Trans-Hydrierung Sehr häufig angewendete katalytische Transformation Bis zu zwei Stereozentren können in einer Reaktion erzeugt werden * * trans In der Entwicklung * * cis Industrieller Standard Chemische Katalyse Biokatalyse 8
Asymmetrische Reduktion von Alkenen Biokatalyse oder chemische Katalyse? Kriterium Biologische Chemische Katalysatoren Katalysatoren Katalysatormenge Sehr gering Faktor 100-10.000 mehr Umweltverträglichkeit Vollständig biologisch abbaubar Häufig Schwermetallkatalysatoren Reaktionsbedingungen Mild: wässriges Medium 20 C-40 C Atmosphärendruck neutraler ph Häufig harsch: Organische Lösemittel Hohe Temperatur Hoher Druck nicht-neutraler ph Selektivität Hoch, wenige Reaktionsschritte Gering, mehr Reaktionsschritte 9
Asymmetrische Reduktion von Alkenen Enreduktasen Klassifikation Flavoenzyme aus der Old Yellow Enzyme Familie Reaktion trans-spezifische Reduktion aktivierter Alkene Substrate Alkene mit elektronenziehender Gruppe (A) Cofaktoren Flavinmononukleotid NADPH oder NADH (kostengünstiger und stabiler) 10
Asymmetrische Reduktion von Alkenen Enreduktasen Enzyme aus strikt anaeroben Bakterien Problem: Sauerstoffempfindlichkeit Sauerstoffstabile Enreduktasen aus aeroben Organismen Probleme: Moderate Enzymaktivität Starke Präferenz für NADPH als Cofaktor Enges Substratspektrum Neuer Ansatz: Enreduktasen aus Cyanobakterien Vorteile: Außergewöhnlich hohe Aktivität mit NADH Exzellente Stereoselektivität Breites Substratspektrum 11
Asymmetrische Reduktion von Alkenen Substratspektrum von Enreduktasen aus Cyanobakterien Maleimid (derivate) Nitroalkene Zyklische Enone Ph Carbonsäureester Ketoisophoron Terpenoide Aldehyde (R)-Carvon (S)-Carvon 12
Inhaltsverzeichnis Bedeutung chiraler Moleküle Asymmetrische Reduktion von Alkenen Ziele des Forschungsvorhabens Arbeitsprogramm 13
Ziele des Forschungsvorhabens Optimierung der Cofaktorspezifität von Enreduktasen aus Cyanobakterien durch Protein Engineering Steigerung der spezifischen Aktivität mit NADH (stabiler / kostengünstiger als NADPH) Beibehaltung der exzellenten Stereoselektivität Entwicklung eines ökonomisch und ökologisch vorteilhaften Verfahrens für die Produktion von (2R,5R)-Dihydrocarvon 14
Ziele des Forschungsvorhabens Bausteine für biologisch aktive Wirk- und Naturstoffe (2R,5R)-Dihydrocarvon ist ein wichtiger Baustein für Antimalaria-Wirkstoffe Verschiedene Naturstoffe (1 (R)-Carvon, 2 (2R,5R)-Dihydrocarvon, ER Enreduktase, FDH Formiatdehydrogenase, HCOO- Formiat) 15
Inhaltsverzeichnis Bedeutung chiraler Moleküle Asymmetrische Reduktion von Alkenen Ziele des Forschungsvorhabens Arbeitsprogramm 16
Arbeitsprogramm Protein Engineering Pentaerythritol-Tetranitrat-Reduktase NADPH:NADH Aktivitätsverhältnis: 120 Cyanobakterielle Enreduktase NADPH:NADH Aktivitätsverhältnis: 1 Kristallstruktur im Komplex mit einem NADH-Derivat und Flavinmononukleotid Homologiemodell einer cyanobakteriellen Enreduktase 17
Zielsetzung Verfahrensentwicklung Vergleich von Verfahren mit isolierten Enzymen und rekombinanten Zellen Vergleich von einphasigen Reaktionssystemen mit Zweiphasensystemen aus Ionischer Flüssigkeit/Puffer oder Adsorberharz/Puffer Ionische Flüssigkeit oder Adsorberharz Ionische Flüssigkeit oder Adsorberharz Wässrige Pufferphase O O ER NADH (R)-Carvon CO2 NAD+ FDH Escherichia coli Formiat (2R,5R)-Dihydrocarvon
Zielsetzung Verfahrensentwicklung Bestes Verfahren (höchste Raum-Zeit-Ausbeute und höchste Produktreinheit): Reaktionskinetische Beschreibung Modellgestützte Optimierung Vergleich von Verfahrensvarianten (Satz-, Zulauf-, kontinuierliche Verfahren) Maßstabsvergrößerung (Litermaßstab) 1 ph-sonde 2 Rührer 3 Bioreaktor 4 Kontrollstation 19
Zielsetzung Verfahrensentwicklung Projektjahr Arbeitspaket 1 2 3 Optimierung der Cofaktorspezifität durch Protein Engineering Vergleich von Verfahren mit isolierten Enzymen und ganzen Zellen Untersuchung verschiedener Zweiphasensysteme Reaktionskinetische Untersuchungen, Optimierung und Maßstabsvergrößerung 20
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Christoph Mähler, Dr. Kathrin Castiglione, Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz Technische Universität München, Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik 21