Arbeitsprotokoll Stand 16. 07. 2003 Dieses Protokoll basiert auf folgenden Publikationen: Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels, Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M, Anal Chem 1996 Mar 1;68(5):850-8 Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nanoelectrospray mass spectrometry, Wilm M, Shevchenko A, Houthaeve T, Breit S, Schweigerer L, Fotsis T, Mann M, Nature 1996 Feb 1;379(6564):466-9 sowie auf den Erfahrungen eines Trainingsaufenthaltes am EMBL in Heidelberg
Wichtig! Alle im Protokoll angegebenen Prozeduren sind das Produkt von eigener Erfahrung, Beobachtung und Literaturangeben. Es ist leicht möglich, daß sich einzelne Werte des Protokolls, besonders Mengen- oder Zeitangaben von anderen Protokollen unterscheiden. Auch stellen viele Angaben bezüglich Zeit, Volumina, oder Anzahl von Vorgängen nur einen Richtwert dar. Wenn nicht ausdrücklich die exakte Einhaltung eines Wertes verlangt wird, sind Änderungen innerhalb gewisser Grenzen kein Problem. 2
Tryptischer in-gel Verdau Allgemeine Hinweise Arbeitsweise: Immer mit puderfreien Handschuhen arbeiten, um Keratinverunreingungen zu vermeiden. Auf Sauberkeit und Staubfreiheit der Umgebung achten! Sämtliche Eppendorf-Gefäße, die mit Gelen oder Extrakten in Berührung kommen, werden unmittelbar vor Verwendung mit 50%igem Acetonitril gewaschen und im Trockenschrank bei 75 C getrocknet. Vorbereitung Gelbande möglichst exakt ausschneiden Hintergrund so gut wie möglich entfernen. Ausgeschnittene Gelbande in Stückchen von etwa 1x1 mm schneiden. 3
Waschen der Gelstücke Verwendete Lösungen: H 2 O Puffer: NH 4 HCO 3 100 mm (320 mg in 40 ml H 2 O = 8 mg/ml) Zu Gelstücken: 150 µl H 2 O 5 min schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben 150 µl Puffer 5 min schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben 70 µl H 2 O + 70 µl ACN 5 min schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben Falls die Gelstücke nicht vollständig entfärbt sind, dann nochmals 70 µl H 2 O + 70 µl ACN 5 min schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben Die vollständig entfärbten Gelstücke werden folgendermaßen geschrumpft und getrocknet: 150 µl ACN 5 min schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben Gelstücke auf Speed-Vac trocknen [Bei ungefärbten Gelen können die Gelstücke gleich geschrumpft und auf der Speed-Vac getrocknet werden: 150 µl ACN 5 min schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben Gelstücke auf Speed-Vac trocknen 4
Reduktion und Alkylierung Verwendete Lösungen: Puffer: NH 4 HCO 3 (320 mg in 40ml H 2 O = 8 mg/ml) Acetonitril Dithiothreitol (DTT) 10 mm in Puffer (1,5mg/ml) Iodacetamid (IAA) 55 mm in Puffer (10 mg/ml) lichtemfpindlich!!! Zu Gelstücken 60 µl DTT-Lsg. 30 min bei 56 C schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben 150 µl ACN 5 min bei Raumtemperatur (RT) schütteln (nicht länger, damit sich die Schwefelbrücken nicht zurückbilden!) kurz zentrifugieren Lösung abheben 60 µl IAA-Lsg. 20 min bei RT schütteln (dunkel!) kurz zentrifugieren Lösung abheben 150 µl Puffer 5 min bei RT schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben 150 µl ACN 15 min bei RT schütteln kurz zentrifugieren Lösung abheben Gelstücke in Speed-Vac. Trocknen, dann auf Eis stellen bzw. zur Lagerung tieffrieren 5
Verdau Verwendete Lösungen: Puffer: NH 4 HCO 3 (320 mg in 40ml H 2 O = 8 mg/ml) Aqua bidest. HCl 1 mm (zur Herstellung der Trypsin-Stammlsg.) Trypsin-Stammlösung: 25 µg Trypsin in 250 µl 1 mm HCl diese Lsg. in 15 µl-portionen aufteilen, je Eppi mit 5 µl CaCl 2 -Stammlsg versetzen und tieffrieren CaCl 2 -Stammlsg. 120 mm: 17,64 mg CaCl 2 *2 H 2 O/ml H 2 O tieffrieren Verdaupufer: frisch bereiten und gekühlt halten (zwischen 0 C un d + 4 C) Zu 15 µl Trypsinstammlsg. (mit CaCl 2 Stammlsg) 50 µl H 2 O (eisgekühlt) 50 µl Puffer (eigekühlt) Inkubationspuffer: 65 µl H 2 O 50 µl Puffer 5 µl CaCl 2 -Stammlsg. (die angegebenen Mengen für Verdaupuffer und Inkubationspuffer reichen für ca. 8 Proben!) 6
Alle Komponenten auf Eis stellen oder in einen tiefgefrorenen Eppi-Block (Trypsin-Stammlsg., Wasser, Puffer, CaCl 2 -Lsg.) und den Verdaupuffer mit kalten (!!) Lösungen erst knapp vor der Zugabe frisch bereiten. Immer gekühlt arbeiten (entweder auf Eis oder auf einem tiefgefrorenen Eppi- Block)! Verdaupuffer in kleinen Schritten den getrockneten Gelen zusetzen ( zuerst 4µl dann 2µl und dann in 1µl Schritten) und die Gelstückchen solange quellen lassen, bis sie vollständig aufgequollen sind. (Dieser Vorgang sollte in ca. 45 min abgeschlossen sein!) Möglichst keinen Überschuß an Verdaupuffer zusetzen, da sich sonst das Trypsin selbst verdaut und die Probe mit Trypsinpeptiden verunreinigt. Die Einhaltung der 45 min ist bei Verwendung von PROMEGA TM Modified Trypsin nicht so wichtig, da sich dieses Enzym nicht ( so schnell) selbst abbaut. In diesem Fall kann die Zugabe über einen längeren Zeitraum erfolgen, was ein gründlicheres Quellen der Gele ermöglicht. Nach Beendigung der Zugabe von Verdaupuffer (und nach der Aufquellung) werden 15 µl Inkubationspuffer (ebenfalls frisch bereitet) zugegeben, damit die Gelstücke bedeckt sind. Die Gelstücke über Nacht bei 37 C unter Schütteln i nkubieren. 7
Extraktion Verwendete Lösungen: Puffer: NH 4 HCO 3 (320 mg in 40ml H 2 O = 8 mg/ml) Extraktionspuffer: NH 4 HCO 3 25mM (1 Teil Puffer + 3 Teile H 2 O) Ameisensäure 5% (20 µl HCOOH + 380 µl H 2 O) Acetonitril Proben kurz zentrifugieren, um Kondenswasser zu sammeln. Zu Gelstücken: 5 µl Extraktionspuffer 15 min bei 37 C schütteln (oder 3 min ins Ultrasch allbad) kurz zentrifugieren dazu 160 µl ACN 15 min bei 37 C schütteln kurz zentrifugieren Überstand in neuem Eppi sammeln! ( auf Speed-vac so lange trocken bis der folgende Schritt beendet ist) Zu Gelstücken: 35 µl 5% Ameisensäure 15 min bei 37 C schütteln (oder 3 min ins Ultraschallbad) kurz zentrifugieren dazu 160 µl ACN 15 min bei 37 C schütteln kurz zentrifugieren Überstand mit erstem vereinigen und auf der Speed-Vac. vollständig trocknen. ACHTUNG: Gelstücke müssen wieder ganz klein geschrumpft und weiß sein!! Ansonsten nochmals 50 µl Acetonitril zusetzen, 10 min schütteln, zentrifugieren und Überstand mit erstem vereinigen. Laut Increasing the Throughput of Protein Identification Using Nanoelectrospray QqTOF Mass Spectrometry von Hanno Stehen, Jens Andersen, Bernhard Küster, Alexandre Podtelejnikov, Juri Rappsilber, Henrik Molina, Matthias Mann (vgl. http://www.pil.sdu.dk/matthias_mann.htm) kann bei der Peptidextraktion die Verwendung organischer Lösungsmittel entfallen 8
und daher auch auf das Einrotieren der Probe verzichtet werden. Die vereinigten Extrakte werden direkt auf die Säule inder Glaskapillare aufgetragen. 9
Probenreinigung mit Zip-Tips TM Verwendete Lösungen: Acetonitril Aqua bidest Methanol Ameisensäure Die auf der Speed-Vac getrocknete Probe wird mit 1 µl 80% HCOOH (direkt auf das Pellet) und sofort danach mit 10 µl 5% MeOH/1% HCOOH versetzt, ev. Kurz gevortext und zentrifugiert. Die C-18 Zip Tips TM (Fa. Millipore) werden wie folgt behandelt Auf Zip-Tip ca. 6 µl POROS-Aufschlämmung (etwas Poros in 50%igem MeOH) pipettieren und mit der Pipette ausdrücken Pipette auf maximales Volumen (10 µl) stellen Mind. 3x50% Acetonitril aufziehen und zum Abfall pipettieren Mind. 3x1% Ameisensäure aufziehen und zum Abfall pipettieren Zum Auftragen der Probe wird die Probelösung mindestens 10x immer wieder aufgezogen und in das Gefäß zurückgedrückt. Nach Möglichkeit vermeiden, Luft aufzuziehen bzw. die Spitze ganz auszudrücken. Zum Waschen der Probe 3x10 µl 5% MeOH/1% HCOOH aufziehen und zum Abfall pipettieren Zum Eluieren der Peptide wird in einem Eppendorfgefäß 6 µl (diese Menge kann je nach Probenkonzentration und Versuchsabsicht auch zwischen 2 und 10 µl betragen) Elutionslösung vorgelegt. Diese lösung ist 1%ig ameisensauer mit variablen MeOH-Gehalt (25%, 40% und 60% MeOH; Der MeOH-Gehalt muß mind. 25% betragen, sonst sprüht die Nanosprayquelle nicht!). Die Elutionslsg. Wird mindestens 10x durch die Spitze gezogen und in das Gefäß zurückgedrückt. Bei diesem Schritt ist besonders darauf zu achten, keine Luft einzusaugen! Sollte man mehrere 10
Elutionsschritte hintereinander ausführen, sollte die Spitze vor dem letzten Elutionsschritt nicht vollständig ausgedrückt werden. Die Elutionslsg. wird danach mit Gel-Loader-Tips in die Nanospray-Nadel überführt. 11