LABORWELT. Fermenter. Automation. Epigenetik. Jetzt neu: Nr. 2 / Jahrgang

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1 LABORWELT Nr. 2 / Jahrgang Fermenter Parallele Bioreaktorsysteme zur Prozessoptimierung Automation Probenvorbereitung für das Next-Generation Sequencing Epigenetik Modifikationen von DNA und Histonen als Diagnose-Tools Jetzt neu:

2 GS Junior System GS Junior, my new best friend...because now I can sequence on my bench-top We think you re going to like the GS Junior System. And not simply because it s exciting. It s much more than that. L The GS Junior System allows you to perform next-generation sequencing in your lab, on your bench, when you re ready. And because it is based on proven 454 Sequencing Systems, it delivers results you can trust time and time again. L The GS Junior System also comes with a desktop PC equipped with userfriendly bioinformatic tools. So you don t need to be an IT expert to assemble, map or analyze your genome, transcriptome or metagenome. And what s not to love about that? To learn more about the GS Junior System and how it can help you and your laboratory succeed, get in touch via our website: It could be the start of a beautiful friendship. GS Junior System The power of next-generation sequencing in your hands For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. 454, 454 SEQUENCING and GS JUNIOR are trademarks of Roche. Roche Diagnostics Deutschland GmbH Sandhofer Straße Mannheim Roche Diagnostics GmbH. All rights reserved.

3 Inhalt Laborwelt 2 / Nachrichten aus der Wissenschaft Erbgutanalyse von Embryonen, Genetische Ursachen von Migräne, DFG veröffentlicht Förderatlas 2012, Bauen mit DNA-Ziegeln 36 Labormarkt im Umbruch No more family Bio-Rad vor dem Verkauf? Fermenter & Bioprozesse Wissenschaft Parallele Rührkesselreaktoren 6 Verbesserte Enzymhydrolyse von Biomassesuspensionen Dirk Weuster-Botz et al., TU München Paperwelt Quality by Design 8 Optimierung von Mixed-feeding-Strategien Oliver Spadiut, BOKU, Wien, Österreich Blitzlicht Benchtop-Bioreaktoren 10 Optimierung der Bioprozessentwicklung Claudia Hüther, DASGIP AG, Jülich TITEl: Fermenter & Bioprozesse Die datengestützte Etablierung von Prozessen zur Produktion von Biopharmazeutika oder von Enzymen zur Feinchemikalienherstellung verdrängt zusehends die erfahrungsgestützte Entwicklung. Wichtig dabei: automatisierte Minifermenter (vgl. S. 6, 10). Blitzlicht Zelltherapie 12 GMP-gerechte Kultur von mesenchymalen Stammzellen Ralf Huss et al., apceth GmbH, München Expertenpanel Bioökonomie 15 Stoffliche Nutzung von Biomasse und Kohlendioxid Jürgen Eck, Richard Eno und Eckhard Boles Blitzlicht Biosensorik 16 Chip-basierte Sensoren für die Biotechnik Matthias Bäcker & Michael Schöning, FH Aachen, Campus Jülich I Blitzlicht Simulation/Modellierung 18 Realitätsnahe Simulation von Zellsignalprozessen Martin Meier-Schellersheim et al., NIAID, Bethesda, Charité, Berlin Blitzlicht Real-time PCR 21 Genotyping mit ultra-hochdurchsatz- PCR Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg Paperwelt Screening 23 Selektive Hemmung von T H 17-Zellen Gitte Neubauer, Cellzome AG/GlaxoSmith Kline, Heidelberg Blitzlicht Next-Generation Sequencing 24 Probenvorbereitung auf Liquid Handling-Systemen Jürgen Zimmermann, EMBL, Heidelberg Expertenpanel Automatisierte Diagnostik 26 Automation in den Omics Alexander Kohlmann, Stefan Müllner, Peter Nürnberg Epigenetik III TITEl: Epigenetik Mit verbesserten Methoden gelingt es immer genauer zu ergründen, wie Modifikationen der DNA- und Histonstruktur die Genexpression regulieren. Erste Verfahren drängen bereits in die medizinische Anwendung (vgl. S. 34). Blitzlicht DNA-Methylierung 27 Mit Elektrophorese einen Blick auf die DNA werfen Evamaria Falck, Bernhard Wünsch, Universität Münster Paperwelt Sequenzierung 29 Mit oxbs-seq auf der Jagd nach Hydroxymethylcytosin Wolf Reik, Babraham Institute, Cambridge, GB Blitzlicht Chromatin-Immunopräzipitation 30 ChIP im Lebendgewebe ein Überblick Anke Hoffmann, Dietmar Spengler, MPI für Psychiatrie, München Automation II TITEl: Laborautomation Automation gilt als Voraussetzung, um die molekulare Diagnostik zum Patienten zu bringen. In dieser Ausgabe: ein qpcr-system im 1536-Well-Format und die Automation der Next-Generation-Sequenzierung (vgl. S. 21, 25) Blitzlicht Krebs-Biomarker 32 Tumordiagnose anhand modifizierter Histone Stefan Holdenrieder, Jörg Ellinger, Universitätsklinikum Bonn Expertenpanel Krebs, Alzheimer, Arzneimittelentwicklung 34 Angriffsziele für Therapien Johannes Gräff, Michael Lübbert und Lutz Hein 37 Akademischer Stellenmarkt 41 Termine 42 Ausblick/Impressum LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 2/2012 3

4 Nachrichten Aktuelles Intro Bioprozesstechnik, Enzymproduktion und der Aufschluss von Biomasse werden in Zeiten weltweiter Förderinitiativen zur Bioökonomie immer wichtiger. Kein Wunder, dass die ACHEMA als traditionelle Leistungsschau der Prozessspezialisten, Bioingenieure und Verfahrenstechniker einen entsprechenden Themenschwerpunkt setzt. Nicht nur eine Roadmap Bioraffinerien (vgl S. 42) und die ersten Gewinner der Innovationsinitative Industrielle Biotechnologie wurden in Frankfurt präsentiert. Die BiobasedWorld rückte die gesamte Wertschöpfungskette in den Vordergrund. Die Ankündigung von US-Präsident Barack Obama, im Falle seiner Wiederwahl einen zweistelligen Milliardenbetrag in die Bioökonomie zu investieren, unterstreicht, dass die Bundesregierung gut beraten ist, jetzt Geld in konkrete Projekte zu stecken. Aktuelle Entwicklungen dokumentieren wir in dieser Ausgabe mit einem Expertenpanel Bioökonomie (vgl. S. 15) und in unserem Spezial Fermenter & Prozesse (ab S. 6). Zukunft der Diagnostik Anders als in Deutschland und der EU beschränken die USA die Bioökonomie nicht auf die Grüne und Weiße Biotechnologie ein Vorteil, gerade wenn es um die Translation von Zukunftstechnologien wie der molekularen Diagnostik oder der Next- Generation-Sequenzierung in die diagnostische Anwendung geht. Zuvor stehen jedoch Standardisierung und Automation an. Was derzeit schon geht und was noch zu leisten ist, erklären Experten auf Seite 25. Über neue Automationslösungen im Sequencing, der qpcr und der experimentellen Funktionsannotation von zellteilungsrelevanten Signalwegen lesen Sie ab Seite 18. Ein zunehmend interessantes medizinisches Forschungsfeld ist die Epigenetik. Was therapeutisch und diagnostisch bereits möglich ist, behandelt unser drittes Spezial ab Seite 27. Dass Europa den Vorgaben der USA meist folgt, scheint hier von Vorteil für die Forschung. Thomas Gabrielczyk Erbgutanalyse Sicherere Ermittlung des Embryo-Genoms Forscher können mit Hilfe einer mütterlichen Blutspende das Genom des Fötus auslesen. In unserem Blut schwimmen nicht nur Blutkörperchen oder Blutplättchen, auch sogenannte zellfreie DNA findet sich darin. Forscher der Universität Washington in Seattle (USA) haben sich erfolgreich zunutze gemacht, dass bei Schwangeren etwa 10% der zellfreien Blut-DNA vom Fötus stammen. In vorerst nur zwei Fällen verglichen sie die isolierten Stücken der zellfreien DNA mit den Genomen der Eltern. Auf diese Weise konnte das Team um Jay Shendure das gesamte Fötusgenom erfolgreich bestimmen. Ein lunar caustic // flickr.com Migräneforschung Auf Gen-Suche Ein internationales Forscher-Konsortium hat vier neue Gen-Orte entdeckt, die das Risiko für Migräne-Attacken beeinflussen. Migräne ist eine Volkskrankheit, die die Lebensqualität der Betroffenen erheblich beeinträchtigt. Ein internationales Forscherteam hat in nature GeneTicS (doi: /ng.2307) eine Studie zu den genetischen Ursachen der Krankheit präsentiert. Das Team unter der Leitung von Experten aus Finnland, Deutschland und den Niederlanden nahm dabei die häufigste Migräne-Variante ins Visier, welche ohne Wahrnehmungsstörungen auftritt ( gewöhnliche Migräne ). Der Ansatz der Forscher: Neue Genvarianten zu finden, die das Risiko für das Auftreten der Krankheit beeinflussen. Die Suche war erfolgreich, da vier neue Risiko- Varianten entdeckt worden sind. Für die Studie wurden die Gendaten von Migränepatienten mit denen von symptomfreien Menschen verglichen. Das Ergebnis: zwei bereits bekannte und vier neue Sequenzvarianten, die bei den Migränepatienten gehäuft auftraten. Fünf dieser Varianten (SNPs) befinden sich in der Nähe von bekannten Genen und könnten deren Ablesehäufigkeit beeinflussen. Die sechste Variante unterscheidet von den anderen: Es ist der erste Migräne-SNP, der in einem Gen liegt. Das Gen MEF2D ist der Bauplan für einen Transkriptionsfaktor, der unter anderem schon mit dem Auftreten der Parkinsonschen Krankheit in Verbindung gebracht wurde. Vergleich mit der DNA, die nach der Geburt aus Nabelschnurblut gewonnen wurde, ergab bei der Probe aus der 18. Schwangerschaftswoche eine Übereinstimmung von 98%. Auch wurden 39 von 44 Mutationen erkannt, die weder beim Vater noch bei der Mutter zu finden waren und damit spontan im Genom des Neugeborenen entstanden sind. Im Magazin Science TranSlaTional Medicine (doi: /scitranslmed ) schreiben die Forscher, dass es bald möglich sei, den Fötus in einem einzigen, nichtinvasiven Test auf das Vorhandensein entsprechender Erbanlagen für die mehr als monogenetischen Erkrankungen zu kontrollieren. Bei den für die Pränataldiagnostik notwendigen Tests wie der Fruchtwasseruntersuchung oder der Chorionzottenbiopsie kommt es selten zu Spontanaborten, die auch gesunde Föten betreffen können. Diese Gefahr besteht bei der Analyse mütterlicher zellfreier DNA nicht. Obwohl der Test für einen Routineeinsatz noch nicht sensitiv genug ist, glauben die Forscher, dass er prinzipiell auch bei Blutproben aus der 8. Schwangerschaftswoche funktioniert. Forschungsförderung Geldspritze von DFG Die Deutsche Forschungs-Gemeinschaft (DFG) hat den Förderatlas 2012 sowie 20 neue Sonderforschungsbereiche (SFB) präsentiert. Wer hat im vergangenen Jahr die meisten Forschungsgelder eingeworben? Bei den Hochschulen sind wieder die RWTH Aachen und die LMU München einsame Spitze. Regional betrachtet hat Berlin seinen Vorsprung gegenüber München ausgebaut. Das sind die wichtigsten Ergebnisse der jährlichen Analyse der DFG. Ende Mai präsentierte sie in Bonn zusammen mit der Hochschulrektorenkonferenz und dem Stifterverband für die Deutsche Wissenschaft in Bonn den 300 Seiten starken Förderatlas Das Ranking war so langweilig wie noch nie: Bezogen auf die Bewilligung von DFG-Geldern nach Hochschulen hat sich im Vergleich zum Vorjahr kaum etwas getan. Nach Aachen und München folgen die FU Berlin, die TU München und die Universitäten Heidelberg und Freiburg. Nahezu zeitgleich stellte die DFG 20 neue SFBs vor. Insgesamt 176 Mio. Euro werden von 1. Juli 2012 an über einen Zeitraum von vier Jahren verteilt. SFBs sind unter Forschern beliebt, weil auch aufwendige und langfristige Vorhaben relativ unkompliziert verwirklicht werden können. Zwölf Projekte haben einen direkten Laborbezug. Dabei geht es zum Beispiel um funktionelle Mikrogele, die Anwendung von Epigenetik-Erkenntnissen in der Medizin und neue Strategien im Kampf gegen Leukämie, Multiple Sklerose oder den Mangel an Spenderorganen Jahrgang Nr. 2/2012 LABORWELT

5 Technologie Zeichenzoo aus DNA-Ziegeln Wei, Dai und Yin // Wyss Institute, Harvard University US-Forscher haben biokompatible DNA-Ziegel entwickelt, mit denen sie nach dem Baukastenprinzip bereits 100 Formen nachgebildet haben. Was wurde mit DNA-Molekülen nicht schon alles gebaut? Smileys, Sterne, Käfige... Seit 2006 arbeiten Forscher in aller Welt daran, nanoskopisch kleine Strukturen und Objekte aus dem Molekül des Lebens herzustellen. Grundlage dieser Origami-Bewegung ist die Fähigkeit langer, einsträngiger DNA-Moleküle, sich eigenständig in eine gewünschte Form zu falten. Peng Yin von der Harvard Universität in Boston hat nun das nächste Level erreicht. Jetzt heißt es: bauen statt falten, Bauklötze statt Papier. Yins Team hat kurze, synthetische DNA-Stücke hergestellt, die sich zu kleinen Ziegeln von 7 mal 3 Nanometern Länge arrangieren. Abhängig von der an der Außenseite zugänglichen Sequenz passen die DNA-Ziegel zueinander und verbinden sich zu einer Wand aus DNA-Ziegeln oder auch nicht. Wie die Systembiologen seit Ende Mai auf der Webseite des Fachmagazins Nature zeigen, sind ein bisschen Hirnschmalz bei der Versuchsplanung vorausgesetzt der Fantasie keine Grenzen gesetzt. So konnten sie mit dieser Methode bereits mehr als 100 Symbole und Zeichen nachbauen. Bisher wurden für das Origami DNA-Moleküle aus Viren genutzt. Für Anwendungen am Menschen, wie etwa DNA-Käfige als Transportvehikel für Arzneimittel, ist das allerdings ein Problem: Das Immunsystem kann diese Vehikel als fremd einstufen und attackieren. Die synthetischen DNA-Ziegel sind laut Yin aber höchst biokompatibel und können das Immunsystem täuschen. Next Generation Sequencing Your Partner of Choice for DNA Sequencing Projects Aus der LABORWELT.de-Galerie Bild der Woche Douglas Cowan, Harvard Medical School, Boston // faseb.org 454 Roche GS FLX Sanger ABI 3730 Small to large projects Blick in die Stammzellfabrik Wie zerbrechliche Seifenblasen oder kunstvolle Ballonfiguren schwebt diese Zellformation durch das Bild. Es handelt sich um adulte Stammzellen und daran hängende Skelettmuskel-Vorläuferzellen. Diese Aufnahme gehört zu den zehn besten des Wettbewerbs Bio-Art, der in diesem Jahr zum ersten Mal ausgetragenen wurde. Mitte Mai veröffentlichte die Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) die Gewinner des Bio-Art-Wettbewerbs. Laut FASEB war dies der erste Wettbewerb für biomedizinische Bilder. Allerdings war die Teilnahme nur FASEB-Mitgliedern und Beschäftigten der US-Gesundheitsinstitute (National Institutes of Health, NIH) gestattet. SOLiD 5500 XL Nichtsdestotrotz waren darunter originelle und fesselnde Beiträge. Zu den zehn Gewinnermotiven gehören zum Beispiel elektrische Fische aus Gabun, die Nervenbahnen der Retina und die Gliedmaße eines Mausembryos. Die LABORWELT-Redaktion hat unter ihnen den Beitrag von Douglas Cowan von der Harvard Medical School in Boston (USA) ausgewählt. Seine Mikroskopieaufnahme zeigt von Myoblasten getragene adulte Skelettmuskelstammzellen. Cowan arbeitet an der Entwicklung künstlicher Stammzellfabriken. In solchen Bioreaktoren sollen einmal Stammzellen für zum Beispiel Zelltherapien in ausreichend großen Mengen hergestellt werden. (alle Bilder der Woche auf Laborwelt.de) Coordination & flexibility between the 3 technologies Extended customer support Bioinformatics genome@microsynth.ch LABORWELT 4-5_LW2_12_News.indd :32:45 Uhr

6 Fermenter & Prozesse Parallele Rührkesselreaktoren I Fermenter et al. Verbesserte Enzym- Hydrolyse von Biomassesuspensionen Dipl.-Ing. Peter Riedlberger und Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz, Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik, Technische Universität München; Dr. Tanja Kurzrock, 2mag AG, München Effiziente biotechnologische Fermentationsverfahren und die entsprechende Sensorik zu ihrer Überwachung werden immer wichtiger. Allein der Markt für Biopharmazeutika soll laut ReseaRch&MaRkets bis 2015 jährlich um 11,2% auf 126 Mrd. Euro wachsen. Hinzu kommen neue Prozesse zur Produktion von Kraftstoffen und Feinchemikalien aus nachwachsenden Rohstoffen im Rahmen der jetzt startenden Bioökonomie-Offensive der Bundesregierung. Nicht zuletzt weil sechs weitere EU-Länder und US-Präsident Barack Obama entsprechende Bioökonomie- Initiativen angekündigt haben, sind derzeit weltweit neue Methoden gefragt, die die Prozess entwicklung beschleunigen. Von Screening bis Biosensorik Von einem neuen Verfahren, mit dem sich der optimale Enzymcocktail zur Hydrolyse lignozellulosehaltiger Reststoffe wie Stroh und Holz finden lässt, berichten Forscher um Dirk Weuster-Botz. Die 48-fach parallelisierten Rührreaktoren im Millilitermaßstab lassen sich in den Litermaßstab skalieren. Wie weit sich die Verhältnisse sogenannter Benchtop-Bioreaktoren in Minireaktoren im Millilitermaßstab oder gar Mikrotiterplattenformat nachstellen lassen, diskutieren Claudia Hüther et al. von der Eppendorf-Tochter DASGIP aus Jülich. Das Vorscreening geeigneter Prozessbedingungen ist letztlich getrieben von dem Gedanken, die bislang weitgehend erfahrungsgestützte Prozessentwicklung durch einen wissenschaftlich reproduzierbaren Prozess zu ersetzen. Getrieben vom Quality-by-Design-Gedanken stellen Spadiut et al. eine neue Mixed-feeding- Strategie vor, die genutzt werden kann, um P. pastoris-produktionsstämme hinsichtlich ihrer Produktivität zu charakterisieren. Darüber hinaus berichten Huss et al. über Fortschritte bei der GMP-gerechten Produktion von Stammzellen und Schöning et al. über neuartige enzymbasierte Biosensoren. Abgerundet wird das Thema durch Expertenstatements zur Bioökonomie. Reststoffe von Pflanzen fallen täglich im Tonnenmaßstab in der Land- und Forstwirtschaft an. Diese Abfälle enthalten jedoch noch große Mengen an wertvollen Zuckermolekülen, wie Glukose und Xylose, die als Ausgangsstoffe für biotechnologische Prozesse zur Gewinnung von Chemikalien eingesetzt werden können. Neben einer stofflichen ist auch eine energetische Nutzung der erzeugten chemischen Substanzen möglich. Die dadurch gewonnenen Biokraftstoffe der zweiten und dritten Generation, wie beispielsweise Ethanol oder Butanol, stehen nicht im Wettbewerb mit der Nahrungsmittelproduktion, da ausschließlich Rest- und Abfallstoffe als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Für eine optimale Verwertung und biotechnologische Umsetzung dieser Pflanzenmaterialien sind zahlreiche experimentelle Untersuchungen notwendig. Eine Schlüsselrolle stellt die möglichst vollständige Freisetzung der Zuckermoleküle aus den Pflanzenmaterialien durch Enzympräparate dar. Sowohl die Entwicklung effizienter Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse als auch die Optimierung der Enzympräparate konnte durch Reihenuntersuchungen in miniaturisierten und 48-fach parallelisierten Rührreaktoren realisiert werden. Die Daten aus dem Millilitermaßstab konnten zudem direkt in den Litermaßstab übertragen werden. Der hohe experimentelle Aufwand zur Optimierung enzymatischer Hydrolysen von Pflanzenmaterialien ist mit sequenziellen Untersuchungen im klassischen Rührkesselreaktor nur schwer zu bewältigen. Auch Reaktorsysteme mit vier bis acht parallelisierten Reaktoren sind in der Regel nicht ausreichend, um schnell ein optimales Hydrolyse-Verfahren zu entwickeln. Andererseits können stark miniaturisierte und parallelisierte Reaktionssysteme, wie beispielsweise Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten 1,5-6,11-12 nur bedingt mit Standard-Rührkesselreaktoren verglichen werden. Des Weiteren erweisen sich geschüttelte Mikrotiterplatten durch das besonders geringe Reaktionsvolumen als nachteilig bei der Homogenisierung von suspendierten Pflanzenmaterialien mit hohem Feststoffanteil und mit großen Partikelabmessungen. A Einen neuen Ansatz zeigen Weuster-Botz et al. 14 mit Rührkesselreaktoren im Millilitermaßstab auf. Diese Bioreaktoren zeichnen sich durch zum Labor- oder Produktionsmaßstab vergleichbare verfahrenstechnische Eigenschaften aus, wodurch bereits in vielen Fällen eine direkte Skalierbarkeit von mikrobiellen Prozessen erreicht werden kann. Neben unterschiedlichen biotechnologischen Prozessen mit Escherichia coli, Bacillus subtilis und Cupriavidus necator 4,7-8,13 konnte dies auch für Prozesse mit dem Mycelbildner Streptomyces tendae 3 und der Hefe Saccharomyces cerevisiae 2 gezeigt werden. Die 48-fach parallel angeordneten Reaktoren ermöglichen ein effizientes biotechnologisches Arbeiten im Hochdurchsatz, weshalb sie auch eine interessante Möglichkeit für die Untersuchung von enzymatischen Verzucke- Abb. 1: (A) 48-fach gefertigte S-Rührer mit einzelnem Milliliter-Rührreaktor ohne Strömungsbrecher im Vordergrund am Deckel des (B) parallelen Rührkesselreaktorsystems B Jahrgang Nr. 2/2012 LABORWELT

7 Parallele Rührkesselreaktoren Fermenter & Prozesse rungsreaktionen in den Biomassesubstraten darstellen. Um Biomassesuspensionen mit hohem Feststoffanteil von bis zu 20% (w/w) und Partikelgrößen von mehreren Millimetern im Milliliter-Rührreaktor enzymatisch hydrolysieren zu können, wurde ein neues Rührorgan ( S-Rührer 9 ) für die gleichmäßige Homogenisierung entwickelt. Dies ermöglicht erstmals zum Standard-Rührkesselreaktor vergleichbare reaktionstechnische Untersuchungen der enzymatischen Feststoffhydrolyse in 48-fach miniaturisierten Rührkesselreaktoren fach paralleles Rührkesselreaktorsystem Das 48-fach parallelisierte Rührkesselreaktorsystem (2mag AG, Abb. 1B) ist modular aufgebaut. Neben einem Grundkörper mit 48 Positionen für Einwegbioreaktoren, integriertem induktiven Antrieb sowie einer Temperierung ermöglichen 48 parallel angeordnete, gleitend gelagerte Rührorgane die effektive Homogenisierung der Biomassesuspension. Für die Homogenisierung der Biomassesuspension wird, wie in Abbildung 1A veranschaulicht, das neue Rührorgan S-Rührer in Milliliter-Bioreaktoren eingesetzt. In die Rührorgane sind zwei Dauermagnete integriert, um diese magnetisch-induktiv in Rotation versetzen zu können. Die Rührerdrehzahl kann über ein Steuergerät zwischen 60 min 1 und 4000 min 1 eingestellt werden. Die S-förmige Geometrie des Rührers entsteht durch zwei gegenüberliegende Rührpaddel. Diese erzeugen bei Rotation eine tangentiale und axiale Strömung des Rührmediums und durchmischen so die Suspension. Für hohe Feststoffkonzentrationen und große Partikelgröße der Pflanzenmaterialien sind Einweg-Bioreaktoren ohne Strömungsbrecher zu bevorzugen. Das Arbeitsvolumen liegt zwischen 8 ml und 15 ml und ist somit ausreichend groß für die mehrfache Probennahme. Die Probennahme kann manuell oder automatisiert mit Hilfe eines Pipettierroboters durch den Deckel des Rührkesselreaktionssystems erfolgen. Abb. 2: (A) Mischzeit bis zu einem Homogenisierungsgrad von 97% als Funktion des Leistungseintrags des neu entwickelten S-Rührers in magnetisch-induktiv angetriebenen Milliliter-Rührreaktoren. (B) Enzymatische Hydrolyse im Satzverfahren im 10 ml-maßstab verglichen mit dem 1 l-maßstab im Rührkesselreaktor (vol. Leistungseintrag < 0,4 W L -1, T = 50 C, ph 5,0) Um eine schnelle Verzuckerung der suspendierten Pflanzenmaterialien durch enzymatische Hydrolyse zu erreichen, ist eine gleichmäßige Homogenisierung der Suspension notwendig. Über Mischzeitexperimente konnte die Homogenisierung im Milliliter-Rührreaktor untersucht und bewertet werden (Abb. 2A). Selbst für geringe volumenbezogene Leistungseinträge kleiner 0,2 W L 1 konnte eine schnelle Durchmischung (97% Homogenität) für Wasser, mikrokristalline Zellulose (20%) und Weizenstroh (5%) festgestellt werden. Pflanzenmaterialien wie Weizenstroh bestehen größtenteils aus Lignozellulose. Diese enthält neben Zellulose und Lignin auch große Mengen an Hemizellulose. Deshalb sind neben Zellulasen auch Hemizellulasen als Enzyme für die enzymatische Hydrolyse von Biomasse interessant. Da die Ausbeute der Monosaccharide beim rohem Pflanzenmaterial meist auf maximal 20% beschränkt ist, sind Substrat-Vorbehandlungen notwendig. Für Weizenstroh mit etwa 2 mm Faserlänge wurde die enzymatische Hydrolyse nach hydrothermischer (160 C; 1 h) und nach chemisch-thermischer Vorbehandlung (135 C; 0,5 h) mit Schwefelsäure (1% v/v) im gerührten Milliliter- und Liter-Maßstab bei vergleichbaren Durchmischungszahlen untersucht. Zusätzlich wurde reine mikrokristalline Zellulose hydrolysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Suspensionen mit 20% Feststoffanteil mikrokristalliner Zellulose und 8% vorbehandeltem Weizenstroh gleichmäßig homogenisierbar und somit für eine effektive enzymatische Hydrolyse von suspendierten Pflanzenmaterialien einsetzbar sind. Für die freigesetzten Monosaccharide konnten bei vergleichbaren Durchmischungszahlen im Milliliter-Rührreaktor nahezu identische Glukose-Freisetzungen zum Standard- Rührkesselreaktor im Liter-Volumen erreicht werden (Abb. 2B). Mit den neu entwickelten, 48-fach parallelisierten Rührreaktoren im Milliliter-Maßstab ist es erstmals möglich, Feststoffanteile und Partikelgrößen vergleichbar zum Liter- Maßstab enzymatisch zu Monosacchariden zu hydrolysieren. Damit konnte ein schnelles und effizientes Verfahren zur Evaluierung und Optimierung enzymatischer Hydrolysen von Pflanzenmaterialien entwickelt werden. Vergleichbare verfahrenstechnische Parameter, wie Leistungseintrag oder Durchmischung ermöglichen eine einfache Maßstabsvergrößerung vom Milliliter- in den Liter-Maßstab. Eine Automatisierung ist einfach mit einem Pipettierroboter möglich. Literatur [1] Chundawat SPS, Balan V, Dale BE (2008): Biotechnol Bioeng 99: [2] Gebhardt G (2010): Reaktionstechnische Untersuchungen von rekombinanten Saccharomyces cerevisiae zur Bernsteinsäureherstellung. Dissertation. Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik. Technische Universität München [3] Hortsch R, Stratmann A, Weuster-Botz D (2010): Biotechnol Bioeng 106: [4] Höfel T, Wittmann E, Reinecke L, Weuster-Botz D (2010): Appl Microbiol Biotechnol 88: [5] Jäger G, Wulfhorst H, Zeithammel EU, Elinidou E, Spiess AC, Büchs J (2011): Biotechnol J 6:1-12 [6] King BC, Donnelly MK., Bergstrom GC, Walker LP, Gibson DM (2009): Biotechn Bioeng 102: [7] Knorr B, Schlieker H, Hohmann H-P, Weuster-Botz D (2007): Biochem Eng J 33: [8] Kusterer A, Krause C, Kaufmann K, Arnold M, Weuster- Botz D (2008): Bioprocess Biosyst Eng 31: [9] Riedlberger P, Weuster-Botz (2010): Rührorgan für Flüssigkeiten. Gebrauchsmusterschrift DE U1 [10] Riedlberger P, Weuster-Botz D (2012): Bioresource Technol 106: [11] Santoro N, Cantu SL, Tornqvist CE, Falbel TG, Bolivar JL, Patterson SE, Pauly M, Walton JD (2010): Bioenerg Res 3: [12] Song L, Laguerre S, Dumon C, Botonnet S, O Donohue MJ (2010): Bioresource Technol 101: [13] Vester A, Hans M, Hohmann H-P, Weuster-Botz D (2009): Appl Microbiol Biotechnol 84: [14] Weuster-Botz D, Puskeiler R, Kusterer A, Kaufmann K, John GT, Arnold M (2005): Bioprocess Biosyst Eng 28: Korrespondenzadressen Homogenisierung und enzymatische Hydrolyse von Pflanzenmaterialien Fazit 2mag AG Dr. Tanja Kurzrock Schragenhofstr. 35 J-K München Tel: +49-(0) Fax: +49 (0) tanja.kurzrock@2mag.de Technische Universität München Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik Prof. Dr.-Ing. Dirk Weuster-Botz Dipl.-Ing. Peter Riedlberger Boltzmannstraße Garching d.weuster-botz@lrz.tu-muenchen.de LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 2/2012 7

8 Fermenter & Prozesse Paperwelt Optimierung von Mixed- Feeding-Strategien Dénes Zalai, Christian Dietzsch, Christoph Herwig, Oliver Spadiut; A dynamic fed batch strategy for a Pichia pastoris mixed feed system to increase process understanding; Biotechnol Prog Apr 14. doi: /btpr Feeding-Strategien mit verschiedenen Substraten werden oft untersucht, um die Expression rekombinanter Proteine in Pichia pastoris zu verbessern. Normalerweise erfolgt die Optimierung des Substratmischungsverhältnisses oder der Methanolkonzentration empirisch auf Basis zahlreicher Fed batch-experimente oder zeitaufwendiger kontinuierlicher Prozesse. In einer aktuellen Studie haben Wiener Wissenschaftler um Oliver Spadiut die Substratversorgung mit Methanol und Glycerin einem Fed-batch-Prozess entkoppelt und den Einfluss der Substratauf nahmerate q s auf Substratflux und Expression des Modellproteins Meerrettich-Peroxidase in einer P. pastoris-mutante untersucht. Mit dieser Strategie konnten Spadiut und Kollegen die spezifische Glyzerin-Aufnahmerate bestimmen, bei der die Produktivität nachließ. LABORWELT: Was ist der Hintergrund Ihrer Arbeiten? Spadiut: Im Rahmen der Quality by Design (QbD)-Initiative fordert die FDA vor allem pharmazeutische Betriebe zu erhöhtem Prozessverständnis und wissenschaftlich basierter Prozesskontrolle auf, um auf dieser Basis gesicherte Produktqualität und -quantität zu erzielen. Viele pharmazeutisch relevante Proteine werden momentan rekombinant, also mittels gentechnisch veränderter Mikroorganismen, hergestellt. Ein wichtiger Organismus hierfür ist die Hefe Pichia pastoris. Eines der Ziele unserer Arbeit ist es, basierend auf QbD-Prinzipien innovative und effektive Bioprozesse mit diesem Mikroorganismus zu entwickeln und aufgezeichnete Daten und erhaltene Informationen in Wissen umzuwandeln, um das generelle Prozessverständnis zu erhöhen und wissenschaftlich basierte Bioprozesse generieren zu können. LABORWELT: Wie sind Sie methodisch vorgegangen? Spadiut: Zur Ertragssteigerung der methylotrophen Hefe P. pastoris und zur Verringerung von im Prozess produzierter Wärme und benötigtem Sauerstoff werden oft sogenannte mixed-feed -Strategien verwendet, das heißt, die Mikroorgansimen werden mit einer Mischung aus Glyzerin und Methanol gefüttert. Da Glyzerin in gewissen Konzentrationen jedoch die Expression rekombinanter Proteine reprimiert, musste man das optimale Verhältnis dieser zwei Substrate bis dato in recht aufwendigen Experimenten bestimmen. In dieser Arbeit kontrollierten und variierten wir die spezifische Substrataufnahmerate (q s ) von Glyzerin und Methanol separat und konnten in nur wenigen Experimenten gewisse Effekte der einzelnen Substrate sowohl auf den Metabolismus der Hefe als auch auf die rekombinante Proteinexpression zeigen. Jetzt noch schneller informiert mit Neu und tagesaktuell Nachrichten Börse Presseschau Mediathek und vieles mehr 8 transkript_web_ea_185x120.indd 13. Jahrgang Nr. 2/ LABORWELT 12:27:50 Uhr

9 Paperwelt Fermenter & Prozesse LABORWELT: Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse? Spadiut: Durch dynamische Fed-Batch-Experimente konnten wir die spezifische Aufnahmerate von Glyzerin, bei der die maximale spezifische Produktivität eines rekombinanten Enzyms erzielt werden konnte und bei deren Überschreitung reprimierende Effekte hervorgerufen wurden, relativ einfach und innerhalb kurzer Zeit bestimmen. Außerdem konnten wir den Vorteil einer dynamischen Prozessführung gegenüber Oliver Spadiut Univ.-Ass. Dipl.-Ing. Dr. nat. techn. Oliver Spadiut promovierte 2008 im Bereich Biotechnologie an der BOKU Wien. Für seine Dissertation wurde er mit drei Wissenschaftspreisen ausgezeichnet. Nach Forschungsaufenthalten an Universitäten in Thailand und Kanada und einer knapp zweijährigen Post-Doc-Zeit an der KTH in Stockholm, Schweden, ist er seit 2010 als Universitätsassistent am Institut für Biochemical Engineering unter der Leitung von Prof. Christoph Herwig an der Technischen Universität Wien (VUT) tätig. konventionellen Methoden zeigen und identifizierten einen zeitabhängigen Effekt der Produktivität von P. pastoris. Diese Arbeit zeigt die Vorteile und den Nutzen der spezifischen Substrataufnahmerate q s als Parameter für Bioprozesskontrolle und -optimierung in einem mixed feed-system und unterstreicht die Bedeutung von dynamischen Experimenten in der Bioprozessentwicklung. LABORWELT: Welcher direkte praktische Nutzen lässt sich aus Ihrer Arbeit ziehen? Spadiut: Unsere innovative, auf der spezifischen Substrataufnahmerate basierende Strategie, die dynamische Batch- und Fed-Batch- Kultivierungen umfasst, ermöglicht eine schnelle und einfache Charakterisierung rekombinanter Hefestämme, erlaubt wissenschaftlich basiertes Prozessverständnis und führt außerdem zu erhöhten spezifischen Produktivitäten. Alle diese Elemente stehen im Einklang mit den QbD-Leitlinien, weshalb man die von uns entwickelte dynamische Prozessführung basierend auf q s als wertvolle Erweiterung der bioprozesstechnologischen Toolbox betrachten kann. LABORWELT: Wie gehen Ihre Arbeiten nun weiter? Spadiut: Wir arbeiten gerade an der Entwicklung und Implementierung von Konzepten und Tools, wie Soft-Sensoren, um diese dynamischen Feeding-Regimes online kontrollieren und steuern zu können. Außerdem überprüfen wir, ob unsere Strategie eine generische Methode darstellt, also ob wir sie auch auf andere rekombinante Produkte, verschiedene Hefestämme und sogar andere Mikroorganismen (zum Beispiel E. coli) sowie Säugerzellen anwenden können. WORKING WITH NANO-GOLD? TRY: PARTICULAR GOLD NANOPARTICLES! made by physical laser ablation: Î Î Î pure, ligand-free gold without citrate or other residues available in water and other solvents direct conjugation to your biomolecules in our labs: Î Î Î high conjugation efficiency high surface coverage particle sizes between 5 and 50 nm Particular GmbH Hannover, Germany info@particular.eu particular.eu

10 Fermenter & Prozesse Benchtop-Bioreaktoren Optimierung der Bioprozessentwicklung Claudia M. Hüther und Kathrin Schmale, DASGIP GmbH, Jülich Die biopharmazeutischen Märkte sind in den letzten beiden Jahrzehnten permanent gewachsen. Der weltweite Umsatz wird bis 2015 voraussichtlich auf 126 Mrd. EUR ansteigen 1 ; zwischen 2009 und 2016 gehen Analysten von Research & Markets von einem jährlichen Umsatzplus von durchschnittlich 11,2% aus. Um diese Erwartungen zu erfüllen, muss die Biotechnologie-Industrie allerdings ihre Entwicklungskosten senken, Fehler in der späten klinischen Entwicklung minimieren, die Entdeckung neuer Targets und Molekularklassen vorantreiben und die Prozessentwicklung insgesamt beschleunigen. Die Quality by Design -Initiative (QbD) der US-amerikanischen Arzneimittelzulassungsbehörde (FDA) bietet Orientierungshilfen zur Verringerung des regulatorischen Aufwands, der mit der Zulassung von Arzneimitteln verbunden ist. Verfahrensweisen werden rationalisiert, die Entwicklungszeiten für Medikamente verkürzt und die Arbeitsauslastung optimiert. In der Definition der FDA heißt es: Quality by Design bezeichnet das Design und die Entwicklung eines Produkts und der dazugehörigen Herstellungsprozesse, die während der Produktentwicklung eingesetzt werden, um zu gewährleisten, dass das Produkt am Ende des Herstellungsprozesses stets die vorab definierte Qualität erreicht. Auch wenn die Vorteile von QbD vor allem in der Produktion zum Tragen kommen, wirkten sie bis in die frühesten Stadien der Produktentwicklung zurück. Die statistische Versuchsplanung (Design of Experiments, DoE), maßstabsgetreue Prognose-Modelle und präzise Prozessanalysen während der Entwicklung fallen allesamt in den Bereich des QbD-Gedankens. Technologie für die Bioprozessentwicklung Die frühe Prozessentwicklung umfasst neben der Zelllinien- und Klonauswahl auch das Screening von Medien, Substratkomposition und Fütterungsstrategien sowie anderer Prozessbedingungen. Traditionell werden hierzu Schüttelkolben eingesetzt, obwohl deren Einschränkungen allgemein bekannt sind. Sie ermöglichen indirekt die Kontrolle von Temperatur, des Umgebungsgases und der Agitationsrate. Die Überwachung und Kontrolle von kritischen Prozessparametern wie beispielsweise dem ph-wert, dem Gelöstsauerstoff (DO) oder das Anwenden von definierten Fütterungsprofilen sind mit diesen Gefäßen allerdings nicht möglich. Diese kritischen Faktoren beeinflussen jedoch das Verhalten, die Lebensfähigkeit und Produktivität der Kulturen und damit letztendlich die Produktqualität und -stabilität. Die Auswahl von suboptimalen Klonen in einer frühen Entwicklungsphase ist bei der Verwendung von Schüttelkolben nichts Ungewöhnliches. Daraus kann eine verringerte Zellproduktivität und Produktqualität während der gesamten Entwicklung resultieren. Dieses Risiko lässt sich eliminieren, wenn bereits während des Screenings Geräte verwendet werden, deren physikalische und mechanische Eigenschaften Bioreaktoren im Produktionsmaßstab so gut wie möglich imitieren. Auf diese Weise lässt sich das Ziel von QbD umsetzen, Qualitätsmaßnahmen, die bereits während der Entwicklung eingeleitet wurden, zu einer hohen Produktqualität zu führen. Moderne Benchtop-Bioreaktoren verfügen über das Potential, die erforderliche Prozesskonsistenz zu gewährleisten. Bei den heutigen hochentwickelten Benchtop-Systemen werden Sensoren und IT-Steuermodule eingesetzt, um kritische Prozessparameter wie Temperatur, ph-wert, Gelöstsauerstoff und Agitation zu überwachen und zu regeln. Wie in Bioreaktoren im Produktionsmaßstab erfolgen Begasung und Substratzufuhr nach vordefinierten Einstellungen. Manche Benchtop-Bioreaktoren sind sogar mit einer Prozessanalytik zur Echtzeit-Überwachung von Abgasen, Nährstoffen, Biomasse und anderen Parametern ausgerüstet. Mittlerweile bieten verschiedene Hersteller Benchtop-Bioreaktorsysteme (meist kleiner als 10 l) an, die sich mit Ausnahme ihrer Größe praktisch nicht von industriellen Bioreaktoren im Produktionsmaßstab unterscheiden. Identische Form-Verhältnisse ermöglichen beispielsweise die Berechnung von hydrostatischem Druck und Sauerstofflöslichkeit, während angepasste Agitationssysteme für vergleichbare Flüssigkeitsdynamik, Stoffübergang und Mischung sorgen. Wissenschaftler können somit anhand der Ergebnisse der Benchtop- Systeme bereits in der Prozessentwicklung das Zellwachstum und die Produktkinetik zum Beispiel eines Liter-Bioreaktors vorhersagen. Um in der Entwicklungsphase so viele Informationen wie nötig zu ermitteln, ist der Maßstab des Bioreaktors entscheidend. Üblicherweise werden Mikro- (unter 1 ml), Mini- (1 ml ml) und Benchtop-Maßstab (0,5 l - 10 l) definiert. Der Pilot- und Produktionsmaßstab umfasst normalerweise 10l bis 100 l bzw. mehr als 100 l, auch wenn das spezielle Volumen in Abhängigkeit von dem jeweiligen Produkt erheblich abweichen kann. Typischerweise werden in der Prozessentwicklung Benchtop-Bioreaktoren mit Arbeitsvolumina von zwei bis drei Litern eingesetzt. Der vergleichsweise große Platzbedarf schränkt die Verwendung solcher Bioreaktoren bei hochgradig parallelen Screening- Schritten aber ein. Auch aufgrund ihres hohen Verbrauchs an wertvollen Materialien sind diese Systeme für schnelle Klon- und Zelllinien- Screenings oder die Medienentwicklung nicht optimal geeignet. Häufig werden daher in der frühen Entwicklung Modelle im Mikrotiterplattenformat eingesetzt. Viele Experten sind der Ansicht, dass diese Systeme für grundlegende Screening- Experimente, nicht jedoch für ernsthafte Pro- Abb. 1: Paralleles Benchtop-Bioreaktorsystem für die Zellkultur Jahrgang Nr. 2/2012 LABORWELT

11 Benchtop-Bioreaktoren Fermenter & Prozesse zessentwicklungsarbeiten geeignet sind. Dr. Frank Baganz vom University College London hat den direkten Zusammenhang zwischen Bioreaktor-Größe und der daraus resultierenden Datenqualität wie folgt dargestellt: Je kleiner die Systeme sind, desto weniger sind sie in der Lage, aussagekräftige Prozessdaten zu liefern. Mini-Bioreaktorsysteme liefern die größte Flexibilität Das Merck Research Institute definiert das optimale Bioreaktor-System im Kleinmaßstab zur Prozessentwicklung als paralleles Bioreaktor- System mit mindestens 24 einzelnen Bioreaktoren und jeweils ca. 100 ml Arbeitsvolumen, doppelter Kapazität für Säugetierzellkulturen oder mikrobielle Fermentation und automatischer Probennahme. Nur wenige handelsübliche Systeme erfüllen diese Kriterien für Bioreaktor-Systeme im Kleinmaßstab. Miniaturisierte Benchtop-Bioreaktoren sind mit den verschiedensten Konfigurationen und Datenverarbeitungsleistungen erhältlich. Der Hauptfaktor bei der Beurteilung dieser Systeme ist das Maß an Übertragbarkeit des Labormaßstabs auf den Pilot-/Produktionsmaßstab. In Tabelle 1 sind die spezifischen Faktoren erläutert, welche bei der Beurteilung eines Benchtop-Systems zu berücksichtigen sind. Fazit Der wachsende Markt für Biopharmazeutika ist stark umkämpft. Sobald Patente auslaufen, sehen sich die Entwickler von Urheber-Produkten dem Wettbewerb von Wettbewerbern und Biosimilar-Entwicklern ausgesetzt. Unternehmen, die die Arzneimittelentwicklung rationalisieren, werden mit niedrigeren Entwicklungskosten, kürzeren Fristen und möglicherweise geringeren Herstellungskosten belohnt. Zur Ausschöpfung dieser Wettbewerbsvorteile müssen weder neue molekularen Targets oder Molekülklassen entdeckt noch eine vollkommen neuartige Prozessausrüstung oder Grundoperationen eingeführt werden: Diese Nutzeffekte sind bereits innerhalb der Unternehmen mit Prozessentwicklungskompetenzen vorhanden. Moderne Benchtop-Bioreaktoren haben die Art und Weise verändert, wie die Hersteller von biopharmazeutischen Produkten die Prozessentwicklung standardisieren und rationalisieren. Diese Systeme, die die kritischen Aspekte der großtechnischen Fermentation und Zellkultur imitieren, bieten Daten- und Informations-Managementtools, die die Einhaltung behördlicher Vorgaben sowohl im Hinblick auf die Zulassung als auch auf die QbD-konforme Prozessentwicklung unterstützen. Tab. 1: Bei der Auswahl geeigneter Bioreaktorsysteme sollten Anwender die Anforderungen an ihr neues System evaluieren, insbesondere mit Hinblick auf spezielle Erfordernisse des Entwicklungsprozesses und die spätere Produktion und Zulassung. Faktoren für die erfolgreiche Wahl geeigneter Benchtop-Bioreaktortechnologie Arbeitsvolumen Die Gefäßgröße variiert von einigen Mikrolitern bis hin zu mehren hundert Millilitern. Mischverhältnisse, Gasaustausch und Aspekt-Ratio-Verhältnisse sollten vergleichbar mit größeren Systemen sein, um die Übertragbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Prozessparameter Die Überwachung der Prozessparameter im Rahmen der QbD-basierten Prozessentwicklung sollte der geplanten Prozessanalytik in den späteren Phasen entsprechen. Die kritischen Prozessparameter sollten sich systematisch erfassen lassen. Die Nutzer sollten auf die Möglichkeit zur Integration von Analysegeräten und Software sowie Automatisierungsoptionen achten. Automatische Probennahme Parallelität Einmal-Gefäße Computerisierung Scale-Up Platzbedarf Modularität Upgrading Konnektivität von externen Geräten und Software Diese Funktion erspart die manuelle Probenentnahme aus dem Bioreaktor wie auch der weiteren Analyse dieser Proben. Es gilt jedoch zu beachten, dass die vollständige Automatisierung, beispielsweise durch Robotik, nicht die echten Prozessabläufe im größeren Maßstab dupliziert. Es gilt hierbei die geeignete Anzahl an simultan geführten Prozessen zu ermitteln, die es ermöglichen die kritischen Prozessparameter zuverlässig einzugrenzen ohne eine übermäßige Datenflut zu generieren. Die Vergleichbarkeit der Messmethoden mit größeren Systemen muss dabei gewährleistet sein. Ebenso wie in der biopharmazeutischen Produktion verursachen Einmal-Gefäße zwar erhöhte Materialkosten, verkürzen jedoch die Leerlaufzeit zwischen einzelnen Prozessdurchläufen und machen Reinigung, Sterilisierung und die dabei nötige Validierung überflüssig. Hierzu zählen die Kontrolle der einzelnen Prozessparameter (ph, Temperatur, DO usw.) sowie die Datenerfassung, die Integration in den IT-Backbone (Archivierungssysteme, Prozessleitsysteme), Datenerfassung, -analyse und -speicherung. In diesem Zusammenhang sind die Schnittstelle und Benutzerfreundlichkeit von Bedeutung. Das Hauptziel von Scale-Down-Experimenten ist es, mit Hilfe der kleinvolumigen Kulturen das Verhalten im großen Maßstab vorherzusagen. Systeme, die diese prädiktive Funktion nicht besitzen, sind Schüttelkolben in keiner Weise überlegen. Zu berücksichtigende Faktoren sind das Formdesign des Bioreaktors, Rührung, Substratzufuhr, Prozessüberwachung, -Kontrolle und -Regelung sowie die Probennahme. Miniaturisierte Benchtop-Bioreaktoren sollten einen Platzbedarf aufweisen, der Hinsichtlich Wartung, Betrieb, Service und Workflow gut zu handhaben ist. Anwender sollten sich der Kompromisse zwischen Reaktorgröße, Platzbedarf, Durchsatz und Datenqualität bewusst sein. Die Software sollte den Einsatz von zwei oder mehreren Mini-Bioreaktorsystemen ermögliche und damit eine nahtlose Konnektivität für die Datenerfassung, -Analyse und -Transfer bieten. Nutzer sollten berücksichtigen, dass Weiterentwicklungen bei Überwachungs- und Kontrollfunktionen auch nachträglich installiert werden können. Die nahtlose Integration von Laborgeräten wie Analysatoren (z.b. HPLC, Massenspektrometern oder Zellzählern), automatische Probennahme und Liquid-Handling ermöglicht das Ermitteln qualitativ hochwertiger Daten sowie das Verkürzen von Entwicklungsphasen. Das Einbinden gezielter Software unterstützt z.b. die Versuchsplanung nach den QbD-Vorgaben (Design of Experiments, DoE) und ermöglicht die QbD-konforme Dokumentation. Potentielle Käufer von miniaturisierten Benchtop-Bioreaktoren sind gut beraten, eine Checkliste mit den Faktoren zu erstellen, die für ihre Arbeitsabläufe sowie ihre regulatorischen und wissenschaftlichen Bedürfnisse relevant sind. Dies wird ihnen angesichts der breit gefächerten Produktlandschaft dabei helfen zu beurteilen, welche dieser Faktoren die jeweiligen Systeme vorweisen können. Diese Funktionen und Anforderungen variieren abhängig von den aktuellen und zukünftigen Prozessentwicklungsanforderungen des Endnutzers. Die führenden Anbieter von Benchtop- Bioreaktoren arbeiten stetig an der Verbesserung von Funktionalitäten und der Vorhersagbarkeit ihrer Miniatur-Systeme. Es ist davon auszugehen, dass in den kommenden Jahren eine breitere Palette an Geräten zur Verfügung stehen wird, die für das Screening und die frühe Prozessentwicklung konzipiert sind, insbesondere in einem Größenbereich der zwischen Mikro- und Benchtop-Geräten angesiedelt ist. Literatur [1] US Biopharmaceutical Market Trends, Forecast, Competition & Strategic Analysis ( ), Markets and Markets, 2010 [2] DePalma A, Microreactors Carve out Growing Niche, Genetic Engineering & Biotechnology News 30(3), 2010 [3] Global Biopharmaceutical Market Report ( ), International Market Analysis Research and Consulting Group (IMARC), 2010 [4] US Food and Drug Administration, Guidance for Industry: Quality Systems Approach to Pharmaceutical CGMP Regulations, 2006 [5] Betts JI and Baganz F, Miniature bioreactors: current practices and future opportunities, Microbial Cell Factories 5(21): 2006 [6] Bareither R and Pollard D, A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: current state and future need, Biotechnology Progress 27: pp2-4, 2011 Korrespondenzadresse Claudia M. Hüther DASGIP GmbH Rudolf-Schulten-Str. 5, Juelich c.huether@dasgip.de LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 2/

12 Fermenter & Prozesse Zelltherapie GMP-gerechte Kultur von mesenchymalen Stammzellen Prof. Dr. Ralf Huss, Dr. Christoph Peter, Dr. Suncana Kern, Dr. Christine Günther, apceth GmbH & Co. KG, München Die GMP-gerechte Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen sowie die Erfüllung der umfassenden europäischen und nationalen arzneimittelrechtlichen Vorgaben sind die Grundvoraussetzung für eine klinische Prüfung und Zulassung entsprechender Zellpräparate für den Einsatz am Menschen. Hierzu gilt es, einen entsprechenden Prozess zu entwickeln und kontinuierlich im Rahmen des Qualitätsmanagements zu verbessern, wie es seit langem für die Herstellung und das in den Verkehr bringen von nicht zellbasierten Therapien üblich ist. Nur so können die Sicherheit und der Nutzen einer neuen Therapieform auf der Basis von mesenchymalen Stammzellen für den Patienten weitestgehend garantiert werden. In gleicher Weise erlaubt ein entsprechendes Herstellungs- und Kultivierungsverfahren die Vergleichbarkeit verschiedenster MSC-Präparate im Hinblick auf eine wissenschaftliche und (prä)klinische Bewertung von mesenchymalen Stammzellen. A Während hämatopoetische Stammzellen (HSCs) schon seit Jahrzehnten in der klinischen Behandlung von Leukämien oder anderen bösartigen Erkrankungen eingesetzt werden, haben em bryonale Stammzellen (ES-Zellen) oder induzierte pluripotente Stammzellen (ips-zellen) aufgrund ethischer Bedenken beziehungsweise noch unbekannter genetischer Risiken wohl zu Recht noch keinen unmittelbaren Einzug in die klinische Anwendung gefunden. Demgegenüber haben mesenchymale Stamm- oder Stromazellen (MSCs) in den vergangenen Jahren zunehmende Bedeutung in der möglichen Behandlung verschiedenster Erkrankungen erlangt. Dies zeigt sich nicht zuletzt in einer stark ansteigenden Zahl an wissenschaftlichen Publikationen und klinischen Prüfungen ( B C MSCs sind adulte Stammzellen (Abb. 1), die sich zu therapeutischen und möglicherweise auch diagnostischen Zwecken aus fast allen humanen Gewebearten leicht isolieren lassen. Humanes Knochenmark (Abb. 1D), Fettgewebe oder Nabelschnurgewebe sind gängige Entnahmequellen; die Gewinnung und Kultivierung von MSCs sind daher im Gegensatz zu ES weitgehend unumstritten. Nach aktuellem Wissensstand birgt die klinische Anwendung von MSCs am Menschen zudem wahrscheinlich weniger Sicherheitsrisiken als die Anwendung von ES und ips 1,2. Die umfassende Charakterisierung von MSCs und ihrer biologischen Funktion in vitro und in vivo hat gezeigt, dass ihre Wirkung in der Zelltherapie durch die Sekretion von parakrinen Faktoren vermittelt wird, die zur Geweberegeneration, einer beschleunigten Wundheilung und zur Immunmodulation führt. Im Gegensatz dazu wird in der Zellersatztherapie die Fähigkeit der MSCs zur Differenzierung in ausgereifte Zellen aller Keimbahnen genutzt, zum Beispiel beim Tissue engineering 1-3. Unabhängig von der Art der Zelltherapie und der gewählten medizinischen Indikation zur klinischen Behandlung am Menschen ist die Kultivierung von MSCs immer ein sehr komplexer pharmazeutischer Prozess. Die Hauptgründe dafür liegen sowohl im hohen wissenschaftlich-medizinischen und regulatorischen Innovationsgrad sowie in den (zell)biologischen Wirkungsmechanismen im Körper, die bisher noch nicht vollständig erforscht und verstanden sind. Die zwei wichtigsten Aspekte müssen aber ohne Ausnahme bei jedem Zellpräparat erfüllt werden: (i) die wichtigen biologischen Eigenschaften, welche das therapeutische Potential von MSCs hegen, sollten bei ihrer Kultivierung erhalten oder sogar gefördert werden; und (ii) alle potentiellen Risiken für die Patienten sollten weitestgehend vorhersagbar sein und möglichst ausgeschlossen werden. EU-Regularien D Abb. 1: A-C Reinraum als Voraussetzung für die GMP-gerechte MSC-Kultivierung; D Knochenmark als Ausgangsmaterial für die MSC-Isolierung; E Adhärente MSCs in Kultur; F Adipo gene Differenzierung von kultivierten MSCs. E F Um die Herstellung derart pharmakologisch wirksamer MSCs für die sichere klinische Anwendung am Menschen zu gewährleisten, werden kultivierte MSCs für die klinische Anwendung in Europa als sogenannte Advanced therapy medicinal products (ATMP) behandelt. Im Rahmen der ATMP-Verordnung (EC 1394/2007) hat der europäische Gesetzgeber die EG-GMP-Richtlinien (2003/94/EG) und die pharmazeutischen Standards auch bei der Kultivierung von MSCs für die klinische Anwendung durchgesetzt 4,5. Das Hauptziel ist, einen umfassend sicheren, robusten und standardisierten, GMP-gerechten Produktionsprozess durch das Zusammenspiel der voneinander unabhängigen Komponenten GMP-Herstellung, GMP-Qualitätskontrolle und GMP-Qualitätssicherung sicherzustellen (Abb Jahrgang Nr. 2/2012 LABORWELT

13 Zelltherapie Fermenter & Prozesse Porvair hairdryer Laborwelt DE 116.5x90_Layout 1 07/03/ :25 Page 1 2). Dementsprechend ist seit Dezember 2011 in der pharmazeutischen Entwicklung von MSCs in Europa eine Herstellungserlaubnis in Verbindung mit einem indikationsabhängigen Investigational Medicinal Product Dossier (IMPD) erforderlich 4. Die nach den GMP-Richtlinien hergestellten MSCs können dann als klinisches Prüfpräparat (Annex 13, EG-GMP-Leitfaden) in einer klinischen Studie eingesetzt werden. Nach beendeter klinischer Studie kann dann die zentrale europäische Zulassung als ATMP-Arzneimittel durch die European Medicines Agency (EMA) erfolgen, da im Falle von ATMPs keine lokale Zulassung möglich ist. In bestimmten Ausnahmefällen ist auch eine Anwendung außerhalb einer klinischen Studie durch die sogenannte Hospital exemption nach 4b Abs. 3 AMG möglich 6. Dies sollte jedoch auch von Seiten des Gesetzgebers nur eine Ausnahme bleiben. ACHEMA Halle 4.2 E44 ANALYTICA Halle B2 215 Wissenschaftlich-technische und Qualitäts-Voraussetzungen Der GMP-Leitfaden regelt ausführlich, welche wissenschaftlich-technischen und qualitativen Voraussetzungen bei der Herstellung von MSCs als Arzneimittel gegeben sein müssen 5. Die GMP-gerechte Kultivierung von MSCs findet in überwachten Reinräumen statt, die je nach den in ihnen stattfindenden Produktionsschritten klassifiziert sein müssen (Abb. 1 A-C). Der EG-GMP-Leitfaden sieht zum Beispiel für Durchführungen am offenen Produkt die höchste Reinheitsklasse A vor im Gegensatz zu Produktionsschritten in geschlossenen Systemen, die in niedrigeren Reinheitsklassen C oder sogar D durchgeführt werden können. Die Reinheitsklassen sind durch Grenzwerte der in den jeweiligen klassifizierten Bereich vorkommenden Partikel und Keime definiert 5,7. Die Einstufung, welche Prozessschritte in welcher Umgebung durchgeführt werden müssen, sollten durch eine Risikoanalyse des Prozesses festgelegt werden 5,7. Dabei werden alle durchzuführenden Prozessschritte unter dem Aspekt betrachtet, wie hoch das Risiko einer Beeinträchtigung der Qualität der Zellkultur oder das Risiko für den Patienten ist. Der wesentliche Bestandteil der GMP-gerechten Kultivierung von MSCs ist eine kontinuierliche Durchführung von Qualitätskontrollen (Abb. 2). Diese beginnt bereits bei den Ausgangsmaterialien (z.b. Knochenmark), führt weiter über einen oder mehrere in-prozess-kontrollpunkte bis zur Qualitätskontrolle des Endproduktes und schließlich der Freigabe des Produktes für die Anwendung im Patienten durch die Qualified Person (QP). Die Qualität des Produktes wird über Spezifikationen definiert, die das Endprodukt erfüllen muss. Kriterien für die Freigabe der kultivierten MSCs sind die Identität, Reinheit, Sterilität, Wirksamkeit und genetische Stabilität. Ein Problem, das sich bei der Produktion von MSCs stellt, ist, dass es bislang keinen Oberflächenmarker gibt, der für die Identitätsbestimmung von MSCs benutzt werden könnte. Nichtsdestotrotz wird weiterhin versucht, einen solchen spezifischen Marker zu identifizieren, der tatsächlich eine Bedeutung für die Funktion von MSCs besitzt. So hat sich die International Society of Cell Therapy (ISCT) zunächst um einen Kompromiss aus einer Kombination von Oberflächenmarkern und Differenzierungspotential als Identitätskriterien für MSCs bemüht 8. Ein zuverlässiges Qualitätssicherungssystem begleitet die Qualitätskontrolle sowie die Herstellung und gewährleistet, dass zu jedem Zeitpunkt der Produktion alle GMP-Standards vollständig befolgt werden (Abb.2). Quality-by-design austria wirtschaftsservice Wir mixen die optimale Finanzierung. Die Wichtigkeit des Zusammenspiels von Qualitätskontrolle, Qualitätssicherung und Produktion bei der GMP-konformen Kultivierung ist besonders im pharmazeutischen Quality-by-design-Konzept ersichtlich (Abb. 2) 10. Quality-by-design bedeutet, dass die Qualität ein Bestandteil des Produktes ist und daher bei der Entwicklung des Produktes und dem Herstellungsprozess berücksichtigt und in die Prozesse eingebaut werden muss. Dabei sollten kontinuierliche Risikoanalysen und das Knowledge-Management Euro Management auf Zeit: Finanzierung von temporärer externer Beratung awsg.at/maz Die Vorzüge eines MiniVap Selbstverständlich würden Sie keinen Haartrockner verwenden, um chromatographische Proben in einer einzelnen Mikrotestplatte zu verdampfen. Sie haben wahrscheinlich aber auch keine Lust Schlange zu stehen, um einen großen Evaporator in Ihrer Abteilung für denselben Zweck zu benutzen. In diesem Fall brauchen Sie einen Porvair MiniVap. 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14 European Biotechnology Network Join the European Biotechnology Network! The European Biotechnology Network is dedicated to facilitating co-operation between professionals in biotechnology and the life sciences all over Europe. The network is run by the European Biotechnology Foundation, a non-profi t organisation based in Brussels. Do you want to know more about the advantages of a (free) membership? Just have a look at our website: (i) eine weitestgehende Kontrolle über das MSC-GMP-Produkt, (ii) die kontinuierliche Adaptation und Verbesserung der Prozesse, und (iii) eine rasche Behebung aller aufgetretenen Abweichungen sowie deren künftige Vermeidung (CAPA, corrective action and preventive action ) ermöglichen. Das risikobasierte Herangehen entwickelt sich mehr und mehr zu einem zentralen Bestandteil bei der Etablierung und Durchführung GMP-konformer Prozesse. Dadurch ist es möglich, schon vor und während der Entwicklung mögliche Risiken zu erkennen und zu minimieren. Die Risikoanalyse hilft weiterhin, die wesentlichen Punkte zu identifizieren, sich darauf zu konzentrieren und dadurch effizienter und schneller zu einem robusten Prozess zu gelangen 10. Für die klinische Anwendung von MSCs ist die Expansion, durch die die Charakteristik und die Qualität der Zellen möglichst nicht verändert werden, eine der wichtigsten Voraussetzungen für einen robusten Prozess. Hierbei bleibt die Diskussion weiterhin kontrovers, wie viele Zellteilungen in der Zellkultur möglich sind, ohne die biologische Funktion von MSC zu beeinflussen. Unklar ist auch, welche Bedeutung die nachgewiesenen oder vermuteten genetischen Veränderungen besitzen, die in Abhängigkeit der Passagen in der Zellkultur, der Anzahl der Zellverdopplungen und der Kultivierungsdauer auftreten können 9. Entscheidend hierfür sind auch die angewendeten Methoden, z.b. WGAS ( whole genome association study ) oder der Karyotyp. Während autologe MSCs kein Risiko der Transmission von genetischem Fremdmaterial zeigen, ist die standardisierte Kultivierung auch nach GMP im Hinblick auf die Konsistenz des Prozesses zwischen einzelnen Präparaten im Gegensatz zu einem allogenen MSC-Zellproduktes zweifellos eine Herausforderung. Auch aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten ist die Herstellung von MSCs für die autologe Anwendung durch die kleine Chargengröße, bei der ein Produktionsprozess eine Charge für einen Patienten ergibt, eine größere Herausforderung als bei der Herstellung allogener Produkte. Bei diesen können in einem Produktionsprozess eine Charge für die Behandlung vieler Patienten hergestellt werden. Literatur 1. Huss, R. (2010) Stem Cells Dev. 19(5): Trounson, A. (2009) BMC Medicine 7: Baiguera, S., et al. (2012) Transplant International 25(4): EU ATMP Verordnung: EC 1394/ EG-GMP-Leitfaden 6. Entscheidungsbaum: Hospital Exemption de/cln_101/nn_ /shareddocs/downloads/pu/innovationsbuero/entscheidungsbaum-_c2_a74b-amg,temp lateid=raw,property=publicationfile.pdf/entscheidungsbaum-%c2%a74b-amg.pdf 7. EN ISO Dominici, M., et al. (2006) Cytotherapy, 8(4): Sensebe, L., et al. (2011) Human Gene Therapy 22(1): Yu, L.X. (2008) Pharm Res. 25(4): Korrespondenzadresse Prof. Dr. med. Ralf Huss (CSO) apceth GmbH & Co. KG Max-Lebsche-Platz 30, München Tel.: +49-(0) Fax: +49-(0) r.huss@apceth.com European Biotechnology Foundation Rue d Egmont 15 B-1000 Bruxelles, Belgique Tel: Fax info@european-biotechnology.org Abb. 2: Kontrolle über den Prozess führt zur Robustheit des Prozesses und zur Sicherheit des Produktes. LABORWELT

15 Expertenpanel Fermenter & Prozesse Bioökonomie Prof. Dr. Eckhard Boles, Dr. Jürgen Eck und Rick Eno Nirgendwo sonst weltweit wird derzeit mehr in die Vision einer wirtschaftlich und ökologisch nachhaltigen Produktion gesteckt als in Deutschland. Bis zu 2,4 Mrd. Euro hat das BMBF bis 2016 für die Nationale Forschungsstrategie BioÖkonomie eingeplant. Im Kern des langfristig angestrebten Produktionswandels hin zu biobasierten Verfahren geht es darum, industriegeführte Konsortien zu etablieren, die den Technologietransfer vom Labor- und Pilotmaßstab in die Anwendung schaffen. Dafür muss sich aber eine Voraussetzung einstellen, die in Europa nicht gegeben ist: Forschung muss schnell und effizient verwertet werden. Eckhard Boles Institut für Molekulare Biowissenschaften, Goethe-Universität Frankfurt am Main, Mitgründer der Butalco GmbH LABORWELT Welche Fortschritte gibt es bei der Entwicklung von Produktionsorganismen, die Pentosen und Hexosen aus Lignozellulose gleichzeitig zur Fermentation von Biokraftstoffen nutzen können? Boles: Biokraftstoffe der zweiten Generation, wie etwa Zellulose-Ethanol, entstehen durch Vergärung von pflanzlicher Biomasse. Die nach dem enzymatischen Aufschluss anfallenden lignozellulosischen Hydrolysate enthalten nicht nur leicht vergärbare Glukose (C6-Zucker), sondern auch C5-Zucker wie Xylose und Arabinose. Obwohl auch immer wieder verschiedene Bakterienarten für die Vergärung der Hydrolysate ins Spiel gebracht werden, wird generell die Hefe Saccharomyces cerevisiae aufgrund ihrer hohen Ethanolproduktionsraten und der Prozessrobustheit als der geeignetste Mikroorganismus angesehen. Der Nachteil von S. cerevisiae, nämlich die Unfähigkeit C5-Zucker zu vergären, konnte in den letzten Jahren mittels genetischer Methoden weitestgehend behoben werden. Es stehen inzwischen verschiedene industriell einsetzbare C5-vergärende Hefen zur Verfügung. Diese Hefen können Lignozellulose-Hydrolysate mit Erträgen von mehr als 90% der theoretischen Ethanolausbeute vergären. Jedoch werden dabei die C5-Zucker erst vergoren, nachdem die Glucose aufgebraucht ist. Das führt zu einer unerwünschten, deutlich verlängerten Prozessdauer. Die Ursache ist, dass bisher für Hefezellen keine spezifischen Aufnahmesysteme für C5-Zucker zur Verfügung stehen. Stattdessen werden C5-Zucker nur langsam und unspezifisch mit Hilfe der Importsysteme für Glukose aufgenommen. Für andere Zuckerarten und in Bakterien konnte kürzlich gezeigt werden, dass wenn die Zellen jeweils spezifische Aufnahmesysteme ausbilden, verschiedene Zucker gleichzeitig und rascher vergoren werden können. Es besteht also dringender Bedarf hinsichtlich der Entwicklung spezifischer C5-Transporter für Hefen. Jürgen Eck Chief Technology Officer, BRAIN AG, Zwingenberg LABORWELT Welche Fortschritte gibt es bei dem Bemühen, Chemikalien und Wertstoffe regenerativ zu erstellen, und wie ist Deutschland im internationalen Vergleich aufgestellt? Eck: Die Jubiläumsausgabe des Wirtschaftsmagazins Capital titelt im Mai dieses Jahres In der Poleposition und weist Deutschland eine führende Rolle beim Eintritt in das Zeitalter der Nachhaltigkeit und der Bioökonomie zu. Im internationalen Vergleich haben wir diese Stellung aufgrund einer starken technologischen Grundlage insbesondere der industriellen weißen Biotechnologie und den traditionell starken Ingenieurswissenschaften unter anderem im Bereich Verfahrensentwicklung und Anlagenbau erarbeiten können. Nicht zuletzt hat uns der Fakt, dass der Wirtschaftsstandort Deutschland noch nie mit Rohstoffreichtum gesegnet war, schon früher als andere über ressourceneffiziente Verfahren und Produkte nachdenken lassen. Zur Schließung von Stoffkreisläufen muss das mittel- und langfristige Ziel klar die Erweiterung der Rohstoffbasis für die Herstellung von Chemikalien und Wertstoffen sein. Dies kann nur unter Nutzung von Lignozellulose sowie industrieller Abfallströme wie CO 2 als Rohstoffe durch hochspezialisierte mikrobielle Produzentenorganismen geschehen. Ein Beispiel hierfür ist die Kooperation der RWE Power AG und der BRAIN AG zur Nutzung von CO 2 aus Kraftwerksabgasen zur Herstellung von Kunststoffen und Plattformchemikalien, in der bereits erste bedeutende Meilensteine auf dem Weg zur Nutzung von CO 2 als Rohstoff erzielt werden konnten. Eine solche Erweiterung der Rohstoffbasis würde Deutschland nicht nur den Ausblick auf einen schier unendlich verfügbaren Rohstoff geben, sondern auch über die Steigerung der Rohstoffeffizienz einen klaren Vorteil im globalen Wettbewerb des beginnenden Wirtschaftszyklus der Bioökonomie verschaffen. Die Poleposition haben wir erreicht, nun gilt es, diese konsequent auszunutzen und in den ersten Runden des Rennens den Vorsprung auszubauen. Die Startampel des Rennens ist spätestens mit der Bekanntgabe des National Bioeconomy Blueprint der Obama-Administration am 26. April auf Grün geschaltet. Rick Eno CEO und Präsident, Metabolix Inc., Cambridge (Mass.), USA LABORWELT Was macht Deutschland attraktiv für einen Hersteller des Biokunststoffes PHA? Eno: Europa ist mit 50% Anteil der größte Markt für Bioplastik. Laut Freedonia Group soll sich der Weltmarkt für Biokunststoffe bis 2015 verdreifachen, mit Westeuropa als weiterhin größtem Verbraucher. Seine zentrale Lage macht Deutschland für uns als Hersteller von PHA zum idealen Standort. Sie ermöglicht es uns, den direkten Kundenkontakt zu intensivieren. Zudem bietet der BioCampus Cologne ein stimulierendes Life Sciences-Umfeld. Von hier aus können wir sehr kosteneffizient unsere regionalen Initiativen zu erneuerbaren Chemikalien ausbauen. Des weiteren haben viele unserer Kunden hier ihren Standort. In Europa wollen wir besonders im Markt für kompostierbare Tragetaschen auf Basis unserer Mvera film- und Mirel-Marken expandieren. Ihre Eigenschaften sind äquivalent zu denen erdölbasierter Tragetaschen und können mit derselben Technologie und ähnlicher Produktivität wie diese verarbeitet werden. Darüber hinaus sind sie aber in Boden und Wasser abbaubar (Mirel) beziehungsweise industriell kompostierbar (Mvera). Zudem nutzen wir unsere PHA-Technologie zur Entwicklung biobasierter C3- und C4-Chemikalien, einem 10 Mrd. $-Weltmarkt mit Applikationen in Kunststoffteilen und Spandex (C3) sowie Farben, Klebstoffen, Windeln und Beschichtungen (C3). LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 2/

16 Fermenter & Prozesse Biosensorik Chip-basierte Sensoren für die Biotechnik Dipl.-Ing. Matthias Bäcker, Prof. Dr.-Ing. Michael J. Schöning, Institut für Nano- und Biotechnologien (INB), Fachhochschule Aachen, Campus Jülich Am Institut für Nano- und Biotechnologien (INB) der Fachhochschule Aachen wird seit mehreren Jahren an Chip-basierten Sensoren zur Erfassung chemischer und biologischer Größen geforscht. Zur Herstellung dieser Sensoren wird dabei auf bewährte Verfahren der Siliziumplanartechnologie zurückgegriffen. Beispielhaft werden in diesem Artikel kapazitive Feldeffektsensoren zur ph-messung und enzymbasierte Biosensoren zum Nachweis von Glukose, Glutamat und Glutamin vorgestellt. Die Herstellung von pharmazeutischen Produkten erfolgt heutzutage nicht mehr nur durch chemische Synthese, sondern auch biotechnologisch mit Hilfe lebender Zellen. Biotechnologische Prozesse sind in der Regel hochkomplex. Die verwendeten Zellen und Mikroorganismen müssen unter optimalen und definierten Bedingungen im Bioreaktor kultiviert werden, um reproduzierbar Produkte hoher Qualität erzeugen zu können. Analytische Verfahren spielen somit eine zentrale Rolle bei dem Verständnis und der Optimierung dieser Prozesse 1. Während der Kultivierung werden Substrate verbraucht und Produkte sowie Metabolite erzeugt. Diese Änderungen haben direkten Einfluss auf die Umgebungsbedingungen im Bioreaktor. Zur Beschreibung dieser Bedingungen werden neben physikalischen Parametern (z.b. Temperatur, Druck) sowohl chemische (z.b. ph-wert, Nährstoffkonzentration) als auch biologische (z.b. Zellaktivität) Parameter erfasst 2. Aufgrund der möglichen Integration mehrerer Funktionalitäten innerhalb eines Bauelementes könnten hierbei Chip-basierte Sensoren als Analysetool Einsatz finden. was zu Messungenauigkeiten führen kann. Daneben stellt vor allen Dingen Glasbruch bei unsachgemäßem Ein- und Ausbau eine weitere Hauptausfallursache dar. Neue Alternativkonzepte auf der Basis von Feldeffektstrukturen wie etwa Ionensensitive Feldeffekttransistoren (ISFETs) scheitern bisher im Wesentlichen an einer unzureichenden Langzeitstabilität und Zuverlässigkeit im Messbetrieb sowie an den relativ hohen Herstellungskosten. Verglichen mit ISFETs bestechen planare EIS (Elektrolyt-Isolator-Silizium)-Strukturen (d.h. nicht photolithographisch strukturierte Feldeffektsensoren) durch ihre einfachere Herstellung und vielfältige Nutzbarkeit 3. Derartige kapazitive EIS-Sensoren bestehen aus einem halbleitenden Siliziumsubstrat, auf dem durch thermische Trockenoxidation eine etwa 30 nm dünne Siliziumdioxidschicht (SiO 2 ) aufgewachsen wird. Zum Messbetrieb wird die Oberfläche des Sensorchips in Kontakt mit der Analytlösung gebracht. In den meisten Fällen kann der Sensorchip mit einem O-Ring gegen die Flüssigkeit abgedichtet werden, wodurch ein aufwendiger Verkapselungsprozess wie z.b. bei ISFETs hinfällig wird. Der elektrische Stromkreis wird über eine Referenzelektrode (z.b. Ag/AgCl), welche Kontakt zum Elektrolyten und ein definiertes Potential liefert, geschlossen (siehe Abb. 1a). In Abhängigkeit von der Protonenkonzentration des zu messenden Elektrolyten stellt sich an der Grenzfläche Elektrolyt/ Isolator eine definierte Oberflächenladung ein. Diese wiederum führt zu einer Kapazitätsänderung der Sensorstruktur, welche die eigentliche Messgröße des Sensorchips darstellt. Wird nun die Kapazität der Sensorstruktur mit Hilfe eines Regelkreises konstant gehalten, so lässt sich der zeitliche Verlauf des Oberflächenpotentials direkt in Abhängigkeit vom ph-wert bestimmen. Abbildung 1b zeigt beispielhaft das Sensorverhalten in ph-pufferlösungen im Bereich von ph 10 bis ph 3. Zur Verbesserung der Sensorcharakteristika kann eine weitere Dünnschicht auf dem SiO 2 abgeschieden werden. Bei der Wahl eines geeigneten ph-sensitiven Transducermaterials zeigt insbesondere eine Doppelisolatorschicht bestehend aus SiO 2 und Tantalpentoxid (Ta 2 O 5 ) herausragende Eigenschaften. Ta 2 O 5 ist chemisch äußerst beständig und weist eine nahezu Nernst sche Sensitivität auf. Mit Ta 2 O 5 - basierten ph-sensoren wird eine Ansprechzeit (90%) von weniger als einer Minute bei einer mittleren ph-sensitivität von 57 mv/ ph und einer Messgenauigkeit von 0,1 ph im Bereich von ph 2 bis ph 12 erzielt. Die Robustheit von Ta 2 O 5 ermöglicht den Einsatz solcher Sensoren auch in (biologischen) Produktionsanlagen, die mittels Cleaningin-place (CIP)- oder Sterilisation-in-place (SIP)-Verfahren gereinigt werden müssen. Auch nach bis zu 30 CIP- bzw. SIP-Zyklen konnte kein Nachlassen der ph-sensitivität festgestellt werden 3,5. Des Weiteren konnte der Einsatz eines EIS-Sensors zum inline- Kapazitiver ph-sensor Potentiometrische ph-einstabglaselektroden ermöglichen in der Bioverfahrenstechnik zwar einerseits eine permanente Überwachung des ph-wertes, andererseits stellen deren unzureichende Autoklavierbarkeit und Handhabung im praktischen Einsatz limitierende Faktoren dar. Solche ph-elektroden müssen für einen sterilen Messbetrieb autoklavierbar sein, was sowohl eine verringerte Lebensdauer als auch Abweichungen in der Messcharakteristik (Kalibrierungsfehler) zur Folge haben kann und häufig ein Austauschen der Elektroden notwendig macht. Während des Messeinsatzes kommt es zudem häufig zu Verschmutzungen oder Verstopfungen des Diaphragmas durch Bestandteile des Mediums (z.b. durch Proteine), Abb. 1: ph-messgerät mit EIS-Sensor, Referenzelektrode und Probezelle (a) und exemplarische Messung im Bereich von ph 10 bis ph 3 4 (b) Jahrgang Nr. 2/2012 LABORWELT

17 Biosensorik Fermenter & Prozesse Abb. 2: Entwickelter Mikrofluidikchip mit integrierten Biosensoren (a) und beispielhafte amperometrische Glutamindetektion (b) Monitoring des ph-wertes während einer Zellkulturfermentation erfolgreich demonstriert werden 3,6. Mikrofluidikchip mit enzymbasierten Biosensoren Ein weiteres Anwendungsbeispiel, bei dem Chip-basierte Sensorsysteme eine Rolle spielen können, stellt die Erfassung von relevanten Nährstoffkonzentrationen bei Fermentationsprozessen dar. Am INB wurde als möglicher Lösungsansatz unlängst ein Mikrofluidikchip entwickelt, der drei enzymbasierte, amperometrische Biosensoren zum Nachweis von Glukose, Glutamat und Glutamin auf einem einzigen Chip integriert 7. Die Herstellung des Mikrofluidikchips erfolgte in drei Schritten: Zunächst wurden Platindünnschichtstrukturen mittels Elektronenstrahlverdampfung abgeschieden und mit Lift-off-Technik strukturiert. Anschließend wurde ein linearer Fluidikkanal auf dem Chip durch photolithographische Strukturierung eines 100 µm dicken SU-8 Photolacks erzielt. Die Breite des Kanals beträgt 1,75 mm und der Abstand zwischen Einlass und Auslass 15 mm. Die Funktionalität der Biosensoren wurde durch Immobilisierung unterschiedlicher Enzyme gewährleistet, die spezifisch die Nährstoffkonzentration im Analyten detektieren. Zur Herstellung des Glukosesensors wurde hierzu auf Glukose- Oxidase zurückgegriffen, der Glutamatsensor basierte auf Glutamat-Oxidase. Die Detektion von Glutamin erfolgte durch Kopplung von zwei Enzymen: Glutaminase katalysiert die Umsetzung von Glutamin zu Glutamat, welches anschließend von Glutamat-Oxidase umgesetzt wird. Bei den Oxidase-basierten Reaktionen entsteht als Nebenprodukt der enzymatischen Reaktion Wasserstoffperoxid. Dieses wird an den gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode polarisierten Platinelektroden umgesetzt. Der resultierende Strom fungiert als Maß für die Analytkonzentration 8. In Abbildung 2a ist ein derartiger Mikrofluidikchip mit immobilisierten Enzymmembranen dargestellt. Zur Messung wurde der Fluidikkanal mit einem Plexiglasdeckel verschlossen und an ein Fließinjektionsanalyse-System angeschlossen. Die Biosensoren wurden systematisch hinsichtlich ihrer intrinsischen Sensoreigenschaften (Sensitivität, linearer Messbereich, untere und obere Nachweisgrenzen) charakterisiert. Abbildung 2b zeigt exemplarisch das Ansprechverhalten des Glutaminsensors auf eine dreifache Injektion von Analytlösung mit einer Glutaminkonzentration im Bereich von 0,01 mm bis 20 mm. Die ermittelten Sensitivitäten beliefen sich auf 1,47, 3,68 und 0,28 µas/mm für den Glukose-, den Glutamat- bzw. den Glutaminsensor. Im Falle des Glukose- und des Glutamatsensors wurde eine untere Nachweisgrenze von 0,05 mm ermittelt, für den Glutaminsensor betrug diese 0,1 mm. Die Kennlinien des Glukose- und des Glutaminsensors verliefen linear bis zu einer Analytkonzentration von 20 mm, die des Glutamatsensors bis zu 10 mm. Die Verwendung der bi-enzymatischen Nachweisreaktion für den Glutaminsensor hat zur Folge, dass dieser einer intrinsischen Querempfindlichkeit gegenüber Glutamat unterliegt. Das bedeutet, der Glutaminsensor ist nicht allein in der Lage, zwischen Glutamat und Glutamin in der Messprobe zu unterscheiden. Dennoch konnte durch die zusätzliche Integration des Glutamatsensors eine Differenzanordnung realisiert werden, welche die Querempfindlichkeit signifikant reduziert 7. Das dargestellte Sensorprinzip lässt sich durch Modifizierung der Rezeptorschicht beispielsweise durch Immobilisierung von weiteren Enzymen oder Ionen-selektiven Membranen erweitern. Literatur [1] Ulber, R., Hitzmann, B., Scheper, T., Chemie Ingenieur Technik 73 (2001), [2] Rehbock, C., Beutel, S. Brückerhoff, T., Hitzmann, B., Riechers, D., Rudolph, G., Stahl, F., Scheper, T., Friehs, K., Chemie Ingenieur Technik 80 (2008), [3] Schöning, M.J., Brinkmann, D., Rolka, D., Demuth, C., Poghossian, A., Sensors and Actuators B (2005), [4] Wagner, T., Maris, R.J., Ackermann, H.-J., Otto, R., Beging, S., Poghossian, A., Schöning, M.J., Sensors and Actuators B 127 (2007), [5] Bäcker, M., Beging, S., Biselli, M., Poghossian, A., Wang, J., Zang, W., Wagner, P., Schöning, M.J., Electrochimica Acta 54 (2009), [6] Bäcker, M., Pouyeshman, S., Schnitzler, Th., Poghossian, A., Wagner, P., Biselli, M., Schöning, M.J., Physica Status Solidi A 208 (2011), [7] Bäcker, M., Rakowski, D., Poghossian, A., Biselli, M., Wagner, P., Schöning, M.J., Journal of Biotechnology (2012) /j.jbiotec [8] Bäcker, M. Delle, L., Poghossian, A., Biselli, M., Zang, W., Wagner, P., Schöning, M.J., Electrochimica Acta 56 (2011), Die Autoren danken S. Beging, A. Poghossian und T. Wagner für die technische Unterstützung und fachliche Diskussion. Korrespondenzadresse Prof. Dr. Michael J. Schöning Fachhochschule Aachen, Campus Jülich Institut für Nano- und Biotechnologien Heinrich-Mußmann-Str. 1, Jülich Tel.: +49-(0) Fax: +49-(0) Schoening@fh-aachen.de LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 2/

18 II Automation Simulation/Modellierung Automation Realitätsnahe Simulation von Zellsignalprozessen Bastian Angermann 1, Frederick Klauschen 1,2, Martin Meier-Schellersheim 1, 1 National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, USA; 2 Charité Universitätsmedizin, Berlin Auf 4,1 Mrd. US-$ soll der globale Markt für Laborautomation in den nächsten drei Jahren wachsen. Zwar finden sich die Hauptabnehmer für automatisierte Produkte nach wie vor in der pharmazeutischen und Biotech-Industrie, doch wird Automation auch in der Grundlagenforschung zum Beispiel in Sequenzierungsprojekten immer wichtiger, um schneller zu Ergebnissen zu kommen und publizieren zu können. Zudem bieten hinreichend automatisierte und systemintegrierte Lösungen potentielle Einnahmequellen für die Auftragsforschung. Die meisten von der US-Automationsgesellschaft SLAS befragten Unternehmen gaben an, in diesem Jahr IT-Dienstleistungen in Auftragsforschung erbringen lassen zu wollen, dicht gefolgt von Forschungsservices. Von Bio-IT zu PCR Um die Datenflut aus den immer zahlreicher werdenden Discovery- und Omics- Projekten interpretieren zu können, ist vor allem eines nötig: einfach zu bedienende bioinformatische Tools, die Aufschluss über die biologische Relevanz der Daten geben. Ein solches Werkzeug zur Modellierung von Signalketten stellen Angermann et al. in diesem Special vor. Wie weit sich die Automation der quantitativen PCR treiben lässt, zeigen Forscher von Roche Diagnostics auf. Sie haben eine entsprechende PCR- Plattform für den Ultrahochdurchsatz in verschiedenen Applikationsfeldern, wie Mikrobiologie oder Krebsdiagnose, getestet und stellen Daten zur Systemintegration mit Liquid-Handlern im Well-Format vor. Hochdurchsatz ist auch gefragt, wenn es darum geht Diagnostiktests durchzuführen. Was die Omics-Technologien bereits heute zur Hochdurchsatzdiagnostik beisteuern können, erläutern Peter Nürnberg, Martin Blüggel und Alexander Kohlmann im LABORWELT-Expertenpanel. Highlight: Mit Proteininteraktionsanalyse gelang es unlängst, den ersten TH17-Blocker zu identifizieren. Die stetig besser werdenden experimentellen zellbiologischen Methoden aus den Bereichen der Proteomik, Genomik oder Mikroskopie bilden die gr0ße Komplexität biologischer Prozesse immer genauer ab. Allerdings stellt die optimale Nutzung der gewonnenen Messergebnisse, das heißt die Übersetzung in ein funktionelles Verständnis, große Herausforderungen an die Datenanalyse. Neben klassischen bioinformatischen oder statistischen Analysemethoden wird eine Integration experimenteller Ergebnisse mit quantitativen dynamischen Modellierungsansätzen benötigt. Die Erstellung entsprechender Modelle kann jedoch in vielen Fällen technisch so schwierig sein, dass selbst erfahrene Theoretiker auf starke Vereinfachungen bei der Beschreibung der komplexen biologischen Zusammenhänge zurückgreifen müssen. Die hier vorgestellte Modellierungsmethode überwindet viele der technischen Schwierigkeiten und erschließt auch primär experimentell arbeitenden Wissenschaftlern die Möglichkeit, morphologisch und biochemisch realistische Zellmodelle zu simulieren und damit Hypothesen quantitativ zu testen und mit experimentellen Daten abzugleichen. In den letzten Jahren hat die Anzahl der Forschungsvorhaben sprunghaft zugenommen, die sogenannte Discovery- oder Daten-getriebene Strategien verfolgen und mit neuen Hochdurchsatzverfahren aus der Genomik oder Proteomik primär umfassende Daten generieren. Im Allgemeinen gestatten diese Daten jedoch noch keine unmittelbaren Schlussfolgerungen auf die zugrundeliegenden biologischen Mechanismen, sondern bilden lediglich die Grundlage für das Aufstellen von Hypothesen, die dann in zielgerichteten Experimenten getestet werden müssen. Viele Phänomene in der Biologie und Medizin entstehen durch ein komplexes Zusammenspiel zahlreicher molekularer Komponenten, die in biochemischen Netzwerken organisiert sind. Die Formulierung zellbiologischer und medizinischer Hypothesen wird durch diese Komplexität erschwert, da solche Gefüge nur noch schwer intuitiv zu erfassen sind, insbesondere, wenn die Hypothesen darauf abzielen, das dynamische Verhalten solcher Vielkomponenten-Systeme zu verstehen oder gar vorherzusagen. Die Schwierigkeit rührt vor allem daher, dass biologische Prozesse Abb. 1: Definition der Rekrutierung eines Gabg-Heterotrimers an einen gebundenen Rezeptor als Teil eines Modells der Aktivierung von G-Proteinen. Die linke Bildseite zeigt die Komplexe vor der Assoziation, der mittlere Bildteil das Produkt der Reaktion, deren Parameter am rechten Bildrand spezifiziert sind. Der Nutzer kann durch Zeichnen einer Linie (im Bild grün) die Wechselwirkung zwischen der intrazellulären Bindungsstelle des zuvor definierten Rezeptor-Liganden-Komplexes mit dem Ga- Fragment des Heterotrimers definieren. Nachdem die Assoziationsrate festgelegt ist, ist die Rekrutierung vollständig beschrieben Jahrgang Nr. 2/2012 LABORWELT

19 Simulation/Modellierung Automation wie etwa die Entwicklung der Immunantwort auf eine Infektion oft nichtlinear sind. Das bedeutet, dass man ihnen nicht unmittelbar ansieht, wie sich Unterschiede in den Ausgangsbedingungen im Laufe der Zeit auf das Verhalten des Systems auswirken können. Um dieser Problematik zu begegnen, werden mathematische Modelle und Computerprogramme entwickelt, mit deren Hilfe das zeitlich-dynamische Verhalten biologischer Systeme simuliert werden kann 1. Solche theoretischen Ansätze können dem Biologen im Prinzip ein Werkzeug zur Verfügung stellen, mit dem Hypothesen getestet werden können, bevor Experimente gemacht werden oder mit dem geprüft werden kann, ob experimentelle Ergebnisse mit bestehenden Modellen vereinbar sind. In der Zellbiologie ist das Ziel hierbei häufig, mit Hilfe der Simulationen zu untersuchen, ob eine Hypothese prinzipiell ein zelluläres Phänomen erklären kann (kommt die Simulation mit einigermaßen vernünftigen Annahmen dem experimentell beobachteten Sachverhalt wenigstens nahe) und welches Experiment am besten geeignet wäre, die Hypothese detaillierter zu prüfen. Simulationen oft zu wenig realitätsnah Ein Problem solcher Simulationsmodelle war aber bisher zum einen eine vereinfachte und damit teilweise realitätsferne Darstellung der komplexen intrazellulären Signalprozesse. Zum anderen war die bei der Modellimplementierung technisch sehr aufwendige Erstellung der mathematischen Gleichungen schwierig. Dies ist besonders gravierend, weil es für solche Anwendungen von Computersimulationen in der biomedizinischen Forschung wesentlich ist, dass ein enger Zusammenhang zwischen dem echten und dem simulierten System (Modell) besteht. Sind die Abstraktionen zu stark, können die Simulationsergebnisse kaum noch mit den experimentellen Daten verglichen werden. Dies birgt zweierlei Gefahren in sich: Es kann sein, dass ein Modell versagt, ohne dass sich die Schwächen des Modelles biologisch analysieren lassen. Dann hat man aus dem Modell nichts lernen können. Zum anderen kann es passieren, dass ein abstraktes Modell gar nicht mehr falsifizierbar ist: Aufgrund der Abstraktion passt es zu einer zu weiten Klasse experimenteller Befunde. Modelle, die nicht falsifizierbar sind, sind wissenschaftlich jedoch nahezu wertlos. Viele Modelle in der mathematischen und auch der computergestützten Biologie sind sehr abstrakt und rechtfertigen dies oft mit dem Hinweis darauf, dass detailliertere Modelle auch detaillierte Daten benötigen, die nicht immer zur Verfügung stehen. Leider führt diese Argumentation in einen Teufelskreis: Abb. 2: Definition zweier wechselwirkender Zellen im Celldesigner. Organische Zellformen können mit Hilfe der Schieberegler auf der linken Seite editiert werden. Änderungen werden in der räumlichen Darstellung in Echtzeit aktualisiert. Eine Durchdringung zweier Zellen wird automatisch vermieden. Für die im Bild türkis gefärbte Zelle wird der Zellkern gezeigt, dessen Form vom Nutzer frei bestimmt werden kann. Experimentatoren messen weniger Details als sie technisch könnten, weil keine Modelle gebaut werden, die diese Details verwenden würden und umgekehrt. Besonders wichtig für das Testen von Hypothesen ist es auch, Modellveränderungen vornehmen zu können: Dabei liegt gerade in der Einführung von Mutationen oder der in silico (also simulierten) Applikation zielgerichteter Inhibition einzelner Signalkomponenten der große Nutzen der Simulationsmodelle. Eine von uns in der Märzausgabe von Nature Methods vorgestellte Methode 2 ermöglicht jetzt erstmals eine Kombination aus morphologisch und biochemisch realistischen Zellmodellen mit einfacher Modellimplementierung und -Simulation und der Möglichkeit, Modelle ohne technische Hürden überwinden zu müssen, an neue Fragestellungen anzupassen. Eine grafische Benutzeroberfläche erleichtert dabei wesentlich die Modelldefinition und Simulation: I Zuerst wird das Signalnetzwerk definiert. Vorteil der neuen Methode ist dabei, dass sie eine effiziente Erstellung auch hochkomplexer Netzwerke erlaubt, da lediglich die Moleküle und die relevanten bi-molekularen Interaktionen manuell definiert werden müssen (Abb. 1). Die Konstruktion sämtlicher möglicher molekularer Komplexe und die Erstellung des eigentlichen Signalnetzwerkes (definiert durch die Gesamtheit der Reaktionen zwischen den Komplexen) erfolgt im Anschluss vollautomatisch. Dies ist einerseits wichtig, weil die Anzahl der möglichen multi-molekularen Komplexe die Zahl der einzelnen Signalmoleküle in der Regel um ein Vielfaches übersteigt und damit deren manuelle Definition von einer gewissen Netzwerkgröße an unpraktikabel und fehleranfällig wird. Des Weiteren wären manuelle Änderungen großer bestehender Signalnetzwerke sehr aufwendig, selbst dann wenn beispielsweise nur das Bindungsverhalten eines einzelnen Proteins verändert werden soll. Denn die Reaktionen für alle Komplexe, in denen das Protein enthalten ist, müssten dann ebenfalls modifiziert werden. Dies bedeutet, dass die automatische Netzwerkgenerierung insbesondere für die computergestützte Erforschung pathologischer Signalpfadveränderungen von Bedeutung ist, da hierfür ausgehend vom physiologischen (gesunden) Ursprungsnetzwerk einzelne oder mehrere Veränderungen in das Modell eingebaut werden müssen. Um etwa den Effekt einer für die Tumormedizin relevanten Kombinationstherapie eines EGFR-Inhibitors mit einem weiteren zielgerichteten Medikament in Zellen mit einer aktivierenden EGF-Rezeptor-Mutation (und ggf. weiteren Mutationen) zu untersuchen, müssen sämtliche beteiligten Komplexe und mathematischen Reaktionsgleichungen angepasst werden. Mit der automatischen Netzwerkgenerierung erfordert dies lediglich eine manuelle Veränderung pro Molekül (anstatt für alle multi-molekularen Komplexe) mithilfe der grafischen Benutzeroberfläche. Diese Methode erlaubt es daher auch biomedizinischen Wissenschaftlern ohne größere Vorkenntnisse in mathematischer oder computergestützter Modellierung, detaillierte Modelle zellulärer Signalprozesse zu erstellen und so zum Beispiel die Effekte von Mutationen in in silico-experimenten zu untersuchen. I Nachdem die Signalkomponenten und ihre gegenseitigen Wechselwirkungen LABORWELT 13. Jahrgang Nr. 2/

20 Automation Simulation/Modellierung Eines der zellulären Signalsysteme, die mit der neuen Methode detailliert untersucht wurden, ist das Reaktionsnetzwerk, das die lokalisierte Stimulation eines Pheromonrezeptors in Hefezellen mit der Aktivierung eines wichtigen Enzyms verbindet, der MAP-Kinase Fus3. Um solche Signale auszutauschen, nehmen die Hefezellen eine charakteristische birnenartige Form an und nähern sich einander an der verjüngten Halsregion, in der dann die Pheromonrezeptoren stimuliert werden. Die Konzentration der Komponenten des Signalnetzwerks in dieser Region führt zu einer sehr effizienten Fus3-Aktivierung, deren Biochemie in einer beispielhaften Studie umfassend quantitativ untersucht wurde 3. Die gemessenen Konzentrationen und molekularen Wechselwirkungsparameter ermöglichten es, ein detailliertes Modell des Netzwerks zu bauen, das dann in eine realistische computergenerierte Zellform eingebettet wurde. Obwohl das modellierte Netzwerk nur ein Dutzend Molekültypen enthält, führt die Tatsache, dass einige von ihnen an mehrere Reaktionspartner gleichzeitig binden und auch in verschiedenen Aktivierungszuständen vorliegen können, zu einer Vielzahl von Komplexkombinationen, deren Reaktionen als ein mathematisches System von mehr als 200 gekoppelten Differentialgleichungen beschrieben werden müssen. Dazu kommt, dass unterschiedliche Bereiche der simulierten Zellen unterschiedliche Reaktionsnetzwerke beinhalten. Während herkömmliche Simulationsmethoden, bei denen jede einzelne Reaktion vom Modellierer spezifiziert werden muss, hier nicht anwendbar gewesen wären, war die neue automatisierte Methode in der Lage, die experimentellen Befunde nicht nur nachzuvollziehen, sondern darüber hinaus zu zeigen, wie wichtig die räumliche Organisation der Signalkomponenten für die effiziente Aktivierung des Fus3-Enzyms ist. Die hier beschriebene Software ist frei verfügbar, funktioniert auf Windows-, Macintosh- und Linux-Computern und kann über die Internetseite der Arbeitsgruppe für computergestützte Zellbiologie am Institut für Allergien und Infektionskrankheiten an den NIH (USA) direkt bezogen werden: Literatur Abb 3: Intrazellulärer Konzentrationsverlauf des aktivierten Fus3-Enzyms in einer simulierten Hefezelle bestimmt sind, wird die Form der Zelle(n), also das morphologische Zellmodell für die Simulationen definiert. Wiederum steht hierfür ein Werkzeug mit grafischer Benutzeroberfläche zur Verfügung. Mit dem Celldesigner (Abb. 2) können nahezu beliebige Zellgeometrien erzeugt werden, so dass ein direkter Vergleich der experimentellen Mikroskopiedaten mit den Ergebnissen der Simulationen möglich wird. Ein großer Vorteil der automatisierten Erzeugung von Signalnetzwerken in der neuen Software ist, dass sich die simulierte Biochemie an sich verändernde zelluläre Formen anpassen kann, ohne dass der Benutzer in den Simulationsablauf eingreifen muss. Das bedeutet, die vorgestellte Methode gestattet es erstmals, realitätsgetreue und dynamische Zellformen mit detaillierter Biochemie in Simulationen zu kombinieren. Des Weiteren ermöglicht die Software eine detaillierte Zuordnung der Signalmoleküle zu verschiedenen (teils durch Diffusionsprozesse kommunizierenden) Zellkompartimenten (membrangebunden oder zytosolisch). Diese Möglichkeit, Rezeptoren spezifischen Membranelementen zuzuweisen und ergänzend zu zytosolischen Molekülen zu betrachten, verbessert die Realitätstreue und damit den praktischen Nutzen der Simulationen. I Schließlich wird die eigentliche Simulation des Modells durchgeführt. Die Simulationsergebnisse können in Echtzeit über eine grafische Benutzeroberfläche visualisiert werden, die die präzise Darstellung der Konzentrationen auswählbarer Signalmo- leküle im Zeitverlauf mit Bezug zur Zellform (Abb. 3) erlaubt. Anwendung [1] Aldridge, B. B., J. M. Burke, et al. (2006). Physicochemical modelling of cell signalling pathways. Nat Cell Biol 8(11): [2] Angermann, B. R., F. Klauschen, et al. (2012). Computational modeling of cellular signaling processes embedded into dynamic spatial contexts. Nat Methods 9(3): [3] Maeder, C. I., M. A. Hink, et al. (2007). Spatial regulation of Fus3 MAP kinase activity through a reactiondiffusion mechanism in yeast pheromone signalling. Nat Cell Biol 9(11): Danksagung Die beschriebene Forschung wurde gefördert vom intra-muralen Forschungsprogramm des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH), USA. Korrespondenzadressen Bastian Angermann 1 bastian.angermann@nih.gov Frederick Klauschen 1,2 Frederick.Klauschen@charite.de Alex D Garcia 1 garciaad@mail.nih.gov Fengkai Zhang 1 zhangfen@niaid.nih.gov Martin Meier-Schellersheim 1 mms@niaid.nih.gov 1 Laboratory of Systems Biology National Institute of Allergy and Infectious Diseases National Institutes of Health Bethesda, Maryland, USA. 2 Institut für Pathologie Charite Universitätsmedizin, Berlin Jahrgang Nr. 2/2012 LABORWELT