Alles für die Histologie. Schnell und zuverlässig.

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1 Alles für die Histologie. Schnell und zuverlässig.

2 Inhaltsverzeichnis 01 Einleitung Fixierung Formaldehyd Andere Fixative Entkalken OSTEOMOLL OSTEOSOFT Paraffin für Histoprozessing und Einblocken Histosec Paraffinschnitte Lösungsmittel Ethanol 2-Propanol Aceton Xylol Neo-Clear Neo-Clear und Neo-Mount Färbungen Färbelösungen Hämatoxylin Kernfärbung H&E PAS Alcianblau-PAS Kernechtrot- Aluminiumsulfat Alcianblau- Kernechtrot Van Gieson Giemsa

3 Färbekits Eindecken Festfarbstoffe QM Qualitätsmanagement Referenzliste PAS Weigert Eisenhämatoxylin Elastika van Gieson Masson-Goldner Methenamin Versilberung Warthin-Starry Versilberung Retikulin-Versilberung Kongorot Tb-color modifiziert Tb-fluor Tb-fluor, phenolfrei DNA-Färbung HEMATOGNOST Fe LEUCOGNOST NASDCL Kanadabalsam Entellan Entellan Neu Entellan Neu für Eindeckautomaten DPX Neo-Mount Certistain Andere Festfarbstoffe

4 Einleitung 01 Einleitung 04 05

5 CE Zertifizierung von IVD Die Direktive 98/79/EC vom 20. Oktober 1998 für In-vitro-Diagnostika (IVD) ist die Grundlage für lokale Gesetze aller EU Mitgliedsstaaten. Ab Dezember 2003 müssen In-vitro-Diagnostika, die in der EU vom Hersteller in den Verkehr gebracht werden entsprechend zertifiziert sein und CE Zeichen auf Etiketten, Gebrauchsanleitungen und Werbematerialien tragen. Eingeführte IVD s, die von Händlern in den Verkehr gebracht werden und als IVD verwendet werden, müssen ab Dezember 2005 das CE Zeichen tragen. Unter die Bezeichnung In-vitro-Diagnostika fallen Reagenzien, Reagenzprodukte, Kalibratoren, Kontrollmaterialien, Kits, Instrumente, Apparaturen, Systeme, die einzeln oder in Kombination verwendet werden und vom Hersteller/in den Verkehrbringer für die In-vitro-Anwendung zur Untersuchung von Proben, einschließlich humaner Blut- und Gewebeproben deklariert sind. IVD s werden verwendet, um Information und Aussagen über verschiedene Zustände, physiologisch oder pathologisch, oder zu angeborenen Abnormalitäten zu erhalten, um therapeutische Auswirkungen zu beobachten oder die Sicherheit und Übertragbarkeit mit potentiellen Empfängern zu bestimmen. Die IVD s werden wie folgt klassifiziert: Klasse 2 Produkte, die unter Anhang II, Liste A und B fallen (wie z.b. in Liste A Produkte zur Blutgruppenbestimmung, HIV Bestimmung, in Liste B für verschiedene Antikörper-, Virus- und Blutzuckerbestimmungen). Klasse 1a Produkte für die Selbstanwendung, andere als in Klasse 2. Klasse 1 Produkte, die nicht zu Anhang II und zu Selbsttest-Produkten gehören. Die Mikroskopie Produkte von uns gehören zu Klasse 1 Produkten. Die CE Zertifizierung ist eine Selbstzertifizierung, bei der Produktgruppen entsprechend dem gültigen EDMA-Code, (European Diagnostic Manufacturers Association) basierend auf der Klassifizierung des VDGH (Verband der Diagnostika-Industrie e.v.) angemeldet werden. Merck hat im Dezember 2003 den CE Zertifizierungsprozess für alle zu dem Termin existierenden Mikroskopie Produkte, die als IVD verwendet werden und zur low-risk Gruppe gehören, erfolgreich abgeschlossen. Für neue Produkte werden Entwicklung, Produktion, Qualitätsprüfung entsprechend der Regularien durchgeführt und dokumentiert, die Produkte werden vor der Einführung im Markt behördlich angemeldet. Zum CE Zertifizierungsprozess gehört die regelmäßige Durchführung interner und externer Qualitätsmanagementsystem Audits nach DIN ISO EN

6 Fixierung Fixierung des Probenmaterials bedeutet die Unterbrechung der komplexen intra- und supravitalen Stoffwechselprozesse, Erhalt der Strukturen und die Verhinderung der postmortalen Zerfallserscheinungen. Die Fixierung verändert das Gewebe in seinem ursprünglichen, nativen Zustand grundlegend. Die Untersuchungen werden an einem, zum Fixiermittel gehörendem, Bild durchgeführt. In der Histologie wird das zu untersuchende Material mit Fixierungsflüssikeit getränkt, dünne Scheiben werden herausgeschnitten und in einen Überschuss an Fixierlösung, das Verhältnis soll mindestens 20:1 betragen, gelegt. Einfluss innerer und äußerer Faktoren: Autolyse, verursacht durch zelleigene Enzyme Verwesung, verursacht durch Mikroorganismen Zersetzung, unter Luftsauerstoff Fäulnis, gleicher Prozess ohne Sauerstoff Ziel der Fixierung Proteine, lösliche organische Substanzen werden mit Hilfe einer chemischen Direktreaktion (Denaturierung) mit Formaldehyd unlöslich gemacht, biologisch inaktiviert und vernetzt. Reaktion der Proteinseitengruppen mit Formaldehyd führt zur Vernetzung, durch die Antigene maskiert werden können, die dann ohne Vorbehandlung nicht mit Antikörpern reagieren können. RH + CH 2 O R-CH 2 (OH) + HR R-CH 2 (OH) R-CH 2 -R + H 2 O Lipide werden fixiert und stabilisiert durch Fixierung des Proteinanteils. Herauslösen der Lipide durch alkoholischen Arbeitsschritte und werden als Vakuolen oder leere, netzartige Strukturen dargestellt. Kohlehydrate werden über die fixierte Umgebung stabilisiert. Nukleinsäuren verlieren beim Fixieren ihre Strukturen und bilden Aggregate. Stabilisierung erfolgt durch fixierte Umgebung. Interzellularräume werden erweitert. Grenzflächen zwischen verschiedenen Strukturen können massiv Schädigung der Strukturen aufweisen. Wasserhaltige Strukturen können Osmose-bedingte Schrumpfung oder Quellung zeigen. 02 Fixierung 06 07

7 Formaldehyd Formaldehyd (HCOH) ist eines der bekanntesten und effektivsten Fixiermittel, das seit mehr als 100 Jahren verwendet wird. Die wässrigen Lösungen werden als Formalinlösung bezeichnet, die konzentrierte Lösung mit % als Formol. Vorteile der Formaldehydfixierung Erhalt der Strukturen. Die Stammlösung ist eine wässrige ca. 40 %ige Lösung von Formaldehyd, Arbeitslösungen sind 4 %ige oder 10 %ige Lösungen. Fixiertes Material ist lange haltbar, das Material wird härter und lässt sich gut bearbeiten. Enzyme, wie alkalische Phosphatase, unspezifische Esterasen, spezifische Esterase, Lipase bleiben nach Formalinfixierung aktiv. Das Material kann praktisch unbegrenzt in verdünnten Formalinlösungen gelagert und aufbewahrt werden. Hat bereits in geringen Konzentrationen desinfizierende Wirkung gegen Viren, Bakterien, Sporen, Tuberkelbakterien, Hepatitis und AIDS Viren. Nachteile der Formaldehydfixierung Histochemische Untersuchungen können schwierig sein, wenn Enzyme und Epitope maskiert sind. Die Maskierung kann jedoch durch Waschen teilweise wieder aufgehoben werden. Kann zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen führen, ist reizend und allergisierend. Technische Hinweise Formaldehyd ist ein schnelles Fixiermittel, mit dem ca. 1 mm Gewebe pro Stunde durchdrungen wird. Die Fixierzeit sollte nicht kürzer als 8 Stunden für eine komplette Fixierung des Materials sein. Lagerung in der Kälte kann zur Bildung von Paraformaldehyd durch Polymerisation führen, das als weißer Niederschlag ausfällt und die Konzentration der Lösung herabsetzt. Lösungen deshalb nicht im Kühlschrank lagern. Wenn sich z.b. durch Lichteinfluss in unstabilisierten und ungepufferten Lösungen Ameisensäure gebildet hat, kann es zur Beeinträchtigung der Kernfärbung kommen. Formaldehydfixierung ist für folgende Materialien besonders geeignet: Übersichtspräparate, Kalk, Knochen, Knorpel. Nervensystem Versilberungen werden durch saure Formaldehydlösungen negativ beeinflusst, hier auch auf neutralen ph-wert achten. Nachfixierung mit anderen Fixativen ist möglich. Beim Arbeiten mit Formaldehydlösungen ist unbedingt auf gute Belüftung des Arbeitsplatzes zu achten. Die 4 %ige Arbeitslösung ist mit Phosphatpuffer eingestellt und schützt das Gewebe. Die Lösung ist für alle Gewebetypen geeignet und liefert eine effektive und schonende Fixierung. Die 37 %ige Stammlösung ist durch die Zugabe von Kalzuimkarbonat gegen eine Verschiebung des ph-wertes in saure Bereiche geschützt, 10 % Methanol schützen Formaldehyd wirkungsvoll vor Polymerisation zu Paraformaldehyd. Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Formalinlösung 4 % gepuffert 1 l, 2,5 l, 10 l Titripak Formaldehydlösung min. 37 % stabilisiert mit 10 % Methanol, säurefrei 1 l, 2,5 l

8 Andere Fixative Es werden in der Literatur noch eine Reihe von Fixiergemischen genannt, bei denen Chemikalien verwendet werden, die für diese Anwendungen nicht mehr zur Verfügung stehen wie Sublimat, Pikrinsäure, Chloroform, Chromsäure, Uranylazetat. Den Vorteilen dieser Fixiergemische zur Darstellung struktureller Besonderheiten steht die Giftigkeit und Gefährlichkeit der Reagenzien gegenüber, denen die Anwender und auch die Umwelt nicht mehr ausgesetzt werden dürfen. Ethanol Ethanol ist ein Fixativ, dessen fixierende Wirkung durch Wasserentzug des Materials und ohne Beeinträchtigung oder Veränderung der Strukturen oder chemischen Bestandteile vonstatten geht. Ethanol (Ethylalkohol) mit einem Gehalt von 96 % oder 100 % (absolut) wird ebenfalls zur Fixierung verwendet. Der vergällte Alkohol, der verwendet werden sollte, ist mit Methyl-Ethylketon vergällt, das Vergällungsmittel verhält sich neutral für die verschiedenen Anwendungen. Die zu fixierenden Proben sollen nicht größer als 5 mm sein. Mit 96 %igem oder 100 %igem Ethanol erreicht man eine schnelle Fixierung, die je nach Dicke der Proben zwischen min bei 1-2 mm starken und 2-4 Stunden bei 3-4 mm starken Proben liegt. Durch die schnelle Entwässerung wird das Material oft spröde bis hart und lässt sich nicht immer gut schneiden. Es kann passieren, dass die Probe außen fixiert und hart ist, im Inneren aber noch nicht ausreichend fixiert ist. Das kann vermieden werden, wenn die Fixierung in geringer konzentrierten Ethanollösungen, bei % Gehalt, begonnen wird. Schrumpfungen können reduziert werden, wenn in kalter Lösung fixiert wird. Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Ethanol absolut, zur Analyse EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur 1 l, 2,5 l Ethanol vergällt mit etwa 1 % Methylethylketon zur Analyse EMSURE 1 l, 5 l Fixierung 08 09

9 Edelstahl-Mehrwegtrommel mit Entnahmesystem für Inertgas-Druckbeaufschlagung

10 Entkalken OSTEOMOLL und OSTEOSOFT Entkalken von Knochen und anderem Hartmaterial, das in histologischen Routineprozessen bearbeitet werden soll Bei empfindlichem Material wie z.b. Beckenkammstanzen, bei dem das Gewebe für den optimalem Erhalt der Zellstrukturen schonend entkalkt werden muss, um die Antigenstrukturen im Gewebe zu schützen und nach dem Entkalkungsprozeß bei Bedarf mit immunhistochemischen Methoden arbeiten zu können, ist eine schonende Entkalkung erforderlich. Hierfür eignet sich die Entkalkungslösung OSTEOSOFT, Art. Nr Für robusteres Knochenmaterial wird eine Knochenentkalkungslösung verwendet, die schnell und zuverlässig entkalkt. Hier ist OSTEOMOLL, Art. Nr zu verwenden. OSTEOMOLL ist eine saure Entkalkerlösung, die Formaldehyd enthält, deshalb wird Entkalkung und Fixierung in einem Schritt durchgeführt. OSTEOMOLL entkalkt Knochen, in Abhängigkeit von Größe, Gewicht und Dichte, von 30 min bis zu max. 8 Stunden bei z.b. Hüftknochenstücken. Dies bedeutet, dass die Abläufe bei der Bearbeitung von Hartmaterial überprüft und kontrolliert werden müssen, da zu lange Behandlung mit OSTEOMOLL zur Reduzierung der Anfärbbarkeit des Materials führen kann. Sollte das entkalkte Material sich beim Schneiden als noch zu hart erweisen, kann man den kompletten Block mit der Materialseite nach unten für ein paar Minuten in eine flache Schale mit OSTEOMOLL zum Nachentkalken einlegen. Ist das Material immer noch zu hart, kann die Prozedur wiederholt werden. Den Paraffinblock vorsichtig abtrocknen und wie gewohnt schneiden. Knochenmarkbiopsie, Paraffinschnitt, OSTEOSOFT, Immunohistochemischer Nachweis, Plasmozytom Knochenmarkbiopsie, Paraffinschnitt, OSTEOSOFT, Immunohistochemischer Nachweis, reaktiver Prozess 03 Entkalken 10 11

11 Wird hartes, kalkhaltiges Gewebsmaterial wie Knochen, Zähne, verkalkte Gefäße histologisch aufgearbeitet, so ist es entweder zu entkalken, um es mit der normalen Paraffineinbettung und Paraffinschnitttechnik bearbeiten zu können, oder das Material muß in Kunststoff eingebettet und auf dem Hartschnittmikrotom geschnitten werden. Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer OSTEOSOFT Für sensitives Hartmaterial (wie Beckenkammbiopsien) 1 l OSTEOMOLL Für Routine-Hartmaterial (Knochen, Zähne u.a.) 1 l

12 Paraffin Paraffin für Histoprozessing und Einblocken Paraffine sind Mischungen aus gesättigten Kohlenwasserstoffen, deren Schmelzpunkt mit zunehmender Kettenlänge steigt. In der Histologie verwendet man Paraffine mit Kettenlängen von Kohlenstoffatomen, d.h. mit Schmelzpunkten zwischen C. Mit dem Schmelzpunkt steigt die Konsistenz des erstarrten Paraffins. Für histologische Routinearbeiten verwendet man meist Paraffin mit einem Schmelzbereich von C. Paraffin bildet beim Erstarren Kristalle. Erfolgt das Abkühlen rasch, so ist das Gefüge des erstarrten Paraffins homogen feinkristallin und die Schneidbarkeit gut. Bei allmählicher Abkühlung kristallisiert Paraffin in unregelmäßigen Platten und Nadeln aus, wobei es zu einer Volumenminderung kommt. Die Oberfläche des erstarrenden Paraffinblocks zieht sich dabei stark ein, es bildet sich der sog. Paraffinnabel. Zwischen den Paraffinkristallen können sich mit Luft gefüllte Spalten bilden. Man erkennt dies an der Sprenkelung des Paraffins, das sonst glasig durchscheinend ist. Die Sprenkelung ist beim Schneiden störend, da an diesen Stellen die Schnitte ihren Zusammenhalt verlieren und ausbrechen. Um die Sprenkelung zu verhindern, setzt man den Paraffinen verschiedene Substanzen zu; der klassische Zusatz ist 5 % Bienenwachs. Moderne Paraffine enthalten verschiedene plastische Polymere, die die Sprenkelung verhindern, die Schnittfähigkeit verbessern und die Infiltrationsgeschwindigkeit steigern. Paraffin soll nur 2-3 C über den Schmelzpunkt erhitzt werden: Überhitztes Paraffin wird durch Oxidation gelb, beim Abkühlen seifig. Der Zusatz von DMSO (Dimethylsulfoxid) sorgt für eine beschleunigte Infiltration und vollständige Durchdringung und die Beigabe von Polymeren für eine erhöhte Plastizität des eingebetteten Gewebes. Durch den hohen Reinheitsgrad ist ein Filtrieren des geschmolzenen Wachses nicht mehr erforderlich. Es ist eine hervorragende Schneidefähigkeit bei Einzel- und Serienschnitten gewährleistet und die Erhaltung von Form und Farbe des histologischen Färbebildes sichergestellt. 04 Paraffin 12 13

13 Histosec Premium-Paraffin für die Routine und Anwendungen in der Immunohistochemie und Mikrowelle HISTOSEC Histosec, ist ein Paraffin höchster Reinheitsstufe, das mit und ohne DMSO erhältlich ist. Der Schmelzbereich ist bei C und in diesem Bereich kann jedes Material ohne Schaden der Bearbeitung unterzogen werden, unabhängig, welche Methoden angewendet werden sollen. Histosec wird in einem aufwendigen Verfahren aus ausgewählten Rohwachsen und Ausgangsstoffen hergestellt und unterliegt strengen Qualitätskontrollen. Beim Histoprozessing, der kompletten Entwässerung der Proben, werden die fixierten und gespülten Proben schrittweise in Alkoholbädern mit steigender Konzentration entwässert. Dann in Bäder mit Intermedien, das sind Lösungen, die sowohl mit Alkohol als auch mit Paraffin mischbar sind, überführt. Als Intermedien werden heute vorwiegend Xylol oder Xylol-Ersatz verwendet. Die so komplett entwässerten Proben werden abschließend in Paraffinbäder gebracht und dort mit Paraffin getränkt. An den Stellen, an denen im nativen Material Wasser oder alkohollösliche Substanzen wie Fett war, ist Paraffin eingelagert worden. In diesem Prozess zeichnet sich Histosec durch sehr gute Standzeiten in den Geräten und durch eine hohe Gebrauchsstabilität aus. Histoprozessing Protokoll Histosec speziell ausgewähltes Paraffin mit dem Zusatz von Polymeren Produkt Konzentration Zeit Ethanol (ETOH) 50 % 1 h Ethanol (ETOH) 70 % 1 h Ethanol (ETOH) 70 % 1 h Ethanol (ETOH) 80 % 1 h Ethanol (ETOH) 90 % 1 h Ethanol (ETOH) 100 %, vergällt 1 h Ethanol (ETOH) 100 %, vergällt 1 h Ethanol (ETOH) 100 %, vergällt 1 h Xylol oder Neo-Clear 1 h Xylol oder Neo-Clear 1 h Histosec 60 C 2 h Histosec 60 C 3 h Die entwässerten und mit Paraffin getränkten Proben werden mit Paraffin eingeblockt, nach dem Ausblocken kühl gelagert, um problemlos Serienschnitte anfertigen zu können.

14 Technischer Hinweis/Troubleshooting Wird technisches Paraffin oder wird Paraffin zu lange im Histoprozessor verwendet, kann es zur verstärkten Aufnahme des Intermediums kommen, bei der sich die Beschaffenheit des Paraffins ändert, es wird schmierig, riecht nach dem Lösungsmittel und kann schlechter in die Proben eindringen. Das kann zur Folge haben, dass die Durchdringung der Proben nicht mehr komplett abläuft und sich die Proben anschließend schlechter schneiden lassen, besonders frische eingeblockte Proben können Schwierigkeiten bereiten und auch die Qualität der Schnitte schlechter ist. Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Histosec 4 x 2,5 kg, 25 kg Histosec ohne DMSO 4 x 2,5 kg, 25 kg Reines Paraffin Paraffin 4 x 2,5 kg Paraffin 14 15

15 Paraffinschnitte Für einige Färbungen wie Kongorot Färbung zum Nachweis von Amyloid sollten die Schnitte 7 μm dick sein, für die Darstellung von Mykobakterien mit Ziehl-Neelsen Methode mindestens 5 μm. Technische Schwierigkeiten beim Schneiden gibt es bei zu weichen, zu harten oder spröden Paraffinblöcken oder wenn vom Histoprozessing noch Lösungsmittelreste im Paraffin sind. Für das Histoprozessing sollten qualitativ hochwertige Lösungsmittel, ein für die Anwendung in der Histologie geprüftes Paraffin und ein passendes Protokoll verwendet werden, um immer stabile und reproduzierbare Ergebnisse zu erreichen. Die Verwendung des hier genannten Protokolls, der Lösungsmittel und Paraffine geben reproduzierbare, gute Ergebnisse und verhindern Störungen und Mehraufwand bei der Verarbeitung des Probenmaterials. Schneiden Paraffinschnitte werden mit Schlitten- oder Rotationsmikrotomen angefertigt. In beiden Fällen wird das Messer horizontal über den Block und das Präparat bewegt, beim Rotationsmikrotom wird die lineare Bewegung durch ein Handrad ausgeführt und in eine Rotationsbewegung umgewandelt. Die gerätespezifischen Details der verschiedenen Mikrotome können in den dazugehörigen Gebrauchsanleitungen nachgelesen werden. Für beide Mikrotome können klassische Mikrotommesser für die Mehrfachbenutzung verwendet werden, für Rotationsmikrotome eignen sich auch Einwegklingen. Die Blöcke sollten vor dem Schneiden immer gekühlt werden. Die gewünschte Schnittdicke, die für normale Präparate zwischen 3-5 μm liegt, wird eingestellt und die Schnitte werden dann in der Stärke angefertigt, wenn das Messer gleichmäßig über den eingespannten Paraffinblock geführt wird. Die Schnitte werden mit einem feinen Pinsel vom Messer abgenommen und weiterbehandelt. Aufziehen und Strecken Die Schnitte werden zum Strecken in ein warmes Wasserbad gebracht und von dort auf einen sauberen Objektträger aufgezogen. Für spezielle Anwendungen werden die Objektträger ggf. beschichtet oder kommerziell vorbehandelte Objektträger verwendet, um ein Abschwimmen in der nachfolgenden Anwendung zu verhindern. Nach dem Aufziehen werden die Objektträger zum Trocknen in den Wärmeschrank gestellt. Vorbereitung zum Entparaffinieren Die Paraffinschnitte werden für ca. 20 min bei ca. 70 C im Wärmeschrank abgeschmolzen und vor den unterschiedlichen Färbungen im warmen Xylol oder Xylol-Ersatz max. 5 min entparaffiniert.

16 Lösungsmittel Ethanol Ethanol, C 2 H 5 OH, ist eines der gebräuchlichen Lösungsmittel in der Histologie. Ethanol wird im Histoprozessing und bei den Färbungen für die ab- und aufsteigenden Alkoholreihen, oder auch zum Spülen in den Färbungen und zum Ansatz für diverse Färbelösungen verwendet. Wie Ethanol beim Histoprozessing und den Färbungen verwendet wird, ist dort in den Anwendungsvorschriften dokumentiert. Ethanol arbeitet schnell und effektiv, es ist darauf zu achten, dass die Bäder regelmäßig erneuert werden, um Qualitätsverluste wie entfärbte Schnitte oder milchig-trübe Präparate zu vermeiden. H 3 C OH Ethanol ist als leichtentzündlich mit dem Gefahrensymbol F eingestuft. Die Sicherheitshinweise und weitere Informationen zum sicheren Umgang mit Ethanol sind im Sicherheitsdatenblatt aufgeführt, das im Internet oder auf Anfrage erhältlich ist. Ethanol ist ein Lösungsmittel, das durch folgende chemisch-physikalische Daten charakterisiert wird: Chemische und physikalische Daten Zündtemperatur 363 C (DIN 51794) Löslichkeit in Wasser (20 C) löslich Schmelzpunkt -114,5 C Molare Masse 46,07 g/mol Dichte 0,790-0,793 g/cm 3 (20 C) ph-wert 7,0 (10 g/l, H 2 O, 20 C) Siedepunkt 78,3 C Dampfdruck 59 hpa (20 C) Explosionsgrenze 3,5-15 % (V) Flammpunkt 13 C c.c. Brechungsindex 1, Lösungsmittel

17 Ethanol wird als unvergällte Qualität mit einer Reinheit von >/= 99,9 % oder auch als 96 %ige Lösung verwendet. Die unvergällten Qualitäten werden per Gesetz mit spezielle Steueraufschlägen belegt und sind deshalb recht preisintensiv. Neben der unvergällten Qualität gibt es auch vergälltes Ethanol, dieses Ethanol enthält 1 % MEK (Methylethylketon). Das Vergällungsmittel wird seit Jahren verwendet und hat sich bewährt, weil die Ergebnisse in der Histologie nicht negativ beeinflusst werden. Durch die Vergällung wird keine extra Steuer erhoben, so dass dieser Qualität für Routineanwendungen der Vorzug gegeben werden sollte. Neben den konzentrierten Ethanol Lösungen wird mit verdünnten Lösungen gearbeitet, die bei Bedarf selbst hergestellt werden. Für die Re- und Dehydrierung werden 50, 70 und 80 %ige Lösungen verwendet. Für Ethanol gibt es natürlich auch verschiedene Qualitätsgrade von zur Analyse, über technische Qualität bis hin zu wiederaufbereiteten Lösungen. Auch hier gilt, dass mit guten Lösungsmittelqualitäten Störungen und Probleme im Ablauf und bei den Ergebnissen vermieden werden können. Ein möglichst realistischer Kosten-Nutzen-Abgleich sollte von Zeit zu Zeit gemacht werden, um bei Bedarf Korrekturen vornehmen zu können. Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Ethanol absolut, 1 l, 2,5 l zur Analyse EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol vergällt mit ca. 1 % Ethylmethylketon zur Analyse EMSURE 1 l, 5 l

18 2-Propanol 2-Propanol, C 3 H 8 O, ist ein Alkohol, der in Labors als Lösungsmittel verwendet wird. 2-Propanol kann auch für die Alkoholreihen zum re- und dehydrieren eingesetzt werden, es reagiert langsamer als Ethanol. OH H 3 C CH 3 2-Propanol trägt die Gefahrensymbole F und Xi und ist als leicht entzündlich und reizend eingestuft. 2-Propanol ist ein Lösungsmittel, das durch folgende chemisch-physikalische Daten charakterisiert wird: Chemische und physikalische Daten Zündtemperatur 425 C (DIN 51794) Löslichkeit in Wasser (20 C) löslich Schmelzpunkt -89,5 C Molare Masse 60,1 g/mol Dichte 0,786 g/cm³ (20 C) ph-wert (H 2 O, 20 C) neutral Siedepunkt 82,4 C (1013 hpa) Dampfdruck 43 hpa (20 C) Explosionsgrenze 2-13,4 % (V) Flammpunkt 17 C, offener Tiegel Brechungsindex 1,378 Wasseraufnahme 1000 g/kg Verdunstungszahl 11 Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer 2-Propanol zur Analyse EMSURE 1 l, 2,5 l ACS, ISO, Reag. Ph Eur Lösungsmittel

19 Aceton Aceton oder auch Dimethylketon, Propanon, C 3 H 8 O ist ein gebräuchliches Lösungsmittel, das für spezielle Anwendung im histologischen Labor verwendet wird, z.b. Fixierung, Zusatz zu Lösungen. H 3 C CH 3 O Aceton trägt die Gefahrensymbole F und Xi und ist als leicht entzündlich und reizend eingestuft. Aceton ist ein Lösungsmittel, das durch folgende chemisch-physikalische Daten charakterisiert wird: Chemische und physikalische Daten Zündtemperatur 465 C (DIN 51794) Löslichkeit in Wasser (20 C) löslich Schmelzpunkt -95,4 C Molare Masse 58,07 g/mol Dichte 0,79 g/cm³ (20 C) ph-wert 5-6 (395 g/l, H 2 O, 20 C) Siedepunkt 56,2 C (1013 hpa) Dampfdruck 233 hpa (20 C) Explosionsgrenze 2,6-12,8 % (V) Flammpunkt 17 C, offener Tiegel Wasseraufnahme 1000 g/kg Brechungsindex 1,35868 Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Acetone zur Analyse EMSURE 1 l, 2,5 l ACS, ISO, Reag. Ph Eur

20 Xylol Xylol ist ein aromatisches Lösungsmittel, C 6 H 4 (CH 3 ) 2 das seit Jahrzehnten in medizinischen Labors im Histoprozessing, zum Entparaffinieren und Klären verwendet wird. CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Xylol ist ein Lösungsmittel, das durch folgende chemisch-physikalische Daten charakterisiert wird: Chemische und physikalische Daten Zündtemperatur 490 C (DIN 51794) Löslichkeit in Wasser 0,2 g/l (20 C) Sättigungskonzentration (Luft) 35 g/m³ (20 C)Luft Schmelzpunkt > -34 C Molare Masse 106,17 g/mol Dichte 0,86 g/cm 3 (20 C) ph-wert (H 2 O) nicht anwendbar Siedepunkt C Dampfdruck 10 hpa (20 C) Explosionsgrenze 1,7-7,0 % (V) Flammpunkt 25 C Kinematische Viskosität 0,85 mm 2/s (201 C) Verdunstungszahl 13, Lösungsmittel

21 Xylol Der Vorteil ist, dass Xylol sehr schnell und effizient Schnitte entparaffiniert und auch die Entwässerung abschließt. Xylol hat eine gute Kapazität und Geschwindigkeit zum Lösen des Paraffins der Schnitten, das hat Xylol zum Standardlösungsmittel in der Histologie gemacht. Geprüfte Vorschriften für den Einsatz von Xylol in der Histologie, sind in den Kapiteln Histoprozessing und Einblocken und Färbungen zu finden. Es werden verschiedene Qualitäten von zur Analyse bis zu technisch eingesetzt, dabei können technische Qualitäten zu schlechteren Ergebnissen und zum vorzeitigen Ausbleichen der Präparate führen. Die Färbeergebnisse und auch die Haltbarkeit der Färbung kann negativ beeinflusst werden. Xylol gehört zu den Lösungsmitteln, die wieder aufgearbeitet werden. Es gibt Systeme im Markt, mit denen gebrauchtes Xylol aufgearbeitet wird und weiter verwendet werden kann. Es sollte nicht unterschätzt werden, dass so eine Aufbereitung immer mit einem gewissen Qualitätsverlust einher geht und der Austausch des aufbereiteten Xylol erfolgen sollte, bevor es zu Qualitätsverlusten am zu bearbeitendem Probenmaterial kommt. Das Problem Der Nachteil ist, dass das aromatische Lösungsmittel Xylol ein Gefahrstoff mit Einstufung Xn hat und entzündlich, gesundheitsschädlich und reizend ist, eine hohe Verdunstungsrate und einen typischen Geruch hat. An diesem Geruch erkennt man schnell, wo mit Xylol gearbeitet wird. Die Labors müssen gut belüftet werden können und mit Xylol muß unter dem Abzug gearbeitet werden. Sicherheitshinweise und weitere Informationen zum sicheren Umgang mit Xylol sind im Sicherheitsdatenblatt aufgeführt, das im Internet oder auf Anfrage erhältlich ist. Aromatische Lösungsmittel, wie Xylol, können bekanntlich bei intensiver Exposition Leber, blutbildende Organe und das lymphatische System schädigen. Die LD 50 oral Dosis ist für die Ratte 2840 mg/kg; LD 50 dermal ist für das Kaninchen > 4350 mg/kg. Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Xylol für Analyse EMSURE 1 l, 2,5 l ACS, ISO, Reag. Ph Eur Xylol reinst (Isomerengemisch) 1 l, 2.5 l

22 Neo-Clear Neo-Clear Xylol-Ersatz Auf Grund schärferer Auflagen des Gesundheits- und Umweltschutzes und veränderten Anwenderverhaltens ist es notwendig, aromatische Lösungsmittel wie Xylol mehr und mehr durch anwenderfreundliche, aromatenfreie Lösungsmittel zu ersetzen. Anforderungen an den Xylol-Ersatz Geringe bis keine Gesundheitsgefährdung Identische Ergebnisse Geringe, besser keine Änderung der Anwendungsvorschriften Gleiche Verwendungsdauer Möglichst geringe bis keine Umweltbelastung Optimale Ergebnisse bei der Anwendung von Neo-Clear technische Hinweise Beim Histoprozessing kann mit dem vom Xylol gewohnten Protokoll gearbeitet werden. Die Anwendungsprüfung ergab für Xylol und Neo-Clear gleiche Standzeiten im Histoprozessor. Beim Entparaffinieren treten keine Unterschiede in der Anwendung auf. Neo-Clear sollte im gleichen Rhythmus wie Xylol erneuert werden. Ein Trübwerden der Alkoholbäder in der Färbereihe wird nicht beobachtet. Das Klären mit Neo-Clear liefert farbstabile Präparate in von Xylol gewohnter Qualität. Um optimale optische Ergebnisse der gefärbten Präparate zu erhalten, müssen die Präparate mit einem passenden Eindeckmittel eingedeckt werden. Wir haben ein spezielles Eindeckmittel im Sortiment, das für den Gebrauch mit Neo-Clear konzipiert wurde. Neo-Mount, Art. Nr , ist für das Eindecken mit Deckglas. In der Praxis wird Xylol-Ersatz verwendet, der aus verschiedenen chemischen Gruppen kommt, aus der Gruppe der Terpene, deren Geruch an Zitrusfrüchte erinnert, und aus der Gruppe der aliphatischen Kohlenwasserstoffgemische, mit einer Kettenlänge von etwa C 7 -C 15, die sie den Isoparaffinen zuordnet. Neo-Clear ist ein gesättigtes, aliphatisches Kohlenwasserstoffgemisch C 9 -C 11, CAS-Nr , nahezu geruchlos, farblos, mischbar mit den meisten organischen Lösungsmittel, nicht mischbar mit Wasser. Neo-Clear ist ein aliphatischer Kohlenwasserstoff (C 9 -C 11 ) und gehört zu den sogenannten Isoparaffinen. Diese Lösungsmittel haben die Eigenschaft Paraffin zu lösen, was für den Ersatzstoff von Xylol eine wesentliche Voraussetzung ist, reagieren aber durch die leicht ölige Konsistenz sehr sensible gegenüber direktem Kontakt zu Wasser. Beim Entparaffinieren mit Neo-Clear treten keine Unterschiede in der Anwendung auf. Neo-Clear sollte im gleichen Rhythmus wie Xylol erneuert werden. Es gibt ein paar Punkte, die in den nachfolgenden Schritten beachtet werden sollten, um eine optimale Handhabung und Qualität der Präparate mit Neo-Clear zu erreichen Lösungsmittel

23 Neo-Clear ist ein gesättigtes, aliphatisches Kohlenwasserstoffgemisch C 9 -C 11 Chemische und physikalische Daten Zündtemperatur ~ 230 C (DIN 51794) Löslichkeit in Wasser 0,1 g/l (20 C) Dichte 0,74-0,75 g/cm³ (20 C) Siedepunkt C Dampfdruck 7,1 hpa (20 C) Explosionsgrenze 0,7-7,0 Vol % Flammpunkt 43 C Lagertemperatur C Neo-Clear ist nach EG-Richtlinien mit Xn, als gesundheitsschädlich eingestuft. Sicherheitshinweise und weitere Informationen zum sicheren Umgang mit Neo-Clear sind im Sicherheitsdatenblatt aufgeführt, das im Internet oder auf Anfrage erhältlich ist. Neo-Clear Xylol-Ersatz für Histoprozessing, Entparaffinieren und Entwässern/Klären

24 Neo-Clear und Neo-Mount Die perfekte Produktkombination für Histoprozessing und Eindecken Neo-Clear und Alkoholqualität Eine Trübung der Alkoholbäder (Ethanol) in der Färbereihe wird nicht beobachtet, wenn mit einer Alkoholqualität wie reinst und besser und einer Alkoholkonzentration von 96 % oder mehr gearbeitet wird. Bei technischen Qualitäten von Alkohol kann der tatsächliche Ethanolgehalt niedriger sein, als angegeben und das verwendete Ethanol hat dann nicht die für die Entwässerung notwendigen Alkoholkonzentration und schleppt Wasser in das Klärmedium Neo-Clear ein. Das kann zu Trübungen in den Neo-Clear Bädern und zu Trübungen auf den eingedeckten Präparaten führen. Neo-Clear und manuelles Eindecken mit Neo-Mount Neo-Clear hat eine geringere Verdunstungsrate als Xylol und das macht kleine Änderungen im gewohnten Protokoll notwendig. Werden die Präparate aus dem letzten Bad der Entwässerung/ Klären genommen, werden sie normalerweise zügig weiter verarbeitet, um das Trocknen der Präparate zu vermeiden. Neo-Clear behandelte Präparate sollten unbedingt mit dem passenden Eindeckmittel Neo-Mount eingedeckt werden, um die gewohnte optische Brillanz zu erzielen. Mit Xylolhaltigen Eindeckmitteln erhält man auf Neo-Clear behandelten Präparaten Schlieren. Wird mit Neo-Clear geklärt und mit Neo-Mount eingedeckt, muß der Überschuss an Neo-Clear von den Präparaten entfernt werden, indem man die Objektträgerhalter für 1-2 min auf ein Blatt Filterpapier stellt. Die Gefahr des Trocknen besteht nicht durch die niedrigere Verdunstungsrate und die Konsistenz von Neo-Clear. Dann werden die Präparate in der üblichen Art eingedeckt. Bleibt der Neo-Clear Überschuss auf den Präparaten und das Präparat wird mit Neo-Mount und Deckglas eingedeckt, kann es zu Luftblasen unter dem Deckglas kommen und die Trocknungszeit kann sich verlängern. Neo-Mount Anwender- und umweltfreundliches Eindeckmittel für farbstabile Präparate, die mit Neo-Clear behandelt worden sind Lösungsmittel

25 Neo-Clear und Eindecken mit Neo-Mount im Eindeckautomaten Werden mit Neo-Clear geklärte Präparate im Eindeckautomaten eingedeckt, so dürfen die Präparate im Behälter vor dem Eindecken nicht mit Neo-Clear bedeckt sein (was bei Xylol ein Muss ist!), sondern müssen in den leeren Behälter eingebracht werden. Die Präparate trocknen nicht aus, auch wenn der Objektträgerhalter komplett mit Präparaten gefüllt ist. Werden die Präparate aus einem mit Neo-Clear gefüllten Behälter direkt eingedeckt, kann es passieren, dass alle eingedeckten Präparate innerhalb weniger Stunden komplett mit Luftblasen unter dem Deckglas bedeckt sind. Die Verwendung von Neo-Clear und Neo-Mount liefern farbstabile Präparate. Die Trocknungszeit für Neo-Mount eingedeckte Präparate beträgt ca. 30 min. Bei Bedarf können die Deckgläser durch Einstellen in Neo-Clear wieder abgelöst werden. Histoprozessing mit Neo-Clear Paraffin Schnitte Entparaffinieren mit Neo-Clear Färben Entwässern mit Neo-Clear Eindecken mit Neo-Mount Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Neo-Clear 5 l Neo-Clear 4 x 5 l Passendes Eindeckmittel Neo-Mount 500 ml

26 Färbungen Färbelösungen Die gebrauchsfertigen Hämatoxylinlösungen für die Histologie haben gegenüber den selbstangesetzten Lösungen entscheidende Vorteile: Kontrollierte Oxidation des Farbstoffs in der Lösung Stabile Färbeergebnisse mit selektiver Kernfärbung Chargenkonstanz Reproduzierbare Ergebnisse Qualitätskontrolle (in Prozess- und Endkontrolle) mit Anwendungsprüfung Hohe Ergiebigkeit Haltbarkeit 3 Jahre Einfache Anwendung Kein direkter Kontakt mit Farbstoff und Reagenzien Wahl zwischen klassischer und modifizierter Lösung Hämatoxylin und Eosin Übersichts- und Standardfärbung Die H&E Färbung ist die Standardfärbung in der Histologie, die einen guten Überblick über die Struktur des Gewebes liefert und dabei die Unterscheidung der untersuchten Strukturen in normal, entzündlich, degenerativ-veränderte oder pathologisch ermöglicht. In der H&E Färbung werden zuerst die Kerne mit einer sauren Hämatoxylinlösung gefärbt, das Hämatoxylin liegt dabei in der oxidierten Form, dem Hämatein vor. Die Lösung enthält neben dem Farbstoff ein dreiwertiges Metallsalz, hier eine Aluminiumverbindung und das Oxidationsmittel, jetzt ein Iodat, statt den früher verwendeten Quecksilbersalzen. Der Farbstoff bildet in der Lösung mit dem Metallsalz eine Chelatkomplexverbindung, der die Färbung an den Zielstrukturen ermöglicht. Damit die komplexe Hämatoxylinverbindung die typische blaue Färbung annimmt, wird im nächsten Schritt mit Leitungswasser gespült und die Färbung so an den Zielstrukturen fixiert. Die Kerne erscheinen dunkelblau, dunkelviolett bis schwarz. Neben den Kernen werden auch Kalk, saurer Schleim und gram-positive Bakterien blau angefärbt. 06 Färbungen 26 27

27 Kernfärbung mit Hämatoxylin Für die am meisten genutzte histologische Färbung, die Hämatoxylin-Eosin Färbung (H&E), werden für die Kernfärbung gebrauchsfertige Färbelösungen benutzt: Mayers Hämalaunlösung oder Hämatoxylinlösung mod. nach Gill III und alkoholische oder wässrige Eosin G-Lösung 0,5 % für die Gegenfärbung, d.h. für Proteine, Kollagen, Keratin, Interzellularsubstanzen. Masson-Goldner Kit für die Darstellung von Bindegwebe mit der Masson-Goldner Trichrom-Färbung Bei beiden Hämatoxylinlösungen werden Aluminiumsalze zur Komplexbildung verwendet, sie gehören zur Gruppe der so genannten Hämalaune und verhalten sich ähnlich im Gebrauch hinsichtlich Färbezeit, Differenzierung und Färbebild. Kernfärbung mit Hämatoxylin Kontrollierte Oxidation des Farbstoffs in der Lösung Stabile Ergebnisse durch selektive Kernfärbung Wahl zwischen klassischer und modifizierter Lösung Klassische Hämatoxylinlösung in der Histologie: Mayers Hämalaunlösung Selektive Kernfärbung Keine Überfärbung Gebrauchsfertig Sehr ergiebig Stabile Lösung Modifizierte Hämatoxylinlösung in der Histologie Hämatoxylinlösung mod. nach Gill III Gute blau-rot Differenzierung des Färbebildes Kurze Färbezeiten Gebrauchsfertig Filtration vor Gebrauch nicht notwendig Speziell für Histologie

28 H&E Gegenfärbung mit Eosin Nach der Kernfärbung muß die Gegenfärbung, die Proteine, Bindegewebe, Fasern, Keratin anfärbt, durchgeführt werden. Der am meisten verwendete Farbstoff ist Eosin G, G steht für gelblich. Es werden, je nach Anforderung und Geschmack, Konzentrationen von 0,1 % bis zu 1 % Eosin in wässrigen oder alkoholischen Färbelösungen verwendet. Die Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch gibt es jetzt neben der Eosin G-Lösung 0,5 % wässrig, sie rundet die Palette der gebrauchsfertigen Färbelösungen für die H&E Färbung ab. Die Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch färbt intensiver als die Eosin G-Lösung 0,5 % wässrig. Mit den beiden Eosin G-Lösungen lassen sich durch Zugabe von Essigsäure inten-sivere Färbeergebnisse erzielen. Zu 100 ml Eosinlösung ca. 0,2 ml Essigsäure (Eisessig) 100 % wasserfrei, zusetzen. Die Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch und die Eosin G-Lösung 0,5 % wässrig können mit Mayers Hämalaunlösung und mit Hämatoxylinlösung mod. nach Gill III verwendet werden. Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch Intensive Ergebnisse Reproduzierbare Ergebnisse Ergiebig Chargenkonstanz Gebrauchsfertig Durchführung H&E Färbung für Paraffinschnitte Schritt Zeit Xylol oder Neo-Clear 5 min Xylol oder Neo-Clear 5 min EtOH 100 % 30 sec EtOH 100 % 30 sec EtOH 96 % 30 sec EtOH 96 % 30 sec EtOH 70 % 30 sec EtOH 70 % 30 sec Färben in Mayers Hämalaun Lösung, 3 min oder Hämatoxylinlösung mod. nach Gill III Spülen in HCl Lösung 0,1 % 2 sec Leitungswasser, fließend 3-5 min Färben in Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch 3 min Eosin G-Lösung 0,5 % wässrig Spülen in Leitungswasser 30 sec EtOH 70 % 30 sec EtOH 96 % 30 sec EtOH 100 % 30 sec EtOH 100 % 30 sec EtOH 100 % 2 min Xylol oder Neo-Clear 5 min Xylol oder Neo-Clear 5 min Eindecken der Xylol-feuchten Präparate mit Entellan Neu und der Neo-Clear -feuchten mit Neo-Clear Eosin G-Lösung 0,5 % wässrig Gute rot-blau Differenzierung des Färbebildes Reproduzierbare Ergebnisse Ergiebig Chargenkonstanz Gebrauchsfertig Resultat Kerne Kalk, saurer Schleim, Bakterien (Gram-positiv) Proteine, Bindegewebe, Kollagen, Keratin dunkelblau, dunkelviolett schwarz orange, rot, gelb-orange Material Die H&E Färbung kann neben Paraffin- und Gefrierschnitten auch für klinisch-zytologisches Material, wie Sputum, Spülflüssigkeiten, Urinsedimente, Ergüsse, FNAB verwendet werden. 06 Färbungen 28 29

29 Werden Schnellschnitte/Gefrierschnitte mit einer H&E Färbung gefärbt, dann ist es wichtig, dass das unfixierte Material mit einer H&E Färbung alle strukturellen Details eindeutig und gut beurteilbar darstellt. Neo-Clear und Neo-Mount bringen Vorteile gegenüber Xylol und einem passenden Eindeckmittel, da diese Kombination nahezu geruchlos ist und nur eine geringe Verdunstung aufweist. Damit muß nicht im Abzug gearbeitet werden und die Färbung kann praktisch gleich neben dem Mikrotom durchgeführt werden. Intestine, Paraffinschnitt, H&E Färbung, Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch, Hämatoxylin nach Gill III Leber, Paraffinschnitt, H&E Färbung, Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch, Hämatoxylin nach Gill III Durchführung H&E Färbung für Gefrierschnitte Niere, Paraffinschnitt, H&E Färbung, Eosin G-Lösung 0,5 % wäßrig, Hämatoxylin nach Gill III Schritt Kernfärbung mit Hämatoxylinlösung mod. nach Gill III Spülen in Leitungswasser Differenzieren in 1 % Essigsäure Bläuen in Leitungswasser Spülen in Aqua dest. Färben in Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch Entwässern in Ethanol 70 % Entwässern in Ethanol 96 % Entwässern in Ethanol 100 % Klären in Neo-Clear Eindecken mit Neo-Mount Zeit sec Schnitte bewegen, bis keine Farbwolken mehr abgehen 10 sec Schnitte bewegen, bis zum Farbumschlag von violett nach blau Kurz abspülen sec Schnitte bewegen, bis keine Schlieren mehr ablaufen Schnitte bewegen, bis keine Schlieren mehr ablaufen Schnitte bewegen, bis keine Schlieren mehr ablaufen 15 sec Magen, Paraffinschnitt, H&E Färbung, Eosin G-Lösung 0,5 % wäßrig, Hämatoxylin nach Gill III Resultat Kerne Proteine, Bindegewebe, Kollagen, Keratin dunkelblau, dunkelviolett, schwarz orange, rot, gelb-orange Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Mayers Hämalaunlösung 500 ml, 1 l, 2,5 l Hämatoxylinlösung modifiziert nach Gill III 500 ml, 1 l, 2,5 l Eosin G-Lösung 0,5 % alkoholisch 500 ml, 2,5 l Eosin G-Lösung 0,5 % wässrig 1 l, 2,5 l Bei Bedarf können die Hämatoxylin- und Eosinlösungen auch aus Festfarbstoffen hergestellt werden.

30 PAS Die PAS (Periodic-Acid-Schiff) Reaktion ist eine der meist verwendeten chemischen Methoden in der Histologie. Bei der PAS-Färbung wird das Material mit Periodsäure behandelt und dabei werden die 1,2 Glykole zu Aldehydgruppen oxidiert. Die Aldehyde geben mit Schiffs Reagenz eine leuchtend rote Farbreaktion. Die PAS-Färbung gibt mit unsubstituierten Polysacchariden, neutralen Mukopolysacchariden, Mukoproteinen und Glykoproteinen, Glykolipiden und Phospholipiden eine spezifische Farbreaktion. Durch die Kombination der PAS-Färbung mit Alcianblau, bei einem ph von 2,5 für die Alcianblau Lösung, lassen sich zusätzlich saure Mukosubstanzen (Glykosaminoglykane) darstellen, ist der ph bei 1 werden die sulfatierten Mukosubstanzen angefärbt. Die PAS-Färbung wird für Paraffinschnitte und Ausstriche verwendet. Schiffs Reagenz für die Periodic-Acid-Schiff /PAS- Reaktion zum Nachweis von Mukopolysacchariden, Glykogen, neutrale Mukopolysacchariden, Mukound Glykoproteinen, Glykolipiden, Phospholipiden, Basalmembranen, Kollagen. Duodenum, Paraffisnschnitt,; PAS-Färbung, Schiffs Reagenz, Hämatoxylin Lösung nach Gill III Durchführung PAS-Färbung Duodenum, Paraffisnschnitt,; PAS-Färbung, Schiffs Reagenz, Hämatoxylin Lösung nach Gill III Schritt Schnitte in typischer Weise entparaffinieren und rehydratisieren Spülen in Aqua dest. Periodsäure Leitungswasser, fließend Spülen in Aqua dest. Schiffs Reagenz Leitungswasser, fließend Spülen in Aqua dest. Hämatoxylin Lösung n. Gill III Leitungswasser Aufsteigende Alkoholreihe, 2 x Neo-Clear oder Xylol Eindecken der Xylol-feuchten Präparate mit Entellan Neu und der Neo-Clear -feuchten Präparate mit Neo-Mount Zeit 5 min 3 min 15 min 3 min 2 min 3 min je 5 min Resultat Kerne Polysaccharide, Glykogen, neutrale Mukopolysaccharide, Muko- und Glykoproteine, Glykolipide, Phospholipide, Basalmembran, Kollagen blau purpur Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Schiffs Reagenz 500 ml Zusätzlich erforderlich Name Packungsgröße Artikelnummer Hämatoxylin Lösung mod. nach Gill III 500 ml, 1 l, 2,5 l Färbungen 30 31

31 Alcianblau-PAS Saure Mukosubstanzen und Polysaccharide, neutrale Mukopolysaccharide werden mit einer Kombination aus Alcianblau (ph 2,5) und PAS-Färbung dargestellt. Durchführung Alcianblau-PAS-Färbung Duodenum, Paraffinschnitt, Alcianblau-PAS Duodenum, Paraffinschnitt, Alcianblau-PAS Schritt Zeit Schnitte in typischer Weise entparaffinieren und rehydratisieren Alcianblau Lösung 5 min Leitungswasser, fließend 3 min Spülen in Aqua dest. Periodsäure 10 min Leitungswasser, fließend 3 min Spülen in Aqua dest. Schiffs Reagenz 15 min Leitungswasser, fließend 3 min Spülen in Aqua dest. Hämatoxylin Lösung n. Gill III 20 sec Leitungswasser, fließend 3 min Aufsteigende Alkoholreihe, 2 x Neo-Clear oder Xylol je 5 min Eindecken der Xylol-feuchten Präparate mit Entellan Neu und der Neo-Clear -feuchten Präparate mit Neo-Mount Resultat Kerne Saure Mukosubstanzen Polysaccharide, neutrale Mukopolysaccharide blau leuchtend hellblau purpur Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Schiffs Reagenz 1 l, 2,5 l Alcianblau-Lösung 1 l Zusätzlich erforderlich Name Packungsgröße Artikelnummer Hämatoxylin Lösung mod. nach Gill III 500 ml, 1 l, 2,5 l

32 Kernechtrot-Aluminiumsulfat Lösung 0,1 % zur Kernfärbung und Übersichtsfärbung Kernechtrot kann einfach als Kernfärbung verwendet werden, wenn mit anderen kontrastreichen Methoden gearbeitet wurde. Einfache und sichere Kernfärbung mit dem Aluminiumlack des Kernechtrots, dabei können Zytoplasma und Hintergrund durch die Reaktion mit ungebundenen Farbstoff angefärbt werden. Die Kernechtrot Lösung zur Kernfärbung wird beispielsweise in der Alcianblau Färbung, bei der Darstellung freien Eisens mit der Berliner- Blau-Reaktion (s. Färbekits: HEMATOGNOST Fe ) oder bei Versilberungen zur Darstellung retikulärer Fasern verwendet. Soll nur eine Plasmafärbung durchgeführt werden, färbt man mit einer angesäuerten wässrigen Kernechtrotlösung 0,1 % die nicht mit Aluminiumsulfat verlackt wurde. Kernechtrot Kernfärbung/Übersichtsfärbung Darstellung der Kerne und aller Zellstrukturen durch Kernechtrot-Aluminiumsulfat-Lösung 0,1 %. Durchführung Kernechtrot Färbung Schritt Konzentration Zeit Schnitte in typischer Weise entparaffinieren nd rehydratisieren Spülen in Aqua dest. 1 min Kernechtrot-Aluminiumsulfat-Lösung 0,1 % 10 min Spülen in Aqua dest. 1 min Ethanol (ETOH) 70 % 1 min Ethanol (ETOH) 96 % 1 min Ethanol (ETOH) 100 % 1 min Ethanol (ETOH) 100 % 1 min Xylol oder Neo-Clear 5 min Xylol oder Neo-Clear 5 min Eindecken der Xylol-feuchten Präparate mit Entellan Neu und der Neo-Clear -feuchten Präparate mit Neo-Mount Resultat Kern Zytoplasma dunkelrot hellrot Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Kernechtrot-Aluminiumsulfat-Lösung 0,1 % 500 ml Färbungen 32 33

33 Alcianblau-Kernechtrot Darm, Paraffischnitt, Alcianblau-Kernechtrot-Aluminiumsulfat-Lösung 0,1 % Magen, Paraffischnitt, Alcianblau-Kernechtrot-Aluminiumsulfat-Lösung 0,1 % Sollen ausschließlich saure Mukosubstanzen dargestellt werden, empfiehlt sich die Alcianblau Färbung (ph 2,5) und zur besseren strukturellen Darstellung der Kerne mit einer Kernechtrot Gegenfärbung. Durchführung Alcianblau-Kernechtrot Färbung Schritt Zeit Schnitte in typischer Weise entparaffinieren und rehydratisieren Alcianblau Lösung 5 min Leitungswasser, fließend 3 min Spülen in Aqua dest. Kernechtrot Lösung 10 min Leitungswasser, fließend 3 min Spülen in Aqua dest. Aufsteigende Alkoholreihe, je 5 min 2 x Neo-Clear oder Xylol Eindecken der Xylol-feuchten Präparate mit Entellan Neu und der Neo-Clear -feuchten Präparate mit Neo-Mount Resultat Kern Saure Mukosubstanzen rot blau Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Alcianblau-Lösung 1 l Kernechtrot-Aluminiumsulfat-Lösung 0,1 % 500 ml

34 Van Gieson Pikrofuchsin-Lösung für die Trichromfärbung nach van Gieson Die van Gieson-Färbung ist eine häufig angewandte Färbung zur kontrastreichen Darstellung von kollagenem Bindegewebe in Paraffinschnitten. Die Pikrofuchsin-Lösung nach van Gieson wird zusammen mit Weigerts Eisenhämatoxylin-Lösung, Art. Nr , in einer Trichromfärbung verwendet. Bei der Pikrofuchsin-Lösung nach van Gieson werden zwei unterschiedlich disperse Farbstoffe die fein-disperse Pikrinsäure und das grob-disperser Säurefuchsin simultan verwendet. Damit werden kollagene Fasern leuchtend rot und Muskulatur, Zytoplasma, Gliafasern gelb anfgefärbt. Amyloid, Hyalin, Kolloid und Schleim werden in Abstufungen zwischen Gelb- und Rottönen angefärbt. Für eine stabile und haltbare Kernfärbung sollte mit Weigerts Eisenhäma-toxylin gefärbt werden, um das Verblassen der Kernfärbung durch die saure Färbelösung zu verhindern. Der Vorteil bei der Verwendung der gebrauchsfertigen Pikrofuchsin-Lösung nach van Gieson ist, dass die Pikrinsäure gelöst vorliegt und der direkter Kontakt vermieden werden kann, wie auch der direkte Kontakt mit dem Farbstoff Säurefuchsin. Die Pikrofuchsin-Lösung nach van Gieson kann auch in Kombination mit der Elastin-Lösung nach Weigert in der Elastika van Gieson Färbung zum Nachweis von elastischen Fasern im histologischen Material verwendet werden. Uterus, Paraffinschnitt, Pikrofuchsin-Lösung Zunge, Paraffinschnitt, Pikrofuchsin-Lösung Durchführung der Trichromfärbung nach van Gieson Van Gieson Färbung Schnitte in typischer Weise entparaffinieren und rehydratisieren Weigert Eisenhämatoxylin Lösung A & B 1:1 Spülen in fließendem Leitungswasser Pikrofuchsin-Lösung Spülen in Aqua dest. Ethanol 96 % Ethanol 96 % Ethanol 100 % Ethanol 100 % Xylol oder Neo-Clear Xylol oder Neo-Clear Eindecken der Xylol feuchten Präparate mit Entellan Neu und der Neo-Clear feuchten Präparate mit Neo-Mount Zeit 5 min 3 min 30 sec 30 sec 30 sec 30 sec 1 min 1 min 5 min 5 min Material Als Ausgangsmaterial werden 3 μm dicke Paraffinschnitte von formalin- oder bouin-fixiertem Gewebe verwendet. Vorbereitung Weigerts Eisenhämatoxylin Lösung Weigerts Lösung A und Weigerts Lösung B im Verhältnis 1:1 mischen. Resultat Kerne Kollagen Muskulatur, Gliafibrillen Kolloid, Schleim, Hyalin, Amyloid, verhorntes Epithel schwarz-braun rot gelb gelb-rot Bestellinformationen Name Packungsgröße Artikelnummer Pikrofuchsin-Lösung 500 ml, 2,5 l Weigerts Eisenhämatoxylin Kit 2 x 500 ml Färbungen 34 35

35 Giemsa Giemsas Azur Eosin Methylenblau Lösung Die Giemsa Färbung ist eine in der Histologie standardmäßig verwendete Methode. Es werden spezielle Materialien wie Knochenmark, Tonsillen, Lymphknoten wegen der überwiegend hämatologischen und lymphatischen Zellen gefärbt. Die Färbung stellt die verschiedenen Zellen mit ihren Knochenmarkbiopsie, Paraffinschnitt, Giemsas Azur- Eosin-Methylenblaulösung Für die Giemsa Färbung von Paraffinschnitten unbedingt eigene Klärungsbäder Knochenmarkbiopsie, Paraffinschnitt, Giemsas Azur- Eosin-Methylenblaulösung morphologischen Merkmalen besser differenziert dar, als das mit einer H&E Färbung erreicht wird. Auch für den Nachweis von Helicobacter pylori in Magenbiopsien kann mit der Giemsa Färbung gefärbt werden. Das Material wird durch die Vorbehandlung wie Fixation und Histoprozessing beeinflusst, die Zellkerne werden in verschiedenen Blautönen angefärbt, andere Bestandteile werden in unterschiedlichen Rottönen dargestellt. mit Xylol oder Neo-Clear verwenden, da Ethanolspuren in den Lösungen zur Entfärbung der Präparate führen können. Vorbehandlung von Knochenmark und Beckenkammstanzen: Optimale Ergebnisse werden durch OSTEOSOFT, milde Entkalkungslösung, erzielt. Die fixierten Stanzen werden für 6 Stunden in OSTEOSOFT zum schonenden Entkalken eingelegt, anschließend dem Histoprozessing überführt. Blöckchen werden vorsichtig angeschnitten und wenn notwendig für 20 min mit OSTEOSOFT nachbehandelt. Durchführung Giemsa Färbung Schritt Schnitte in typischer Weise entparaffinieren und rehydratisieren Aqua dest. Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau Lösung unverdünnt, filtriert Essigsäure 0,1 % Aqua dest. 2-Propanol 2-Propanol 2-Propanol Xylol oder Neo-Clear Xylol oder Neo-Clear Eindecken der Xylol-feuchten Präparate mit Entellan Neu und der Neo-Clear -feuchten Präparate mit Neo-Mount Resultat Zellkerne, Zellen Kollagen, Osteoid eosinophile Granula saure Mukopolysaccharide, Mastzellgranula, Knorpelmatrix azidophile Substanzen Zeit 10 sec 15 min 10 sec 10 sec 10 sec 10 sec 10 sec 5 min 5 min blau-dunkelblau blassblau rot rötlich-violett orange-rot