Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik Teil 3 Analytische Verfahren Klinische Chemie & Immunologie Prof. Dr. Ralf Lichtinghagen Medizinische Hochschule Hannover Klinische Chemie Tel.: 0511-5323940
Spektroskopie: Photometer (Grundbausteine)
Spektroskopie: Lambert-Beersches Gesetz log I o /I = A = a c x c x d A: Absorbance (im Deutschen früher Extinktion E) (spektrales dekadisches Absorptionsmaß) a c : Proportionalitätsfaktor (Extinktionskoeffizient) c: Schichtdicke in cm d: Konzentration in mol/l Absorbance A hat Messbereich von Null bis Unendlich I = I 0 A = 0 I = 0 A = Unendlich Transmission T (I/I 0 ) hat Messbereich von 0 bis 1 log 1/T = A I = I 0 T = 1 (%T = 100) I = 0 T = 0
Photometrie: Prinzipien Direkte Photometrie Substanz ist farbig oder absorbiert im UV-Bereich: z.b. Bilirubin, freies Hb Indirekte Photometrie Analyt wird in Messreaktion zu photometrisch messbarem Produkt (z.b.enzymatisch) umgewandelt. (Glucose, Lactat, Ethanol...) Berechnung erfolgt nach Lambert-Beer-Gesetz (a c =A/c x d) mittels Standard mit bekannter Konzentration c (Probe) = A (Probe) /A (Standard) x c (Standard) oder aus einer Kalibrationskurve CAVE: Gültigkeit nur innerhalb der des linearen Messbereichs
Photometrie: Prinzipien Gültigkeit des Lambert- Beer-Gesetzes nur für stark verdünnte Lösungen: Keine gegenseitige Beeinflussung chromophorer Gruppen verschiedener Moleküle
Photometrie: Prinzipien Indikatorreaktion in diesem Zusammenhang häufig Bildung bzw. Verbrauch von NAD(P)H. Im Gegensatz zu NAD(P) + hat NADH ein Absorptionsmaximum bei 340 nm Beispiel: Bestimmung von Glucose mittels Hexokinase-Reaktion: Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP Indikatorreaktion: Hexokinase Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Glucose-6-Phosphat + NADP + 6-Phosphogluconat + NADPH + H + Absorption bei 340 nm korreliert mit gebildetem NADPH und mit Glucosekonzentration
Flammenphotometrie Bestimmung von Natrium, Kalium Calcium, Lithium Färbung einer nicht leuchtenden Flamme durch Alkali- und Erdalkalisalze aufgrund thermischer Anregung von Valenzelektronen. Freiwerdende Energie als Licht mit elementspezifischen Wellenlängen a: Lösungsmittel verdampft org. Verbindungen verbrennen d: Zerfall von NaCl in freie Atome, die thermisch angeregt werden Je mehr Atome in der Flamme vorhanden sind, umso intensiver ist die Flammenfärbung und damit die Emissionsstrahlung Verwendung des Prinzips rückläufig im Vergleich zur Potentiometrie
Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) Bestimmung von z.b. Kupfer, Selen, Zink, Schwermetalle Hohlkathodenlampen (gibt es für ca. 60 Elemente) erzeugen elementspezifisches Licht Atomisiertes Probenmaterial absorbiert monochromatisches für das zu bestimmende Element spezifische Licht Absorption als Maß für die Konzentration des entsprechenden Elementes in der Messlösung
Potentiometrie Beispiel der Glaselektrode zur ph-messung Messanordnung für Potentiometrie Messung eines Potentials erfolgt fast stromlos als Potentialdifferenz bezogen auf das Potential einer Referenzelektrode Potentiometrische Messung erfordert somit: Messelektrode und Referenzelektrode mit ionenselektiver Membran. Einstab-Glaselektrode mit H + -sensitiver Glasmembran (Ionen-sensitiv)
Potentiometrie Die ISE-Einheit zur Bestimmung von Natrium, Kalium und Chlorid In nahezu jedem klinisch-chemischen Analysengerät befindet sich eine sogenannte ISE-Einheit. Diese Elektroden können aufgrund z.b. der Beschaffenheit ihrer Membran spezifisch die Ionenaktivität von Ionen wie Kalium, Natrium, Chlorid und im Bedarfsfall auch Calcium messen. Wichtigste Methode zur Bestimmung dieser Messgrößen. z.b. Kalium-Elektrode mit spezieller ionenselektiver Kunstoffmembran, in welche das Antibiotikum Valinomycin eingebettet ist (bindet spezifisch Kalium-Ionen). ISE- Chipmodul Indirekte ISE: Probe wird zuerst pipettiert und vorverdünnt (z.b. 1:20) in der ISE-Einheit gemessen. Direkte ISE: Anwendung in Blutgasgeräten zur Messung aus Vollblut, keine Vorverdünnung
Immunologische Verfahren Antikörper 80%) IgG IgM IgA IgD IgE Prozent. Anteil am Serum Ig-Pool 70-75 10 15-20 <1 Spuren Molekulargewicht (x1000) 150 970 385(Dimer)
Serumelektrophorese Information aus densitometrischer Auswertung IgG, IgA und IgM mit unterschiedlicher Verteilung polyklonal monoklonal
Immunologische Verfahren Immunelektrophorese/ Immunfixation Qualitative Methode zum Nachweis von monoklonalen Immunglobulinen mittels monospezifischen Antiseren gegen Anti-IgG Anti-IgA Anti-IgM Anti-Kappa Anti-Lambda
Immunologische Verfahren Nephelometrie/ Turbidimetrie Bei diesen immunchemischen Verfahren wird durch Antikörper-Antigen-Aggregate das Licht gestreut. Anwendung beim Nachweis vieler Serumproteine (Albumin, Immunglobuline, Akute-Phase-Proteine, Speicher- und Transportproteine) und Urinproteine (Albumin, α 1 -Mikroglobulin). Nephelometrie: Messung eines Anteils des gestreuten Lichtes (A) Turbidimetrie: (A) Messung der Abschwächung der Lichtintensität (B) (B)
Immunologische Verfahren Heidelberger-Kurve als Grundlage bei Trübungs- und Streulichtmessungen Antikörperüberschuss: Jede Steigerung der AG-Menge führt zu weiter Vernetzung, die im Äquivalenzbereich am stärksten ist. Antigenüberschuss: Aggregate werden wieder kleiner und somit besser löslich. Zahl der AK reicht nicht aus alle AG zu verküpfen.
Immunologische Verfahren Immunoassay zur Messung zahlreicher Analyten (Proteine, Pharmaka...) z.b. ELISA Enzyme linked immunoadsorbent assay (photometrisches Detektionsprinzip) Alternative Detektionsprinzipen (z.t. deutlich sensitiver als der enzymatische Substratumsatz): z.b. Fluoreszenz Chemiluminiszenz (LIA) Elektrochemiluminiszenz (ECLIA)
Immunologische Verfahren Sandwich-Assay Einsatz eines Capture -Antikörpers und eines markierten Zweitantikörpers Art der Markierung legt Detektionsprinzip fest (ELISA, RIA, LIA, ECLIA...)
Immunologische Verfahren kompetitiver ELISA Ein Indikator (Tracer, Label, Konjugat) konkurriert mit der Probe um Bindungsstellen Art der Markierung gibt Detektionsprinzip vor
Enzymkinetik Anwendung in der Diagnostik von Erkrankungen von Leber, Herz, Pankreas... Für die Diagnostik und Verlaufskontrolle zahlreicher Erkrankungen werden in der Klinischen Chemie Aktivitätsbestimmungen von zahlreichen Enzymen durchgeführt. Biochemische Grundlage Enzyme erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktion durch Herabsetzung der Aktivierungsenergie. Ohne Enzyme würden biochemische Reaktionen im Organismus nicht in nennenswertem Umfang ablaufen. Enzyme verlassen die katalysierte Reaktion unverändert. Für den Einsatz in der Labordiagnostik ist weniger die biochemische Grundlage von Bedeutung als vielmehr der Bildungsort im Organismus und innerhalb der einzelnen Zelle und damit die Art der Freisetzung eines Enzyms. Kinetischer Test Erfassung der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Umwandlung zur Bestimmung der Enzymaktivität. Messung der Enzymaktivität in U/l.
Bedingungen für enzymatische Tests Damit enzymatische Bestimmungen auch von Labor zu Labor verglichen werden können (Standardisierung), sind u.a. die Einhaltung folgender Rahmenbedingungen unbedingt erforderlich Optimale Substratkonzentration Optimaler ph-wert Optimale Coenzymkonzentration Optimale Konzentration von Aktivatoren Definierte Temperatur (37 C) Veränderung der Temperatur um 1 C verändert das Ergebnis eines enzymatischen Tests um ca. 10%
Mit steigender Substratkonzentration nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (v) zu 1) Wenig Substrat, Enzymmoleküle vorwiegend noch frei 2) Zunahme des Substrats, Hälfte der Enzyme frei, halbmaximale v 3) Hohe Substratkonzentration, kein Enzym mehr zur Verfügung, maximale v. weitere Substratzugabe erhöht v nicht Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit Enzymkinetik nach Michaelis-Menten Michaeliskonstante
Messung der Enzymaktivität Aufnahme einer Absorptions- Zeit-Kurve in einem vorgegebenen Messintervall zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit Beispiel: Bestimmung der Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH) LDH Lactat + NAD + Pyruvat + NADH + H + Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm (Zunahme von NADH)
Besonderheiten enzym. Tests Der optische Test nach Warburg beruht auf der Oxidation von NADH bzw. der Reduktion von NAD + Man unterscheidet: Einfacher optischer Test: z.b. LDH-Bestimmung Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion: Direkte Messung der enzymatischen Reaktion ist nicht möglich (z.b. ALT) ALT L-Alanin + α-ketoglutarat L-Glutamat + Pyruvat LDH Pyruvat + NADH + H + Lactat + NAD + Messung der Absorptionsabnahme bei 340 nm (Abnahme von NADH)
Besonderheiten enzym. Tests Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und Indikatorreaktion: Direkte Kopplung von enzymatischer Reaktion und Indikatorreaktion nicht möglich (z.b. Creatinkinase (CK)) Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP Hilfsreaktion Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP Indikatorreaktion CK Hexokinase Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Glucose-6-Phosphat + NADP + 6-Phosphogluconat + NADPH + H + Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm (Zunahme von NADPH)