True Confocal Scanner Leica TCS SP2. Benutzerhandbuch

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1 Tre Confocal Scanner Leica TCS SP2 Bentzerhandbch

2 ,QKDOWVYHU]HLFKQLV Inhaltsverzeichnis...2 Allgemeines...5 Bentzng dieses Manals...5 Ne in der Beschreibng der Einzelfnktionen...6 Konfokale Bildgebng...6 Hilfe über das Internet...8 Rechtliche Hinweise...9 Sicherheitshinweise...11 Starten des Betriebssystems...25 Einrichten von Bentzern...30 Inbetriebnahme des Konfokalsystems...31 Einstellen der Köhlerbelechtng...40 Pflege nd Reinigng...42 Die Leica Confocal Software: Ein Überblick...44 Öffnen nd Speichern von Datensätzen...46 Menüfnktionen...47 Dateiformate LCS...50 Spezifikation des Dateiformats Lei (Version beta 2.000)...52 Vorgehensweisen nd Übngen z asgewählten Prozessen...61 Afnahmeparameter für die erste Bildafnahme einstellen...61 Afnahmeparameter mit der Bedienkonsole einstellen...67 Bentzerdefinierte Afnahmeparametersätze (IPS) erzegen...72 Rambildserien afnehmen...77 Zeitbildserien afnehmen...86 Lambdaserien (Spektralbildserien) afnehmen...96 Seqentielle Bildserien afnehmen Bildafnahmen von Aswertngsbereichen (ROI-Scan) Allgemeines Einführng in die Hilfe der Leica Confocal Software Kontextsensitive Hilfe öffnen Datenafnahmefnktionen Strahlengang einstellen Aksto-optischen Strahlteiler (AOBS) einstellen (optional) Objektiv aswählen Detektoren einstellen Elektronischer Zoom Vergrößerte Afnahme eines Bildasschnitts Detektionslochblende einstellen Scanformat aswählen Scanmods aswählen Scangeschwindigkeit aswählen Zeitserie einstellen Einmal-Scan starten Endlos-Scan starten Dialogfenster Series Scan Overview Anfangspnkt einer rämlichen Serie definieren Anfangspnkt einer Wellenlängenserie definieren Endpnkt einer rämlichen Serie definieren Endpnkt einer Wellenlängenserie definieren Anzahl der rämlichen Schnitte bestimmen Anzahl der Wellenlängenschritte bestimmen Serien-Scan starten Afnahmeseqenzen konfigrieren Definition eines Bleichexperiments Unidirektionalen oder Bidirektionalen Scan aswählen Phase einstellen Scanfeld drehen...145

3 Afnahmeparameter eines Experiments übernehmen Bildafnahme einer Linie im Mittelngsverfahren Bildafnahme im Brstbetrieb Bildafnahme im Mittelngsverfahren Bildafnahme im Akkmlationsverfahren Bildafnahme mit einer digitalen Aflösng von 8 Bit oder 12 Bit UV-Linsenrad einstellen (option) Laserlinie für Bildhintergrnd aswählen (ROI Scan) Laserlinien für einzelne Aswertngsbereiche aswählen (ROI Scan) XY-Objekttisch steern Datendarstellngsfnktionen Ansichtsfenster Viewer Afnahmen als Miniatransicht im Experiment Browser anzeigen Dialogfenster Viewer Options Anzeigen der Detektionskanäle Bild(er) im Ansichtsfenster Viewer zoomen Farbzordnngstabellen (LUT) aswählen Einzelbild anzeigen Mehrfachbild anzeigen Überlagerngsbild anzeigen Darstellng von Bildserien Projektionen Erzegng von 3D-Ansichten Datenverarbeitng D Projektionen nd Animationen von Bildserien (optional) Arithmetische nd Boolesche Operationen Konvertierng der Bitaflösng von Bildern Verbinden oder Trennen von Bildaschnitten, Bildern nd Bildserien Einstellen von Helligkeit, Kontrast nd Gammakorrektr Erweiterter Foks drch Projektionen von Bildstapeln af ein Einzelbild Lineare Filter nd Morphologische Filter (optional) Nivellieren nd Filtern von Oberflächenafnahmen (optional) Redzieren von Übersprechen zwischen Detektionskanälen Segmentierng von Bildstrktren (optional) Mess- nd Analysefnktionen Histogramm berechnen Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) Messen eines Profils entlang einer Strecke Messen von Oberflächen nd Volmen Qantifizierngsgraphen in die Präsentationsseite kopieren Qantifizierngsgraphen drcken Qantifizierngsdaten exportieren Aswertngsbereich (ROI) als Ellipse definieren Aswertngsbereich (ROI) als Polygon definieren Aswertngsbereich (ROI) als Rechteck definieren Aswertngsbereich (ROI) atomatisch definieren Aswertngsbereich (ROI) markieren nd verschieben Aswertngsbereich (ROI) verschieben nd drehen Aswertngsbereiche (ROI's) löschen Datendokmentation Präsentationsseite anlegen Bild in die Präsentationsseite kopieren Linie in die Präsentationsseite zeichnen Rechteck in die Präsentationsseite zeichnen Textfeld in die Präsentationsseite einfügen Drcken Datenhandling Datei öffnen Datei speichern Datei speichern nter...238

4 Alle Dateien speichern Bentzerspezifische Anpassngen Fnktionen über die Bedienkonsole steern Experiment anlegen Ansichtsfenster Viewer als Vorlage abspeichern Optionale Softwarepakete Materials Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) Anhang Anpassngsfnktion zr Korrektr von Trendverläfen Fnktionsweise der Booleschen Verknüpfngen Glossar Spezifikationen Maße nd Dimensionen Leica TCS SP Index...254

5 $OOJHPHLQHV $OOJHPHLQHV %HQXW]XQJGLHVHV0DQXDOV =XGLHVHP+DQGEXFK Dieses Handbch wrde gleichzeitig als Ttorial wie ach als Referenzhandbch für das Leica TCS SP2 konzipiert nd richtet sich ebenso an den nerfahrenen wie ach an den erfahrenen Bentzer. Falls Sie noch keine Erfahrng mit diesem Gerät haben, sollten Sie mit dem Kapitel "Arbeiten mit der LCS-Software" beginnen, die Software einige Zeit lang verwenden nd anschließend die übrigen Kapitel des Handbchs lesen. Erfahrene Bentzer können die Kapitel, das Inhaltsverzeichnis nd den Index drchsehen, wenn sie Erläterngen z einem bestimmten Thema wünschen. Dieses Handbch erlätert ach, wie die Leica Confocal-Software nd das Leica Mikroskop interagieren. Wie dieses Handbch verwendet wird Wir empfehlen Ihnen, dieses Handbch nicht nr z lesen, sondern es als Arbeitsbch z verwenden. Darüber hinas können Sie es als Ttorial einsetzen, m sich mit der Leica Confocal-Software vertrat z machen. Es erlätert eine ganze Reihe von Afgaben nd ihre Asführng. Gehen Sie die Anweisngen schrittweise drch, m einen möglichst großen Lernerfolg z erzielen. Anweisngen zm Asführen bestimmter Afgaben sind in diesem Handbch drch eine andere Überschrift kenntlich gemacht. Asführen von Afgaben Nach der einleitenden Überschrift wird Ihnen entweder die Vorgehensweise zm Asführen der gewünschten Afgabe erlätert (d.h. drch schrittweise Anleitngen), oder es werden Ihnen verschiedene Optionen afgezeigt, nter denen Sie wählen können: 1. Nmerierte Absätze wie dieser enthalten schrittweise Anleitngen. Befolgen Sie sie, m die Fnktionsweise der Tools z lernen. 2. Wenn mehrere Menübefehle nacheinander aszwählen sind, erscheint zwischen den einzelnen Menübefehlen ein Pfeil: )LOH 6DYHbedetet beispielsweise, dass Sie af File (Datei) klicken nd in dem angezeigten Plldown-Menü die Option Save (Speichern) aswählen sollen. In der Regel wird eine Abfolge von Schritten angegeben. Führen Sie den oder die angegebenen Schritte as, m die gewünschte(n) Aktion(en) aszlösen. Wir empfehlen Ihnen, dieses Handbch noch einmal drchzlesen, nachdem Sie bereits eine Weile mit dem Leica TCS SP2 gearbeitet haben. Sie werden beim zweiten Lesen af nützliche Fnktionen stoßen, die Sie beim ersten Mal übersehen haben. Online-Hilfe Das Leica TCS SP2 ist mit einem kontextsensitiven Hilfesystem asgestattet, das Ihnen die verschiedenen Fnktionen des Systems erlätert. So schen Sie über das Inhaltsverzeichnis der Online-Hilfe nach bestimmten Hilfethemen: Klicken Sie af +HOS &RQWHQWV Die Online-Hilfe wird afgerfen nd zeigt das Dialogfeld CONTENTS (Inhalt) an. Dieses Dialogfeld enthält das Inhaltsverzeichnis in Form eines Verzeichnisbames, der expandiert oder redziert werden kann. Doppelklicken Sie af einen Eintrag des Inhaltsverzeichnisses, m die entsprechenden Informationen anzzeigen. So schen Sie mittels eines Stichworts nach bestimmten Hilfethemen: Klicken Sie af +HOS+LOIH,QGH[ Die Online-Hilfe wird afgerfen nd zeigt das Dialogfeld INDEX (Index) an. Geben Sie den Begriff ein, nach dem Sie schen möchten. Die Online-Hilfe zeigt Ihnen das Stichwort an, das dem angegebenen Begriff am ähnlichsten ist. So schen Sie mittels der Volltextsche nach bestimmten Hilfethemen: Klicken Sie af +HOS+LOIH 6HDUFK6XFKHQ Die Online-Hilfe wird afgerfen nd zeigt das Dialogfeld SEARCH (Schen) an. Geben Sie den Begriff oder Asdrck ein, nach dem Sie schen möchten, nd klicken Sie af die Schaltfläche LIST TOPICS (Themen anzeigen). Es wird Ihnen nn eine hierarchisch gegliederte Liste der Themen angezeigt. Rechts neben dem Feld, in das Sie den Begriff oder Asdrck eingeben haben, befindet sich ein Menü, in dem Sie die Volltextsche nter Verwendng von booleschen Operatoren drchführen können. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 5 von 262

6 $OOJHPHLQHV 1HXLQGHU%HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 3D-Projektionen nd Animationen von Bildserien (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 121) Aksto-optischen Strahlteiler (AOBS) einstellen (Kapitel Datenafnahmefnktionen, Seite 121) Arithmetische nd Boolesche Operationen (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 191) Konvertierng der Bitaflösng von Bildern (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 196) Verbinden oder Trenne von Bildasschnitten, Bildern nd Bildserien (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 197) Einstellen von Helligkeit, Kontrast nd Gammakorrektr (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 201) Erweiterter Foks drch Projektionen von Bildstapeln af ein Einzelbild (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 204) Lineare Filter nd Morphologische Filter (optional) (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 206) Nivellieren nd Filtern von Oberflächenafnahmen (optional) (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 212) Redzieren von optischem Übersprechen zwischen Detektionskanälen (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 216) Segmentierng von Bildstrktren (optional) (Kapitel Datenverarbeitng, Seite 218) Afnahmen als Miniatransicht im Experiment Browser anzeigen (Kapitel Datendarstellng, Seite 155) Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Kapitel Bentzerspezifische Anpassngen, Seite 240) XY-Objekttisch steern (Kapitel Datenafnahme, Seite 150).RQIRNDOH%LOGJHEXQJ :DVLVWNRQIRNDOH0LNURVNRSLH" Bereits 1953 in der Planngsphase, hat sich die konfokale Laser Scanning Mikroskopie erst in den vergangenen 10 Jahren z einer in der Praxis häfig eingesetzten Technik entwickelt. Hete kommt sie in der biologischen Forschng, chemischen Analyse nd Materialprüfng bevorzgt zm Einsatz. Ein Gerät dieser Art vereint in sich die Ergebnisse jahrelanger Forschng nd Entwicklng in vielen verschiedenen Bereichen: Mikroskopie, Lasertechnologie nd Optik für kohärentes Licht, Videotechnologie, Elektronik nd Comptertechnologie. In der konfokalen Mikroskopie werden Strktren erkannt, indem das von einer Probe emittierte oder reflektierte Licht as einer einzigen Fokalebene gebündelt nd sämtliches Licht, das nicht as dieser Ebene stammt, nterdrückt wird. Bei einem konfokalen Pnktscanner fokssieren die Linsen des Mikroskops das Laserlicht af einen einzelnen Pnkt der Probe (der )RNDOSXQNW). Der Laser tastet die Probe nn Pnkt für Pnkt ab nd erzegt so das gescannte Bild. Floreszenzlicht nd Reflexionslicht der Probe werden drch das Objektiv zrückgeleitet. Das Mikroskop nd das optische System des Scan-Modls fokssieren das vom Fokalpnkt emittierte Licht af einen zweiten Pnkt, den.rqirndosxqnw. Drch die am Konfokalpnkt befindliche winzige Öffnng (sog. Pinhole), kann das Licht vom Fokalpnkt in den Detektor gelangen. Aßerfokales Licht gelangt nicht drch die Öffnng. Das konfokale Prinzip wird für die Epifloreszenzmikroskopie schematisch dargestellt. Wie bei konventionellen Epifloreszenzmikroskopen wird eine Linse ebenso als Kondensor wie ach als Objektiv verwendet. Der große Vorteil ist, dass die Notwendigkeit, zwei Linsen exakt miteinander abzgleichen nd gemeinsam aszrichten, entfällt. Ein kollimierter nd polarisierter, drch eine Apertr geleiteter Laserstrahl wird von einem Strahlenteiler (einem dichroitischen Spiegel) in den hinteren Teil der Objektivlinse reflektiert nd af die Probe fokssiert. Das von der Probe zrückreflektierte Licht wird drch dieselbe Linse zrückgeleitet. Der Lichtstrahl wird drch das Pinhole (d.h. die Konfokalöffnng) fokssiert, m af diese Weise alles aßerfokale Licht, d.h., Licht, das von anderen Bereichen der Probe nterhalb oder oberhalb der Fokalebene abgegeben wird, z nterdrücken. Das Volmen der optischen Schnitte, hängt von verschiedenen Parametern wie dem (variablen) Drchmesser der Öffnng nd der Wellenlänge ab. Die innerfokalen Daten jedes Pnktes af der Probe werden von einem lichtempfindlichen Detektor (z.b. einer Photodiode), der hinter der Konfokalöffnng angeordnet ist, afgezeichnet. Das analoge Asgangssignal wird digitalisiert nd an einen Compter weitergeleitet. Bei dem Detektor handelt es sich m einen Pnktdetektor, der nr das Licht von einem Pnkt der Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 6 von 262

7 $OOJHPHLQHV Probe empfängt. Daher kann mit dem konfokalen Mikroskop - im Gegensatz zm konventionellen Mikroskop, bei dem ein größerer Bereich der Probe z sehen ist - z einem Zeitpnkt immer nr ein Pnkt der Probe beobachtet werden. Ein Gesamtbild der Probe ergibt sich daher erst drch das pnktweise Abtasten der Probe, wobei entweder der Lichtpnkt oder die Probe verschoben wird. Diese beiden Möglichkeiten haben z der Entwicklng von zwei nterschiedlichen Typen von konfokalen Mikroskopen geführt: Mikroskope mit beweglichem Objekttisch (Stage-scanning): Der Objekttisch mit der Probe wird nach jeder angefertigten Afnahme ein Stück weitergefahren, während das optische System bei diesem Scannen stehen bleibt. Mikroskope mit Strahlen- oder Spiegeltechnik: Der Lichtpnkt wandert über die feststehende Probe nd tastet sie mit Hilfe von kleinen, schnellen, mit Galvanometern betriebenen Spiegeln, wie sie von LEICA verwendet werden, Pnkt für Pnkt ab. Das LEICA TCS SP2-System ermöglicht es, eine einzelne Fokalebene wie ach eine ganze Reihe von Ebenen horizontal oder vertikal abzbilden. Ein einziger vertikaler Schnitt, oder xz-scan, ermöglicht eine Seitenansicht der Probe. Wird eine Abfolge von optischen Schnitten drch die Probe z einem Bildstapel zsammengesetzt nd anschließend digital verarbeitet, hat das den Vorteil, dass as diesem mehrdimensionalen Datensatz entweder ein berechnetes zweidimensionales Bild (Projektion) erstellt oder eine verkleinerte 3D-Darstellng der Probe af einem geeigneten Compter erzegt werden kann. 2SWLVFKHV$XIO VXQJVYHUP JHQ Der Begriff Aflösng bezieht sich af die Fähigkeit, feinste Details in einer Strktr z nterscheiden. Bei einem idealen Mikroskop wäre das optische System vollkommen frei von jeder Art von Aberration. In einem solchen hypothetischen Instrment würde das Aflösngsvermögen lediglich drch die Begng begrenzt. Man kann dies asdrücken als den kleinsten Abstand zwischen zwei Pnkten in einer Probe, bei dem sie noch immer als zwei getrennte Pnkte gesehen werden (Rayleighkriterim). Über diese Grenze hinas verschmelzen die beiden Pnkte miteinander (d.h. ihre Begngsscheibchen überlappen ganz oder teilweise) nd können nicht mehr als zwei nterschiedliche Pnkte erkannt werden. Dieser Abstand läßt sich as der Größe Begngsbildes eines nendlich kleinen Pnktes der Probe berechnen. Er entspricht dem Radis des ersten Minimms in diesem Begngsbild. Dies wiederm hängt mit den nmerischen Apertren des Objektivs nd des Kondensors zsammen. Die nmerische Apertr wird drch den Brechngsindex der Linse nd die Größe des Lichtkegels definiert, der eindringen kann. Analog z der oben geführten Argmentation kann die axiale Aflösng definiert werden als der Radis des ersten Minimms entlang der Mikroskopachse des Begngsbildes eines Pnktobjekts. Entsprechend der Theorie für derartige 3D-Begngsbilder, ist das optische Aflösngsvermögen entlang der z-achse m den Faktor 2 geringer als das laterale optische Aflösngsvermögen. Die optische Aflösng entlang der z-achse beträgt damit etwa die Hälfte der Aflösng innerhalb der Fokalebene. Bei dem LEICA TCS SP2-Mikroskop handelt es sich m ein echtes Pnkt-Scanning-System mit extrem hoher Empfindlichkeit nd theoretischer x-, y- nd z-aflösng, das keine Kompromisse eingeht. Die Scan-Aflösng bezieht sich af die Bildschärfe, die drch Anzahl nd Größe der Pixel bestimmt wird. Je größer die Anzahl Pixel nd je größer das Scanformat gewählt wird, m so leichter können zwei nah beieinander liegende Objekte nterschieden werden. Die Scan-Aflösng ist af das maximale optische Aflösngsvermögen beschränkt. 'HWHNWLRQ Das konfokale Abbilden, genaer, das Messen der optischen Eigenschaften sehr kleiner Mengen einer Probe, wird nicht nr drch die optische Qalität des Mikroskops beschränkt. Andere Beschränkngen sind: - Kontinierliche Proben werden (afgrnd von Probenentnahme nd digitaler Verarbeitng) nr in getrennten kleinen Probemengen gemessen. - Die Exaktheit mit der diese kleinen Mengen definiert sind, wird drch den Scan-Mechanisms bestimmt. - Die Stärke der Lichtqelle in Relation zm Reflexionsvermögen der Probe. - Die Empfindlichkeit nd das Raschen des Detektors. Ach der Detektor ist eine zentrale Komponente im konfokalen Mikroskop.Afgrnd ihres sehr hohen Signal-z-Raschverhältnisses, setzt LEICA Microsystems Heidelberg Photomltiplier als Detektoren ein. %LOGEHDUEHLWXQJ Bei den ersten konfokalen Mikroskopen war der Detektor an ein Oszilloskop mit nachlechtendem Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 7 von 262

8 $OOJHPHLQHV Phosphor angeschlossen, nd das Bild wrde so anzeigt, wie es gescannt wrde. In den hetigen Geräten wird das Signal znächst digital verarbeitet nd dann von einem Compter afgezeichnet. Dadrch besteht nn die Möglichkeit, das angezeigte Bild af vielfache Weise z verändern. Folgende Möglichkeiten bestehen: - Verstärken der Kontraste drch Schwellwerte, lineare Kontraststreckng nd Gammakorrektr (Krvenverlaf des Bildintensitätswertes vs. graphische Darstellng der Qellenintensität). - Doppelbelichtng von Bildern in Experimenten. - Digitales Filtern zm Vergrößern von Kanten, zm Glätten, Entstören etc. - Rekonstrktion von 3D-Ansichten mit Hilfe von z Bildstapeln zsammengesetzten optischen Schnitten. Dies ermöglicht beispielsweise, die Rekonstrktion eines Bildes einer xz-ebene anhand von Bildstapeln von xy-ebenen. Zdem können vollständige 3D-Modelle der Probe erstellt nd as jeder beliebigen Richtng nterscht werden. - Zsammenstellng von digitalen Filmen anhand von mit dem Mikroskop afgenommenen Zeitserien. - Qantisierng nd Messngen Diese Art der Bildbearbeitng erhöht nicht die Qalität der gesammelten Daten; sie dient jedoch daz, die Sicht z verbessern nd die qalitative Interpretation der Daten z erleichtern. /LFKWTXHOOH Laser eignen sich in der konfokalen Mikroskopie hervorragend als Lichtqellen, da sie sehr helles Licht abgeben nd der Strahl nr eine geringe Abweichng afweist. Darüber hinas sind sie sehr einfach z fokssieren nd stabil in der Intensität. Gerade diese Stabilität ist bei qantitativen Messngen von Bedetng.,QWHJUDWLRQ Das Leica TCS SP2 wrde als ganzheitliches System konzipiert. Alle optischen nd mechanischen Elemente arbeiten nahtlos mit der Compter-Hardware nd -Software zsammen. Die dazgehörige Leica Confocal Software nterstützt den gesamten Prozeß der Bilderstellng, angefangen beim optischen Schneiden über die Bildverarbeitng nd -analyse (die Haptanwendng in der Software) bis hin zm Asdrcken des erstellten Bildes af einem Drcker. +LOIH EHUGDV,QWHUQHW Bitte wenden Sie sich bei Problemen zerst an Ihre Leica-Niederlassng oder Ihren Leica- Vertragshändler vor Ort. Falls Sie Informationen z Leica Microsystems Heidelberg GmbH nd zr konfokalen Mikroskopie wünschen, erhalten Sie diese af nserer Website nter Oder senden Sie ns eine an llt.spport@leica-microsystems.com. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 8 von 262

9 $OOJHPHLQHV 5HFKWOLFKH+LQZHLVH Version 2.1, , Hergestellt in der Bndesrepblik Detschland. Copyright 2001/2002, Leica Microsystems Heidelberg GmbH. Alle Rechte vorbehalten. Diese Pblikation darf ohne die asdrückliche Genehmigng der Leica Microsystems Heidelberg GmbH weder ganz noch teilweise af elektronischem oder mechanischem Weg reprodziert oder weitergegeben werden. Dies schließt ach das Fotokopieren, Afzeichnen oder Speichern af einem abrfbaren System sowie die Übersetzng in eine andere Sprache ein. (,*(17h0(55(&+7( Die in diesem Dokment enthaltenen Daten sind Eigentm der Leica Microsystems Heidelberg GmbH nd stehen asschließlich den Knden dieses Unternehmens z ihrer Sicherheit sowie für einen effizienten Betrieb nd die korrekte Wartng des hierin beschriebenen Prodktes zr Verfügng. Die Verwendng oder Weitergabe von Daten, die Eigentm der Leica Microsystems Heidelberg GmbH sind, mit dem Zweck, sie zr Herstellng oder Reprodktion des hierin beschriebenen Prodktes oder eines ähnlichen Prodktes z verwenden, ist verboten, nd die Ashändigng dieses Dokmentes stellt ach keinerlei Lizenz oder implizite Genehmigng daz dar. h%(5$5%(,781*(181'9(5b1'(581*(1 Leica Microsystems Heidelberg GmbH behält sich das Recht vor, dieses Dokment z überarbeiten nd/oder die hierin beschriebenen Prodkte jederzeit nd ohne vorherige Ankündigng oder sonstige Verpflichtng weiterzentwickeln nd z verbessern. Die Informationen nd technischen Spezifikationen in diesem Handbch können jederzeit nd ohne vorherige Ankündigng geändert werden. *$5$17,( Leica Microsystems Heidelberg GmbH stellt diese Pblikation ohne Mängelgewähr nd ohne Gewähr jedwelcher Art, weder explizit noch implizit, einschließlich aber nicht beschränkt af die implizite Gewähr der Handelbarkeit oder der Eignng für einen bestimmten Zweck, zr Verfügng. Bei der Erstellng dieses Dokmentes wrden alle angemessenen Sicherheitsmaßnahmen getroffen, einschließlich der Drchführng einer Überprüfng der technischen wie nichttechnischen Aspekte. Leica Microsystems Heidelberg GmbH übernimmt keinerlei Gewähr für eventelle Fehler oder Aslassngen. Ebenso ist Leica Microsystems Heidelberg GmbH nicht verantwortlich für direkte, zfällige oder Folgeschäden, die sich as der Verwendng des in diesem Dokment enthaltenen Materials ergeben können. 6&+87=0$5.(181':$5(1=(,&+(1 In diesem Handbch werden Warenzeichen genannt. Statt der Anbringng eines Warenzeichensymbols ( ) an jedem genannten Warenzeichen erklären wir hiermit, dass wir diese Namen lediglich in redaktioneller Art nd Weise nd - zm Ntzen des Warenzeicheninhabers - ohne die Absicht einer Warenzeichenverletzng verwenden. 6,&+(5+(,7 'LHYHUZHQGHWHQ%HJULIIHGHU/DVHUVLFKHUKHLWVNODVVHEH]LHKHQVLFKDXIGDV 1RUPHQZHUN(1) UGHQ*HOWXQJVEHUHLFKGHU&'5+LVWLP7H[WGLH /DVHUNODVVHGXUFK,9GLH/DVHUNODVVH%GXUFK,,,EGLH/DVHUNODVVH$GXUFK,,,$ GLH/DVHUNODVVHGXUFK,,VRZLHGLH/DVHUNODVVHGXUFK,]XHUVHW]HQ Dieses Gerät wrde konzipiert nd hergestellt, m die geltenden Leistngsnormen für Laserprodkte der Klasse 3B z erfüllen, wie sie drch die Normen nd Vorschriften der USHHS CDRH/FDA, OSHA nd EN definiert werden, die zm Zeitpnkt der Herstellng als gültig bekannt waren. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 9 von 262

10 $OOJHPHLQHV Da nicht jede mögliche Gefahrensitation vorasgesehen werden kann, obliegt es dem Anwender, bei Installation, Betrieb nd Wartng des Prodktes sorgfältig nd mit gesndem Menschenverstand vorzgehen nd alle geeigneten Sicherheitsmaßnahmen z treffen, die für Laser der Klasse 3B sowie für elektrische Hochspannngsgeräte gelten. Es empfiehlt sich nicht, von den veröffentlichten Betriebs- oder Wartngsvorgängen abzweichen. Jegliches Abweichen von den vorgegebenen Betriebs- nd Wartngsvorgängen geschieht asschließlich af Risiko des Bentzers. 62)7:$5(/,=(1= Die in diesem Dokment beschriebene Software nterliegt einer Lizenzvereinbarng, die im Prodkt eingeschlossen ist. Diese Vereinbarng erlätert die Bedingngen, nter denen die Verwendng des Prodktes erlabt bzw. verboten ist. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 10 von 262

11 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH Der folgende Abschnitt erlätert die standardmäßigen Sicherheitsmaßnahmen, Warnngen nd Sicherheitshinweise. $OOJHPHLQH6LFKHUKHLWVDQZHLVXQJHQ Ihre Sicherheit steht an erster Stelle. Lesen nd beachten Sie daher alle in diesem Handbch sowie die af dem Gerät angebrachten Warnngen nd Sicherheitshinweise, bevor Sie Leica-Geräte in Betrieb nehmen. Wenn Sie die Sicherheitswarnngen nd Sicherheitshinweise nicht beachten, kann dies z schwerer Körperverletzng sowie z erheblichem Sachschaden am Gerät nd an den Daten führen. hehuqdkphghv5lvlnrvi UGHQ%HWULHEGHU*HUlWH Der Bediener oder Eigentümer des Prodktes übernimmt das Risiko für den Betrieb des Gerätes. Der Eigentümer oder Bediener ist voll haftbar für alle Folgen, die sich ergeben können, wenn das Gerät von anderen als atorisierten Leica-Kndendienstmitarbeitern geöffnet wird, wenn es nicht ordnngsgemäß gewartet oder repariert wird oder wenn es z anderen als den in der begleitenden Dokmentation oder der Online-Hilfe genannten Zwecken eingesetzt wird. Leica Microsystems Heidelberg GmbH haftet für keinerlei Schäden, die as der Nichtbeachtng der oben genannten Informationen resltieren. Die oben genannten Informationen modifizieren in keiner Weise, weder implizit noch explizit, die Gewährleistngs- nd Haftngsklaseln, die in den allgemeinen Geschäftsbedingngen der Leica Microsystems Heidelberg GmbH enthalten sind. :DUQKLQZHLVH6LFKHUKHLWVKLQZHLVHXQG+LQZHLVH Die in diesem Handbch enthaltenen Warnhinweise, Sicherheitshinweise nd Hinweise sind wie folgt gekennzeichnet. (LQHVROFKH:DUQXQJPDFKW6LHDXIHLQHQ%HWULHEVYRUJDQJHLQ9HUIDKUHQHLQH %HGLQJXQJRGHUHLQH$QZHLVXQJDXIPHUNVDPGLHVWULNWEHDFKWHWXQGHLQJHKDOWHQ ZHUGHQPXVVGDDQGHUQIDOOV*HIDKUI U/HLEXQG/HEHQGHU3HUVRQHQEHVWHKWGLHPLW GHP*HUlWDUEHLWHQ (LQVROFKHU6LFKHUKHLWVKLQZHLVPDFKW6LHDXIHLQHQ%HWULHEVYRUJDQJHLQ9HUIDKUHQ HLQH%HGLQJXQJRGHUHLQH$QZHLVXQJDXIPHUNVDPGLHVWULNWEHDFKWHWXQGHLQJHKDOWHQ ZHUGHQPXVVGDHVDQGHUQIDOOV]XVFKZHUHP6DFKVFKDGHQDP*HUlWRGHUGHQ'DWHQ RGHU]XHLQHP'DWHQYHUOXVWNRPPHQNDQQ +LQZHLVHHQWKDOWHQHQWZHGHU]XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQHQ]XHLQHPEHVWLPPWHQ7KHPD RGHUEHVRQGHUH$QZHLVXQJHQ]XU+DQGKDEXQJGHV3URGXNWHVXQWHUHLQHUEHVWLPPWHQ %HGLQJXQJRGHUHLQHU.HWWHYRQ8PVWlQGHQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 11 von 262

12 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH %HVRQGHUH%HGLQJXQJHQGHV$XIVWHOORUWHV Wenngleich die Einhaltng der Grenzwerte bezüglich der Emission elektromagnetischer Strahlng (EMV) drch dieses Gerät getestet wrde, kann ein Restrisiko der Beeinflssng anderer Geräte nicht asgeschlossen werden. 'LHVHV*HUlWGDUIQLFKWLQHLQHP5DXPPLWPHGL]LQLVFKHQ*HUlWHQGLHGHU /HEHQVHUKDOWXQJGLHQHQDXIJHVWHOOWZHUGHQ 9RUMHGHU2UWVlQGHUXQJGHV.RQIRNDOV\VWHPVVROOWHGLHVHVJU QGOLFKJHUHLQLJWZHUGHQ *OHLFKHVJLOWDXFKI UGLH(QWIHUQXQJYRQ7HLOHQ'LHVEHWULIIWLQVEHVRQGHUH6\VWHPH GLHVLFKLQELRORJLVFKPHGL]LQLVFKHQ)RUVFKXQJVODERUVEHILQGHQ 'LHVLVWQ WLJXPHLQHHYWOYRUOLHJHQGH.RQWDPLQDWLRQ]XEHVHLWLJHQXQGGDPLWHLQH 9HUVFKOHSSXQJJHIlKUOLFKHU6XEVWDQ]HQXQG(UUHJHUXQGHLQHGDPLWHLQKHUJHKHQGH *HIlKUGXQJYRQ3HUVRQHQ]XYHUPHLGHQ$FKWHQ6LHGDEHLQLFKWQXUDXI2EHUIOlFKHQ VRQGHUQLQVEHVRQGHUHDXFKDXI9HQWLODWRUHQXQG. KOHLQULFKWXQJHQGDVLFKGRUW EHVRQGHUVKlXILJ6WDXEDQVDPPHOQNDQQ 'LH%HQXW]XQJGHV*HUlWHV]XDQGHUHQDOVGHQDQJHJHEHQHQ=ZHFNHQVRZLHGDV QLFKWDXWRULVLHUWHgIIQHQGHV*HUlWHVNDQQ]XHLQHU*HIlKUGXQJGXUFKHOHNWULVFKH 6SDQQXQJVRZLHGXUFK/DVHUVWUDKOXQJI KUHQ 'LHYHUZHQGHWHQ%HJULIIHGHU/DVHUVLFKHUKHLWVNODVVHEH]LHKHQVLFKDXIGDV 1RUPHQZHUN(1) UGHQ*HOWXQJVEHUHLFKGHU&'5+LVWLP7H[WGLH /DVHUNODVVHGXUFK,9GLH/DVHUNODVVH%GXUFK,,,EGLH/DVHUNODVVH$GXUFK,,,$ GLH/DVHUNODVVHGXUFK,,VRZLHGLH/DVHUNODVVHGXUFK,]XHUVHW]HQ /DVHU.ODVVH Dieses Gerät wrde konzipiert nd hergestellt, m die Leistngsnormen für Laser-Einrichtngen der Klasse 3B z erfüllen, wie sie drch die Normen nd Vorschriften der USHHS, CDRH/FDA, OSHA, EN nd Unfallverhütngsvorschriften VBG 93 definiert wrden, die zm Zeitpnkt der Herstellng gültig waren. Da nicht alle möglichen Gefahrensitationen vom Hersteller vorhersehbar sind, obliegt es dem Anwender, bei Installation, Betrieb nd Wartng des Prodktes sorgfältig nd mit gesndem Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 12 von 262

13 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH Menschenverstand vorzgehen nd alle geeigneten Sicherheitsmaßnahmen z treffen, die für Laser der Klasse 3B sowie für elektrische Hochspannngsgeräte gelten. Abweichen von den vorgegebenen Betriebs- nd Wartngsvorgängen geschieht asschließlich af Risiko des Bentzers. Das Leica TCS SP2 ist harmlos sofern es gemäß den Anweisngen verwendet wird ) UGLH(LQKDOWXQJGHUJHOWHQGHQ6LFKHUKHLWVEHVWLPPXQJHQLVWGHU%HWUHLEHU YHUDQWZRUWOLFK$XV6LFKHUKHLWVJU QGHQLVWGHU$XIHQWKDOWLP/DVHUEHUHLFKQXU HLQJHZLHVHQHP/HLFD6HUYLFHSHUVRQDO]XOlVVLJ 7HFKQLVFKH6LFKHUKHLWVPD QDKPHQ Gemäß den Verordnngen zr Laser-Sicherheit, EN (eropäische Norm) nd CDRH (US- Norm), ergreift Leica Microsystems Heidelberg GmbH verschiedene Sicherheitsmaßnahmen. Warnetiketten wrden an allen Öffnngen oder entfernbaren Teilen angebracht, an denen es möglicherweise z einem Astritt von Laserlicht kommen kann. Darüber hinas wrden mehrere /DVHU6LFKHUKHLWVVFKDOWHU montiert. Beachten Sie die Vorgabe der Norm EN : "Sicherheit von Laser-Einrichtngen, Teil 1. Geräteklassifikation, Anforderngen nd Bentzerhandbch", wonach für Installationen, in denen Geräte der Klasse 3B verwendet werden, ein Beaftragter für Laser-Sicherheit (Laser Safety Officer) oder ein Laserschtz-Berater (Laser Protection Advisor) z ernennen ist. Es liegt in der Verantwortng des Betreibers, geeignete Kontrollen für den Einsatz des Gerätes festzlegen nd diese z überarbeiten. 6HKHQ6LHQLHPDOVGLUHNWLQHLQHQ/DVHUVWUDKORGHUHLQH5HIOH[LRQGHV/DVHUVWUDKOV 6HW]WPDQVLFKHLQHP/DVHUVWUDKODXVNDQQGLHVGDV6HKYHUP JHQLUUHSDUDEHO VFKlGLJHQ(LQUHIOHNWLHUWHU/DVHUVWUDKOLVWHEHQVRLQWHQVLYZLHHLQGLUHNWHU6WUDKO 'HU%HQXW]HULVWMHGHU]HLWI UGHQVLFKHUHQ%HWULHEXQGGLHVLFKHUH:DUWXQJGLHVHV *HUlWHVYHUDQWZRUWOLFK'LH(LQVWXIXQJDOV/DVHU(LQULFKWXQJGHU.ODVVH%XQGGLH (UI OOXQJGHU9RUVFKULIWHQ]XUHOHNWULVFKHQ6LFKHUKHLWLVWQXUGDQQJHZlKUOHLVWHWZHQQ DOOH6LFKHUKHLWVYRUULFKWXQJHQYHUULHJHOXQJHQXQGV\VWHPH]XP(LQVFKOLH HQGHV /DVHUVLQEHWULHEVEHUHLWHP=XVWDQGVLQGXQGDUEHLWHQ'XUFKGHDNWLYLHUWHRGHU EHVFKlGLJWH6LFKHUKHLWVYRUULFKWXQJHQRGHUV\VWHPHGDV3HUVRQDOHLQHU/DVHUVWUDKOXQJ GHU.ODVVH%DXVJHVHW]WZHUGHQGLHVWDUNJHQXJLVWXPVFKZHUH$XJHQYHUOHW]XQJHQ 9HUEUHQQXQJHQRGHU6DFKVFKlGHQ]XYHUXUVDFKHQ -HJOLFKHU(LQJULIILQHLQHVGHU6LFKHUKHLWVV\VWHPHXQGRGHUHLQHUGHU 6LFKHUKHLWVYHUULHJHOXQJHQRGHUMHJOLFKH'HDNWLYLHUXQJHLQHVGHU6LFKHUKHLWVV\VWHPH XQGRGHUHLQHUGHU6LFKHUKHLWVYHUULHJHOXQJHQKDW]XU)ROJHGDVVGHU*DUDQWLHDQVSUXFK YHUIlOOW Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 13 von 262

14 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH $QVFKOXVVNDEHO Das im Liefermfang Ihres Gerätes enthaltene Set von Anschlsskabeln erfüllt die Anforderngen des Landes, in dem Sie das Gerät erworben haben. Falls Sie das Gerät in einem anderen Land einsetzen, müssen Sie Anschlsskabel verwenden, die die Anforderngen des entsprechenden Landes erfüllen. )ROJHQGH%HVFKDOWXQJLVWYRP+HUVWHOOHUYRUJHVFKULHEHQ Das Anschlsskabel des Mikroskops mss in die mitgelieferte Steckerleiste eingesteckt werden. Falls eine Hg-Hochdrcklampe verwendet wird, so sollte diese an einem separaten Netzanschlss angeschlossen werden. Dies verhindert, dass sie ständig gemeinsam mit dem Steerrechner nd der Scanelektronik ein- nd asgeschaltet wird nd erhöht somit die Lebensdaer der Belechtngsqelle. 'LHVHV*HUlWZXUGHI UGHQ$QVFKOXVVDQHLQHJHHUGHWH6WHFNGRVHNRQ]LSLHUW'HU (UGXQJVVWHFNHULVWHLQHZLFKWLJH6LFKHUKHLWVIXQNWLRQ8P5LVLNHQZLHHOHNWULVFKH 6FKOlJHRGHU6DFKVFKlGHQ]XPLQGHUQGDUIGLHVH)XQNWLRQQLFKWGHDNWLYLHUWZHUGHQ 8P5LVLNHQZLH%UDQGJHIDKUXQGHOHNWULVFKH6FKOlJH]XPLQGHUQGDUIGDV*HUlW QLHPDOV5HJHQRGHU)HXFKWLJNHLWDXVJHVHW]WZHUGHQgIIQHQ6LHDXINHLQHQ)DOOGDV *HKlXVH'LHJHVDPWH:DUWXQJGDUIDXVVFKOLH OLFKYRQHLQHPYRQ/HLFDDXWRULVLHUWHQ 7HFKQLNHUDXVJHI KUWZHUGHQ (VGDUINHLQHUOHL)O VVLJNHLWLQGDV*HUlWHJHKlXVHHLQGULQJHQQRFKG UIHQGLH HOHNWULVFKHQ.RPSRQHQWHQPLW)O VVLJNHLWLQ.RQWDNWNRPPHQ'DV*HUlWPXVV YROOVWlQGLJWURFNHQVHLQEHYRU6LHHVDQGDV6WURPQHW]DQVFKOLH HQRGHUHV HLQVFKDOWHQ $OOJHPHLQH6LFKHUKHLWVKLQZHLVH In Übereinstimmng mit den allgemeinen Sicherheitsverordnngen sowie den Sicherheitsverordnngen bezüglich Lasergeräte sollten Sie folgende Anweisngen befolgen: Beachten Sie die Anweisngen für den Betrieb des Gerätes! Verwenden Sie dieses Prodkt nr gemäß den in diesem Handbch sowie in der Online-Hilfe der Leica Confocal Software enthaltenen Informationen. Lesen Sie erst alle Anweisngen für den Betrieb des Gerätes sorgfältig drch, bevor Sie das System starten. Als Vorbereitng af die einzelnen von Ihnen aszführenden Arbeitsschritte sollten Sie sich immer zerst die entsprechende Beschreibng der Fnktion in der Online-Hilfe drchlesen nd vor allem die Sicherheitsvorschriften beachten, die die Handhabng des Systems betreffen. Eine Übersicht über die einzelnen Fnktionen finden Sie im Inhaltsverzeichnis der Online-Hilfe. Verwenden Sie dieses Prodkt asschließlich für die in diesem Handbch sowie in der Online-Hilfe der Leica Confocal Software beschriebenen Zwecke. Das System wrde für das Erstellen von konfokalen Laser Scan-Bildern nd qantitativen Messngen im Bereich der Werkstoffknde asgelegt. Jeglicher Einsatz des Leica TCS SP2 z anderen Zwecken oder in anderen Anwendngen gilt als nsachgemäßer nd nzlässiger Gebrach. Der Bentzer übernimmt das volle Risiko für alle Experimente, die mit diesem System drchgeführt werden, sowie Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 14 von 262

15 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH für die Folgen, die sich as diesen Experimenten ergeben. Dies gilt vor allem dann, wenn das Gerät vom Bentzer geöffnet oder modifiziert wrde. Befolgen Sie die Wartngsanweisngen. Bitte lesen Sie hierz das Kapitel 'Pflege nd Reinigng' in diesem Handbch drch. Führen Sie an dem Gerät keine Eingriffe drch, die nicht in diesem Handbch oder nachträglich zgestellter Handbchergänzngen beschrieben sind. Asschließlich von Leica Microsystems Heidelberg GmbH atorisierten Kndendiensttechnikern ist es erlabt, Reparatren nd Serviceeingriffe aszführen. Schließen Sie an das Prodkt nr solche elektrischen Geräte an, die in dieser Begleitdokmentation genannt werden. Schließen Sie niemals andere, in dieser Dokmentation nicht genannte Geräte an. Wenden Sie sich bitte, bevor Sie an das Prodkt irgendeines dieser Geräte anschließen, an Ihre Leica-Serviceagentr vor Ort oder direkt an Leica Microsystems Heidelberg GmbH. Verwenden Sie keinen Mikroskopkondensor S70. Drch den großen Arbeitsabstand nd die geringe nmerische Apertr des S70-Kondensors, könnte es im ngünstigen Fall nter Umgehng von Sicherheitshinweisen (siehe "Besondere Sicherheitshinweise für Bentzer) z einer nzlässig hohen Laserstrahlenbelastng kommen. Verwenden Sie daher nr die Leica Kondensoren S1 nd S23. Besondere Sicherheitshinweise für Bentzer Leica Microsystems Heidelberg GmbH hat drch spezielle Sicherheitsmaßnahmen gemäß verschiedenen Sicherheitsverordnngen alles nr mögliche nternommen, m die Sicherheit des Bentzers z maximieren nd Gesndheitsrisiken z minimieren. Der Bentzer hat das TCS SP2 gemäß den Anweisngen z betreiben, m seine eigene Sicherheit z gewährleisten. Im folgenden werden verschiedene wichtige Pnkte afgeführt: Objektive niemals während eines Scan-Vorgangs astaschen So taschen Sie Objektive korrekt as: Vergewissern Sie sich, dass der Scan-Mods asgeschaltet ist. Stellen Sie sicher, dass sich kein Laserlicht in der Fokalebene befindet. Drehen Sie den Objektivrevolver, so dass sich das asztaschende Objektiv aßerhalb der optischen Achse befindet nd nach aßen zeigt. Gehen Sie vorsichtig vor nd üben Sie keine Kraft af den Objektivrevolver as, da dies bei Objektivscannern daerhaft z einer Verminderng der Aflösng führen kann. Schraben Sie das nee Objektiv ein, nd drehen Sie den Objektivrevolver, so dass es wieder innerhalb der optischen Achse z liegen kommt. Alle nbentzten Positionen af dem Objektivrevolver sind mit einer Abdeckng z versehen! Niemals während des Scan-Vorgangs Objekte in den Strahlengang des Lasers halten! Legen Sie die Probe ordnngsgemäß in den Probenhalter! Niemals die Probe während eines Scan-Vorgangs astaschen! So taschen Sie die Probe korrekt as: Vergewissern Sie sich, dass der Scan-Mods asgeschaltet ist. Stellen Sie sicher, dass sich kein Laserlicht in der Fokalebene befindet. Schließen Sie die Sicherheitsklappe am Tbs. Taschen Sie nn die Probe as. /DVHU6LFKHUKHLW Bei dem Begriff 'LASER' handelt es sich m ein as /ight $mplification by 6timlated (mission of 5adiation gebildetes Knstwort. Der erste Laser wrde 1960 vorgestellt nd arbeitete mit einem Rbin als Lasermedim. Laser werden mittlerweile in sehr vielen verschiedenen Bereichen eingesetzt, in der Chirrgie ebenso wie bei Strichcodelesern an Spermarktkassen, in Laser Pointern, Laserdrckern oder in CD-Spielern. Laser können einen sehr intensiven nd sehr feinen (kollimierten) Strahl elektromagnetischer Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 15 von 262

16 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH Strahlng in einem Wellenlängenbereich von 150 nm bis 1 mm erzegen. Diese Strahlng zeigt sich in der Regel in Form eines sehr intensiven Lichts. Da es sich beim Laserlicht nicht m einen ionisierenden Strahlngstyp handelt, verläft die Interaktion mit Materie in der Regel an der Oberfläche. Das Age nd die Hat sind Organe, die sehr empfindlich reagieren, wenn sie der Laserstrahlng asgesetzt werden. Die Aswirkngen der Laserstrahlen af diese beiden Organe variieren dabei nd hängen vom Typ des Lasers (Wellenlänge der Strahlng) nd der Leistng des Strahls ab. Eine Laserenergie mit entsprechender Wellenlänge nd Leistng kann von der Linse des Ages af die Retina fokssiert werden nd dort z schweren, irreparablen Verletzngen führen. Wenn die Leistng der Laserstrahlng hoch geng ist, kann es, wenn Gliedmaßen oder andere Körperteile dem Laserstrahl asgesetzt werden, z Verbrennngen der Hat kommen. Die nachfolgende Tabelle faßt die verschiedenen Bereiche des von Lasern prodzierten elektromagnetischen Spektrms zsammen nd zeigt af, welche Organe beim Kontakt mit dem Laserstrahl gefährdet sind. 6SHNWUDOEHUHLFK :HOOHQOlQJH %HWURIIHQHV2UJDQ UV-C 100 nm bis Vollständig absorbiert von Kornea nd Konjnktiva 280 nm Ultraviolett UV-B 280 nm bis 320 nm Fast vollständig absorbiert von Kornea (Hornhat) nd Konjnktiva (Bindehat) UV-A 320 nm bis Linse (Linsentrübng) 380 nm Sichtbar 380 nm bis 760 nm Retina (Netzhat) IR-A 760 nm bis Retina, Linse, Hat 1400 nm Infrarot IR-B 1400 nm bis Kornea nd Hat 3000 nm IR-C 3000 nm bis 10 6 nm Kornea nd Hat Laser werden häfig nach Art des Lasermedims gekennzeichnet. Die Unterteilng in Laser- Gefahrenklassen richtet sich nach der/den Wellenlänge(n), der maximalen Daer der Bestrahlng nd der drchschnittlichen Leistng des Lasers. /DVHU*HIDKUHQNODVVHQ 'LUHNWHV+LQHLQVFKDXHQLQGHQ/DVHUVWUDKOVROOWHJUXQGVlW]OLFKYHUPLHGHQZHUGHQ JOHLFKJ OWLJXPZHOFKHQ/DVHUW\SHVVLFKKDQGHOWXQGZLHQLHGULJGLH/HLVWXQJGHV /DVHUVVHLQPDJ.ODVVH Ungefährliche Laser (meist gekapselt)..odvvh Sichtbare Laser mit niedriger Leistng, die afgrnd des Lidschtzreflexes normalerweise ngefährlich sind, es sei denn, man blickt direkt in den Laserstrahl..ODVVH$ Laser, die bei zfälligem, krzzeitigem Hineinschaen in den Laserstrahl normalerweise ngefährlich sind; diese Laser können jedoch dann eine Gefahr darstellen, wenn eine Kollektoroptik verwendet wird..odvvh% Laser, die beim direkten Hineinschaen in den Laserstrahl oder beim Hineinschaen in den spiegelnd reflektierten Strahl Agenverletzngen verrsachen können..odvvh Laser, die beim Hineinschaen in den direkten Strahl, den spiegelnd reflektierten Strahl oder in die diffse Reflexion (Streng) Agenverletzngen oder Hatverbrennngen verrsachen können. Es kann Brandgefahr entstehen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 16 von 262

17 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH *HNDSVHOWH6\VWHPH Laser-Einrichtngen oder Lasersysteme der Klassen 2, 3A, 3B oder 4, die in einem Schtzgehäse ntergebracht sind nd in einem niedrigeren Klassifizierngsmods betrieben werden, können in einer niedrigeren Klasse eingestft werden. Es können besondere Kontrollmaßnahmen erforderlich werden, m diese niedrigere Klassifizierng beizbehalten. 9RQ/DVHUQDXVJHKHQGH*HIDKUHQ Die Gefahren, die von Laser-Einrichtngen asgehen können, lassen sich in folgende Haptgrppen nterteilen: 1. Agenverletzngen, z.b. Verbrennngen der Retina oder Kornea. 9(5/(7=81*(1'(55(7,1$6,1',55(3$5$%(/ 2. Hatverletzngen, z.b. Verbrennngen. 3. Elektrische Gefahren, die von Hochspannngsgeräten asgehen. 4. Brand- nd Explosionsgefahr. 6SH]LILNDWLRQGHUYHUZHQGHWHQ/DVHUVWUDKOXQJ /DVHUW\S :HOOHQOlQJHÃ 0D[LPDOHÃ/LFKWOHLVWXQJÃDPÃ 0D[LPDOHÃ/LFKWOHLVWXQJÃLQÃ 3XOVGDXHU >QP@ /DVHUDXVJDQJÃ>P:@ GHUÃ)RNDOHEHQHÃ>P:@ Ar-UV 351, 364 < 50 < 2.5 continos wave (ngeplst, Daerstrich) Diode 405 < 25 < 4 continos wave (ngeplst, Daerstrich) Diode 430 < 10 < 4 continos wave (ngeplst, Daerstrich) HeCd 442 < 30 < 3 continos wave (ngeplst, Daerstrich) ArKr 488, 568, 647 < 125 < 10 continos wave (ngeplst, Daerstrich) Ar 458, 476, 488, 514 < 200 < 50 continos wave (ngeplst, Daerstrich) HeNe 543 < 1.5 < 0.5 continos wave (ngeplst, Daerstrich) Kr 568 < 25 < 5 continos wave (ngeplst, Daerstrich) HeNe 633 < 15 < 4 continos wave (ngeplst, Daerstrich) )ROJHQGH/DVHUVLFKHUKHLWVNHQQ]HLFKHQZHUGHQYHUZHQGHW DQDOOHQgIIQXQJHQDXVGHQHQ/LFKWDXVWUHWHQNDQQ Für Laser, die im sichtaren Spektralbereich Für Laser, die im ltravioletten Spektralbereich emittieren emittieren (Ar/ ArKr/ Kr/ HeNe/ HeCd/ Diode) (Ar-UV) / $ 6 ( 5 5 $ ', $ 7, 2 1, 6 ( 0, 7 7 ( ' ) , 6 $ 3 ( ( $ 9 2, ' ( ; ( 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' )520Ã7+,6Ã$3(5785( $92,'Ã(;32685( Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 17 von 262

18 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' )520Ã7+,6Ã$3(5785( $92,'Ã(;32685( 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' )520Ã7+,6Ã$3(5785( $92,'Ã(;32685( DQDOOHQ*HKlXVHWHLOHQGLHPLW:HUN]HXJHQJH IIQHWZHUGHQN QQHQXQGDXVGHQHQ /DVHUVWUDKOXQJDXVWUHWHQNDQQ Für Laser, die im sichtaren Spektralbereich emittieren (Ar/ ArKr/ Kr/ HeNe/ HeCd/ Diode) Für Laser, die im ltravioletten Spektralbereich emittieren (Ar-UV) '$1*(5 /$6(5Ã5$',$7,21Ã:+(1Ã23(1 $92,'Ã(;32685(Ã72Ã%($0 '$1*(5 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21Ã:+(1Ã23(1 $92,'Ã(;32685(Ã72Ã%($0 DXIGHP'HFNHOGHU9HUVRUJXQJVHLQKHLW Für Laser, die im sichtaren Spektralbereich emittieren (Ar/ ArKr/ Kr/ HeNe/ HeCd/ Diode) Für Laser, die im ltravioletten Spektralbereich emittieren (Ar-UV) /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã+H1HÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$U.UÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$5*21ÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 18 von 262

19 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã.5<3721ÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$U.U+H1HÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$U.U+H1H+H&GÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 3RVLWLRQGHU/DVHUVLFKHUKHLWVNHQQ]HLFKHQ,QYHUVHV0LNURVNRS Position 1 für System OHNE UV-Laser /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( für Systeme MIT UV-Laser Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 19 von 262

20 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( Position 2 für Systeme OHNE UV-Laser /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( für Systeme MIT UV-Laser 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( $XIUHFKWHV0LNURVNRS Position 1 für Systeme OHNE UV-Laser /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( für Systeme MIT UV-Laser Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 20 von 262

21 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( Position 2 für Systeme OHNE UV-Laser /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( für Systeme MIT UV-Laser 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21,6Ã(0,77(' $92,'Ã(;32685( )520Ã7+,6Ã$3(5785( 6FDQNRSI Position 1 nd 2 für Systeme OHNE UV-Laser '$1*(5 /$6(5Ã5$',$7,21Ã:+(1Ã23(1 $92,'Ã(;32685(Ã72Ã%($0 für Systeme MIT UV-Laser '$1*(5 9,6,%/(Ã$1'Ã,19,6,%/( /$6(5Ã5$',$7,21Ã:+(1Ã23(1 $92,'Ã(;32685(Ã72Ã%($0 9HUVRUJXQJVHLQKHLW'HFNHO Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 21 von 262

22 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH Position 1 '$1*(5 /$6(5Ã5$',$7,21Ã:+(1Ã23(1 $92,'Ã(;32685(Ã72Ã%($0 für Systeme mit HeNe-Laser /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã+H1HÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 Für Systeme mit ArKr-Laser /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$U.UÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 Für Systeme mit Ar-Laser /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$5*21ÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 Für Systeme mit Kr-Laser /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã.5<3721ÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 Für Systeme mit HeNe-Laser, Ar-Laser nd Kr-Laser /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$U.U+H1HÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 Für Systeme mit HeNe-Laser, HeCd-Laser, Ar-Laser nd Kr-Laser /$6(55$',$7,21 $92,'Ã',5(&7Ã(;32685(Ã72Ã%($0 ÃÃP:Ã$U.U+H1H+H&GÃÃQP &/$66Ã,,,EÃ/$6(5Ã352'8&7 Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 22 von 262

23 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH 6\VWHP EHUEOLFN $XIUHFKWHV0LNURVNRS 7 Diode Laser 430 nm, 10 mw option 7 HeCd Laser 442 nm, 30 mw option Ar Laser 488/514 nm, 150 mw HeNe Laser 633 nm, 15 mw 12 option 13 1 IR port HeNe Laser 543 nm, 1.5 mw Kr Laser 568 nm, 25 mw ArKr Laser nm, 125 mw 12 option option Ã/DVHUÃÃÃP: 7L6DSSKLUH 89Ã/DVHUÃÃP: $U,RQ SP2_FDA.fh $XIUHFKWHV0LNURVNRSVWDWLY2EMHNWLYH0LNURVNRS3UREHQWLVFK.RQGHQVRU 'XUFKOLFKWGHWHNWRUQRQGHVFDQQHG890RGXODWRUQXUI U896\VWHPH/DVHUVLFKHUKHLWV 6KXWWHUJHNDSVHOWH/LFKWOHLWIDVHUQDOOH/LFKWOHLWIDVHUQGLH]XP6FDQNRSII KUHQ 6WUDKOYHUHLQLJXQJ9,60RGXODWRU6FDQNRSI/DVHUER[2NXODUH Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 23 von 262

24 6LFKHUKHLWVKLQZHLVH,QYHUVHV0LNURVNRS FDAinverted.FH5,QYHUVHV0LNURVNRSVWDWLY2EMHNWLYH0LNURVNRS3UREHQWLVFK.RQGHQVRU $OXPLQLXPVFKHLEHDOV6WUDKOIlQJHU6FKXW]K OVH]ZLVFKHQ.RQGHQVRUXQG'XUFKOLFKWGHWHNWRU $QVFKOX I U6FDQNRSI6FDQNRSIGHUVHOEHZLHEHLPDXIUHFKWHQ0LNURVNRSVWDWLY Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 24 von 262

25 ,QEHWULHEQDKPH 6WDUWHQGHV%HWULHEVV\VWHPV Das Betriebssystem wird atomatisch gestartet, sobald Sie Ihren PC einschalten. Als erstes sehen Sie einen Begrüßngsbildschirm. Melden Sie sich nn bei Ihrem Compter an. Wie Sie den Anweisngen in dem angezeigten Dialogfeld entnehmen können, melden Sie sich drch gleichzeitiges Hernterdrücken der Tasten &WUO, $OW nd 'HOHWH beim System an. Sobald Sie die Tasten Ctrl, Alt nd Delete gedrückt haben, öffnet sich das Dialogfeld /RJLQ Information. Geben Sie hier Ihr Kennwort ein, mit dem Sie sich als gültiger Bentzer dieses Compters identifizieren. Der Standardbentzername für das Leica TCS SP2 System latet "TCS_User". Ein Standardkennwort ist nicht eingestellt. Es empfiehlt sich, für jeden Bentzer eine eigene Bentzer-ID einzrichten (Systemadministrator). Es werden dabei persönliche Verzeichnisse angelegt, die nr vom jeweiligen Bentzer gelesen werden können. Da die LCS-Software af der Bentzerverwaltng des Betriebssystems afbat, werden ach für die Verwaltng bentzerspezifischer Profile der LCS Software eigene Dateien angelegt. Zm Einrichten von Bentzern sei af das Kapitel "Einrichten von Bentzern" in diesem Handbch verwiesen, Sobald Sie sich mit ihrer Bentzer-ID angemeldet haben, können Sie Ihr Kennwort ändern. Drücken Sie hierz die Tasten &WUO, $OW nd 'HOHWH gleichzeitig. Klicken Sie anschließend af &KDQJHSDVVZRUG. Es öffnet sich das Dialogfeld &KDQJHSDVVZRUG. Geben Sie im Feld 2OG3DVVZRUG Ihr aktell gültiges Kennwort ein (das Feld zr Kennworteingabe ist Groß-/kleinschrift-empfindlich, achten Sie daher daraf, ob Sie Groß- oder Kleinbchstaben verwenden). Drücken Sie anschließend die Tablator-Taste. Drch Drücken der Tablator-Taste springt der Crsor in das nächste Feld. Geben Sie nn Ihr nees Kennwort ein, nd drücken Sie anschließend noch einmal die Tablator- Taste. Geben Sie das nee Kennwort nn zr Bestätigng ein zweites Mal ein. Af diese Weise werden Tippfehler asgeschlossen. Dies ist vor allem deshalb sehr wichtig, weil die Zeichen, die Sie eintippen, af dem Bildschirm nr als Sternchen erscheinen. )DOOV6LHGDV.HQQZRUWEHLGHU%HVWlWLJXQJIDOVFKHLQJHJHEHQKDEHQZLUGQXQHLQH :DUQXQJDQJH]HLJW9HUVXFKHQ6LHHVQRFKHLQPDO Klicken Sie anschließend af OK. Wenn Sie sich das nächste Mal anmelden, ist Ihr nees Kennwort wirksam. %HDFKWHQ6LH:HQQ6LHHLQ.HQQZRUWHLQJHJHEHQKDEHQG UIHQ6LHHVDXINHLQHQ)DOO YHUJHVVHQ2KQHGDVNRUUHNWH.HQQZRUWKDEHQ6LHNHLQHQ=XJULIIPHKUDXI,KUHQ &RPSXWHU Es wird nn das Dialogfeld Welcome angezeigt. Nehmen Sie sich einen Moment Zeit, m den Tip "Did yo know..." z lesen, nd klicken Sie dann af die Schaltfläche &ORVH, m mit der Arbeit mit dem Betriebssystem z beginnen. $UEHLWHQPLWGHU0DXV Um das Betriebssystem wirklich effizient verwenden z können, benötigen Sie eine Mas. Folgende Mas-Aktionen müssen Sie kennen: =HLJHQ6LHDXI bedetet, dass Sie den Crsor (der bei Bewegngen mit der Mas die Form eines Pfeils annimmt) af das angegebene Objekt setzen sollen, indem Sie die Mas bewegen. Die Spitze des Pfeils mss das Objekt berühren. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 25 von 262

26 ,QEHWULHEQDKPH.OLFNHQ6LHDXIbedetet, dass Sie den Crsor wie oben beschrieben af ein angegebenes Objekt setzen nd dann die Mastaste einmal krz hernterdrücken nd wieder loslassen sollen. Sofern nicht anders angegeben, verwenden Sie daz immer die linke Mastaste (andernfalls werden Sie beispielsweise angewiesen, mit der rechten Mastaste z klicken). Indem Sie ein Objekt anklicken, wählen Sie es normalerweise as. 'RSSHONOLFNHQ6LHDXI bedetet, dass Sie den Crsor wie oben beschrieben af ein angegebenes Objekt setzen nd dann zweimal krz hintereinander die Mastaste hernterdrücken nd wieder loslassen sollen. Drch Doppelklicken wird ein Objekt in der Regel aktiviert. =LHKHQ6LH bedetet, dass Sie den Crsor af ein Objekt setzen, die Mastaste hernterdrücken nd die Mas, während Sie die Mastaste gedrückt halten, an eine andere Stelle bewegen sollen. Sofern nicht anders angegeben, verwenden Sie daz immer die linke Mastaste (andernfalls werden Sie beispielsweise angewiesen, mit der rechten Mastaste z ziehen). 'LH%HQXW]HUREHUIOlFKHGHV%HWULHEVV\VWHPV Die Basis-Bentzeroberfläche des Betriebssystems wird als "'HVNWRS" bezeichnet. Der Desktop bildet den Hintergrnd für die darin enthaltenen Objekte. Die Asgangsobjekte af dem Desktop ermöglichen es dem Bentzer, mit dem System af logische Art z interagieren nd die Objekte des Systems anzzeigen. Der Hintergrnd, vor dem alle Bilder nd Dialogfelder abgebildet sind, wird als Desktop bezeichnet. In der Task-Leiste werden alle gegenwärtig afgerfenen Fenster nd Programme angezeigt. Sie können zwischen den einzelnen Fenstern nd Programmen wechseln, indem Sie af den entsprechenden Namen in der Task-Leiste klicken. Die Schaltfläche Start öffnet ein Menü, über das Sie die gewünschten Programme starten. Klicken Sie af die Schaltfläche Start. Das sich öffnende Menü enthält verschiedene Menüoptionen mit einzelnen Untermenüs. Klicken Sie af die gewünschte Option. Weiterhin stehen Ihnen af dem Desktop einige Symbole zr Verfügng. Sie aktivieren ein solches Symbol, indem Sie daraf doppelklicken. Im folgenden werden krz die einzelnen Objekte erlätert, die Sie af dem Desktop sehen. Z den Standardobjekten af dem Desktop gehört das Symbol 0\&RPSXWHU. Wenn Sie af dieses Symbol GRSSHONOLFNHQ, öffnet sich das Fenster My Compter. Über das Fenster 'My Compter' haben Sie leichten Zgriff af die Haptkomponenten Ihres Comptersystems oder Ihrer Arbeitsstation, so z.b. af die Festplatte(n) oder die Diskettenlafwerke. Wenn Sie beispielsweise af das Symbol +DUGGLVN>&@ doppelklicken, wird Ihnen der Inhalt der Festplatte Ihres PC angezeigt. Af diese Weise hat der Bentzer die Möglichkeit, lokale Ressorcen als Objekte anzzeigen. Aßerdem können Sie vom Fenster 'My Compter' ach af die Systemsteerng (Symbol Control Panel) nd den Drcker des Steerrechners zgreifen, falls ein Drcker installiert wrde. Falls Sie während der Installation eine der lokalen Zsatzanwendngen wie 'Dial-Up Networking' installiert haben, erscheint diese ach im Fenster 'My Compter'. Über das Symbol &RQWURO3DQHO im Fenster My Compter können Sie zdem jede beliebige Systemkomponente anzeigen nd verändern. Das Fenster Control Panel enthält seinerseits ebenfalls zahlreiche Symbole, die es Ihnen ermöglichen, Ihr System z steern. Möglicherweise sehen Sie af Ihrem PC noch andere, hier nicht erläterte Symbole. Der Grnd dafür kann sein, dass Sie z.b. eine andere Hardware installiert haben oder dass Sie eventell an ein Modem oder ein Netzwerk angeschlossen sind. Ein weiterer Grnd kann ach sein, dass Sie andere Betriebssystem-Optionen installiert haben. Wenn Sie af das Symbol 1HWZRUN1HLJKERUKRRG doppelklicken, öffnet sich das Dialogfeld Network Neighborhood nd zeigt Ihnen an, wer nd welche Geräte mit Ihrer Arbeitsstation verbnden sind. Dieses Dialogfeld stellt einen sehr einfachen Mechanisms dar, m drch die Netzwerksysteme nd Ressorcen z blättern, z denen Sie nabhängig vom jeweiligen Netzwerkhersteller eine Verbindng herstellen können. Wenn früher ein System mit verschiedenen Netzwerktypen gleichzeitig verbnden werden sollte, msste man sich beim Anschließen des Systems nd Anzeigen des Netzwerks immer nach den Vorgaben des jeweiligen Herstellers richten. Das Betriebssystem dagegen ist in der Lage, eine allgemeine Ansicht des gesamten Netzwerks z liefern, selbst dann, wenn das Netzwerk Ressorcen von Windows NT, Novell NetWare, Banyan Vines oder anderen enthält. Das Symbol,QER[ wird verwendet, wenn Microsoft Exchange af Ihrem System aktiv ist. Das Betriebssystem verfügt über einen integrierten -Dienst, der af Microsoft Mail (MS Mail) nd Microsoft Exchange basiert. Falls sich in dem Netzwerk, an das Ihr System angeschlossen ist, bereits ein MS Mail Postoffice befindet, kann der Mail-Client des Betriebssystems direkt eine Verbindng Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 26 von 262

27 ,QEHWULHEQDKPH daz afbaen. Über das Symbol Inbox können Sie af Ihre Nachrichten zgreifen. Das Symbol 5HF\FOH%LQ (der Papierkorb) stellt das Depot für gelöschte Objekte dar. Solange sich eine Datei in diesem Papierkorb befindet, kann sie, falls sie versehentlich gelöscht wrde, schnell nd einfach wiederhergestellt werden. Das Betriebssystem behält Dateien solange in diesem Depot, bis das System über keinen freien Plattenplatz mehr verfügt. In diesem Fall beginnt das Betriebssystem den Inhalt des Papierkorbs (Recycle Bin) z löschen, wobei die ältesten Dateien nach dem FIFO- Prinzip (First-in First-ot) zerst gelöscht werden. 'DWHLHQGLH EHUVFKULHEHQZXUGHQZHLO]ZHLYHUVFKLHGHQH$QZHQGXQJHQHLQH'DWHL PLWGHPVHOEHQ1DPHQYHUZHQGHWKDEHQZHUGHQQLFKWLP3DSLHUNRUEJHVSHLFKHUW Drch Doppelklicken af das Symbol Recycle Bin zeigen Sie den Inhalt des Papierkorbs an. Wenn ein leeres Fenster angezeigt wird, ist dies die Bestätigng, dass sich keinerlei Objekte im Papierkorb befinden. Das Startmenü Drch einen einzelnen Klick mit der linken Mastaste af die Schaltfläche Start wird das Startmenü geöffnet. Darin werden Ihnen sieben Haptkategorien von Optionen angezeigt, über die Sie die Arbeit mit dem System afnehmen können. Drch einen einzelnen Klick mit der rechten Mastaste öffnet sich ein kleines Steermenü, in dem die Optionen Open, Explore nd Find enthalten sind. Die Fnktionsweise wird im folgenden beschrieben. Starten von Programmen Das Startmenü enthält verschiedene Kategorien, in denen Ihre Anwendngen nd Ihre Arbeit gespeichert sind. Sie können sich die einzelnen Untermenüs anzeigen lassen, indem Sie mit der Mas af die gewünschte Option zeigen. Dadrch wird atomatisch das jeweils nächste Untermenü angezeigt. Hierbei brachen Sie nicht mit der Mas z klicken! Die Option 3URJUDPV öffnet das Untermenü z Programs. In diesem Menü sind alle installierten nd Ihnen zr Verfügng stehenden Anwendngen afgeführt. Einige Optionen sind mit einem Pfeil markiert. Dieser Pfeil zeigt an, dass ein weiteres Untermenü folgt. Zeigen Sie z.b. mit der Mas af die Option $FFHVVRULHV, m sich das dazgehörige Untermenü anzeigen z lassen. Im Untermenü z Accessories wird eine Liste der im Betriebssystem integrierten Programme angezeigt. 7,3 Wenn Sie ein Objekt entweder vom Desktop oder Windows Explorer mit der Mas af die Schaltfläche Start ziehen (drag) nd dort absetzen (drop), wird atomatisch eine Verknüpfng erstellt. Dieses Objekt erscheint ab sofort im Startmenü nd kann nn darüber afgerfen werden. Sie haben mehrere Möglichkeiten, m ein Programm z starten. Die im folgenden beschriebene Methode ist die einfachste: 1. Klicken Sie af die Schaltfläche Start. 2. Klicken Sie af Programs. 3. Klicken Sie af die Grppe, die das Programm enthält, das Sie starten möchten (z.b. LCS). 4. Klicken Sie af das Program, das Sie starten möchten (z.b. Leica LCS). Aßerdem können Sie ein Programm starten, indem Sie ein Dokment, das Sie mit dem betreffenden Programm erstellt haben, öffnen. Das Programm wird atomatisch gestartet, wenn das Dokment geöffnet wird. Doppelklicken Sie af eine Dokmentendatei im Fenster My Compter oder im Windows Explorer, m sie z öffnen. Statt dessen können Sie ach af die Schaltfläche Start klicken nd im Menü Docments ein kürzlich verwendetes Dokment aswählen. Weiterhin haben Sie die Möglichkeit, ein Programm z starten, indem Sie af das Programmsymbol (sog. Shortct) af dem Desktop doppelklicken. Shortcts sind Verknüpfngen z anderen Dateien. Wenn Sie af einen Shortct klicken, verfolgt Windows die Verknüpfng zrück bis zr rsprünglichen Datei. Wenn Sie ein Dokment oder ein Programm sehr häfig verwenden, möchten Sie möglicherweise einen entsprechenden Shortct erstellen, der af dem Desktop zr Verfügng steht. Daz müssen Sie mit der Mas af das gewünschte Objekt zeigen, die rechte Mastaste hernterdrücken, gedrückt halten nd das Objekt as dem Fenster Windows Explorer oder My Compter herasziehen. Wenn Sie nn die Mastaste loslassen, erscheint ein Menü. Wählen Sie in diesem Menü die Option Create Shortct(s) Here. Einige Programme erstellen während ihres Installationsvorgangs atomatisch einen Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 27 von 262

28 ,QEHWULHEQDKPH Shortct. 'DV%HWULHEVV\VWHPYHUIROJWGLH9HUNQ SIXQJ]ZLVFKHQHLQHP6KRUWFXWXQGGHP 2ULJLQDOQLFKWDNWLY]XU FN'DVEHGHXWHW:HQQ6LHEHLVSLHOVZHLVHHLQHQ6KRUWFXWI U HLQ3URJUDPPHUVWHOOHQXQGGDQQGDV2ULJLQDOLQHLQHQDQGHUHQ2UGQHUYHUVFKLHEHQ XQGQLFKWNRSLHUHQNDQQHVYRUNRPPHQGDVVGHU6KRUWFXWQLFKWPHKUIXQNWLRQLHUW Der Ordner Startp hat eine besondere Fnktion: Alle Programme, die sich in diesem Ordner befinden, werden atomatisch gestartet, sobald Sie das Betriebssystem starten. Im Menü Docments sind die Namen der letzten 15 von Ihnen erstellten Dateien afgeführt. Sie können jede dieser Dateien nd gleichzeitig die damit verbndene Anwendng öffnen, indem Sie einfach in diesem Menü af den Namen der Datei klicken. $OOH'RNXPHQWHQGDWHLHQGLHYRQHLQHU$QZHQGXQJDXVJH IIQHWZXUGHQLQGHU5HJHO ZHUGHQGD]XLQGHUMHZHLOLJHQ$QZHQGXQJGLH0HQ EHIHKOH)LOH2SHQJHZlKOWVLQG KLHUQLFKWDXIJHI KUW,QGLHVHU/LVWHVLQGQXUDOOGLH'RNXPHQWHHQWKDOWHQGLHGLUHNW YRP'HVNWRSDXVJH IIQHWZXUGHQ Das Menü Settings enthält drei Befehle, über die Sie Änderngen an den Einstellngen Ihres Systems vornehmen können. Über dieses Menü können Sie direkt af die Systemsteerng nd den Drcker zgreifen. Aßerdem öffnen Sie hierüber das Fenster Task Properties. Die Möglichkeit, af diese Weise die wichtigsten Dienstprogramme der Systemkonfigration afrfen z können, ist vor allem dann sehr hilfreich, wenn eine Anwendng bereits geöffnet nd im Vordergrnd aktiv ist nd Sie schnell eine Änderng vornehmen möchten. Die Option Find bietet Ihnen eine sehr einfache Möglichkeit, nach Systemressorcen z schen. Im Untermenü dieser Option können Sie drei Arten von Schen drchführen. 'LH7DVN/HLVWH Die Task-Leiste die sich am nteren Bildschirmrand befindet zeigt konstant an, welche Anwendngen derzeit af dem System asgeführt werden. Darüber hinas stellt sie eine einfache Möglichkeit dar, m zwischen den einzelnen Anwendngen z wechseln. Sobald Sie eine weitere Anwendng öffnen, werden die minimierten Ansichten der bereits geöffneten Programme in der Task- Leiste angepaßt, so dass ach die minimierte Ansicht der neen Anwendng in der Task-Leiste Platz findet. Af diese Weise wird sichergestellt, dass immer alle geöffneten Anwendngen in der Task- Leiste sichtbar sind. Um von einem lafenden Programm z einem anderen z wechseln, brachen Sie nr in der Task-Leiste af die minimierte Ansicht des gewünschten Programms z klicken. Zdem stellt Ihnen die Task-Leiste konstant Zsatzinformationen nd -fnktionen zr Verfügng. So z.b. die Systemzeit nd die Latstärkeregelng, falls Sie eine Sond-Karte installiert haben. All diese Fnktionen können vom Bentzer nach Belieben geändert nd angepaßt werden. (LQVWHOOHQYRQ'DWXPXQG8KU]HLW Sie haben die Möglichkeit, das aktelle Datm, die Uhrzeit nd die Zeitzone über das Symbol Date/Time im Fenster Control Panel einzstellen. Diese Einstellng ist sehr wichtig, da das Betriebssystem alle Ihre Dateien mit einem Datm nd einer Uhrzeit versieht, sobald Sie sie erstellen oder Änderngen daran vornehmen. Sie können die beiden Optionen aswählen, indem Sie af die entsprechende Registerkarte klicken. 6RlQGHUQ6LH'DWXPXQG8KU]HLW Klicken Sie af das gewünschte Datm, oder verwenden Sie die Steerschaltflächen, m den angezeigten Monat nd das Jahr z ändern. Die Uhrzeit kann aßerdem ach verändert werden, indem Sie znächst die digitale Anzeige aswählen nd die Zeit dann mit Hilfe des nach oben nd Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 28 von 262

29 ,QEHWULHEQDKPH des nach nten zeigenden Pfeils einstellen. 6RlQGHUQ6LH=HLW]RQH Wählen Sie as der Dropdown-Liste am oberen Rand des Dialogfeldes die entsprechende Zeitzone as. Achten Sie daraf, ob die Option zr atomatischen Umstellng der Uhr af Sommer- bzw. Winterzeit asgewählt ist. Af einigen Systemen können Sie aßerdem den markierten Bereich af die Weltkarte ziehen nd an der korrekten Stelle absetzen. Wenn Sie im Betriebssystem Änderngen an den Datms- nd Uhrzeiteinstellngen vornehmen, wird dadrch die batteriebetriebene CMOS Uhr in Ihrem System aktalisiert. -HQDFK.RQILJXUDWLRQNDQQHVYRUNRPPHQGDVV6\VWHPHGLHDQHLQ1HW]ZHUN DQJHVFKORVVHQVLQGEHLMHGHP$QPHOGHQHLQH'DWXPVXQG8KU]HLWDNWXDOLVLHUXQJYRP 1HW]ZHUN6HUYHUHUKDOWHQ:HQQGLH8KU]HLWLP6HUYHUIDOVFKLVWGDQQLVWDXFKGLH 8KU]HLW,KUHU$UEHLWVVWDWLRQHQLQNRUUHNW%LWWHLQIRUPLHUHQ6LHLQGLHVHP)DOO,KUHQ 1HW]ZHUN$GPLQLVWUDWRU $XIUXIHQGHU+LOIH Das Betriebssystem enthält ein mfangreiches nd leistngsstarkes Hilfesystem. Zsätzlich z den Hilfemenüs, die Ihnen in jedem Fenster zr Verfügng stehen, gibt es für das Startmenü noch eine eigenständige nd in sich abgeschlossene Hilfe. Um sie afzrfen, müssen Sie mit der Mas af die Schaltfläche Start nd anschließend af Help klicken. In diesem Dialogfeld stehen Ihnen drei Registerkarten zr Verfügng: Contents, Index nd Find. Die Registerkarte Contents (Inhalt) liegt zoberst af. Die anderen Registerkarten können Sie afrfen, indem Sie einfach daraf klicken. &RQWHQWV Die Registerkarte Contents zeigt die einzelnen Hilfethemen an. Die Hilfethemen sind in Kategorien nterteilt nd werden drch kleine Bchsymbole dargestellt. Doppelklicken Sie af eines der Bücher, m es z öffnen. Es werden nn die darin befindlichen Bücher nd Dokmente angezeigt. Doppelklicken Sie af eines der Bücher oder Dokmente, m es z öffnen.,qgh[ Die Registerkarte Index enthält einen Index mit allen zr Verfügng stehenden Themen. Geben Sie den Begriff ein, den Sie nachschlagen möchten. Während Sie die ersten Bchstaben eingeben, wird in der Liste geblättert nd der entsprechende Teil in der alphabetisch afgebaten Index-Liste angezeigt. Doppelklicken Sie, wenn Sie das gewünschte Hilfethema in der Liste gefnden haben, af das Thema, m es anzzeigen. )LQG Die Registerkarte Find bietet Ihnen statt der Sche nach Kategorien die Möglichkeit der Volltextsche. Geben Sie den Begriff oder Asdrck, z dem Sie ein Thema in der Hilfe schen möchten, in das Textfeld ein. Das Textfeld ist mit einer Wörterliste in Ihren Hilfedateien verknüpft. Alle Begriffe oder Asdrücke, die den von Ihnen eingegebenen Begriffen oder Asdrücken entsprechen, werden angezeigt. Sie können mehr als einen Begriff eingeben, indem Sie die einzelnen Begriffe drch ein Leerzeichen voneinander trennen. Falls Sie die Schoption ändern möchten, rfen Sie daz die Menüoption Options af. Wenn Sie das erste Mal af diese Registerkarte klicken, gibt Windows die Meldng as, dass Sie znächst eine Liste erstellen müssen. Klicken Sie af Next nd anschließend af Finish, m die Liste z erstellen. Sie sehen nn die Haptregisterkarte Find. Geben Sie den geschten Begriff in das obere Textfeld ein. Klicken Sie dann im mittleren Feld af ein Wort, m die Sche einzgrenzen. Sehen Sie sich zletzt die am nteren Rand angezeigte Liste mit Hilfethemen drch, nd doppelklicken Sie af das Thema, das Sie lesen möchten. Wenn Sie sich das Thema drchgelesen haben, können Sie entweder af Help Topics klicken, m zm Haptbildschirm der Hilfe zrückzkehren, oder af Back, m zm vorhergehenden Hilfethema zrückzkehren. Klicken Sie af die Schaltfläche Close, m die Hilfe z verlassen. 9HUODVVHQGHV%HWULHEVV\VWHPV6KXWGRZQ Klicken Sie grndsätzlich immer erst af den Befehl 6KXW'RZQ, bevor Sie Ihren PC asschalten. Über den Befehl Sht Down wird das Betriebssystem korrekt beendet (herntergefahren). Gleichzeitig stellen Sie damit sicher, dass ach alle übrigen noch lafenden Prozesse ordnngsgemäß Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 29 von 262

30 ,QEHWULHEQDKPH angehalten nd Daten, die sich gegebenenfalls im Cache befinden, vom Cache af die Festplatte übertragen werden. Es stehen Ihnen verschiedene Optionen zr Verfügng, wenn Sie das System hernterfahren. :HQQ6LHGHQ&RPSXWHUDXVVFKDOWHQRKQHLKQYRUKHURUGQXQJVJHPl KHUXQWHU]XIDKUHQNDQQGLHV]XHUKHEOLFKHQ'DWHQYHUOXVWHQI KUHQ (LQULFKWHQYRQ%HQXW]HUQ 1. Einloggen als Administrator Melden Sie sich an als Administrator. Verwenden Sie daz die ID: "Administrator" nd das Passwort:"Admin" 2. Öffnen Sie den User-Manager Wählen Sie 6WDUW 3URJUDPV $GPLQLVWUDWLYH7RROV 8VHU0DQDJHU 3. Definieren Sie einen neen Bentzer Geben Sie daz in dem geöffneten Dialogfenster mindestens folgende Angaben ein: 1. Username 2. Password (mss in der folgenden Zeile zr Bestätigng noch einmal eingegeben werden) Wählen Sie von den Checkboxen folgende beiden as: a.) "User mst change password at next logon" (Damit kann der ne angelegte Bentzer sein eigenes Passwort beim Einloggen definieren) b.) "Password never expires" (Damit hat ein einmal definiertes Passwort solange Gültigkeit, bis es entweder im User Manager geändert oder der Bentzer gelöscht wird) Wählen Sie in der Fsszeile des Dialogs die Option "Profiles" as. Hier geben Sie im Feld "Local path" nn den folgenden Pfad zm Ablegen der bentzerspezifischen Datein an: d:\sers\sername ("sername" ist ein Platzhalter. An seiner Stelle mss der tatsächlich definiertes Bentzername angegeben werden.] :HUNVVHLWLJHLQJHEDXWH)HVWSODWWHQZHUGHQPLW3DUWLWLRQHQ&?XQG'?JHOLHIHUW'DV %HQXW]HUYHU]HLFKQLVVROODXIGHU3DUWLWLRQ'?DQJHOHJWZHUGHQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 30 von 262

31 ,QEHWULHEQDKPH,QEHWULHEQDKPHGHV.RQIRNDOV\VWHPV 3U IHQ6LHREGHU6RIWZDUH.RSLHUVFKXW]VWHFNHUDXIGHUSDUDOOHOHQ'UXFNHUVFKQLWWVWHOOH LKUHV5HFKQHUVYRUKDQGHQLVW Ohne den Kopierschtzstecker können Sie die LCS Software NICHT starten. 6FKDOWHQ6LHGDVRGHUGLH0LNURVNRSHXQGGLH/LFKWTXHOOHQHLQ Alle manellen Leica Mikroskopstative (DM-LM, DM-IRB, DM-R, DM-LFSE) lassen sich an den seitlich am Stativ angebrachten Schaltern ein- nd asschalten. Alle atomatisierten Leica Mikroskopstative (DM- LFSA, DM-RXA, DM-RXA2, DM-RE, DM-IRBE) lassen sich an den seitlich am Stativ angebrachten Schaltern ein- nd asschalten. Die Leica Mikroskopstative DM-LFSA, DM-IRE2 nd DM-RXA2 lassen sich an der separaten Elektronikeinheit (LEICA CTR MIC Electronics box) ein- nd asschalten. $OOH)OXRUHV]HQ]ODPSHQVLQGPLWHLQHPHLJHQHQ1HW]WHLODXVJHU VWHW6LHODVVHQVLFK GHVKDOEDXFKQXUDQGLHVHP1HW]WHLOHLQXQGDXVVFKDOWHQ 6FKDOWHQ6LHQXQDP%HGLHQSXOWGLH6FKDOWHUI UGHQ6WHXHUUHFKQHU3&GHQ.RQIRNDOVFDQQHU6FDQQHUXQGGLH/DVHU/DVHUVHLQ 0HOGHQ6LHVLFKDP5HFKQHUDQ Wenn für Sie bereits eine eigene Bentzer ID erzegt wrde, verwenden Sie bitte diese. Damit ist sichergestellt, dass bentzerspezifische Einstellngen ach tatsächlich nr für Sie abgespeichert nd bereitgehalten werde. Falls der Systemadministrator für Sie noch keine eigene Bentzer-ID angelegt hat, melden Sie sich an als "TCS_User". Ein Passwort ist keines einzgeben. 6WDUWHQ6LHGDV/&63URJUDPP Klicken Sie daz af das Programmsymbol af dem Desktop des Rechners. L C S :lkohq6lhqxqhlq6riwzduhsurilodxv Für jeden Bentzer läss sich ein eigenes Profil erstellen, das sowohl den Afba der graphischen Bentzeroberfläche als ach die Definition bentzerspezifischer Einstellngen des Konfokalsystems beinhaltet. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 31 von 262

32 ,QEHWULHEQDKPH :DUWHQ6LHPLWGHPQlFKVWHQ6FKULWWELVGLH,QLWLDOLVLHUXQJGHU+DUGZDUHNRPSRQHQWHQ NRPSOHWWDEJHVFKORVVHQLVW /HJHQ6LHHLQH3UREHDXIXQGULFKWHQ6LHGLH3UREHLPNRQYHQWLRQHOOHQ0LNURVNRSLHUPRGXV HLQ Fokssieren Sie znächst af eine Stelle in Ihrer Probe die Sie beobachten wollen. Stellen Sie danach die Köhlerbelechtng ein (siehe Kapitel "Köhlerbelechtng" Seite 40)). a.) Einstellen af konventionelle Beobachtng bei den afrechten Mikroskopen der Bareihe DM- Rxxx, DM-LFxx '0B5[[0LNURVNRSUHLKH '0/)6[0LNURVNRSUHLKH 6FKDOWVWDQJHDXI9,6VWHOOHQXQG)OXRUHV]HQ]ILOWHUUDGDXIHQWVSUHFKHQGHQ)LOWHUZ UIHOGUHKHQ 3RV'$3,RSWLRQDO3RV75,7&3RV),7&3RV/HHUSRVLWLRQ6FDQ b.) Einstellen af konventionelle Beobachtng bei den inversen Mikroskopen der Bareihe DM-IRxx Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 32 von 262

33 ,QEHWULHEQDKPH '0B,5[[0LNURVNRSUHLKH /LQNVVHLWLJH6FKDOWVWDQJHYROOVWlQGLJKHUDXV]LHKHQHQWIHUQWXQG)OXRUHV]HQ]ILOWHUUDGDXI HQWVSUHFKHQGHQ)LOWHUZ UIHOGUHKHQ 3RV'$3,RSWLRQDO3RV75,7&3RV),7&3RV/HHUSRVLWLRQ6FDQ5HFKWVVHLWLJH 6FKDOWVWDQJHYROOVWlQGLJHLQVFKLHEHQ,P)DOOHHLQHV896\VWHPV'UHKHQ6LHGLH7XEXVOLQVHLQGLH3RVLWLRQ6FDQ '0B,5[[0LNURVNRSUHLKH 5HFKWVVHLWLJHV7XEXVOLQVHQUDGDXI6FDQVWHOOHQ :HFKVHOQ6LHQXQLQGHQ.RQIRNDOEHWULHE a.) Umstellen af Konfokalbeobachtng bei den afrechten Mikroskopen der Bareihe DM-Rxxx, DM- LFxx '0B5[[0LNURVNRSUHLKH '0/)6[0LNURVNRSUHLKH 6FKDOWVWDQJHXQG)OXRUHV]HQ]ILOWHUUDGDXI6FDQVWHOOHQ $XVZDKOHLQHVVSH]LILVFKHQ6DW]HVYRQ$XIQDKPHSDUDPHWHUQ (Applikation) Drücken Sie die Taste "Beam" im Arbeitsschritt "Acqisition" Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 33 von 262

34 ,QEHWULHEQDKPH Wählen Sie in dem geöffneten Dialogfenster "Beam Path Setting" eine Methode as (rechtes oberes Fenster) 8QWHU0HWKRGHZLUGHLQ6DW]YRQ+DUGZDUHHLQVWHOOXQJHQ,36,QVWUXPHQW3DUDPHWHU 6HWWLQJYHUVWDQGHQGHUVSH]LILVFKI UHLQHEHVWLPPWH$XVQDKPHWHFKQLNXQGHLQ VSH]LHOOH$UWGHU3UREHQSUlSDUDWLRQLVW'LH%H]HLFKXQJ),7&75,7&EH]HLFKQHW EHLVSLHOVZHLVHGLH(LQVWHOOXQJHQI UHLQ=ZHLNDQDODXIQDKPHVLPXOWDQI UGLHEHLGHQ )OXRUHV]HQ]IDUEVWRIIH),7&XQG75,7&1HEHQGHQILUPHQVHLWLJYRUJHJHEHQHQ 0HWKRGHQN QQHQVHOEVWYHUVWlQGOLFKDXFKHLJHQH0HWKRGHQGHILQLHUWXQG DEJHVSHLFKHUWZHUGHQ6LHKHKLHU]XGDV.DSLWHO%HQXW]HUDQSDVVXQJHQ6RIWZDUH $XVZDKOGHV0LNURVNRSREMHNWLYV Drücken Sie die Taste "Obj." im Arbeitsschritt "Acqisition" Wählen Sie as dem geöffneten Dialogfenster das Objektiv, das Sie verwenden wollen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 34 von 262

35 ,QEHWULHEQDKPH %HLDXWRPDWLVLHUWHQ0LNURVNRSVWDWLYHQZLUGGDVDXVJHZlKOWH0LNURVNRSREMHNWLY DXWRPDWLVFKLQGHQ6WUDKOHQJDQJJHEUDFKW ) UDQGHUH6WDWLYHPXVVGLHVPDQXDOHUIROJHQ $XVZDKOGHV6FDQYHUIDKUHQV Drücken Sie die Taste "Mode" zr Aswahl des Scanverfahrens 0LWGHP6FDQYHUIDKUHQVWHOOHQ6LHHLQZHOFKH$UWYRQ'DWHQVWDSHODXIJHQRPPHQ ZHUGHQVROO6LHN QQHQZlKOHQ]ZLVFKHQ DUlXPOLFKHQ6FDQYHUIDKUHQ[\][]\ E]HLWOLFKHQ6FDQYHUIDKUHQ[W[\W[]W[\]W FVSHNWUDOHQ6FDQYHUIDKUHQ[\λ[]λ $XVZDKOGHV6FDQIRUPDWV Drücken Sie die Taste "Format" zr Aswahl des Scanformats Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 35 von 262

36 ,QEHWULHEQDKPH 0LWGHP6FDQIRUPDWOHJHQ6LHGLH$Q]DKOYRQ5DVWHUSXQNWHQIHVWPLWGHU6FDQQHUGDV 6FDQIHOGDEWDVWHW 2SWLPLHUXQJGHU$XIQDKPHSDUDPHWHULP(QGORVVFDQ Drücken Sie die Taste "Continos." zm Starten des Endlosscans Sobald der Endlosscan läft, können Sie mit der Bedienkonsole nd den daraf definierten Afnahmeparametern die Bildqalität optimieren. Z den Optimierngsparametern gehören: a.) die genae Z-Position innerhalb der Probe b.) der Verstärkngsfaktor des asgewählten Detektors c.) den Drchmesser der Detektionslochblende d.) den Zoomfaktor $XIQDKPHHLQHVGUHLGLPHQVLRQDOHQUlXPOLFKHQ'DWHQVDW]HV'6HULH Schen Sie sich die obere Begrenzng des Datensatzes den Sie afnehmen wollen. Bentzen Sie daz den entsprechenden Knopf zr Z-Positionseinstellng der Bedienkonsole. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 36 von 262

37 ,QEHWULHEQDKPH 6WDQGDUGPlVVLJEHILQGHWVLFKGLH(LQVWHOOXQJGHU=3RVLWLRQDXI3RVLWLRQGHU %HGLHQNRQVROH Standardbelegng der Bedienkonsole (nterer Bildrand) Drücken Sie die Taste "Begin" zr Definition des Startpnktes der 3D-Serie Schen Sie sich die ntere Begrenzng des Datensatzes den Sie afnehmen wollen. Bentzen Sie daz den entsprechenden Knopf zr Z-Positionseinstellng der Bedienkonsole Drücken Sie die Taste "End" zr Definition des Endpnktes der 3D-Serie Stoppen Sie nn den Endlosscan indem Sie die Taste "Cont." noch einmal drücken Drücken Sie die Taste "Sect." zr Definition der Anzahl optischer Schnitte. :HLWHUH'HWDLOV]XGLHVHU)XQNWLRQN QQHQ6LHGHU2QOLQHKLOIHHQWQHKPHQ Drücken Sie die Taste "Aver." zr Definition der Anzahl von Mittelngsvorgängen (Frame- Average) *HPLWWHOWZHUGHQEHLGLHVHP9HUIDKUHQLPPHU$XIQDKPHQHLQHVHLQ]HOQHQRSWLVFKHQ 6FKQLWWHV Drücken Sie nn die Taste "Series" zr Afnahme der 3D-Serie Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 37 von 262

38 ,QEHWULHEQDKPH $EVSHLFKHUQGHU%LOGGDWHQ Wählen Sie as der Menüzeile )LOH!6DYHDV zm Abspeichern des Datensatzes :HLWHUH'HWDLOV]XP7KHPD$EVSHLFKHUQYRQ'DWHQVlW]HQXQG]X6SHLFKHUIRUPDWHQ VLHKH.DSLWHOÄ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 38 von 262

39 ,QEHWULHEQDKPH giiqhqxqg6shlfkhuqyrq'dwhqvlw]hq ³6HLWH Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 39 von 263

40 ,QEHWULHEQDKPH (LQVWHOOHQGHU. KOHUEHOHXFKWXQJ :DVLVWGLH. KOHUEHOHXFKWXQJ" In einem mikroskopischen Bild kann immer nr ein bestimmter Bereich einer Probe abgebildet (Bildfeld). Die Köhlerbelechtng erlabt es, gena diesen Bereich z belechten. Der Hintergrnd für die genae Aslechtng des Bildefeldes ist folgender: Wenn der asgelechtete Bereich kleiner ist als das Bildfeld, wird der vom Objektiv wahrgenommene Lichtkegel nd damit die nmerische Apertr kleiner. Da das optische Aflösngsvermögen direkt von der nmerischen Apertr abhängt, wird bei geringerer Aslechtng ach das optische Aflösngsvermögen verringert - was in den meisten Fällen nicht gewollt ist. Wenn der asgelechtete Bereich größer ist als das Bildfeld, führt dies z vermehrtem Strelicht. Dies führt wiederrm z einer Verringerng des Bildkontrastes. Dies kann z Folge haben, dass optisch afgelöste Strktren des mikroskopischen Bildes nicht mehr beobachtet werden können. Die Köhlerbelechtng stellt einen Kompromiss zwischen maxinmalem Kontrast nd maximalem Aflösngsvermögen dar. Die leistngsfähigsten Mikroskopobjektive erreichen oft nr bei exakt eingestellter Köhlerbelechtng ihr bestes optisches Verhalten. (LQVWHOOHQGHU. KOHUEHOHXFKWXQJ )RNXVVLHUHQ Stellen Sie einen Bereich Ihres Präparates scharf ein, der für Sie von Interesse ist. Achten Sie dabei noch nicht af die Bildqalität. giiqhqghu$shuwxueohqgh Öffnen Sie die Apertrblende vollständig. Diese wird später wieder soweit geschlossen werden, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist. A F F '05[[ '0,U[[ A '0/6)[[ $$SHUWXUEOHQGH))HOGEOHQGH Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 40 von 263

41 ,QEHWULHEQDKPH 6FKOLH HQGHU)HOGEOHQGH Das Bildfeld wird dadrch in den meisten Bereichen dnkel werden. Sie werden einen nscharfen, nfokssierten Lichtfleck sehen. Falls dieser Lichtfleck beim schließen der Feldblende as dem Gesichtsbereich verschwindet, ist die Feldblende z zentrieren. In diesem Fall sollten Sie die Feldblende soweit z öffnen, bis der Lichtfleck am Rand des Gesichtsfeldes z sehen ist. )DOOVNHLQ/LFKWIOHFN]XVHKHQLVWLVWGHU.RQGHQVRUP JOLFKHUZHLVHDXIGLHIDOVFKH + KHHLQJHVWHOOW9HUVWHOOHQ6LHGHVKDOEGLH+ KHGHV.RQGHQVRUVELV6LHGLH )HOGEOHQGHVHKHQN QQHQ )RNXVVLHUHQ Stellen Sie den Rand des Lichtflecks nn scharf ein, in dem Sie die Höhe des Kondensors verändern. =HQWULHUHQ Drehen Sie die Zentrierschraben des Kondensors solange, bis der Lichtfleck in der Mitte des Gesichtsfeldes zentriert ist. Das Zentrieren geht etwas einfacher, wenn Sie die Feldblende etwas öffnen m den Lichtfleck z vergrößern. giiqhqghu)hogeohqgh Öffnen Sie die Feldblende nn so weit, bis der Lichtfleck gerade am Rand des Bildfeldes verschwindet. 6FKOLH HQGHU$SHUWXUEOHQGH Schließen Sie die Apertrblende so weit, bis Sie den gewünschten Bildkontrast erreicht haben (Öffnen af ca. 70% des maximalen Drchmessers). :HQQ6LHGDV2EMHNWLYZHFKVHOQ Es kann vorkommen, dass Sie nach Objektivwechsel die Köhlerbelechtng nachjstieren müssen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 41 von 263

42 3IOHJHXQG5HLQLJXQJ 3IOHJHXQG5HLQLJXQJ Informationen z Wartng nd Pflege des konventionellen Leica Forschngsmikroskopsfinden Sie in den entsprechenden Handbüchern. Anweisngen nd Zsatzinformationen, die die Komponenten des konfokalen Systems TCS SP2 betreffen, sind im folgenden zsammengefaßt. 6WDQGRUWZDKO Setzen Sie das System niemals Zglft as. Es sollte dafür gesorgt werden, dass das TCS SP2 niemals in der Nähe von Afzügen, Klimaanlagen oder anderen Ein- nd Aslässen afgestellt wird. Planen Sie deshalb den Afstellngsort gena. Mikroskop vor Stab nd Fett schützen Wenn Sie das System nicht verwenden, sollten Sie es immer mit einer Knststofffolie (im Liefermfang enthalten) oder einem saberen Bamwolltch abdecken. Das System sollte in einer so weit wie möglich stab- nd fettfreien Umgebng betrieben werden. Befinden sich keine Objektive im Objektivrevolver, sollten die freien Positionen immer mit Stabschtzkappen versehen werden. Aggressive Chemikalien nter großer Vorsicht verwenden Gehen Sie äßerst Vorsichtig vor, wenn Sie bei Ihrer Arbeit mit Sären, Lagen oder anderen aggressiven Chemikalien z tn haben. Achten Sie daraf, diese Sbstanzen von den optischen nd mechanischen Komponenten des Systems fernzhalten. Reinigen des optischen Systems Das optische System des Mikroskops mss sich stets in gereinigtem Zstand befinden. Af keinen Fall sollten Sie die optischen Komponenten mit den Fingern oder etwas Stabigem oder Fettigem berühren. Entfernen Sie Stab mit einem feinen, trockenen Haarpinsel. Falls dies nicht asreicht, können Sie ein saberes, mit destilliertem Wasser angefechtetes Tch verwenden. Hartnäckige Vernreinigngen lassen sich mit reinem Alkohol, Chloroform oder Naphtha von den Glasoberflächen entfernen. Falls eine Objektivlinse zfällig drch ngeeignetes Immersionsöl oder drch die Probe kontaminiert wird, wenden Sie sich bitte an Ihre nächste Leica-Vertretng. Dort berät man Sie gern über die Verwendng bestimmter Lösngsmittel zr Reinigng. Lassen Sie sich nbedingt bei der Wahl der geeigneten Lösngsmittel beraten, da einige Lösngsmittel den Klebstoff, mit dem die Linse angebracht wrde, lösen können. 1LHPDOVGLH2EMHNWLYH]XP5HLQLJHQ IIQHQ Die Immersionslinsen sollten direkt nach der Verwendng vom Immersionsöl befreit werden. Entfernen Sie das Immersionsöl znächst mit einem saberen Tch. Legen Sie, nachdem Sie den größten Teil des Immersionsöls entfernt haben, ein feines für Linsen geeignetes Tch über die Immersionsseite der Linse. Bringen Sie nn eine Tropfen des Lösngsmittels af, das man Ihnen hierfür empfohlen hat, nd wischen Sie sanft mit dem Tch über die Linsenoberfläche. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Linse vollständig gereinigt ist. Verwenden Sie daz jedes mal ein nees, saberes Linsentch. Reinigen der Mikroskopoberfläche Verwenden Sie ein Bamwoll- oder ein Ledertch (mit Naphtha oder Alkohol angefechtet), m die Oberfläche des Mikroskopgehäses oder des Scanners (lackierte Teile) z reinigen. 1LHPDOV$FHWRQ;\ORORGHU1LWUR9HUG QQHUYHUZHQGHQGDVLHGHQ/DFNDQJUHLIHQ Alle LEICA-Komponenten nd -Systeme wrden sorgfältig nd mit den modernsten Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 42 von 263

43 3IOHJHXQG5HLQLJXQJ Prodktionsmethoden hergestellt. Falls Sie trotzdem mit Ihrem Gerät Probleme haben sollten, verschen Sie bitte nicht, die Geräte oder Zbehörteile selbst z reparieren, sondern wenden Sie sich bitte an Ihre Leica-Vertretng. 9RUMHGHU2UWVlQGHUXQJGHV.RQIRNDOV\VWHPVVROOWHGLHVHVJU QGOLFKJHUHLQLJWZHUGHQ 'LHVEHWULIIWLQVEHVRQGHUH6\VWHPHGLHVLFKLQELRORJLVFKPHGL]LQLVFKHQ )RUVFKXQJVODERUVEHILQGHQ 'LHVLVWQ WLJXPHLQHHYWOYRUOLHJHQGH.RQWDPLQDWLRQ]XEHVHLWLJHQXQGGDPLWHLQH 9HUVFKOHSSXQJXQGHLQH*HIlKUGXQJDQGHUHU3HUVRQHQ]XYHUPHLGHQ$FKWHQ6LH GDEHLQLFKWQXUDXI2EHUIOlFKHQVRQGHUQLQVEHVRQGHUHDXFKDXI9HQWLODWRUHQXQG. KOHLQULFKWXQJHQGDVLFKGRUWEHVRQGHUVKlXILJ6WDXEDQVDPPHOQNDQQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 43 von 263

44 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN 'LH/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUH(LQhEHUEOLFN 6WDUWHQGHU6RIWZDUH Vorassetzngen zm Starten der Software Die LCS Software verfügt über ein Schtzsystem, das es gewährleistet, dass jede verkafter Softwarelizenz nicht af zwei Comptern gleichzeitig läft. Des weiteren werden über dieses Schtzsystem ach sämtliche zsätzlich gekafte Applikationspakete freigeschaltet. Das Schtzsystem besteht as einem Hardwarestecker (ein sog. Dongle), der af die parallele Schnittstelle des Steerrechners afgesteckt wird. Die Fnktionalität der parallelen Schnittstelle (z.b. Drckeransteerng o.ä.) wird dadrch nicht beeinträchtigt. Sollten Sie einen separaten Rechner mit einer Zweitinstallation betreiben wollen, so ist der Schtzstecker af die parallele Schnittstelle des Zweitrechners afzstecken. 6REDOG6LHGHQ6FKXW]VWHFNHUYRP6WHXHUUHFKQHUGHV.RQIRNDOV\VWHPVDEJH]RJHQ KDEHQNDQQGLH6RIWZDUHQLFKWPHKUJHVWDUWHWZHUGHQ'DVEHGHXWHWGDVVGDV.RQIRNDOV\VWHPQLFKWPHKU]XEHWUHLEHQLVW Die LCS Software kann in zwei Modi gestartet werden, dem Hardwaremode nd dem Simlationsmode. Im Hardwaremode werden sämtliche Hardwarekomponenten von der Software angesprochen nd initialisiert. As diesem Grnd sollten Sie beim Start im Hardwaremode die Hardware zerst nd nach ca. 20 Seknden die Software starten. Im Simlationsmode läft die Software komplett ohne Hardware. Diese Betriebsart empfiehlt sich bei Zweitinstallationen af einem weiteren Rechner nd ist z.b. für Schlngen oder Offline-Analyse von bereits afgenommenen Datensätzen geeignet. 9RUJHKHQVZHLVHEHLP6WDUWGHU6RIWZDUH Wählen Sie 6WDUW_3URJUDPV_/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUH.. Es öffnet sich der Startbildschirm der Leica Confocal Software. In diesem Fenster können Sie nn as drei Profilen wählen. &RPSDQ\ Mit dieser Option wird die Leica Confocal Software mit werksseitig vorgegebenen Einstellngen gestartet. Das bedetet, dass die Konfigration nd die Position der Toolbars fest vorgegeben ist. Diese Einstellngen können nicht geändert werden. 3HUVRQDO Mit dieser Option wird ein bentzerspezifisches Einstellngsprofil verwendet. Der Bentzername wiederm hängt davon ab, nter welchem Accont sich eine Person am Betriebssystem anmeldet. Wenn beim ersten Start drch einen Bentzer noch kein persönliches Einstellngsprofil vorliegt, wird atomatisch die werksseitige Standardeinstellng als persönliches Profil verwendet. /DVW([LW Mit dieser Option wird das zletzt verwendete Einstellngsprofil verwendet. ) U)RUWJHVFKULWWHQH Wenn Sie über mehrere Einstellngsprofile verfügen, können Sie diese beim Start laden, wenn Sie mit dem Maszeiger af die Schaltfläche mit den drei kleinen schwarzen Pnkten drücken (befindet sich am rechten nteren Rand der Profiloptionen). Hier können Sie ach Ihr aktell eingestelltes persönliches Einstellngsprofil wieder af das werksseitige Standardprofil zrücksetzen. Nach Drücken der Start-Schaltfläche wird die Leica Confocal Software mit dem entsprechenden Einstellngsprofil gestartet. 'LH6RIWZDUHVWDUWHWQDFKHLQHUJHZLVVHQ=HLWXQWHU%HQXW]XQJGHVDXVJHZlKOWHQ (LQVWHOOXQJVSURILOVDXFKVHOEVW Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 44 von 263

45 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN 'DVH[SHULPHQWHOOH.RQ]HSWGHU6RIWZDUH Die Leica Confocal Software erlabt es, Bilddaten oder Ergebnisse von Bildverarbeitngsschritten z Grppen zsammenzfassen. Je eine Grppe wird "Experiment" genannt nd in einem speziellen Datenformat (*.lei) abgespeichert. So können originale experimentelle Bilddaten gemeinsam mit Bilddarstellngsdaten abgelegt werden. Weitere Details entnehmen Sie bitte dem Kapitel "Datenorganisation drch Grppieren von Experimenten" 3ULQ]LSLHOOHU$XIEDXGHU%HQXW]HUREHUIOlFKH Das Assehen der graphischen Bentzeroberfläche - im Folgenden krz GUI (*raphical 8ser,nterface) genannt - hängt sehr stark vom verwendeten Einstellngsprofil ab. Dennoch verfügt das GUI über eine Reihe von Standardelementen. Das GUI verfügt über folgende Standardelemente: 'LH0HQ ]HLOH In ihr befinden sich die Kategorien File, View, Macro, Tools, Window sowie Help. Innerhalb dieser Kategorien finden Sie Befehle nd Informationen zr allgemeinen Darstellng, Einstellng sowie zr Anpassng an den Bentzer. Sie enthält keine Fnktionen zr direkten Steerng von Scanfnktionen. Diese befinden sich im TCS-Menü (9LHZ 0HQX 7&60HQX). Die Menüzeile selbst kann nicht konfigriert werden. 'DV$QVLFKWVIHQVWHU7&6B9LHZHU In ihm werden Bilddaten, experimentelle Bedingngen sowie Angaben zm Bentzer angezeigt. Das Bildfenster kann konfigriert werden (siehe Kapitel "Modifikation der Bentzeroberfläche nd Definition bentzerspezifischer Einstellngen"). Das Bildfenster zeigt nicht nr konfokale Bilddatensätze, sondern ach experimentelle Daten wie Systemeinstellngen. Ein Bildfenster für ein nees Experiment kann geöffnet werden über )LOH 1HZ. 7&60HQ 7&6B0HQX Das TCS Menü enthält die Schaltflächen z den einzelnen Fnktionen des Gerätes. Es ist nterteilt in einzelne Arbeitsschritte. Je nach Softwareasstattng kann die Anzahl der Arbeitsschritte nterschiedlich sein. Der Standardsatz von Arbeitsschritten besteht as der Datenafnahme (Acqire), der Bilddarstellng (View), der Oberflächenrekonstrktion (3 D), den Messfnktionen (Qantify), den Bildverarbeitngs- nd Analysefnktionen (Process) sowie den Dokmentationsfnktionen (Annotate). Falls das TCS Menü im aktellen Einstellngsprofil nicht angezeigt wird, können Sie es über 9LHZ 0HQX 7&60HQX ein- nd asschalten. 6FKDOWIOlFKHQEHUHLFK7RROEDU In diesem Bereich können einzelne Tasten (Fnktionsbttons) eingefügt nd bentzerspezifisch eingerichtet werden. Der Vorteil des Schaltflächenbereichs liegt vor allem darin, dass er sich mit dem gesamten Inhalt an Schaltflächen ein- nd asschalten lässt. Gehen Sie hierfür wie folgt vor: 9LHZ 0HQX &RQWDLQHU. $QVLFKWVIHQVWHUI U'RNXPHQWH([SHULPHQW2YHUYLHZ In ihm werden die afgenommenen Experimente sowie deren Inhalte in einem Verzeichnisbam dargestellt. Das Ansichtsfenster kann geöffnet werden über 9LHZ ([SHULPHQW2YHUYLHZ. 6WDWXVOHLVWH6WDWXVEDU Die Statsleiste befindet sich am nteren Rand der Bentzeroberfläche der Leica Confocal Software. In ihr werden angezeigt: - Der Fortschritt beim Laden von Bilddaten (Progressbar) - Die Versionsnmmer der Software - Die Bezeichnng der Maschinenkonfigration (Systemtyp). Details über Einzelfnktionen können Sie dem Kapitel "Die LCS Softwarefnktionen" entnehmen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 45 von 263

46 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN giiqhqxqg6shlfkhuqyrq'dwhqvlw]hq /HVEDUH'DWHLIRUPDWH Folgende Dateiformate lassen sich in der Leica Confocal Software öffnen nd darstellen Experimente (*.lei): Es handelt sich hierbei m ein Leica-spezifisches, binäres Datenformat. Dieses Format ist für Daten von kompletten Experimenten vorgesehen. TIFF-Dateien (*.tif): Es handelt sich dabei m Leica Bilddateien im Single- nd Mlti-TIFF-Format. Es können sowohl Bilddateien in früher verwendeten TCS Formaten als ach externe Dateien im RGB-TIFF-Format eingelesen werden. Annotation (*.ano): Es handelt sich hierbei ebenfalls m ein Leica-spezifisches, binäres Datenformat. In ihm werden Präsentationsseiten (Annotations) abgespeichert. Die af den Präsentationsseiten vorhandenen Elemente wie Bilder, Texte nd Grafiken liegen jeweils als einzelne Objekte vor. Beim Lesen der Dateien werden nicht nr die Bilddaten sondern ach die experimentellen Einstellngen geladen. $XWRPDWLVFKHhEHUQDKPHYRQ$XIQDKPHSDUDPHWHUQ Mit der Leica Confocal Software können die Hardwareeinstellngen, die mit Experimenten oder Einzelbildern abgespeichert wrden, für ein nees Experiment übernommen werden. So kann die Afnahme von verschiedenen Experimenten nter gleichbleibenden Einstellngen vorgenommen werden. Zr Übernahme aktivieren Sie das Ansichtsfenster des Datensatzes, dessen Einstellngen Sie übernehmen wollen. Drücken Sie danach die Schaltfläche "Apply" (befindet sich bei dem werksseitigen Einstellngsprofil im Schaltflächenbereich [Toolbar]). )DOOV6LHGLH6FKDOWIOlFKH$SSO\QLFKWLQHLQHPGHUDQJH]HLJWHQ)HQVWHUYRUILQGHQ N QQHQ6LHGLH7DVWHLQHLQEHOLHELJHV)HQVWHUODGHQPLW7RROV &XVWRPL]H:lKOHQ 6LHLQGHPDQJH]HLJWHQ'LDORJIHQVWHUGDV5HJLVWHU&RPPDQGV.DWHJRULH)LOH.OLFNHQ6LHPLWGHUOLQNHQ0DXVWDVWHDXIGLH7DVWH$SSO\KDOWHQGLHOLQNH0DXVWDVWH JHGU FNWXQG]LHKHQ6LHGLHVHLQGDV)HQVWHU,KUHU:DKO/DVVHQ6LHGLHOLQNH 0DXVWDVWHORVXPGLH7DVWHDQGHUDNWXHOOHQ3RVLWLRQHLQ]XI JHQ 6SHLFKHUQYRQ%LOGHUQ Einzelbilder nd Experimente lassen sich in denselben Datenformaten abspeichern wie sie bereits im Abschnitt " Lesbare Dateiformate " beschrieben sind. Speichern können Sie Ihre Bilder nd Experimente mit )LOH 6DYH. Beim erstmaligen Speichern eines Experimentes, wird atomatisch die "Save as"-fnktion verwendet, die Sie zr Eingabe eines Dateinamens affordert. Neben der Definition eines geeigneten Dateinamens können Sie hier ach das Dateiformat wählen. Experimente können nr im Leicaspezifischen *.lei-format. Beim Speichern von Experimenten können sie evtl. vorhandene Einzelbilder im *.tif oder *.raw-format abspeichern. +DWWHQ6LHGDV([SHULPHQWRGHUGDV%LOGEHUHLWVHLQPDODEJHVSHLFKHUWZHUGHQEHL MHGHPZHLWHUHQ6SHLFKHUYRUJDQJGLHDOWHQ'DWHQ EHUVFKULHEHQ:HQQ6LHGLHVQLFKW ZROOHQXQGGLHQHXHQ'DWHQXQWHUHLQHPDQGHUHQ1DPHQDEVSHLFKHUQZROOHQVROOWHQ 6LH)LOH 6DYHDVZlKOHQ Datenorganisation drch Grppieren von Experimenten Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 46 von 263

47 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN Das Konzept der Leica Confocal Software erlabt es, Einzelbilder, Bildserien sowie Ergebnisse von Bildverarbeitngsschritten z einer Grppe - einem Experiment - zsammenzfassen. Sie erhalten einen Überblick über die geladenen Experimente im Experimentenansichtsfenster (Experiment Overview). Falls das Experimentenansichtsfenster geschlossen ist, können Sie es mit 9LHZ ([SHULPHQW2YHUYLHZ öffnen. Mit )LOH 1HZ nd )LOH 1HZ7HPSODWH wird ein nees Experiment angelegt. Ebenso werden bereits abgespeicherte Dateien, die Sie öffnen, als separate Experimente verwaltet. Zsammenstellen von Experimenten Nachdem Sie mit )LOH 1HZ oder )LOH 1HZ7HPSODWH ein nees Experiment definiert haben, können Sie dieses skzessive mit Daten füllen. %LOGHUGLHPLWGHU(QGORV6FDQ)XQNWLRQ&RQWLQXRXVVFDQDXIJHQRPPHQZXUGHQ ZHUGHQEHLPQlFKVWHQ6FDQVWDUWDXWRPDWLVFK EHUVFKULHEHQ:ROOHQ6LHHLQH (LQ]HODXIQDKPHGDXHUKDIWDOV7HLOHLQHV([SHULPHQWHVEHKDOWHQVROOWHQ6LHGLH(LQPDO 6FDQ)XQNWLRQZlKOHQ Teil eines Experiments sind Daten, die mit der "Einmal-Scan-" bzw. mit der "Serien-Scan"-Fnktion afgenommen wrden. Führen Sie an einem Datensatz Bildverarbeitngsfnktionen drch, können Sie die Ergebnisse ebenfalls als Bestandteil des Experimentes abspeichern. Wählen Sie sich daz drch einen Doppelklick das gewünschte Einzelbild bzw. die Serie as dem Experimentenansichtsfenster. Führen Sie nn die Bildverarbeitngsfnktionen drch (z.b. Maximmsprojektion oder Topologiebild o.ä.). Markieren Sie den Bereich innerhalb des Ansichtsfensters (Viewer), den Sie als Teil des Experimentes afbewahren wollen. Über die rechte Mastaste (Kontextmenü) wählen Sie 6HQGWR ([SHULPHQW. Die Option 6HOHFWLRQUDZ legt eine Kopie der Rohdaten des asgewählten Objektes als neen, separaten Bestandteil des Experimentes an. Die Option 6HOHFWLRQVQDSVKRW legt ein RGB-Bild (keine 3D-Daten, reines Photo) des asgewählten Objektes als neen Bestandteil des Experimentes an. 0HQ IXQNWLRQHQ Folgende Fnktionen stehen über die Menüzeile zr Verfügng: )LOH0HQ 1HZ Diese Option öffnet ein nees Experiment in einem neen Ansichtsfenster. Für die Darstellng des Ansichtsfensters wird die aktive Voreinstellng verwendet (siehe daz Kapitel " Voreinstellngen nd Vorlagen"). 1HZ7HPSODWH Diese Option öffnet ein nees Experiment in einem neen Ansichtsfenster. Die Art der Darstellng des Ansichtsfensters kann as einem Satz von Vorlagen gewählt werden. 2SHQ Diese Option öffnet ein bereits abgespeichertes Experiment oder einen einzelnen Datensatz (Bilddaten oder Annotation). Für die Darstellng des Ansichtsfensters wird die aktive Voreinstellng verwendet (siehe daz Kapitel " Voreinstellngen nd Vorlagen"). 2SHQ7HPSODWH Diese Option öffnet ein bereits abgespeichertes Experiment, einen einzelnen Datensatz oder Dokmentationsdateien Präsentationsdateien. Die Art der Darstellng des Ansichtsfensters kann as einem Satz von Vorlagen gewählt werden. &ORVH Diese Option schließt das aktell aktive Experiment. Dabei wird das Experiment nicht atomatisch vorher gespeichert. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 47 von 263

48 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN (VZLUGQLFKWQDFKJHIUDJWREGDV([SHULPHQWYRUGHP6FKOLH HQJHVSHLFKHUWZHUGHQ VROO &ORVHDOO Diese Option schließt alle Experimente. Dabei wird das Experiment nicht atomatisch vorher gespeichert. (VZLUGQLFKWQDFKJHIUDJWREGDV([SHULPHQWYRUGHPVFKOLH HQJHVSHLFKHUWZHUGHQ VROO 6DYH Speichert das aktelle Experiment. 6DYHDV Speichert das aktelle Experiment nter einem anderen Namen. 5HFHQWILOHV Öffnet eine der zletzt geöffneten Dateien. 3ULQW Öffnet einen Dialog zm Drcken des Inhaltes des aktell aktiven Fensters. ([LW Beendet das Programm. 9LHZ0HQ 0HQXV Mit dieser Option können das TCS-Menü nd der Schaltflächenbereich (Toolbar) ein- oder asgeschaltet werden. 6WDWXVEDU Diese Option schaltet die Darstellng der Statszeile am nteren Rand der Bentzeroberfläche der LCS Software ein bzw. as. ([SHULPHQW2YHUYLHZ Diese Option öffnet ein Fenster, in dem die einzelnen Experimente nd deren Bestandteile (Datensätze, Graphen etc.) bamartig dargestellt werden. Drch Doppelklick af den gewünschten Experimentbestandteil innerhalb des Experiment-Overview-Fensters, wird das entsprechende Ansichtsfenster in den Vordergrnd gestellt. 9LHZHU2SWLRQV Mit dieser Option können verschiedene Einstellngen für die Darstellng von Datensätzen im Ansichtsfenster vorgenommen werden (z.b. Darstellngswinkel nd Berechnngsmethoden zr Darstellng der Bilddaten.a.). 0DFUR0HQ 0DFURV In Abhängigkeit von der installierten Software können mit dieser Option entweder Makros direkt editiert oder nr afgezeichnet nd gestartet werden. 1XUZHQQGLHNRPSOHWWHLQWHJULHUWH9%$(QWZLFNOXQJVXPJHEXQJ,'(LQVWDOOLHUWZXUGH Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 48 von 263

49 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN N QQHQ0DNURVDXFKHGLWLHUWXQGPRGLIL]LHUWZHUGHQ 5HFRUGD1HZ0DFUR Startet den Makrorecorder zr atomatischen Afzeichnng eines Makros. (Weitere Details entnehmen sie bitte der zr optionalen Makroentwicklngsmgebng mitgelieferten Dokmentation.) 3DXVH5HFRUGLQJ Unterbricht die atomatische Afzeichnng eines Makros. 6WRS5HFRUGLQJ Stoppt die atomatische Afzeichnng eines Makros. 9LVXDO%DVLF(GLWRURSWLRQDO Startet die Software zr Entwicklng von Makros nd Programmen af der Basis von Visal Basic for Applications (VBA). Hier können Makros editiert, modifiziert nd sogar ganze Programme entwickelt werden. 7RROV0HQ /HJHQG,QIR Diese Option öffnet das Dialogfenster zr Eingabe bentzerspezifischer Angaben. Diese Angaben (z.b. Instittsname, Bezeichnng der Probe etc.) werden mit jedem Datensatz abgespeichert nd können in der Legende neben den afgenommenen Bildern angezeigt werden. 2EMHFWLYH Diese Option öffnet das Dialogfenster zr Definition der verwendeten Objektive. Die von ihnen verwendeten Objektive können as der in dem Dialogfenster verfügbaren Liste per "Drag and Drop" kopiert nd damit der Software kenntlich gemacht werden. 'LHULFKWLJH$QJDEHGHV2EMHNWLYHVLVWZLFKWLJGDHLQLJHEHUHFKQHWH*U HQGDYRQ DEKlQJHQ]%6FDQIHOGGLPHQVLRQHQDXWRPDWLVFKH$QSDVVXQJGHU 'HWHNWLRQVORFKEOHQGH 0LFURVFRSH Diese Option ermöglicht die Aswahl des verwendeten Leica Mikroskops. Diese Aswahl beeinflsst die Art nd Weise der Ansteerng des Mikroskops (z.b. des motorisierten Objektivrevolvers). 6HWWLQJV Diese Option ermöglicht die Aswahl von Hardwareeinstellngen, die beim Öffnen eines bereits gespeicherten Datensatzes übernommen werden sollen. /LFHQVH Mit dieser Option können Lizensen nachinstalliert werden. Eine Lizenz wird üblicherweise dann nachinstalliert, wenn ein optional angebotenes Softwarepaket nachträglich hinzgekaft wird. :LQGRZ0HQ 1HZ:LQGRZ Diese Option öffnet ein nees Ansichtsfenster innerhalb desselben Experimentes. Damit kann beispielsweise ein- nd derselbe Datensatz in nterschiedlichen Darstellngen gleichzeitig angezeigt werden (z.b. Topo- + Overlaydarstellng) +HOS0HQ &RQWHQWV Öffnet das Inhaltsverzeichnis der Onlinehilfe. 6HDUFK Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 49 von 263

50 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN Startet die Volltextsche innerhalb der Onlinehilfe.,QGH[ Öffnet das Schlüsselwortverzeichnis der Onlinehilfe. 'DWHLIRUPDWH/&6 Formate bentzerspezifischer nd geräteabhängiger Daten Die LCS Software verfügt über folgende Dateiformate für bentzerspezifische Daten: Verzeichnis: Leica Verzeichnis: User Instrmentenwerte (,nstrment 3arameter 6ettings) *.IPS *.IPS Makros Company.mac User.mac Vorlagen für Bedienkonsole *.pbo *.pbo Bentzerprofile CompanyProfile.pro PersonalProfile.pro LastExitProfile.pro LastRecent.lst Vorlagen *.prt *.prt Kalibrierdaten Machine.lhw Farbzordnngstabellen *.lt bentzerspezifisches Profil wie es bei der letzten Bentzng definiert war *.lst Im Einzelnen beinhalten die verschiedenen Dateiformate:,36 In diesem Format werden Instrmentenparameter abgespeichert. Darnter fallen hardwarenahe Einstellngen wie die Intensität der einzelnen Laserlinien, die Anzahl von simltan bentzten Kanälen, die Art des bentzten Haptstrahlteilers, die Position nd Bandbreite der einzelnen Spektrophotometerblenden sowie die Sensitivität der Detektoren. Es gibt sowohl werksseitig definierte nveränderliche Standardsätze von Instrmentenparametern, die eine sehr schnelle Einstellng der Hardware ermöglichen. des weiteren kann sich jeder Bentzer Instrmentenparametersätze in seinem eigenen Bentzerverzeichnis abspeichern. Hiermit können Sie die für Ihr Anwendngsgebiet typischen Instrmentenparameter abspeichern nd reprodzierbar für andere Experimente bereitstellen. PDF In diesem Format werden Makros abgespeichert. Makros beinhalten VBA (9isal %asic for $pplication)-programmcode. Die einzelnen Programmobjekte zr Steerng des Konfokalsystems werden von Leica in einem Objektmodell bereitgestellt. Weitere Einzelheiten zr Entwicklng von Makros zr Steerng des Konfokalsystems entnehmen Sie bitte dem Kapitel "Die LCS Makrosprache". Mit der Software werden werksseitig bereits vordefinierte Makros mitgeliefert, die Sie sowohl nverändert verwenden als ach selbst modifizieren können. Die selbsterstellten bzw. modifizierten Makros werden im jeweiligen bentzerspezifischen Verzeichnis abgespeichert. SER In diesem Format werden Vorlagen für die Belegng der Bedienkonsole gespeichert. Mit diesen Vorlagen wird definiert, welcher Scanparameter drch welchen Drehknopf kontrolliert wird. Ach hier gibt es werksseitige Voreinstellngen, die sich für die meisten Standardanwendngen als sinnvoll herasgestellt haben. Selbstdefinierte Vorlagen werden im bentzerspezifischen Verzeichnis gespeichert. SUR In diesem Format werden spezifische Profile der Bentzeroberfläche abgespeichert. Daz gehört, welche Taste sich in welcher Position in welcher Toolbar befindet. des weiteren können nee Toolbars definiert bzw. bereits definierte Toolbars as nd eingeblendet werden. Ach die Position der Toolbars - ob eingebettet oder frei beweglich - wird in einem Profil festgehalten. So kann sich jeder Bentzer seine eigene Bentzeroberfläche gestalten. Systemverantwortliche können mit diesem Werkzeg beispielsweise für jede Kenntnisstfe des Bentzers (Einsteiger, Fortgeschritenere, Experte) eine eigene Bentzeroberfläche gestalten. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 50 von 263

51 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN OVW Im Bentzerverzeichnis wird neben den einzelnen bentzerspezifischen Profilen ach noch das Profil der letzten Bentzng sowie eine Liste mit den vier letzten vom Bentzer bentzten Datensätzen abgespeichert. SUW In diesem Format werden Vorlagen für das Ansichtsfenster "Viewer" gespeichert. Damit kann das Assehen nd die Art der dargestellten Informationen spezifisch festgehalten werden. Eine Erklärng der einzelnen Konfigrationsmöglichkeiten erhalten Sie im Kapitel "Ansichtsfenster Viewer". OKZ In diesem Format werden Kalibrierdaten nd Hardwareeinstellngen des Konfokalsystems festgehalten. Diese Datei ist asschliesslich von Servicepersonal, das von Leica Microsystems Heidelberg zertifiziert ist, z bearbeiten. 9HUlQGHUXQJHQLQGLHVHU'DWHLN QQHQVFKZHUZLHJHQGHXQWHU8PVWlQGHQLUUHSDUDEOH 6FKlGHQDP.RQIRNDOV\VWHPQDFKVLFK]LHKHQ6FKlGHQGLHQDFKZHLVOLFKGXUFK 0RGLILNDWLRQGLHVHU'DWHLGXUFK%HQXW]HU]XVWDQGHNRPPHQKDEHQHLQHQ9HUOXVWGHU *DUDQWLHI UGDV*HVDPWV\VWHP]XU)ROJH OXW In diesem Format werden Farbzordnngstabellen abgespeichert. Mit ihnen werden die von den Detektoren gemessenen Intensitätswerte jeweils einer Farbe zgeordnet. Damit können neben der reinen Farbdarstellng, bestimmte Intensitätsbereiche herasgehoben werden. Nähere Einzelheiten entnehmen Sie bitten dem Kapitel "Farbzordnngstabellen aswählen". )HVWVWHKHQGH/HLFDVSH]LILVFKH'DWHQIRUPDWH Folgende Dateiformate lassen sich in der Leica Confocal Software öffnen nd darstellen 5RKGDWHQUDZ Das RAW-Format speichert Daten als lineares zweidimensionales Array im INTEL Format. Der Spaltenindex des Arrays entspricht der schnellsten Abtastdimension (meist die x-achse), der Zeilenindex entspricht der langsameren Abtastdimension (meist die y-achse). Bei einer 8-Bit- Afnahme wird jede Messgröße als einzelnes Byte abgespeichert. Bei einer 12-Bit Afnahme werden 2 Bytes verwendet, wobei gemäß dem INTEL-Format (littel endian) das erste Byte die höherwertigen Bits enthält. Jeder optische Schnitt wird für jeden Kanal in einer separaten Datei mit der Dateiendng.raw gespeichert. Die Namenskonvention latet: 1DPHGHV([SHULPHQWVB1DPHGHV 'DWHQVDW]HVB.DQDOQXPPHUB]'LPHQVLRQB1XPPHUGHVRSWLVFKHQ6FKQLWWHV.raw ([SHULPHQWHOHL Es handelt sich hierbei m ein Leica-spezifisches, binäres Datenformat. Dieses Format ist für Daten von kompletten Experimenten vorgesehen. In diesem Dateiformat wird eine Dateibeschreibngen gespeichert, die af eine Serie von Bilddateien im TIFF-Format oder im RAW-Format verweist. 7,))'DWHLHQWLI Es handelt sich dabei m Leica Bilddateien im Single- nd Mlti-TIFF-Format. Es können sowohl Bilddateien in früher verwendeten TCS Formaten als ach externe Dateien im RGB-TIFF-Format eingelesen werden. $QQRWDWLRQDQR Es handelt sich hierbei ebenfalls m ein Leica-spezifisches, binäres Datenformat. In ihm werden Präsentationsseiten (Annotations) abgespeichert. Die af den Präsentationsseiten vorhandenen Elemente wie Bilder, Texte nd Grafiken liegen jeweils als einzelne Objekte vor. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 51 von 263

52 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN 2EHVVLFKEHLGHUJHVSHLFKHUWHQ0HVVJU HXPHLQHQ,QWHQVLWlWVZHUWRGHUXPHLQHQ + KHQZHUWKDQGHOWZLUGLQGHU]XJHK ULJHQ/(,'DWHLJHVSHLFKHUW Niederwertiges Byte lat INTEL-Format Höherwertiges Byte lat INTEL Format 'DUVWHOOXQJHLQHU%LW=DKOLP,17(/)RUPDW 6SH]LILNDWLRQGHV'DWHLIRUPDWVÄ/HL³9HUVLRQEHWD Sobald in der LCS Software eine Datei gespeichert wird, wird ein zerst ein Unterverzeichnis zm aktellen Verzeichnis angelegt. In dieses Unterverzeichnis wird abgespeichert: 1. Eine Beschreibngsdatei; deren Afba wird im folgenden beschrieben. Sie dient der Interpretation der Daten eines Experimentes drch die LCS Software 2. Die einzelnen Bilddateien; die Namensgebng der Bilddateien folgt der folgenden Logik: NAME_Kanalnmmer_dimensionIndex. So bedetet z.b. Chloroplast_C1_Z1, dass der vom Bentzer angebene Name des Datensatzes "Chloroplast" ist, dass das Bild dem ersten optischen Schnitt eines dreidimensionalen Datenstapels (Z1) entspricht, nd dass die Daten im ersten Detektionskanal (C1) afgenommen wrden. %HLVSLHO]XP$EVSHLFKHUQHLQHV([SHULPHQWVLP/HL)RUPDW 6WUXNWXUGHU%HVFKUHLEXQJVGDWHL Die Beschreibngsdatei ist nr für die LCS Software z lesen. Sie besteht as einer Sammlng verschiedener Tabellen nd besitzt folgende Strktr +HDGHUWDEHOOH %\WH %HGHXWXQJ 0 JOLFKH:HUWH Byteanordnng 0x Intel LSB 0x4D4D4D4D Motorola MSB Identifikation für Leica "Lei" Format 0x016033F Versionsnmmer aktell: =x Adresse der Verzeichnistabelle 15 $ jede mögliche Adresse im Bereich der Gesamtlänge der Datei 9HU]HLFKQLVWDEHOOH$ $GUHVVH %HGHXWXQJ 'DWHQW\SGHV Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 52 von 263

53 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN (LQWUDJV Adresse von Anzahl von Einträgen in dieser Tabelle DWORD $ = A A+4 Index des ersten Eintrags (Gibt einen logischen Speicherblock DWORD wieder, z.b. Afnahmeparameter ("Hardwaresettings") oder Bildparameter ("Dimensionen") A+8 Adresse $ des 1.Eintrags DWORD A+12 Index des ersten Eintrags (Gibt einen logischen Speicherblock DWORD wieder, z.b. Afnahmeparameter ("Hardwaresettings") oder Bildparameter ("Dimensionen") A+14 Address $ des 2.Eintrags DWORD Die Länge der Verzeichnistabelle hängt davon ab, wieviele Bilder nd Bilddaten in einem Experiment gespeichert werden sollen (Afnahmeparameter, Anzahl Kanäle, Anzahl optischer Schnitte etc.). Jeder Eintrag in der Verzeichnistabelle entspricht dabei einem logischen Speicherblock. %ORFNWDEHOOH;Q $GUHVVH %HGHXWXQJJ 'DWHQW\S A1 bzw. A2 bzw. Prüfziffer DWORD A3...A i A i + 4 Bytes Beschreibng des Inhaltes der Blocktabelle DWORD (wird derzeit nicht bentzt) A i + 8 Byte Version des Eintrags DWORD A i + 12 Byte Größe des Eintrags DWORD A i + 16 Byte Beginn des Eintrags Der Datentyp hängt vom Typ des Eintrags ab )ROJHQGHORJLVFKHQ6SHLFKHUEO FNHVLQGYHUI JEDU const DWORD ID_SERIES = 10; const DWORD ID_IMAGES = 15; const DWORD ID_DIMDESCR = 20; const DWORD ID_FILTERSET = 30; const DWORD ID_TIMEINFO = 40; const DWORD ID_SCANNERSET = 50; const DWORD ID_EXPERIMENT = 60; const DWORD ID_LUTDESC = 70; Für den Datentyp DWORD ist ein Speicherplatz von 32 Bit definiert 6SHLFKHUEORFN,'B6(5,(6 Dieser Datenblock beinhaltet Informationen über die Größe der kompletten, in einem Experiment zsammengefassten Datenserie. Dieser Datenblock kommt immer gena ein einziges mal pro Experiment af. Der Datenblock ist folgendermaßen afgebat: *U H>E\WH@ 'DWHQW\S 6\PERO %HVFKUHLEXQJ 4 int interne Versionsnmmer 4 int nse Anzahl von Bildserien 4 int nim Länge eines Dateinamens in wchar 4 int next Länge der Dateiendng der Bilddatei in Bytes next wchar Dateiendng der Bilddatei 6SHLFKHUEORFN,'B,0$*(6 Dieser Block beinhaltet alle Dateinamen aller Bilddateien, die z einer Serie gehören. Der Datenblock ist folgendermaßen afgebat: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 53 von 263

54 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN 4 int nfiles Anzahl der Einzelbilder der Serie 4 int Breite eines Einzelbildes 4 int Länge eines Einzelbildes 4 int Bits / Datenpnkt (Aflösng der Afnahme) 4 int Datenpnkte / Pixel (Aflösng der Darstellng) Für die nächsten Q Bilddateien nim * 2 wchar Name des nächsten Bildes 6SHLFKHUEORFN,'B',0'(6&5 Dieser Block beschreibt, die wie ein Bild im n-dimensionalen Ram beschrieben wird. *U H 'DWHQW\S 6\PERO %HVFKUHLEXQJ >E\WH@ 4 int interne Versionsnmber der VOXEL-Beschreibng 4 int Voxeltyp.z.B. RGB oder GRAY (siehe folgende Tabelle VOXEL-TYPEN) 4 DWORD Bytegröße eines Pixels Typisch: (1 oder 2) oder (3 oder 6 für RGB) 4 DWORD Aflösng der Scandaten (8, 12 oder 16 Bit) 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette length in wchar (wchar = Zide FKDUacter; Textzeichenformat, das im Gegensatz zm ACSII-Format (1 Byte) eine 2-Byte-Codierng der Textzeichen verwendet. ntc * 2 wchar Maximaler Wert der Messgröße (Intensitätswert oder Längenwert einer Strecke) für ein Voxel. 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Minimaler Wert der Messgröße (Intensitätswert oder Längenwert einer Strecke) für ein Voxel. 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Kennzeichnng der Messgröße ("I" für Intensität, "z" für Längenwert) 4 int interne Versionsnmmer 4 int ndims Dimension des Bildes z.b.x_y_ch_z = 4 Für die nächsten Q Dimensionen 4 DWORD Identifikationsnmmer (ID) der Dimension (siehe folgende Liste "Identifikationsnmmern (ID) für Bilddimensionen") 4 DWORD Größe der Dimension (z.b. 512 Pixel) 4 DWORD Abstand zwischen Sb-Dimensionen (z.b. Byte-Abstand zwischen den Bildserien zweier afeinanderfolgender Kanalnmmern) 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Physikalische Länge mit Längeneinheit z.b. 10 µm 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Physikalische Startposition mit Längeneinheit z.b. 10 µm 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in Bytes ntc wchar Name der Bildserie 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in Bytes ntc wchar Beschreibng der Bildserie,GHQWLILNDWLRQVQXPPHUQ,'I U%LOGGLPHQVLRQHQ Folgende Identifikationsnmmern sind möglich: ID (dezimal) Bedetng 0 ndefiniert Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 54 von 263

55 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN 120 x 121 y 122 z 116 t für Zeitdimension Kanalnmmer Wellenlänge Rotation x-wide für den motorisierten xy-tisch y-wide für den motorisierten xy-tisch z-wide für den z-tisch ser1 (nicht spezifiziert) ser2 (nicht spezifiziert) ser3 (nicht spezifiziert) Grawert z.b. von Histogramm Grawert1 z.b. von Histogramm Grawert2 z.b. von Histogramm Grawert3 z.b. von Histogramm logisches x (nicht physikalischer sondern logischer Positionswert) logisches y (nicht physikalischer sondern logischer Positionswert) logisches z (nicht physikalischer sondern logischer Positionswert) logisches t (nicht physikalischer sondern logischer Positionswert) logischer Wellenlängenwert (nicht physikalischer sondern logischer Wert) logischer Rotationswert (nicht physikalischer sondern logischer Wert) logischer x-wide-wert (nicht physikalischer sondern logischer Wert) logischer y-wide-wert (nicht physikalischer sondern logischer Wert) logischer z-wide-wert (nicht physikalischer sondern logischer Wert) 6SHLFKHUEORFN,'B),/7(56(7 Dieser Speicherblock beschreibt die Hardwareeinstellngen wie beispielsweise Pinholedrchmesser oder die asgewählten Filte. Der Speicherblock beginnt mit einem SAFEARRAY header, der die Menge nd die Größe der Einträge beschreibt. Eine vollständige Beschreibng der SAFEARRAY- Strktr, siehe Anhang 1. Von der SAFEARRAY -Strktr werden derzeit lediglich drei Einträge bentzt: VDF'LPV sollte = 1 sein. Es werden derzeit nr eindimensionale Datenfedler (Arrays) bentzt. VDFE(OHPHQWV Größe der Elemente in Byte VDUJVDERXQG>@F(OHPHQWV gibt an, wieviele Elemente in der Strktr enthalten sind Größe [byte] Datentyp Symbol Beschreibng 24 SAFEARRAY sa Microsoft-Typ, siehe Anhang 1 für alle Elemente, die die Strktr enthält = sa.rgsabond[0].celements 128 wchar Bezeichner für den Inhalt des Eintrags 64 wchar Name einer Krzbeschreibng, z.b. eine tiff-beschreibngs-marke (tiff-tag) 64 wchar Zeichenkette (hier steht der Inhalt der Zeichenkette) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 55 von 263

56 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN 16 VARIANT beinhaltet den Datentyp nd den Datenwert (mit Asnahme des Datentyps "string" (Zeichenkette); dieser wird im obigen Feld beschrieben) 4 DWORD separater Speicherplatz für Datenwerte 4 DWORD nbentzt 4 DWORD Bezeichner (ID) des Speicherblocks (nr für internen Gebrach) 4 DWORD Testwert 6SHLFKHUEORFN,'B7,0(,1)2 Dieser Speicherblock beinhaltet Zeitmarker für Bildserien, die mit einem zeitabhängigen Scanmods afgenommen wrden. Größe Datentyp Symbol Beschreibng [Byte] 4 int ndims gibt an, wieviele Dimensionen die Beschreibng des Zeitmarkers mfasst 4 int gibt an, welche Dimension mit einem Zeitmarker versehen wrde Für die nächsten Q Dimensionen 4 DWORD Bezeichner (ID) der Dimension (siehe Beschreibng des Speicherblocks D_DIMDESCR) 4 DWORD Größe der Dimension (Anzahl Elemente z.b. 512 Pixel) 4 DWORD Abstand zwischen den einzelnen Dimensionseinträgen 4 int nts Anzahl der Zeitmarker Für die nächsten QZeitmarker = nts 64 wchar Zeitmarker als Zeichenkette (Datentyp "string") 4 int ntm Anzahl der Zeitmarken pro Zeitmarker Für die nächsten P Zeitmarken = ntm 4 int nc Anzahl von Dimensionen der Zeitmarkerbeschreibng loop nc 4 int Koordinate in dieser Dimension 64 wchar Zeitmarke als Zeichenkette (Datentyp wchar) %HLVSLHO Bild mit folgenden Dimensionen nd Dimensionsgrößen: x y ch z Die Beschreibng einer Zeitmarke latet z.b. 512_512_3_10. Diese Beschreibng passtgena zr Beschreibng des Bildes. Eine Zeitmarkerbeschreibng 1024_1024_3_10 für obiges Beispielbild bedeted, dass das Originalbild eine xy-dimension von 1024*1024 hatte nd per Software redziert wrde (downsampling). In solchen Fällen mss die Zeitmarke entsprechend ne berechnet werden. Eine Zeitmarke kann z jedem Zeitpnkt während eines n-dimensionalen Datenafnahmeprozesses (Scan) definiert werden. Eine Koordinate einer Zeitmarke von 0_0_2_7 bedetet, dass die Zeitmarke z Beginn eines Datensatzes (0_0_c_#) im zweiten Kanal (0_0_2_#) für den 7. optischen Schnitt(0_0_2_7) gesetzt wrde. 6SHLFKHUEORFN,'B6&$11(56(7 Dieser Speicherblock beinhaltet Geräteparameter, die zm Zeitpnkt der Bildafnahme eingestellt Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 56 von 263

57 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN werden. Weitere Details über die SAFEARRAY-Strktr, finden Sie in der Beschreibng des Speicherblocks ID_FILTERSET. Größe Datentyp Symbol Beschreibng [Byte] 24 SAFEARRAY sa Microsofttyp, siehe Anhang für alle Elemente, die die Strktr enthält = sa.rgsabond[0].celements 128 wchar Bezeichner für den Inhalt dieses Eintrags 64 wchar Name für eine Krzbeschreibng z.b. in der tiff- Beschreibngs Marke (tiff-description-tag) 64 wchar Zeichenkette (hier steht der Inhalt der Zeichenkette) 20 VARIANT beinhaltet den Datentyp nd den Datenwert (mit Asnahme des Datentyps "string" (Zeichenkette); dieser wird im obigen Feld beschrieben) 4 DWORD separater Speicherplatz für Datenwerte 4 DWORD nbentzt 4 DWORD Bezeichner (ID) des Speicherblocks (nr für internen Gebrach) 4 DWORD Testwert 6SHLFKHUEORFN,'B(;3(5,0(17 Beschreibng des bentzten Speicherformates (z.b. *.lei file with PC-Tiff images ) Größe [Byte] Datentyp Symbol Beschreibng 4 int interne Versionsnmmer 4 int Anzahl von Bildern in der Datensammlng des Experimentes 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Krzbeschreibng des Formats 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Dateiendng der Haptdatei 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Bezeichner des Einzelbildformats (z.b. PC-TIFF) 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in wchar ntc * 2 wchar Dateiendng für das Einzelbildformat (z.b. tif / raw) 6SHLFKHUEORFN,'B/87'(6& Beschreibng der Farbzordnngstabellen (LUT's) Größe[Byte] Datentyp Symbol Beschreibng 4 int nlu Anzahl von Kanälen 4 DWORD Bezeichner (ID) der Dimension, deren Darstellng eingefärbt wird. Für die nächsten Kanäle bis = nlu 4 int interne Versionsnmmer 1 bool bool IsInverted 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in Bytes ntc wchar Beschreibng der Farbzordnngstabelle (LUT) 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in Bytes ntc wchar Dateiname der Farbzordnngstabelle (falls vorhanden) 4 int ntc Länge der folgenden Zeichenkette in Bytes ntc wchar Name der Farbzordnngstabelle selbst 4 int Feld zr internen Verwendng 4 int Dimension der Farbzordnngstabelle Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 57 von 263

58 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN 6$)($55$<'DWD7\SH typedef strct FARSTRUCT tagsafearray { nsigned short cdims; // Cont of dimensions in this array nsigned short ffeatres; // DON T CARE nsigned long cbelements; // Size of an element of the array. // Does not inclde size of // pointed-to data. nsigned long clocks; // DON T CARE void HUGEP* pvdata; // Pointer to the data. SAFEARRAYBOUND rgsabond[1]; // One bond for each dimension. } SAFEARRAY; 'DVOHLFDVSH]LILVFKH'DWHLIRUPDW/(,EHQXW]WQXUHLQGLPHQVLRQDOH'DWHQIHOGHU $UUD\V 6$)($55$<%281' Strctre Represents the bonds of one dimension of the array. The lower bond of the dimensionis represented byllbond, and celements represents the nmber of elements in the dimension. The strctre is defined as follows: typedef strct tagsafearraybound { nsigned long celements; // nm of elements long llbond; // DON T CARE } SAFEARRAYBOUND; 9$5,$17DQG9$5,$17$5* typedef strct FARSTRUCT tagvariant VARIANT; typedef strct tagvariant { VARTYPE vt; nsigned short wreserved1; nsigned short wreserved2; nsigned short wreserved3; nion { nsigned char bval; // VT_UI1. short ival; // VT_I2. long lval; // VT_I4. float fltval; // VT_R4. doble dblval; // VT_R8. VARIANT_BOOL boolval; // VT_BOOL. SCODE scode // VT_ERROR. CY cyval; // VT_CY. DATE date; // VT_DATE. BSTR bstrval; // VT_BSTR. IUnknown FAR* pnkval; // VT_UNKNOWN. IDispatch FAR* pdispval; // VT_DISPATCH. SAFEARRAY FAR* parray; // VT_ARRAY *. nsigned char FAR* pbval; // VT_BYREF VT_UI1. short FAR* pival; // VT_BYREF VT_I2. long FAR* plval; // VT_BYREF VT_I4. float FAR* pfltval; // VT_BYREF VT_R4. doble FAR* pdblval; // VT_BYREF VT_R8. VARIANT_BOOL FAR* pboolval; // VT_BYREF VT_BOOL. SCODE FAR* pscode; // VT_BYREF VT_ERROR. CY FAR* pcyval; // VT_BYREF VT_CY. DATE FAR* pdate; // VT_BYREF VT_DATE. BSTR FAR* pbstrval; // VT_BYREF VT_BSTR. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 58 von 263

59 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN }; IUnknown FAR* FAR* ppnkval; // VT_BYREF VT_UNKNOWN. IDispatch FAR* FAR* ppdispval; // VT_BYREF VT_DISPATCH. SAFEARRAY FAR* FAR* pparray; // VT_ARRAY *. VARIANT FAR* pvarval; // VT_BYREF VT_VARIANT. void FAR* byref; // Generic ByRef. };,Q'DWHLHQPLWGHP/(,)RUPDWZHUGHQQLHPDOV3RLQWHUDOV3DUDPHWHUYHUZHQGHW 9$57<3( typedef nsigned short VARTYPE; enm VARENUM{ VT_EMPTY = 0, // Not specified. VT_NULL = 1, // Nll. VT_I2 = 2, // 2-byte signed int. VT_I4 = 3, // 4-byte signed int. VT_R4 = 4, // 4-byte real. VT_R8 = 5, // 8-byte real. VT_CY = 6, // Crrency. VT_DATE = 7, // Date. VT_BSTR = 8, // Binary string. VT_DISPATCH = 9, // IDispatch VT_ERROR = 10, // Scodes. VT_BOOL = 11, // Boolean; Tre=-1, False=0. VT_VARIANT = 12, // VARIANT FAR*. VT_UNKNOWN = 13, // IUnknown FAR*. VT_UI1 = 17, // Unsigned char. // Other constants that are not valid in VARIANTs omitted here. }; VT_RESERVED = (int) 0x8000 // By reference, a pointer to the data is passed. VT_BYREF = (int) 0x4000 VT_ARRAY = (int) 0x2000 // A safe array of the data is passed. Der vt-wert bestimmt die Interpretation der Daten des Experiments wie folgt: :HUW %HVFKUHLEXQJ VT_EMPTY Kein Wert wrde angegeben VT_UI1 Ein nbenanntes 1-byte Zeichen wrde gespeichert in E9DO. VT_I2 Ein 2-byte Ganzzahlwert (Integer) wrde gespeichert in L9DO. VT_I4 Ein 4-byte Ganzzahlwert (Integer) wrde gespeichert in O9DO. VT_R4 Ein IEEE 4-byte Gleitzahlwert (real vale) wrde gespeichert iniow9do. VT_R8 Ein IEEE 8-byte Gleitzahlwert (real vale) wrde gespeichert in GEO9DO. VT_CY Ein Fixkommawert wrde angegeben. Der Fixkommawet besteht as 15 Stellen vor dem Komma nd 4 Stellen nach dem Komma. Der Wert wrde gespeichert in F\9DO. VT_BSTR Asnahme für Dateien im Lei-Format: Eine Zeichenkette wrde in der VariablenTCHAR gespeichert Ein gleitender Nllwert wrde angegeben. Die gleitende Nll ist dabei kein NULL- VT_NULL Zeiger. Dieser Wert wird benötigt für eine 3-Zstandslogik wie z.b. in der Datenbankabfragesprache SQL. VT_ERROR Ein SCODE-Fehler wrde angegeben.der Fehlertyp is spezifiziert in VFRGHH. Eine Boolesche Größe (wahr / falsch) wrde angegeben. VT_BOOL Der Wert 0xFFFF (alle Bits=1) bedetet "wahr", der Wert 0 (alle Bits=0) bedetet "falsch". Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 59 von 263

60 $OOJHPHLQHUhEHUEOLFN VT_DATE Ein Wert, der einem Datm entspricht, wrde angegeben. Ein Datm wird gespeichert als Zahl im doble-precision Format. Alle Daten werden gespeichert als Differenztage zm 01.Janar Der Eintrag "25" beispielsweise entspronlinehilfe für TCS SP2icht dem Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 60 von 263

61 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq 9RUJHKHQVZHLVHQXQGhEXQJHQ]XDXVJHZlKOWHQ 3UR]HVVHQ $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Klicken Sie af das Pfeilsymbol «$FTXLUH» nd öffnen Sie mit der Taste «Beam» das Dialogfenster «Beam Path Setting». Doppelklicken Sie in diesem Dialogfenster im Listenfeld oben rechts af einen $XIQDKPHSDUDPHWHUVDW],36, m wichtige Hardwareeinstellngen z laden. :DVLVWHLQ$XIQDKPHSDUDPHWHUVDW]" Ein Afnahmeparametersatz (IPS:,nstrment 3arameter 6etting) ist eine Datei, in der alle für eine bestimmte Afnahmetechnik spezifischen Hardwareeinstellngen abgespeichert werden. «FITC-TRITC» beispielsweise bezeichnet die Einstellngen für eine Zweikanalafnahme mit den beiden Floreszenzfarbstoffen FITC nd TRITC. Mit einem Afnahmeparametersatz können optimierte Hardwareeinstellngen in einer Datei abgespeichert nd mit einem einfachen Doppelklick wieder geladen werden. Mit einem «/» gekennzeichnete Afnahmeparametersätze sind von Leica vordefiniert nd können nicht verändert werden. Bentzerdefinierte, editierbare Afnahmeparametersätze werden im Verzeichnisbam nter «8»gespeichert. :LHPDQEHQXW]HUGHILQLHUWH$XIQDKPHSDUDPHWHUVlW]H,36HU]HXJW Ordnen Sie jedem aktiven 'HWHNWLRQVNDQDO 307ª die Farbzordnngstabelle «Glow(O&U)» z. Klicken Sie af das Symbol der Farbzordnngstabelle Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 61 von 263

62 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af «Glow (O&U)» nd af «OK» +LQZHLV]XU%LOGTXDOLWlW Die Farbzordnngstabelle «Glow (O&U)» visalisiert Maximalwerte bla nd Minimalwerte grün. Damit ist sie für die Optimierng der Bildqalität bestens geeignet. In Schritt 12 wird beschrieben, wie man mit Hilfe dieser Farbzordngstabelle den Intensitätswertebereich einer Afnahme für die Darstellng am Monitor optimiert. Bevor Sie mit der Optimierng der Bildqalität beginnen, überprüfen Sie die Standardeinstellngen der im Folgenden in Schritt 5 bis 9 genannten Afnahmeparameter, die während der Bildafnahme nicht mehr verändert werden können. Klicken Sie af die Taste «2EMHFWLYH» nd wählen Sie in der Liste ein Mikroskopobjektiv as. Falls keine Einträge in der Liste erscheinen, müssen die Mikroskopobjektive den Steckplätzen des Objektivrevolvers zgeordnet werden. Lesen Sie daz die Hilfebeschreibng der Taste «Objective», indem Sie zerst af die Taste «Help» nd dann af «Objective» klicken. +LQZHLV]XU%LOGTXDOLWlW Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 62 von 263

63 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Die nmerische Apertr des Mikroskopobjektivs bestimmt die Aflösng des Bildes, das heißt den minimalen Abstand zwischen zwei Pnkten im Objekt, die noch als getrennt im Bild dargestellt werden können. Stärker vergrössernde Objektive haben ach ein größeres Aflösngsvermögen. Mit der Strahlafweitng (Taste «Beam Expander») kann der Strahldrchmesser des Laserstrahls optimal an die Linse des aktell verwendeten Objektivs angepasst werden. Die Standardeinstellng «Beam Exp 6» ist in den meisten Fällen optimal. Bei der Verwendng schwacher Laser nd hochaflösender Objektive kann drch Verwendng einer geringeren Strahlafweitng die Belechtng der Objektivlinse noch verbessert werden. Klicken Sie af die Taste «0RGH» nd wählen Sie einen Scanmods as. Mit dem Scanmods bestimmen Sie die Dimensionalität der Bildafnahme. Sie können zwischen den Rambildserien «xyz, xzy», den Zeitbildserien «xt, xyt, xzt, xyzt» nd den Spektralbildserien «xyλ, xzλ» wählen. Klicken Sie af die Taste «)RUPDW» nd wählen Sie ein Scanformat as. +LQZHLV]XU%LOGTXDOLWlW Das Scanformat bestimmt die Anzahl der Pnkte, mit der der Scanner das Präparat abtastet nd damit die Anzahl der Pixel des Bildes. Je grösser das Scanformat bei einem gegebenen Scanfeld ist, desto geringer wird der Abstand zwischen den Abtastpnkten nd desto besser ist Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 63 von 263

64 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq die Aflösng des Bildes. Klicken Sie af die Taste «6SHHG» nd wählen Sie die Scangeschwindigkeit as. Mit der Scangeschwindigkeit legen Sie fest, wieviele Bildzeilen pro Seknde vom Scanner abgetastet werden. +LQZHLV]XU%LOGTXDOLWlW Mit der Scangeschwindigkeit beeinflsst man die Bildqalität. Je geringer die Scangeschwindigkeit bei einem gegebenen Scanformat ist, desto besser ist das Signal/ Rasch-Verhältnis des Bildes. Verdoppeln Sie noch die Scangeschwindigkeit, indem Sie drch Betätigen der Taste «Scan» den Bidirektionalen Scan aktivieren. Beim Bidirektionalen Scan wird nicht nr der Hin- sondern ach der Rücklaf des Scanners für die Abtastng verwendet. Klicken Sie af die Taste «%LW» nd wählen Sie die Bittiefe as. Bei 8 Bit können 256, bei 12 Bit 4096 verschiedene Intensitätswerte afgenommen werden. Starten Sie nn mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan, m die Bildqalität während der Bildafnahme z optimieren. Klicken Sie af die Taste «6HULHV» nd wählen Sie für die Bildafnahme eine geeignete Foksebene (Z-Position), in der Regel die hellste Stelle im Präparat. Ziehen Sie das gelbe Qadrat an die gewünschte Z-Position RGHU Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 64 von 263

65 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Doppelklicken Sie af «Absolte Position» nd geben Sie einen Wert ein. +LQZHLV]XP)LQGHQGHU)RNXVHEHQH Falls Sie Schwierigkeiten haben, die Foksebene z finden, kann es daran liegen, dass die Signalverstärkng der Detektoren nicht richtig eingestellt ist. Klicken Sie af die Taste «Signal» nd stellen Sie den «Gain»-Wert der aktiven Detektionskanäle af die maximale Voltzahl. Viele Afnahmeparameter sind schneller nd beqemer über die Bedienkonsole als über die Tasten einzstellen. :LHPDQPLWGHU%HGLHQNRQVROH$XIQDKPHSDUDPHWHUHLQVWHOOW Klicken Sie af die Taste «6LJQDO» nd stellen Sie die Signalverstärkng (Gain) nd den Schwellenwert (Offset) getrennt für jeden verwendeten Detektor (PMT) ein. Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af die Zahl nd geben Sie einen Wert Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 65 von 263

66 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq ein. Stellen Sie den «Gain»-Wert so ein, dass die hellsten Stellen im Bild (Strktr) bla dargestellt werden. Stellen Sie den «Offset»-Wert so ein, dass die dnklen Stellen im Bild (Hintergrnd) grün dargestellt werden. Als grobe Regel gilt, dass ngefähr die Hälfte des Hintergrnds grün dargestellt werden sollte. +LQZHLV]XU%LOGTXDOLWlW Die Adaptation der Detektionsparameter af das Präparat stellt sicher, dass der in der Bildafnahme vorliegende Intensitäts- wertebereich optimal dem digitalen Wertebereich zgeordnet nd visalisiert wird. Viele Afnahmeparameter sind schneller nd beqemer über die Bedienkonsole als über die Tasten einzstellen. :LHPDQPLWGHU%HGLHQNRQVROH$XIQDKPHSDUDPHWHUHLQVWHOOW Klicken Sie af die Taste «3LQKROH» nd stellen Sie die Detektionslochblende af eine Airy- Einheit. +LQZHLV]XU%LOGTXDOLWlW Die Detektionslochblende ist entscheidend für die Aflösng des Bildes. Mit der Einstellng der Detektionslochblende af eine Airy-Einheit stellt man sicher, dass die Dicke eines optischen Schnittes minimal ist nd man somit eine maximale Aflösng in der z-dimension des Bildes erreicht. Viele Afnahmeparameter sind schneller nd beqemer über die Bedienkonsole als über die Tasten einzstellen. :LHPDQPLWGHU%HGLHQNRQVROH$XIQDKPHSDUDPHWHUHLQVWHOOW Klicken Sie af die Taste «(OHFWURQLF =RRP» nd vergrößern Sie den Bereich, der afgenommen werden soll. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 66 von 263

67 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq +LQZHLV]XU%LOGTXDOLWlW Mit dem Elektronischen Zoom kann die Aflösng des Bildes verbessert werden. Ist zm Beispiel der Vergrößerngsfaktor 2.00 asgewählt, wird nr ein Viertel des maximalen Scanfeldes abgetastet. Bei einem gegebenen Scanformat verringert sich so der Abstand zwischen den Abtastpnkten nd verbessert sich die Aflösng. Viele Afnahmeparameter sind schneller nd beqemer über die Bedienkonsole als über die Tasten einzstellen. :LHPDQPLWGHU%HGLHQNRQVROH$XIQDKPHSDUDPHWHUHLQVWHOOW Klicken Sie af die Taste «&RQWLQXRXV», m die Bildafnahme im Endlosscan z beenden. l Sie haben jetzt alle wichtigen Afnahmeparameter eingestellt nd können mit der Afnahme von Bildserien fortfahren. $XIQDKPHSDUDPHWHUPLWGHU%HGLHQNRQVROHHLQVWHOOHQ Viele Afnahmeparameter sind schneller nd beqemer über die %HGLHQNRQVROH als über die Tasten der Software einzstellen. Den sieben Drehknöpfen der Bedienkonsole können verschiedene Afnahmeparameter zgeordnet werden, die dann von der Bedienkonsole gesteert werden können. +LQZHLV Die Statszeile der Bedienkonsole wird am nteren Rand der Bedienoberfläche eingeblendet. Ist dies nicht der Fall, wählen Sie «View\ Stats Bars\ Control Panel Stats Bar». Laden Sie eine YRUGHILQLHUWH%HOHJXQJ für die Drehknöpfe der Bedienkonsole. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 67 von 263

68 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Die drei kleinen Schaltflächen für die Konfigration der Bedienkonsole befinden sich am rechten Rand der Statszeile der Bedienkonsole. Klicken Sie af die mittlere der drei Schaltflächen. Wählen Sie eine der vordefinierten Belegngen as, zm Beispiel «Standard». In der Statszeile werden in sieben Feldern die der Bedienkonsole zgeordneten Afnahmeparameter angezeigt. Die Anordnng dieser Felder entspricht der Anordnng der Drehknöpfe der Bedienkonsole. Sie können die %HOHJXQJ der Drehknöpfe der Bedienkonsole nach Ihren Bedürfnissen ändern. Klicken Sie in der Statszeile der Bedienkonsole af das Feld (Drehknopf), dem Sie einen anderen Afnahmeparameter zordnen wollen. Wählen Sie im Listenfeld den neen Afnahmeparameter as, der dem entsprechenden Drehknopf der Bedienkonsole zgeordnet werden soll. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 68 von 263

69 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Wählen Sie «Gain PMT 1..» oder «Offset PMT 1...», wenn Sie die Signalverstärkng nd den Schwellenwert für den entsprechenden Detektor einstellen wollen. Entspricht dieser Taste in der Software: Wählen Sie «Phase», m eine mögliche Phasen- verschiebng z korrigieren, wenn Sie mit dem bidirektionalen Scan arbeiten. Entspricht dieser Taste in der Software: Wählen Sie «Pinhole», wenn Sie den Drchmesser der Detektionslochblende einstellen wollen. Entspricht dieser Taste in der Software: Wählen Sie «Scan Field Rotation», wenn Sie die Rotation des Scanfeldes einstellen wollen. Entspricht dieser Taste in der Software: Wählen Sie «Z Position» nd «Z Wide Position», wenn Sie die Foksebene (Z-Position) einstellen wollen. Entspricht diesen Tasten in der Software: Wählen Sie «Zoom», wenn Sie den Vergrößerngsfaktor des Elektronischen Zooms einstellen wollen. Entspricht dieser Taste in der Software: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 69 von 263

70 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Mit «Smart Gain» nd «Smart Offset» stellen Sie die Signalverstärkng nd den Schwellenwert des Detektionskanals ein, den Sie zvor im Ansichtsfenster Viewer angeklickt haben. Mit «Macro» speichern Sie den aktell asgeführten Befehl als Makro ab. Die $QVSUHFKHPSILQGOLFKNHLW der Drehknöpfe kann variiert werden. Z diesem Zweck klicken Sie in der Statszeile der Bedienkonsole mit der rechten Mastaste af einen Afnahmeparameter. Bei den Afnahmeparametern «Phase», «Pinhole», «Scan Field Rotation» nd «Zoom» kann man zwischen drei Empfindlichkeitsstfen wählen. Bei den Afnahmeparametern «Gain», «Offset», «Smart Gain» nd «Smart Offset» kann die Anzahl Volt pro Drehng des Drehknopfs variiert werden. Wählen Sie «others...» m einen bentzerdefinierten Wert einzgeben. Bei den Afnahmeparametern «Z Position» nd «Z Wide Position» kann die Anzahl Mikrometer pro Drehng des Drehknopfs variiert werden. Wählen Sie «others...» m einen bentzerdefinierten Wert einzgeben. Beim Afnahmeparameter «Z Wide Position» gibt es zsätzlich die Standardeinstellng «Atomatic». 6WDQGDUGHLQVWHOOXQJ $XWRPDWLFªEHL =:LGH3RVLWLRQª Bei der Standardeinstellng «Atomatic» wird die Empfindlichkeit des Drehknopfes in Abhängigkeit des Vergrößerngsfaktors des verwendeten Objektivs atomatisch eingestellt: Bei Objektiven mit einer Vergrößerng m < 10 wird die Einstellng SC = 150 µ m pro Umdrehng verwendet. Bei Objektiven mit einer Vergrößerng 10 < m < 20 wird die Einstellng S3 = 15 µ m pro Umdrehng verwendet. Bei Objektiven mit einer Vergrößerng 20 < m < 30 wird die Einstellng S2 = 7 µ m pro Umdrehng verwendet. Bei Objektiven mit einer Vergrößerng 30 < m < 60 wird die Einstellng S1 = 1 µm pro Umdrehng verwendet. Bei Objektiven mit einer Vergrößerng m > 60 wird die Einstellng S0 = 0,5 µ m pro Umdrehng verwendet. Speichern Sie die QHXH=XRUGQXQJ als bentzerdefinierte Belegng ab. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 70 von 263

71 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af die linke der drei Schaltflächen. Geben Sie der Belegng einen Namen nd klicken Sie af OK. Es stehen Ihnen optionale Befehle zr Verfügng, wenn Sie die QHX GHILQLHUWH %HOHJXQJ markieren nd das Kontextmenü mit der rechten Mastaste öffnen. Klicken Sie af die rechte der drei Schaltflächen. Die nee definierte Belegng der Bedienkonsole erscheint im Listenfeld nter «8». Immer wenn Sie af «My Lovely Template» doppelklicken, wird die entsprechende Belegng geladen. Wählen Sie «Set as defalt template», wenn die Belegng standardmäßig beim Öffnen der Software geladen werden soll. Wählen Sie «Remove defalt setting», m die Einstellng als Standardbelegng rückgängig z machen. Wählen Sie «Load», m die Belegng z laden. Wählen Sie «Rename», m der Belegng einen neen Namen z geben. Wählen Sie «Delete», m die Belegng z löschen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 71 von 263

72 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq %HQXW]HUGHILQLHUWH$XIQDKPHSDUDPHWHUVlW]H,36HU]HXJHQ Klicken Sie af das Pfeilsymbol «$FTXLUH» nd Path Setting». öffnen Sie mit der Taste «Beam» das Dialogfenster «Beam In diesem Dialogfenster werden die Afnahmeparametersätze im /LVWHQIHOG REHQ UHFKWV eingeblendet. :DVLVWHLQ$XIQDKPHSDUDPHWHUVDW]" Ein Afnahmeparametersatz (IPS:,nstrment 3arameter 6etting) ist eine Datei, in der alle für eine bestimmte Afnahmetechnik spezifischen Hardwareeinstellngen abgespeichert werden. «FITC-TRITC» beispielsweise bezeichnet die Einstellngen für eine Zweikanalafnahme mit den beiden Floreszenzfarbstoffen FITC nd TRITC. Mit einem Afnahmeparametersatz können optimierte Hardwareeinstellngen in einer Datei abgespeichert nd mit einem Doppelklick wieder atomatisch geladen werden. Mit einem «/» gekennzeichnete Afnahmeparametersätze sind von Leica vordefiniert nd können nicht verändert werden. Bentzerdefinierte, editierbare Afnahmeparametersätze werden im Verzeichnisbam nter «8»gespeichert. Wählen Sie «7RROV?6HWWLQJV?,QVWU3DUDPHWHU6HWWLQJV» nd legen Sie zerst die Parameter fest, die beim Laden des neen Afnahmeparametersatzes berücksichtigt werden sollen. Wählen Sie «Tools/ Settings/ Instr. Parameter Settings». Wählen Sie die Option «IPS-DobleClick» nd markieren Sie im Listenfeld die gewünschten Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 72 von 263

73 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Afnahmeparameter. Um die Afnahmeparameter während der Bildafnahme af das aktell verwendete Präparat anzpassen, starten Sie mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan. $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Klicken Sie im Dialogfenster «Beam Path Setting» af die Schaltfläche «6DYH», m die modifizierten Parameterein- stellngen als Afnahmeparametersatz abzspeichern. Geben Sie dem neen Afnahmeparametersatz einen Namen nd klicken Sie af OK. Der ne definierte Afnahmeparametersatz erscheint im Listenfeld nter «8». Immer wenn Sie af «My Gorgeos IPS» doppelklicken, werden alle nter diesem Afnahme- parametersatz abgespeicherten Hardwareeinstellngen geladen. :RZHUGHQ$XIQDKPHSDUDPHWHUVlW]HJHVSHLFKHUW" Bentzerdefinierte Afnahmeparametersätze werden im Verzeichnis des nter Windows NT aktell angemeldeten Bentzers gespeichert. Als Standardeinstellng befindet sich das Verzeichnis der Bentzer nter D:\sers\... Zgriff af einen Afnahmeparametersatz hat deshalb immer nr der Bentzer, der diesen ach erzegt hat. Sollen mehrere Bentzer Zgriff af einen bentzerdefinierten Parametersatz haben, mss dieser vom Ersteller oder Administrator für andere Bentzer freigegeben werden. Sie können anderen Bentzern den =XJULII af Ihren Afnahmeparametersatz ermöglichen. Öffnen Sie im Windows Explorer das Verzeichnis, wo die Afnahmeparametersätze abgespeichert sind. Als Standard- einstellng befindet sich dieses, zm Beispiel für einen als Administrator angemeldeten Bentzer, nter D:\ sers\ Administrator\ Lcs\ Instrment Parameter Settings\... Markieren Sie den Afnahmeparametersatz, öffnen Sie mit der rechten Mastaste das Kontextmenü nd wählen Sie «Properties». Klicken Sie in diesem Dialogfenster af das Register «Secrity» nd dann af «Permissions». Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 73 von 263

74 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie im Dialogfenster «File Permissions» af die Schaltfläche «Add..», m die Bentzer aszwählen, die eine Zgriffsberechtigng erhalten sollen. Wählen Sie im Feld «Names» die gewünschten Bentzer as, zm Beispiel «Everyone», nd klicken Sie af «Add» Vergeben Sie im Listenfeld «Type of Access» dem neen Bentzer den Rechtestats «Fll Access» nd schließen Sie das Dialogfenster mit «OK». Kopieren Sie im Windows Explorer die Datei des Afnahmeparametersatzes in das Verzeichnis C:\Program files\ Leica\ Lcs\ Instrment Parameter Settings\...:LFKWLJ9HUZHQGHQ 6LHGD]XGHQ%HIHKO.RSLHUHQªQLFKW $XVVFKQHLGHQª Wenn Sie das Dialogfenster «Beam Path Setting» das nächste Mal öffnen, wird der Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 74 von 263

75 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Afnahmeparametersatz nter «/» angezeigt nd ist damit für alle Bentzer zgänglich. Es stehen Ihnen optionale Befehle zr Verfügng, wenn Sie den QHX GHILQLHUWHQ $XIQDKPHSDUDPHWHUVDW] markieren nd das Kontextmenü mit der rechten Mastaste öffnen. Wählen Sie «Set as defalt setting», wenn der Parametersatz standardmäßig beim Öffnen der Software geladen werden soll. Wählen Sie «Remove defalt setting», m die Einstellng als Standardparametersatz rückgängig z machen. Wählen Sie «Load», m den Parametersatz z laden. Wählen Sie «Rename», m dem Parametersatz einen neen Namen z geben. Wählen Sie «Delete», m den Parametersatz z löschen. Sollte die *HVFKZLQGLJNHLW, mit der der Afnahme- parametersatz geladen wird, z langsam sein, können Sie einen Schnellmods aktivieren. Wählen Sie «Tools\ Settings\ Scan Options». Aktivieren Sie den Schnellmods, indem Sie das Kontrollkästchen «Fast IPS Exection» anklicken. +LQZHLV Wenn Sie Afnahmeparametersätze öffnen, die nicht mit der aktell verwendeten Version der Leica Confocal Software erstellt wrden, kann der Schnellmods nter Umständen nicht verwendet werden. Sie erhalten dann eine Fehlermeldng nd müssen das System ne starten. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 75 von 263

76 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Um die Afnahmeparametereinstellngen eines bereits vorhandenen Experiments für eine nee Bildafnahme wieder z verwenden, öffnen Sie das Experiment nd klicken Sie af die Taste «$SSO\». Wählen Sie «Tools\ Settings\ Instr. Parameter Settings» nd legen Sie die Afnahmeparameter fest, die drch Betätigen der Taste «Apply» übernommen werden sollen. Wählen Sie «Tools/ Settings/ Instr. Parameter Settings». Wählen Sie die Option «IPS-Apply» nd markieren Sie im Listenfeld die gewünschten Afnahmeparameter. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 76 von 263

77 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq 5DXPELOGVHULHQDXIQHKPHQ Klicken Sie af das Pfeilsymbol «$TXLUH» nd dann af die Taste «Mode» nd wählen Sie den Scanmods «xyz» oder «xzy» as. Wählen Sie den Scanmods «xyz», wenn Sie einen Stapel as horizontalen Einzelbildern (orthogonal zr optischen Achse) afnehmen wollen. Wählen Sie den Scanmods «xzy», wenn Sie einen Stapel as vertikalen Einzelbildern (parallel zr optischen Achse) afnehmen wollen. :HOFKH6FDQPRGLZHUGHQDQJH]HLJW" Die Zahl der zr Verfügng stehenden Scanmodi hängt von der Art des verwendeten Z- Stellantriebs ab. Der Z-Stellantrieb wird mit der Taste «z-scan» eingestellt. Es stehen alle Scanmodi zr Verfügng, wenn der galvanometerbetriebene Z-Objekttisch verwendet wird. Im Listenfeld ist die Aswahl «z-galvo» einzstellen. Es stehen nr die Scanmodi «xyz, xt, xyt, xyzt nd xyλ» zr Verfügng, wenn der elektromotorbetriebene Z-Objekttisch verwendet (oder bei inversen Mikroskopen der Objektivrevolver verfahren) wird. Im Listenfeld ist die Aswahl «z-wide» einzstellen. Öffnen Sie mit der Taste «%HDP» das Dialogfenster «Beam Path Setting» nd wählen Sie die Anregngswellenlänge as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 77 von 263

78 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ein. Wählen Sie einen geeigneten $QUHJXQJVVWUDKOWHLOHU as. Ist Ihr System mit einem aksto-optischen Strahlteiler (AOBS) asgerüstet, optimiert dieser atomatisch den Strahlengang für die asgewählte Wellenlänge. Andernfalls doppelklicken Sie af die grüne Linie nd wählen einen Strahlteiler as: Wählen Sie den Dichroiten RSP 500 bei Afnahmen von FITC nd GFP mit einer Anregngswellenlänge von 488 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 600 nm. Wählen Sie den Dichroiten RSP 465 bei Afnahmen von CFP mit einer Anregngswellenlänge von 458 nm nd einer Detektionsbandbreite von 465 bis 525 nm. Wählen Sie den Doppeldichroiten DD 488 / 543 bei Afnahmen von FITC nd TRITC oder GFP nd DsRED mit einer Anregngswellenlänge von 488 nd 543 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 530 nm bzw. 555 bis 700 nm. Wählen Sie den Tripeldichroiten TD 488 / 543 / 633 bei Afnahmen von FITC, TRITC nd CY5 mit einer Anregngswellenlänge von 488, 543 nd 633 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 535 nm, 555 bis 620 nm bzw. 650 bis 750 nm. Wählen Sie den Netralteiler RT 30/70 bei Reflektions- afnahmen. Wählen Sie einen oder mehrere 'HWHNWLRQVNDQlOH 307ª nd stellen Sie den verwendeten Floreszenzfarbstoff nd die Detektionsbandbreite ein. Klicken Sie af das Listenfeld eines Detektionskanals nd wählen Sie einen Floreszenzfarbstoff as. Die Emissionskrve des Floreszenzfarbstoffes wird im Spektrm eingeblendet. Positionieren Sie den Schieberegler nter der Emissionskrve. +LQZHLV]XU3RVLWLRQGHV'HWHNWLRQVEDQGHV Achten Sie bei Floreszenzafnahmen daraf, dass Sie das Detektionsband nicht nter der Laserlinie positionieren, da sonst Reflektionslicht mit afgenommen wird. Der Abstand von Detektionsband zr Laserlinie sollte im blaen Spektralbereich (Anregngslinie 488 nm) mindestens 5 nm betragen, im grünen Spektralbereich (Anregngslinie 543 nm) 10 nm nd im roten Spektralbereich (Anregng 633 nm) 15 nm. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 78 von 263

79 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Doppelklicken Sie af den Schieberegler des asgewählten Detektionskanals. Im Dialogfenster «Range Properties» geben Sie je eine Wellenlänge für Anfang nd Ende des Detektionsbandes ein. Klicken Sie af das Symbol der Farbzordnngstabelle. Klicken Sie af eine Farbzordnngstabelle nd af «OK». Bei der ersten Bildafnahme empfiehlt es sich, mit der Farbzordngstabelle «Glow(O&U)» z arbeiten. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 79 von 263

80 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Öffnen Sie mit der Taste «6HULHV» das Dialogfenster «Series Scan Overview» nd definieren Sie den Anfangspnkt nd den Endpnkt der Rambildserie. Scanmods xyz Scanmods xzy Um den Anfangspnkt z definieren, ziehen Sie das gelbe Qadrat an die gewünschte Z- Position (im Scanmods xyz) oder Y-Position (im Scanmods xzy) nd klicken Sie dann af das Kontrollkästchen «Begin». Um den Endpnkt z definieren, ziehen Sie das gelbe Qadrat an die gewünschte Z-Position (im Scanmods xyz) oder Y-Position (im Scanmods xzy) nd klicken Sie dann af das Kontrollkästchen «End». RGHU Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 80 von 263

81 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Doppelklicken Sie af «Absolte Position», geben Sie einen Wert ein nd klicken Sie dann af das Kontrollkästchen «Begin». Doppelklicken Sie af «Absolte Position», geben Sie einen Wert ein nd klicken Sie dann af das Kontrollkästchen «End». 5HODWLYH=3RVLWLRQLHUXQJ Wenn der elektromotorbetriebene Z-Stellantrieb verwendet wird nd mit der Taste «z-scan» die Option «z-wide» eingestellt wrde, kann eine relative Z-Position eingestellt werden. Die relative Z-Position wird relativ zm oberen Schwellenwert «Upper Threshold» berechnet, der am Mikroskopstativ eingestellt werden mss. Diese Möglichkeit der relativen Z-Positionierng besteht nr bei Mikroskopstativen des Typs DM RXA, DM RXA2, DM IRE2 nd DM LFSA (sowie bei den älteren Stativen IRBE mit der EPROM Version 2.40). Die beiden Schwellenwerte «Upper Threshold» nd «Lower Threshold» werden im Dialogfenster «Series Overview» angezeigt. Klicken Sie af die Taste «6HFWLRQV» nd legen Sie die Anzahl der Bildafnahmen zwischen Anfangs- nd Endpnkt fest. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 81 von 263

82 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Wählen Sie einen der vorgegebenen Werte oder «Others». Wenn Sie «Others» wählen, haben Sie im Dialogfenster «=<&RQILJXUDWLRQ» die Möglichkeit, die Anzahl der Afnahmen «#» oder die Schrittweite «Step size» in Abhängigkeit der Höhe des Bildstapels «Image dim.z» z berechnen. Wenn Sie die Anzahl der Afnahmen verändern nd af «Calclate» neben «#» klicken, wird die Schrittweite berechnet mit der Priorität, die Höhe des Bildstapels nverändert z lassen. Wenn Sie die Anzahl der Afnahmen verändern nd af «Calclate» neben «Step size» klicken, wird die Schrittweite berechnet mit der Priorität, die Anzahl der Afnahmen nverändert z lassen. Wenn Sie die Schrittweite verändern nd af «Calclate» neben «Step size» klicken, wird die Anzahl der Afnahmen berechnet mit der Priorität, die Höhe des Bildstapels nverändert z lassen. Wenn Sie die Schrittweite verändern nd af «Calclate» neben «#» klicken, wird die Anzahl der Afnahmen berechnet mit der Priorität, die Schrittweite nverändert z lassen. Um die Bildqalität während der Bildafnahme z optimieren, starten Sie mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 82 von 263

83 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Stellen Sie die Foksebene (Z-Position), die Detektoren nd das Detektionspinhole ein. Lesen Sie daz die Schritte 7 bis 15 im Kapitel «Afnahmeparameter für die erste Bildafnahme einstellen». $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Starten Sie mit der Taste «6HULHV» die Rambildserie. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme eines Bildes wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Line Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme einer Linie wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Klicken Sie af die Taste «Gallery», m bereits während der Bildafnahme die einzelnen Afnahmen im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. +LQZHLV Bei der Afnahme von großen Datensätzen kann die Verwendng der «Gallery» Fnktion die Afnahmeleistng verschlechtern. Für eine statistische Aswertng der Rambildserie klicken Sie af das Pfeilsymbol «4XDQWLI\» nd dann zm Beispiel af die Taste «Profile». Das Betätigen dieser Taste öffnet das Dialogfenster «Profile» nd blendet eine Messstrecke in das Bild ein. Die Messstrecke kann beliebig ne positioniert werden. Folgende Befehle stehen im Dialogfenster «Profile» zr Verfügng, wo der $XVZHUWXQJVJUDSK zsammen mit verschiedenen statistischen Werten angezeigt wird. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 83 von 263

84 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Halten Sie den Maszeiger über das Diagramm nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Export», m die Aswertngsdaten als ASCII Textdatei z exportieren. Wählen Sie «Send to» nd «Docment», m eine Bildschirmkopie des Aswertngsgraphen als nee Datei im aktiven Experiment anzlegen. Wählen Sie «Print», m den Aswertngsgraphen z drcken. Klicken Sie af das Pfeilsymbol «View» nd die Taste «Play», m die Rambildserie als Filmseqenz ablafen z lassen. Simltan daz werden der Aswertngsgraph nd die dazgehörigen Aswertngsdaten der jeweiligen Einzelbilder angezeigt. Sie können ein %LOG HLQHV 'HWHNWLRQVNDQDOV getrennt als neen Datensatz im aktiven Experiment anlegen. Klicken Sie af das Bild des gewünschten Detektionskanals. Halten Sie den Maszeiger über das Ansichtsfenster Viewer nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Selection (raw)», m die Bilddaten des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «Selection (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «All (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des Gesamtbildes als nee Datei anzlegen. Die gespeicherten Dateien befinden sich im Ansichtsfenster «Experiment Overview», wo Ihnen im Kontextmenü folgende Befehle zr Verfügng stehen: Markieren Sie eine Datei nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Activate», m die Bilddaten der Datei im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. Wählen Sie «New Window», m die aktelle Afnahme in einem zweiten Ansichtsfenster z öffnen. Sie können so dasselbe Bild zm Beispiel mit einer anderen Farbzordnngstabelle Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 84 von 263

85 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq anzeigen lassen. Wählen Sie «Delete», m die Datei z löschen. Wählen Sie «Rename», m der Datei einen neen Namen z geben. Wählen Sie «Export», m eine Afnahme im Dateiformat *.avi z exportieren. Wählen Sie «Browse Images», m alle Afnahmen eines Experiments als Miniatrbilder af der Bedienoberfläche anzzeigen. Wählen Sie «Properties», m in einem Dialogfenster eine Krzbeschreibng der Afnahme einzgeben. Sie können Dateien von einem Experiment in das andere ziehen nd verschieben (drag and drop), indem Sie die Datei mit gedrückter linker Mastaste af den Ordner des gewünschten Experiments ziehen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 85 von 263

86 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq =HLWELOGVHULHQDXIQHKPHQ Klicken Sie af das Pfeilsymbol «$FTXLUH» nd dann af die Taste «Mode» nd wählen Sie den Scanmods «xt», «xyt», «xzt» oder «xyzt» as. Wählen Sie den Scanmods «xt», wenn Sie eine Linie in regelmäßigen Zeitintervallen afnehmen wollen. Wählen Sie den Scanmods «xyt», wenn Sie horizontale Einzelbilder (orthogonal zr optischen Achse) in regelmäßigen Zeitintervallen afnehmen wollen. Wählen Sie den Scanmods «xzt», wenn Sie vertikale Einzelbilder (parallel zr optischen Achse) in regelmäßigen Zeitintervallen afnehmen wollen. Wählen Sie den Scanmods «xyzt», wenn Sie einen Stapel as horizontalen Einzelbildern (orthogonal zr optischen Achse) in regelmäßigen Zeitintervallen afnehmen wollen. Die Aswahl einer dieser Scanmodi aktiviert atomatisch die Taste «Time», die für die Afnahme einer Zeitbildserie benötigt wird: :HOFKH6FDQPRGLZHUGHQDQJH]HLJW" Die Zahl der zr Verfügng stehenden Scanmodi hängt von der Art des verwendeten Z- Stellantriebs ab. Der Z-Stellantrieb wird mit der Taste «z-scan» eingestellt. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 86 von 263

87 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Es stehen alle Scanmodi zr Verfügng, wenn der galvanometerbetriebene Z-Objekttisch verwendet wird. Im Listenfeld ist die Aswahl «z-galvo» einzstellen. Es stehen nr die Scanmodi «xyz, xt, xyt, xyzt nd xyλ» zr Verfügng, wenn der elektromotorbetriebene z-objekttisch verwendet (oder bei inversen Mikroskopen der Objektivrevolver verfahren) wird. Im Listenfeld ist die Aswahl «z-wide» einzstellen. Öffnen Sie mit der Taste «%HDP» das Dialogfenster «Beam Path Setting» nd wählen Sie die Anregngswellenlänge as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein. Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ein. Wählen Sie einen geeigneten $QUHJXQJVVWUDKOWHLOHU as. Ist Ihr System mit einem aksto-optischen Strahlteiler (AOBS) asgerüstet, optimiert dieser atomatisch den Strahlengang für die asgewählte Wellenlänge. Andernfalls doppelklicken Sie af die grüne Linie nd wählen einen Strahlteiler as: Wählen Sie den Dichroiten RSP 500 bei Afnahmen von FITC nd GFP mit einer Anregngswellenlänge von 488 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 600 nm. Wählen Sie den Dichroiten RSP 465 bei Afnahmen von CFP mit einer Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 87 von 263

88 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Anregngswellenlänge von 458 nm nd einer Detektionsbandbreite von 465 bis 525 nm. Wählen Sie den Doppeldichroiten DD 488 / 543 bei Afnahmen von FITC nd TRITC oder GFP nd DsRED mit einer Anregngswellenlänge von 488 nd 543 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 530 nm bzw. 555 bis 700 nm. Wählen Sie den Tripeldichroiten TD 488 / 543 / 633 bei Afnahmen von FITC, TRITC nd CY5 mit einer Anregngswellenlänge von 488, 543 nd 633 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 535 nm, 555 bis 620 nm bzw. 650 bis 750 nm. Wählen Sie den Netralteiler RT 30/70 bei Reflektions- afnahmen. Wählen Sie einen oder mehrere 'HWHNWLRQVNDQlOH 307ª nd stellen Sie den verwendeten Floreszenzfarbstoff nd die Detektionsbandbreite ein. Klicken Sie af das Listenfeld eines Detektionskanals nd wählen Sie einen Floreszenzfarbstoff as. Die Emissionskrve des Floreszenzfarbstoffes wird im Spektrm eingeblendet. Positionieren Sie den Schieberegler nter der Emissionskrve. +LQZHLV]XU3RVLWLRQGHV'HWHNWLRQVEDQGHV Achten Sie bei Floreszenzafnahmen daraf, dass Sie das Detektionsband nicht nter der Laserlinie positionieren, da sonst Reflektionslicht mit afgenommen wird. Der Abstand von Detektionsband zr Laserlinie sollte im blaen Spektralbereich (Anregngslinie 488 nm) mindestens 5 nm betragen, im grünen Spektralbereich (Anregngslinie 543 nm) 10 nm nd im roten Spektralbereich (Anregng 633 nm) 15 nm. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 88 von 263

89 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Doppelklicken Sie af den Schieberegler des asgewählten Detektionskanals. Im Dialogfenster «Range Properties» geben Sie je eine Wellenlänge für Anfang nd Ende des Detektionsbandes ein..olfnhq6lhdxigdv6\peroghu)due]xrugqxqjvwdehooh.olfnhq6lhdxihlqh)due]xrugqxqjvwdehoohxqgdxi 2.ª Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 89 von 263

90 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Bei der ersten Bildafnahme empfiehlt es sich, mit der Farbzordngstabelle «Glow(O&U)» z arbeiten. $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Klicken Sie af die Taste «7LPH» nd stellen Sie alle erforderlichen Parameter für die Zeitbildserie ein. Die einstellbaren Parameter sind für die verschiedenen Scanmodi einer Zeitbildserie nterschiedlich. )XQNWLRQVZHLVHGHV'LDORJIHQVWHUV 7LPH&RQILJXUDWLRQª Jeder Parameter kann in Abhängigkeit der anderen Parameter berechnet werden. Klicken Sie af den Parameter, der berechnet werden soll. Das entsprechende Eingabefeld erscheint gra. Geben Sie nn die Werte für die anderen Parameter ein. Klicken Sie af «Apply», m den Parameter z berechnen. Klicken Sie af «Reset», m die zletzt gespeicherten Werte anzzeigen. Ist der Scanmods «xt» asgewählt, sind diese Parameter einzstellen: Im Feld «Lines» geben Sie die Anzahl der Afnahmen der Linie ein. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen «Maximize», m im Feld «Lines per page» die Anzahl der Linien einzstellen, die afgenommen werden sollen, bevor die Daten an den Rechner weitergeleitet werden. Als Standardeinstellng wird eine Afnahme kontinierlich abgearbeitet, bis der Speicher des Scankopfes keine Daten mehr afnehmen kann. Im Feld «Complete Time» geben Sie die Gesamtzeit für die Bildafnahme ein. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 90 von 263

91 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Ist der Scanmods «xyt» oder «xzt» asgewählt, sind diese Parameter einzstellen: Im Feld «Frames» geben Sie die Anzahl der Afnahmen des Einzelbildes ein. Im Feld «T» definieren Sie das Zeitintervall zwischen den Afnahmen von zwei Einzelbildern. Ist das Kontrollkästchen «Minimize» asgewählt, wird das Minimalintervall eingestellt, das heißt die Zeit für die Afnahme eines Einzelbildes (abhängig von Scanparametern wie dem Scanformat nd der Scan- geschwindigkeit) pls eines notwendigen Pasenintervalls für die Positionierng des Scanspiegels. Im Feld «Complete Time» geben Sie die Gesamtzeit für die Bildafnahme ein. Ist der Scanmods «xyzt» asgewählt, sind folgende Parameter einzstellen: Im Feld «Stacks» geben Sie die Anzahl der Afnahmen des Bildstapels ein. Im Feld «T» definieren Sie das Zeitintervall zwischen den Afnahmen von zwei Bildstapeln. Ist das Kontrollkästchen «Minimize» asgewählt, wird das Minimalintervall eingestellt, das heißt die Zeit für die Afnahme eines Bildstapels (abhängig von Scanparametern wie dem Scanformat nd der Scan- geschwindigkeit) pls eines notwendigen Pasenintervalls für die Positionierng des Scanspiegels. Im Feld «Complete Time» geben Sie die Gesamtzeit für die Bildafnahme ein. Um die Bildqalität während der Bildafnahme z optimieren, starten Sie mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 91 von 263

92 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Stellen Sie die Foksebene (Z-Position), die Detektoren nd das Detektionspinhole ein. Lesen Sie daz die Schritte 7 bis 15 im Kapitel «Afnahmeparameter für die erste Bildafnahme einstellen». $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Starten Sie mit der Taste «6HULHV» die Zeitbildserie. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme eines Bildes wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Line Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme einer Linie wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Für eine statistische Aswertng der Zeitbildserie klicken Sie af das Pfeilsymbol «4XDQWLI\» nd dann zm Beispiel af die Taste «Histogram». Das Betätigen dieser Taste öffnet das Dialogfenster «Histogram» nd aktiviert atomatisch die ROI Tasten, die Sie in den nächsten Schritten benötigen werden: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 92 von 263

93 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Markieren Sie einen Aswertngsbereich (ROI) im Bild, indem Sie zm Beispiel af die Taste «:L]DUG» nd die Taste «Polygon» klicken. Doppelklicken Sie im Bild af die Strktr, die asgewertet werden soll. Die Kontren der Strktr werden atomatisch als Aswertngsbereich markiert. Wählen Sie mit den Tasten «Ellipse» oder «Rectangle» andere geometrische Formen nd markieren Sie weitere Aswertngsbereiche im Bild. Deaktivieren Sie die Taste «Wizard», wenn Sie die Aswer- tngsbereiche freihand in das Bild zeichnen wollen. Mit den Tasten «Select» nd «Rotate», können Sie die Aswertngsbereiche verschieben, drehen nd ihre Größe ändern, mit der Taste «Clear» können Sie alle Aswertngsbereiche löschen Folgende Befehle stehen im Dialogfenster «Histogram» zr Verfügng, wo der $XVZHUWXQJVJUDSK zsammen mit verschiedenen statistischen Werten angezeigt wird. Halten Sie den Maszeiger über das Diagramm nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Export», m die Aswertngsdaten als ASCI Textdatei z exportieren. Wählen Sie «Send to» nd «Docment» m eine Bildschirmkopie des Aswertngsgraphen Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 93 von 263

94 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq als nee Datei im aktiven Experiment anzlegen. Wählen Sie «Print», m den Aswertngsgraphen z drcken. Klicken Sie af das Pfeilsymbol «View» nd die Taste «Play», m die Zeitbildserie als Filmseqenz ablafen z lassen. Simltan daz werden der Aswertngsgraph nd die dazgehörigen Aswertngsdaten der jeweiligen Einzelbilder angezeigt. Sie können ein %LOGHLQHV'HWHNWLRQVNDQDOV getrennt als neen Datensatz im aktiven Experiment anlegen. Klicken Sie af das Bild des gewünschten Detektionskanals. Halten Sie den Maszeiger über das Ansichtsfenster Viewer nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Selection (raw)», m die Bilddaten des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «Selection (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «All (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des Gesamtbildes als nee Datei anzlegen. Die gespeicherten Dateien befinden sich im Ansichtsfenster «Experiment Overview», wo Ihnen im Kontextmenü folgende Befehle zr Verfügng stehen: Markieren Sie eine Datei nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Activate», m die Bilddaten der Datei im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. Wählen Sie «New Window», m die aktelle Afnahme in einem zweiten Ansichtsfenster z Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 94 von 263

95 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq öffnen. Sie können so dasselbe Bild zm Beispiel mit einer anderen Farbzordnngstabelle anzeigen lassen. Wählen Sie «Delete», m die Datei z löschen. Wählen Sie «Rename», m der Datei einen neen Namen z geben. Wählen Sie «Export», m eine Afnahme im Dateiformat *.avi z exportieren. Wählen Sie «Browse Images», m alle Afnahmen eines Experiments als Miniatrbilder af der Bedienoberfläche anzzeigen. Wählen Sie «Properties», m in einem Dialogfenster eine Krzbeschreibng der Afnahme einzgeben. Sie können Dateien von einem Experiment in das andere ziehen nd verschieben (drag and drop), indem Sie die Datei mit gedrückter linker Mastaste af den Ordner des gewünschten Experiments ziehen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 95 von 263

96 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq /DPEGDVHULHQ6SHNWUDOELOGVHULHQDXIQHKPHQ Klicken Sie af das Pfeilsymbol «$FTXLUH» nd af die Taste «Mode» nd wählen Sie den Scanmods «xyλ» oder «xzλ» as. Wählen Sie den Scanmods «xyλ», wenn Sie horizontale Einzelbilder (orthogonal zr optischen Achse) jeweils bei einer bestimmten Wellenlänge afnehmen wollen. Wählen Sie den Scanmods «xzλ», wenn Sie vertikale Einzelbilder (parallel zr optischen Achse) jeweils bei einer bestimmten Wellenlänge afnehmen wollen. Die Aswahl einer der beiden Scanmodi aktiviert atomatisch die Tasten, die für die Afnahme einer Lambdaserie benötigt werden: :HOFKH6FDQPRGLZHUGHQDQJH]HLJW" Die Zahl der zr Verfügng stehenden Scanmodi hängt von der Art des verwendeten Z- Stellantriebs ab. Der Z-Stellantrieb wird mit der Taste «z-scan» eingestellt. Es stehen alle Scanmodi zr Verfügng, wenn der galvanometerbetriebene Z-Objekttisch verwendet wird. Im Listenfeld ist die Aswahl «z-galvo» einzstellen. Es stehen nr die Scanmodi «xyz, xt, xyt, xyzt nd xyλ» zr Verfügng, wenn der elektromotorbetriebene Z-Objekttisch verwendet (oder bei inversen Mikroskopen der Objektivrevolver verfahren) wird. Im Listenfeld ist die Aswahl «z-wide» einzstellen. Aßerdem sind die Scanmodi für die Afnahme einer Lambdaserie «xyλ» nd «xzλ» nr verfügbar, wenn nr ein Detektionskanal aktiv ist. Öffnen Sie mit der Taste «%HDP» das Dialogfenster «Beam Path Setting» nd wählen Sie die Anregngswellenlänge as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 96 von 263

97 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ein. Wählen Sie einen geeigneten $QUHJXQJVVWUDKOWHLOHU as. Ist Ihr System mit einem aksto-optischen Strahlteiler (AOBS) asgerüstet, optimiert dieser atomatisch den Strahlengang für die asgewählte Wellenlänge. Andernfalls doppelklicken Sie af die grüne Linie nd wählen Sie den Netralfilter «RT 30/70» as, der sich für eine Lambdaserie besonders eignet. Wählen Sie einen 'HWHNWLRQVNDQDO 307ª nd ordnen Sie diesem eine Farbzordnngstabelle z. Klicken Sie af das Symbol der Farbzordnngstabelle. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 97 von 263

98 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af eine Farbzordnngstabelle nd af «OK». Bei der ersten Bildafnahme empfiehlt es sich, mit der Farbzordngstabelle «Glow(O&U)» z arbeiten. $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Definieren Sie die 'HWHNWLRQVEDQGEUHLWH für den verwendeten Detektionskanal. Doppelklicken Sie af den Schieberegler des asgewählten Detektionskanals. Im Dialogfenster «Range Properties» geben Sie je eine Wellenlänge für Anfang nd Ende des Detektionsbandes ein. Definieren Sie $QIDQJVSXQNWXQG(QGSXQNW der Lambdaserie. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 98 von 263

99 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq XQG Ziehen Sie den Schieberegler an die gewünschte Position im Spektrm nd klicken Sie af die Taste «Lambda Begin», m den Anfangspnkt z speichern. XQG Ziehen Sie den Schieberegler an die gewünschte Position im Spektrm nd klicken Sie af die Taste «Lambda End», m den Endpnkt z speichern. Klicken Sie af die Taste «/DPEGD6WHSV» nd legen Sie die Anzahl der Bildafnahmen fest. Innerhalb der Spanne zwischen Anfangs- nd Endpnkt der Bildserie wird die eingestellte Anzahl von Afnahmen in gleichmäßigen Schrittweiten afgenommen. Um die Bildqalität während der Bildafnahme z optimieren, starten Sie mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan. Stellen Sie die Foksebene (Z-Position), die Detektoren nd das Detektionspinhole bei verschiedenen Positionen im Spektrm ein. Lesen Sie daz die Schritte 7 bis 15 im Kapitel «Afnahmeparameter für die erste Bildafnahme einstellen» Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 99 von 263

100 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Starten Sie mit der Taste «6HULHV» die Lambdaserie. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme eines Bildes wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Line Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme einer Linie wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Klicken Sie af die Taste «Gallery», m bereits während der Bildafnahme die einzelnen Afnahmen im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. $FKWXQJ Bei der Afnahme von grossen Datensätzen kann die Verwendng der «Gallery» Fnktion die Afnahmeleistng verschlechtern. Für eine statistische Aswertng der Lambdaserie klicken Sie af das Pfeilsymbol «4XDQWLI\» nd dann zm Beispiel af die Taste «Pr.(z)». Das Betätigen dieser Taste öffnet das Dialogfenster «Profile throgh Stack» nd aktiviert atomatisch die ROI Tasten, die Sie in den nächsten Schritten benötigen werden: Markieren Sie einen Aswertngsbereich (ROI) im Bild, indem Sie zm Beispiel af die Taste «:L]DUG» nd die Taste «Polygon» klicken. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 100 von 263

101 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Doppelklicken Sie im Bild af die Strktr, die asgewertet werden soll. Die Kontren der Strktr werden atomatisch als Aswertngsbereich markiert. Wählen Sie mit den Tasten «Ellipse» oder «Rectangle» andere geometrische Formen nd markieren Sie weitere Aswertngs- bereiche im Bild. Deaktivieren Sie die Taste «Wizard», wenn Sie die Aswer- tngsbereiche freihand in das Bild zeichnen wollen. Mit den Tasten «Select» nd «Rotate», können Sie die Aswertngsbereiche verschieben, drehen nd ihre Größe ändern, mit der Taste «Clear» können Sie alle Aswertngsbereiche löschen. Folgende Befehle stehen im Dialogfenster «Profile throgh Stack» zr Verfügng, wo der $XVZHUWXQJVJUDSK zsammen mit verschiedenen statistischen Werten angezeigt wird. Halten Sie den Maszeiger über das Diagramm nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Export», m die Aswertngsdaten als ASCI Textdatei z exportieren. Wählen Sie «Send to» nd «Docment» m eine Bildschirmkopie des Aswertngsgraphen als nee Datei im aktiven Experiment anzlegen. Wählen Sie «Print», m den Aswertngsgraphen z drcken. Klicken Sie af das Pfeilsymbol «View» nd die Taste «Play», m die Lambdaserie als Filmseqenz ablafen z lassen. Simltan daz werden mittels einer senkrechten Hilfslinie der Aswertngsgraph nd die dazgehörigen Aswertngsdaten der jeweiligen Einzelbilder angezeigt. Sie können ein %LOG HLQHV 'HWHNWLRQVNDQDOV getrennt als neen Datensatz im aktiven Experiment anlegen. Klicken Sie af das Bild des gewünschten Detektionskanals. Halten Sie den Maszeiger über das Ansichtsfenster Viewer nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 101 von 263

102 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Wählen Sie «Selection (raw)», m die Bilddaten des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «Selection (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «All (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des Gesamtbildes als nee Datei anzlegen. Die gespeicherten Dateien befinden sich im Ansichtsfenster «Experiment Overview», wo Ihnen im Kontextmenü folgende Befehle zr Verfügng stehen: Markieren Sie eine Datei nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Activate», m die Bilddaten der Datei im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. Wählen Sie «New Window», m die aktelle Afnahme in einem zweiten Ansichtsfenster z öffnen. Sie können so dasselbe Bild zm Beispiel mit einer anderen Farbzordnngs- tabelle anzeigen lassen. Wählen Sie «Delete», m die Datei z löschen. Wählen Sie «Rename», m der Datei einen neen Namen z geben. Wählen Sie «Export», m eine Afnahme im Dateiformat *.avi z exportieren. Wählen Sie «Browse Images», m alle Afnahmen eines Experiments als Miniatrbilder af der Bedienoberfläche anzzeigen. Wählen Sie «Properties», m in einem Dialogfenster eine Krzbeschreibng der Afnahme einzgeben. Sie können Dateien von einem Experiment in das andere ziehen nd verschieben (drag and drop), indem Sie die Datei mit gedrückter linker Mastaste af den Ordner des gewünschten Experiments ziehen. 6HTXHQWLHOOH%LOGVHULHQDXIQHKPHQ Zerst werden die Afnahmeparameter für die erste Afnahmemethode eingestellt nd als Afnahmeparametersatz abgespeichert. Klicken Sie z diesem Zweck af das Pfeilsymbol «$FTXLUH» nd öffnen Sie mit der Taste «Beam» das Dialogfenster «Beam Path Setting». Wählen Sie die $QUHJXQJVZHOOHQOlQJH as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 102 von 263

103 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ein. Wählen Sie einen geeigneten $QUHJXQJVVWUDKOWHLOHU as. Ist Ihr System mit einem aksto-optischen Strahlteiler (AOBS) asgerüstet, optimiert dieser atomatisch den Strahlengang für die asgewählte Wellenlänge. Andernfalls doppelklicken Sie af die grüne Linie nd wählen einen Strahlteiler as: Wählen Sie den Dichroiten RSP 500 bei Afnahmen von FITC nd GFP mit einer Anregngswellenlänge von 488 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 600 nm. Wählen Sie den Dichroiten RSP 465 bei Afnahmen von CFP mit einer Anregngswellenlänge von 458 nm nd einer Detektionsbandbreite von 465 bis 525 nm. Wählen Sie den Doppeldichroiten DD 488 / 543 bei Afnahmen von FITC nd TRITC oder GFP nd DsRED mit einer Anregngswellenlänge von 488 nd 543 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 530 nm bzw. 555 bis 700 nm. Wählen Sie den Tripeldichroiten TD 488 / 543 / 633 bei Afnahmen von FITC, TRITC nd CY5 mit einer Anregngswellenlänge von 488, 543 nd 633 nm nd einer Detektionsbandbreite von 500 bis 535 nm, 555 bis 620 nm bzw. 650 bis 750 nm. Wählen Sie den Netralteiler RT 30/70 bei Reflektions- afnahmen. Wählen Sie einen 'HWHNWLRQVNDQDO 307ª nd stellen Sie den verwendeten Floreszenzfarbstoff nd die Detektionsbandbreite ein. Klicken Sie af das Listenfeld eines Detektionskanals, zm Beispiel «PMT2», nd wählen Sie einen Floreszenzfarbstoff, zm Beispiel «TRITC» as. Die Emissionskrve des Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 103 von 263

104 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Floreszenzfarbstoffes wird im Spektrm eingeblendet. Positionieren Sie den Schieberegler nter der Emissionskrve. +LQZHLV]XU3RVLWLRQGHV'HWHNWLRQVEDQGHV Achten Sie bei Floreszenzafnahmen daraf, dass Sie das Detektionsband nicht nter der Laserlinie positionieren, da sonst Reflektionslicht mit afgenommen wird. Der Abstand von Detektionsband zr Laserlinie sollte im blaen Spektralbereich (Anregngslinie 488 nm) mindestens 5 nm betragen, im grünen Spektralbereich (Anregngslinie 543 nm) 10 nm nd im roten Spektralbereich (Anregng 633 nm) 15 nm. Doppelklicken Sie af den Schieberegler des asgewählten Detektionskanals. Im Dialogfenster «Range Properties» geben Sie je eine Wellenlänge für Anfang nd Ende des Detektionsbandes ein. Klicken Sie af das Symbol der Farbzordnngstabelle. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 104 von 263

105 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af eine Farbzordnngstabelle nd af «OK». Bei der ersten Bildafnahme empfiehlt es sich, mit der Farbzordngstabelle «Glow(O&U)» z arbeiten. $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Um die Bildqalität während der Bildafnahme z optimieren, starten Sie mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan. Stellen Sie die Foksebene (Z-Position), die Detektoren nd das Detektionspinhole ein. Lesen Sie daz die Schritte 7 bis 15 im Kapitel «Afnahmeparameter für die erste Bildafnahme einstellen». $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Klicken Sie im Dialogfenster «Beam Path Setting» af die Schaltfläche «6DYH» m die Einstellngen der ersten Afnahmemethode als Afnahmeparametersatz abzspeichern. Geben Sie dem Afnahmeparametersatz einen Namen nd klicken Sie af OK. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 105 von 263

106 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Der ne definierte Afnahmeparametersatz erscheint im Listenfeld nter «8». :LHPDQEHQXW]HUGHILQLHUWH$XIQDKPHSDUDPHWHUVlW]H,36HU]HXJW Jetzt werden die Afnahmeparameter für die zweite Afnahmemethode eingestellt nd als Afnahmeparametersatz abgespeichert. Wählen Sie die $QUHJXQJVZHOOHQOlQJH as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein. Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ein. Wählen Sie einen geeigneten $QUHJXQJVVWUDKOWHLOHU as. Die detaillierte Beschreibng der zr Verfügng stehenden Strahlteiler finden Sie in Schritt 3. Wählen Sie einen 'HWHNWLRQVNDQDO 307ª nd stellen Sie den verwendeten Floreszenzfarbstoff nd die Detektionsbandbreite ein. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 106 von 263

107 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af die Listenfelder der Detektionskanäle, zm Beispiel «PMT1» nd «PMT3» nd wählen Sie jeweils einen Floreszenzfarbstoff, zm Beispiel «FITC» nd «CY5» as. Die Emissionskrven der Floreszenzfarbstoffe werden im Spektrm eingeblendet. Positionieren Sie die Schieberegler nter den jeweiligen Emissionskrven. Doppelklicken Sie af den Schieberegler des asgewählten Detektionskanals. Im Dialogfenster «Range Properties» geben Sie je einen Wert für Anfang nd Ende des Detektionsbandes ein. Klicken Sie jeweils af das Symbol der Farbzordnngstabelle. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 107 von 263

108 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af eine Farbzordnngstabelle nd af «OK». Bei der ersten Bildafnahme empfiehlt es sich, mit der Farbzordngstabelle «Glow(O&U)» z arbeiten. Um die Bildqalität während der Bildafnahme z optimieren, starten Sie mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan. Stellen Sie die Foksebene (Z-Position), die Detektoren nd das Detektionspinhole ein. Lesen Sie daz die Schritte 7 bis 15 im Kapitel «Afnahmeparameter für die erste Bildafnahme einstellen» $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Klicken Sie im Dialogfenster «Beam Path Setting» af die Schaltfläche «6DYH» m die Einstellngen der zweiten Afnahmemethode als Afnahmeparametersatz abzspeichern. Geben Sie dem Afnahmeparametersatz einen Namen nd klicken Sie af OK. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 108 von 263

109 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Der ne definierte Afnahmeparametersatz erscheint im Listenfeld nter «8». Klicken Sie im Dialogfenster «Beam Path Setting» nten links af «6HTXHQWLDO6FDQ». Die für die seqentielle Bildafnahme benötigten Dialog- elemente werden geöffnet. Kopieren Sie im Dialogfenster «Beam Path Setting» die Afnahmeparametersätze in das Listenfeld «6HTXHQWLDOVFDQVHWWLQJV». Markieren Sie den Afnahmeparametersatz im Listenfeld oben rechts.im Dialogfenster. Klicken Sie dann af die Schaltfläche «Add» nten links im Dialogfenster. RGHU Ziehen nd verschieben Sie den Afnahmeparametersatz (drag and drop), indem Sie ihn mit gedrückter linker Mastaste in das Listenfeld «Seqential scan settings» ziehen. Klicken Sie af die Schaltfläche «Remove», m den Afnahmeparametersatz wieder z löschen. Klicken Sie af die Schaltfläche «Save», m die Afnahmeparametersätze als eine seqentielle Afnahme- methode z speichern. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 109 von 263

110 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Mit der Schaltfläche «Load» kann dieser Methode später wieder geladen werden. Legen Sie fest, wann zwischen den seqentiellen Methoden mgeschaltet wird, indem Sie im /LVWHQIHOG 0RGHª einen der drei seqentiellen Modi aswählen. Wählen Sie «between lines», wenn nach der Afnahme einer Linie die Afnahmemethode gewechselt werden soll. Wählen Sie «between frames», wenn nach der Afnahme eines Einzelbildes die Afnahmemethode gewechselt werden soll. Wählen Sie «between stacks», wenn nach der Afnahme eines Bildstapels die Afnahmemethode gewechselt werden soll. Überprüfen Sie im /LVWHQIHOG 3DUDPHWHUª die Parameter, die für die Afnahme aller seqentiellen Afnahmemethoden verwendet werden sollen. Klicken Sie das Kontrollkästchen des gewünschten Parameters an. Stellen Sie nn alle anderen Afnahmeparameter ein, die sich je nach Art der Afnahme Rambildserie, Zeitbildserie oder Spektralbildserie nterscheiden. Starten Sie mit der Taste «6HULHV» oder «Single Scan» die seqentielle Bildafnahme. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 110 von 263

111 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Haben Sie den seqentiellen Mods «between lines» gewählt, können Sie mit der Taste «Continos» ach den Endlos-Scan starten. Der Endlos-Scan Mods hat den Vorteil, dass viele Afnahmeparameter während der Bildafnahme verändert werden können. Klicken Sie af die Taste «Gallery», m bereits während der Bildafnahme die einzelnen Afnahmen im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. Sie können ein %LOG HLQHV 'HWHNWLRQVNDQDOV getrennt als neen Datensatz im aktiven Experiment anlegen. Klicken Sie af das Bild des gewünschten Detektionskanals. Halten Sie den Maszeiger über das Ansichtsfenster Viewer nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Selection (raw)», m die Bilddaten des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «Selection (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «All (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des Gesamtbildes als nee Datei anzlegen. Die gespeicherten Dateien befinden sich im Ansichtsfenster «Experiment Overview», wo Ihnen im Kontextmenü folgende Befehle zr Verfügng stehen: Markieren Sie eine Datei nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Activate», m die Bilddaten der Datei im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. Wählen Sie «New Window», m die aktelle Afnahme in einem zweiten Ansichtsfenster z öffnen. Sie können so dasselbe Bild zm Beispiel mit einer anderen Farbzordnngstabelle Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 111 von 263

112 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq anzeigen lassen. Wählen Sie «Delete», m die Datei z löschen. Wählen Sie «Rename», m der Datei einen neen Namen z geben. Wählen Sie «Export», m eine Afnahme im Dateiformat *.avi z exportieren. Wählen Sie «Browse Images», m alle Afnahmen eines Experiments als Miniatrbilder af der Bedienoberfläche anzzeigen. Wählen Sie «Properties», m in einem Dialogfenster eine Krzbeschreibng der Afnahme einzgeben. Sie können Dateien von einem Experiment in das andere ziehen nd verschieben (drag and drop), indem Sie die Datei mit gedrückter linker Mastaste af den Ordner des gewünschten Experiments ziehen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 112 von 263

113 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq %LOGDXIQDKPHQYRQ$XVZHUWXQJVEHUHLFKHQ52,6FDQ Zerst werden alle Afnahmeparameter für die Afnahme des Gesamtbildes optimiert. Um dies während der Bildafnahme z tn, starten Sie mit der Taste «&RQWLQXRXV» die Bildafnahme im Endlosscan. Stellen Sie die Foksebene (Z-Position), die Detektoren nd das Detektionspinhole ein. Lesen Sie daz die Schritte 7 bis 15 im Kapitel «Afnahmeparameter für die erste Bildafnahme einstellen» $XIQDKPHSDUDPHWHUI UGLHHUVWH%LOGDXIQDKPHHLQVWHOOHQ Klicken Sie af das Pfeilsymbol «$FTXLUH» nd öffnen Sie mit der Taste «Beam» das Dialogfenster «Beam Path Setting». Wählen Sie für den Bildhintergrnd (Gesamtbild) die Anregngswellenlänge as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein. Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ei Klicken Sie af die Taste «52,» m die Lasereinstellng für den Bildhintergrnd z speichern. Das Betätigen dieser Taste aktiviert atomatisch die Tasten, die Sie in den nächsten Schritten benötigen werden: Sollte die Taste «ROI» in der Bedienoberfläche nter der Kategorie «Acqire» nicht z finden sein, wählen Sie Tools\ Cstomize\ Commands\ Category Basic Scan. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 113 von 263

114 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af die Taste «ROI» nd ziehen Sie sie mit gedrückter linker Mastaste af die Bedienoberfläche. Wählen Sie für den im nächsten Schritt z zeichnenden Aswertngsbereich (ROI) die $QUHJXQJVZHOOHQOlQJH as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein. Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ein. Um den ersten Aswertngsbereich in das Gesamtbild z zeichnen, klicken Sie af das Pfeilsymbol «4XDQWLI\» nd dann zm Beispiel af die Taste «Wizard» nd die Taste «Polygon». Doppelklicken Sie im Bild af eine Strktr, die als Aswertngsbereich definiert werden soll. Die Kontren der Strktr werden atomatisch als Aswertngsbereich markiert. Mit den Tasten «Select» nd «Rotate», können Sie die Aswertngsbereiche verschieben, drehen nd ihre Größe ändern, mit der Taste «Clear» können Sie alle Aswertngsbereiche löschen. Wählen Sie für einen zweiten Aswertngsbereich die $QUHJXQJVZHOOHQOlQJH as nd stellen Sie die Intensität der Laserlinie ein Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 114 von 263

115 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Ziehen Sie den Schieberegler oder doppelklicken Sie af den Zahlenwert nd geben Sie einen Wert für die Laserintensität ein. Um den zweiten Aswertngsbereich in das Gesamtbild z zeichnen, klicken Sie af das Pfeilsymbol «4XDQWLI\» nd dann zm Beispiel af die Taste «Ellipse». Deaktivieren Sie die Taste «Wizard», wenn Sie die Aswer- tngsbereiche freihand in das Bild zeichnen wollen. Mit den Tasten «Select» nd «Rotate», können Sie die Aswer- tngsbereiche verschieben, drehen nd ihre Größe ändern, mit der Taste «Clear» können Sie alle Aswertngsbereiche löschen. Wiederholen Sie diese in den Schritten 4 bis 7 beschriebene Prozedr für jeden weiteren Aswertngsbereich, den Sie im Bild definieren wollen. Klicken Sie dann af die Taste «&RQILJXUDWLRQ» m eine Übersicht über die definierten Aswertngsbereiche nd zgeordneten Laserlinien z erhalten. Hier können Sie gegebenenfalls noch einmal die Zordnng von Laserlinie nd Aswertngsbereichen ändern. Starten Sie mit der Taste «6HULHV» die Bildserie. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme eines Bildes wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Um das Signal/ Rasch-Verhältnis z verbessern, klicken Sie af die Taste «Line Average». Legen Sie fest, wie oft die Afnahme einer Linie wiederholt werden soll. Es wird jeweils der Mittelwert angezeigt. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 115 von 263

116 hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq Klicken Sie af die Taste «Gallery», m bereits während der Bildafnahme die einzelnen Afnahmen im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. Sie können ein %LOG HLQHV 'HWHNWLRQVNDQDOV getrennt als neen Datensatz im aktiven Experiment anlegen. Klicken Sie af das Bild des gewünschten Detektionskanals. Halten Sie den Maszeiger über das Ansichtsfenster Viewer nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Selection (raw)», m die Bilddaten des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «Selection (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des markierten Asschnitts als nee Datei anzlegen. Wählen Sie «All (snapshot)», m eine Bildschirmkopie des Gesamtbildes als nee Datei anzlegen. Die gespeicherten Dateien befinden sich im Ansichtsfenster «Experiment Overview», wo Ihnen im Kontextmenü folgende Befehle zr Verfügng stehen: Markieren Sie eine Datei nd öffnen Sie das Kontextmenü, indem Sie die rechte Mastaste betätigen. Wählen Sie «Activate», m die Bilddaten der Datei im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen. Wählen Sie «New Window», m die aktelle Afnahme in einem zweiten Ansichtsfenster z öffnen. Sie können so dasselbe Bild zm Beispiel mit einer anderen Farbzordnngstabelle anzeigen lassen. Wählen Sie «Delete», m die Datei z löschen. Wählen Sie «Rename», m der Datei einen neen Namen z geben. Wählen Sie «Export», m eine Afnahme im Dateiformat *.avi z exportieren. Wählen Sie «Browse Images», m alle Afnahmen eines Experiments als Miniatrbilder af der Bedienoberfläche anzzeigen. Wählen Sie «Properties», m in einem Dialogfenster eine Krzbeschreibng der Afnahme einzgeben. Sie können Dateien von einem Experiment in das andere ziehen nd verschieben (drag and drop), indem Sie die Datei mit gedrückter linker Mastaste af den Ordner des gewünschten Experiments ziehen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 116 von 263

117 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ $OOJHPHLQHV (LQI KUXQJLQGLH+LOIHGHU/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUH Es stehen Ihnen folgende Hilfeinstanzen zr Verfügng:.XU]KLOIH Wenn sie den Maszeiger eine gewisse Zeit über einer Taste der Leica Confocal Software stehen lassen, wird eine Krzerklärng der Fnktion dieser Schaltfläche angezeigt. Die Krzerklärng (help banner) verschwindet wieder atomatisch, wenn der Maszeiger bewegt wird..rqwh[wvhqvlwlyh+loih Wollen Sie die kontextsensitive Hilfefnktion verwenden, klicken Sie af die Taste Help: Die gesamte Bentzeroberfläche wird dann eingefroren nd neben dem Maszeiger wird ein Fragezeichen eingeblendet. Wenn Sie jetzt af eine beliebige Taste klicken, wird anstelle der Schaltfnktionen, die üblicherweise drch Tastendrck asgelöst werden, eine Erklärng zr jeweiligen Taste angezeigt. Wenn die Taste Help nicht af ihrer Bentzeroberfläche z finden ist: Wählen Sie im Menü Tools die Option Cstomize. Hier finden Sie sämtliche Tasten nach Kategorien geordnet. In der Kategorie File finden Sie die Taste Help. Klicken Sie mit der linken Mastaste af die Taste, halten sie die Mastaste gedrückt nd ziehen Sie die Taste in das von Ihnen gewünschte Fenster.,QKDOWGHU2QOLQHKLOIH&RQWHQWV Wenn sie im Menü Help die Option Contents wählen, wird das Inhaltsverzeichnis der Onlinehilfe angezeigt. Hier können Sie nn aswählen, z welchen Fnktionen Sie Hilfe anfordern wollen. 6XFKHQPLW6FKO VVHOEHJULIIHQ,QGH[ Wenn sie im Menü Help die Option Index wählen, wird ein Verzeichnis mit Schlüsselbegriffen angezeigt. Wählen Sie einen Schlüsselbegriff as. Sie springen z den entsprechenden Inhaltsseiten, drch zweifachen Masklick oder wenn Sie die Schaltfläche Display drücken. 9ROOWH[WVXFKHPLWORJLVFKYHUNQ SIWHQ6XFKEHJULIIHQ6HDUFK Wenn sie im Menü Help die OptionSearch wählen, wird die eingebate Volltext-Schmaschine gestartet. In das Eingabefenster können sie einen Schbegriff eingeben. Wenn Sie af das rechts neben dem Eingabefenster vorhandene Dreieck klicken, werden logische Operatoren angezeigt. Wählen Sie den entsprechenden Operator as. Geben Sie nach dem Operator den zweiten Schbegriff ein, den Sie mit dem ersten Schbegriff verknüpfen wollen: %HLVSLHOH Lochblende AND Schnitte Lochblende OR Schnitte Lochblende NEAR Schnitte Lochblende NOT Schnitte (UJHEQLV Dieses Statement scht Hilfethemen, in denen sowohl das Wort «Lochblende» als ach das Wort «Schnitte» vorkommt. Dieses Statement scht Hilfethemen, in denen entweder das Wort «Lochblende» oder das Wort «Schnitte» oder beide vorkommen. Dieses Statement scht Hilfethemen, in denen sich das Wort «Lochblende» nd das Wort «Schnitte» in einem bestimmten Schradis befinden. Darüberhinas werden ach ähnlich geschriebene Begriffe gescht. Dieses Statement scht Hilfethemen, in denen sich das Wort «Lochblende» nd nicht das Wort «Schnitte» befinden. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 117 von 263

118 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ %XFK]HLFKHQ)DYRULWHV Wenn Sie im Dialogfenster der Onlinehilfe das Register Favorites wählen, können sie das aktelle Hilfethema in eine Liste afnehmen. Über die Einträge in dieser Liste sind die asgewählten Hilfethemen sehr schnell zgänglich..rqwh[wvhqvlwlyh+loih IIQHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Help aktivieren Sie die kontextsensitive Hilfefnktion der Onlinehilfe, mit der Sie krze Erläterngen z den verschiedenen Tasten nd Fnktionen der Leica Confocal Software afrfen können. Klicken Sie af die Taste Help. Neben dem Maszeiger wird ein Fragezeichen eingeblendet. Alle Tasten sind jetzt vorübergehend ohne Fnktion. Klicken Sie mit dem Maszeiger af die Taste, z der Sie nähere Informationen wünschen. Die Onlinehilfe wird geöffnet mit der Beschreibng der entsprechenden Taste. In der Onlinehilfe können Sie mit einem Index von Schlüsselwörtern nd mit einer Schfnktion nach bestimmten Themen oder Tasten schen. Die einzelnen Beschreibngen können asgedrckt werden. Sie können die Onlinehilfe ach öffnen, indem Sie im Menü Help eine der Optionen Contents, Search oder Index anklicken. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 118 von 263

119 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'DWHQDXIQDKPHIXQNWLRQHQ 6WUDKOHQJDQJHLQVWHOOHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Beam öffnen Sie das Dialogfenster Beam Path Setting, in dem Sie den Strahlengang nd die Detektoren mit den dazgehörigen Farbzordnngstabellen für die Bildafnahme einrichten können. $QUHJXQJVZHOOHQOlQJHDXVZlKOHQ Oberhalb des Spektrms im Dialogfenster befinden sich die Felder, in denen Sie die Anregngswellenlänge über einen AOTF einstellen: Klicken Sie af das Kontrollkästchen neben der Laserbezeichnng, m den Laser z aktivieren. Stellen Sie die Leistng der Laserlinie ein, indem Sie den Schieber der entsprechenden Skala af den gewünschten Wert ziehen, oder Doppelklicken Sie af den Prozentwert der Laserleistng. Es wird ein weiteres Dialogfenster geöffnet, in dem Sie den exakten Wert eintragen können. Die aktive Laserlinie wird im Spektrm als Linie eingeblendet. 3DUDPHWHUHLQVWHOOXQJHQODGHQXQGVSHLFKHUQ Ebenfalls oberhalb des Spektrms befindet sich ein Listenfeld, in dem Sie Parametereinstellngen laden nd speichern können. Für die wichtigsten Kombinationen von Floreszenzfarbstoffen sind werkseitig vordefinierte Parametereinstellngen verfügbar. Diese mit einem / (Leica) gekennzeichneten Parametereinstellngen können nr geladen aber nicht verändert werden. Sie können die für eine spezifische Bildafnahme vorgenommenen Einstellngen ach als bentzerdefinierte Parametereinstellng speichern nd somit jederzeit mit einem Klick wieder laden: Klicken Sie af die Schaltfläche Save. Ein Dialogfenster wird geöffnet, in dem Sie einen Namen für die Parametereinstellng eingeben. Die Parametereinstellng wird im Listenfeld nter User angelegt nd ist mit einem 8 (User) gekennzeichnet. Sie können die Parameter aswählen, die mit dem Befehl Save gespeichert werden sollen: Wählen Sie im Menü Tools die Option Settings. Klicken Sie im Dialogfenster Settings af das Register Instrment Parameters. Wählen Sie die Parameter as, indem Sie af das entsprechende Kontrollkästchen klicken. Mit den Schaltflächen Select all nd Deselect all können Sie alle Parameter aswählen oder die Wahl aller Parameter rückgängig machen. Wenn Sie eine dieser bentzerdefinierten oder voreingestellten Parametereinstellngen anklicken nd anschließend af die rechte Mastaste klicken, stehen Ihnen in einem Kontextmenü folgende Befehle zr Verfügng: %HIHKO Set as defalt setting Remove defalt )XQNWLRQ Die Parametereinstellng wird als Standardeinstellng beim Start der Software geladen. Die Markierng als Standardeinstellng wird rückgängig gemacht. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 119 von 263

120 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ setting Load Die Parametereinstellng wird geladen. Rename (nr bei 8) Die Parametereinstellng kann mbenannt werden. Delete (nr bei 8) Die Parametereinstellng wird gelöscht. $QUHJXQJVVWUDKOWHLOHUDXVZlKOHQ Der Anregngsstrahlteiler lenkt das Anregngslicht des Lasers af das Präparat nd trennt vom Präparat zrückkommendes Floreszenzlicht nd reflektiertes Anregngslicht. Ist das Konfokalsystem mit einem aksto-optischen Strahlteiler AOBS (Acosto-Optical Beam Splitter) asgerüstet, wird bei Aswahl einer oder mehrerer Laserlinien der AOBS atomatisch so eingestellt, dass Floreszenzlicht maximal transmittiert nd Reflexionslicht maximal nterdrückt wird. & siehe Aksto-optischen Strahlteiler (AOBS) einstellen (Seite 121) Ist das Konfokalsystem mit konventionellen Anregngsstrahlteilern asgerüstet, mss ein geeigneter Filter für die jeweilige Anwendng asgewählt werden. Links neben dem Spektrm befindet sich das Symbol (grüne, gekippte Linie) für den Anregngsstrahlteiler. Klicken Sie af das Symbol nd wählen Sie den gewünschten Strahlteiler as: Netralfilter, wie z.b. der Filter RT 30/70, werden bei Reflexionsanwendngen eingesetzt, m das Anregngslicht af die Probe nd das reflektierte Licht zm Detektionspinhole z leiten. Dichroitische Filter, wie z.b. der Reflexionskrzpassfilter RSP 510, werden bei Floreszenzanwendngen eingesetzt, m Floreszenzlicht eines bestimmten Wellenlängenbereichs vom Anregngslicht z trennen nd z detektieren. Doppeldichroitische Filter werden für Bildafnahmen verwendet, bei denen das Präparat mit zwei Floreszenzfarbstoffen markiert nd mit zwei Anregngswellenlängen angeregt wird. Mit dem Doppeldichroiten DD 488/ 568 zm Beispiel, wird Anregngslicht mit der Wellenlänge 488nm nd 568nm vom Detektionslicht getrennt. Je nach Systemkonfigration sind noch Doppeldichroiten des Typs DD 488/ 543 nd DD 458/ 514 aswählbar. Tripeldichroitische Filter werden für Bildafnahmen verwendet, bei denen das Präparat mit drei Floreszenzfarbstoffen markiert nd mit drei Anregngswellenlängen angeregt wird. Mit dem Tripeldichroit TD 488/ 568/ 633 zm Beispiel, wird Anregngslicht mit der Wellenlänge 488nm, 568nm nd 633nm vom Detektionslicht getrennt. Je nach Systemkonfigration sind noch Tripeldichroiten des Typs TD 488/ 568/ 647nd TD 488/ 543/ 633.aswählbar. 'HWHNWRUHQXQG)DUE]XRUGQXQJVWDEHOOHQ/87HLQVWHOOHQ Unterhalb des Spektrms im Dialogfenster sind die Felder für die vier Detektoren PMT 1 bis 4 sowie für den Drchlichtdetektor PMT Trans angeordnet. Nehmen Sie folgende Einstellngen vor: Aktivieren Sie die gewünschten Detektoren, indem Sie af das jeweilige Kontrollkästchen Active nterhalb des Symbols für die Farbzordnngstabellen klicken. Ein Wrfschatten verbindet nn den aktivierten Detektor mit dem entsprechenden Schieber af der Skala des Spektrms. Bestimmen Sie den Wellenlängenbereich, in dem detektiert werden soll, indem Sie die beiden Enden des Schiebers af die gewünschten Positionen af der Skala ziehen, oder Doppelklicken Sie af den Schieber. Es wird ein weiteres Dialogfenster geöffnet, in dem Sie einen exakten Wert für Anfangspnkt nd Endpnkt des Wellenlängenbereichs eintragen können. Für Floreszenzanwendngen sind für jeden Detektor Listenfelder mit den gängigen Floreszenzfarbstoffen angelegt. Wählen Sie den gewünschten Floreszenzfarbstoff as, m seine Emissionskrve im Spektrm einzblenden. Wählen Sie eine Farbzordnngstabelle as, indem Sie af das entsprechende Symbol klicken. & siehe Farbzordnngstabellen aswählen (Seite 166) ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 120 von 263

121 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ $NXVWRRSWLVFKHQ6WUDKOWHLOHU$2%6HLQVWHOOHQRSWLRQDO Af dieser Seite finden Sie folgende Themen 6 Fnktion des aksto-optischen Strahlteilers 6 Verwendng des AOBS bei Floreszenzafnahmen 6 Verwendng des AOBS bei gemischten Reflexions-/ Floreszenzafnahmen )XQNWLRQ Der aksto-optische Strahlteiler (englisch: AOBS: Acosto-Optical Beam Splitter) lenkt das Anregngslicht des Lasers af das Präparat nd trennt vom Präparat zrückkommendes Floreszenzlicht nd reflektiertes Anregngslicht. In Leica Konfokalmikroskopen ersetzt nd optimiert der AOBS konventionelle Anregngsfilter wie zm Beispiel Doppeldichroite oder Tripeldichroite. Der AOBS ist ein transparenter optischer Kristall, an den ein Ultraschallwellenfeld angelegt ist. Licht, das den optischen Kristall drchdringt, wird in Abhängigkeit seiner Wellenlänge nd der Wellenlänge des Ultraschallwellenfeldes gebegt. Drch Modlation der Ultraschallamplitde kann mit dem AOBS nicht nr eine Laserlinie selektiert, sondern ach die Lichtmenge sowie das Strahlteilerverhältnis von Anregngs- nd Detektionslicht für die asgewählte Laserlinie geregelt werden. Mit dem AOBS können simltan bis z 8 Anregngswellenlängen gleichzeitig verwendet werden. 9HUZHQGXQJGHV$2%6EHL)OXRUHV]HQ]DXIQDKPHQ Die Standardeinstellng ist af Floreszenzafnahmen mit bis z 4 Anregngswellenlängen asgerichtet. Sobald Sie im Dialogfenster Beam Path Setting mit dem Schieberegler eine Laserlinie aktivieren, wird der AOBS atomatisch so eingestellt, dass Anregngslicht maximal zm Präparat abgelenkt wird. Für Floreszenzlicht ist der AOBS transparent, nabhängig vom Schieberegler. Der Schieberegler im Dialogfenster AOBS steht af 100%. & siehe Strahlengang einstellen (Seite 119) Als Standardeinstellng sind die beiden Kontrollkästchen Enhanced Dynamics nd Ultra-High Dynamics aktiviert. Mit dieser doppelten Dynamikeinstellng wird sichergestellt, dass Reflexionslicht, das den Strahlengang in mgekehrter Richtng zrückläft, as der optischen Achse entfernt nd somit nicht detektiert wird. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 121 von 263

122 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Werden mehr als 4 Anregngswellenlängen verwendet, ist die doppelte Dynamikeinstellng nicht mehr für alle Laserlinien möglich. In diesem Fall wird die verbesserte Dynamik (Kontrollkästchen Enhanced Dynamics) für die krzwelligste Laserlinie atomatisch asgeschaltet. Mit jeder weiteren zsätzlichen Anregngswellenlänge wird die verbesserte Dynamik für eine weitere Laserlinie deaktiviert. 9HUZHQGXQJGHV$2%6EHLJHPLVFKWHQ)OXRUHV]HQ]5HIOH[LRQVDXIQDKPHQ ÃÃ ÃÃ Wollen Sie ach Reflexionslicht afnehmen, genügt es in der Regel, den Anteil des Reflexionslichts mit dem Schieberegler z variieren. Ist dies nicht asreichend, klicken Sie af die Schaltfläche Maximm detection of reflected light. Der entsprechende Schieberegler wird atomatisch af 50% eingestellt nd die verbesserte Dynamik (Kontrollkästchen Enhanced Dynamics) asgeschaltet. Bei reinen Reflexionslichtafnahmen kann drch zsätzliches Deaktivieren des Kontrollkästchens Ultra-High Dynamics der Anteil des Reflexionslichts für alle Laserlinien af ein Maximm erhöht werden. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 122 von 263

123 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 2EMHNWLYDXVZlKOHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Objective öffnen Sie eine Liste von Objektiven, as der Sie das für Ihre Bildafnahme geeignete Objektiv aswählen können. In dieser Liste werden nr die Objektive angezeigt, die zvor einem der maximal sieben Einschrabplätzen des Objektivrevolvers zgeordnet wrden. Diese Zordnng können Sie wie folgt vornehmen: Wählen Sie im Menü Tools die Option Objective. Es wird ein Dialogfenster geöffnet mit einer mfangreichen Liste von Objektiven nd den symbolisch dargestellten Einschrabplätzen (Slots) des Objektivrevolvers. Schen Sie in dieser Liste das von Ihnen verwendete Objektiv nd klicken Sie es an. Halten Sie die linke Mastaste gedrückt nd ziehen Sie das Objektiv af das Symbol des Slots, in welchem das Objektiv eingeschrabt ist. Die Zordnng wird in der Software gespeichert nd das Objektiv erscheint in der Aswahlliste, die mit der Taste Objective geöffnet werden kann. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Objektive, die sie im Objektivrevolver eingesetzt haben. Mit den Schaltflächen Add, Remove nd Edit können Sie in diesem Dialogfenster nee Objektive eintragen oder löschen sowie Objektivbezeichnngen editieren. %HLGHQ0LNURVNRSHQGHV7\SV'05;$'05;('0,5%(XQG'0,5%(ZLUGGHU 2EMHNWLYUHYROYHUYRQGHU6RIWZDUHDQJHVWHXHUWVRGDVVEHLGHU$XVZDKOHLQHV 2EMHNWLYV EHUGLH7DVWHRGHUGDV'LDORJIHQVWHU2EMHFWLYHGDV2EMHNWLYDXWRPDWLVFKLQ GHQ6WUDKOHQJDQJJHGUHKWZLUG%HLDOOHQDQGHUHQ0LNURVNRSW\SHQPXVVGDV2EMHNWLY QLFKWQXULQGHU6RIWZDUHHLQJHVWHOOWVRQGHUQ]XVlW]OLFKQRFKPDQXHOOLQGHQ 6WUDKOHQJDQJJHEUDFKWZHUGHQ =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Bei der Wahl des richtigen Objektivs für eine bestimmte Anwendng ist neben der Korrektionsklasse des Objektivs (Achromate, Apochromate, Floritobjektive nd Planobjektive) vor allem der Vergrößerngsfaktor nd die nmerische Apertr entscheidend. Die nmerische Apertr bestimmt das Aflösngsvermögen eines Objektivs nd wird as dem Öffnngswinkel des vom Objektiv afgenommenen Lichtkegels nd dem Brechngsindex des Medims zwischen Objektivlinse nd Präparat errechnet: NA = n*sin α Stärker vergrößernde Objektive haben im allgemeinen höhere nmerische Apertren, aber ach kleinere Eintrittslinsen nd können deshalb Licht nr von einem relativ kleineren Scanfeld afnehmen. Objektive mit hoher Apertr ermöglichen zwar eine hohe Aflösng, haben jedoch den Nachteil, dass sie nr einen geringen freien Arbeitsabstand zlassen. Die folgende Tabelle veranschalicht diese Zsammenhänge: 2EMHNWLY $XIO VXQJ [\ $XIO VXQJ /XIWÃ] $XIO VXQJ :DVVHUÃ] $XIO VXQJ goã] 6FDQIHOGJU HÃ [\ HC PL FLUOTAR 5x HC PL FLUOTAR 10x N PLAN 20x N PLAN 50x Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 123 von 263

124 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ PL APO 100x Werte in nm bei Wellenlänge λ Werte in 488 nm µm 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Trockenobjektive werden typischerweise in der Materialknde für die Unterschng von Oberflächenstrktren verwendet. Für die Bildafnahme von Schichtstrktren, bei denen Materialschichten mit nterschiedlichen Brechngsindizes afeinandertreffen, sind Immersionsobjektive am besten geeignet. Bei biologischen Präparaten hängt es vom Präparat nd seinem Einbettmedim ab, ob man sich für ein Ölimmersionsobjektiv oder Wasserimmersionsobjektiv entscheidet. Die beste Aflösng erhält man, wenn die Brechngsindizes von Einbettmedim bzw. Präparat nd Objektivmedim afeinander abgestimmt sind. 'HWHNWRUHQHLQVWHOOHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Signal öffnen Sie ein Dialogfenster, in dem Sie die Detektoren so einstellen können, dass der gesamte Wertebereich der detektierten Intensitäten einer Farbzordnngstabelle zgeordnet nd im Bild dargestellt wird. Z diesem Zweck kann für jeden Detektor ein Gain Wert nd ein Offset Wert eingestellt werden. Mit dem Gain Wert wird die Verstärkng des detektierten Signals verändert nd damit die Bildhelligkeit nd der Bildkontrast. Mit dem Offset Wert bestimmen Sie einen Schwellenwert. Nr Signale oberhalb dieses Schwellenwertes werden detektiert nd im Bild angezeigt. Sie haben zwei Möglichkeiten, m den Gain Wert nd den Offset Wert einzstellen: Bewegen Sie mit dem Maszeiger den Schieber af der Skala. Der entsprechende Wert wird nterhalb der jeweiligen Skala angezeigt. Doppelklicken Sie af den Zahlenwert, der nterhalb der Skala angezeigt wird. Es wird ein weiteres Dialogfenster geöffnet, in dem Sie den exakten Wert eintragen können. Für die Optimierng von Gain Wert nd Offset Wert eignen sich am besten die Farbzordnngstabellen *ORZ2YHU, *ORZ8QGHU nd *ORZ2YHUDQG8QGHU. & siehe Farbzordnngstabellen aswählen (Seite 166) Sie können den Gain Wert nd den Offset Wert der Detektoren ach mit den entsprechenden Drehknöpfen der Bedienkonsole einstellen. & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) ÃÃ ÃÃ (LQ'HWHNWRULVWHUVWDNWLYZHQQGDVHQWVSUHFKHQGH.RQWUROONlVWFKHQ$FWLYHLP 'LDORJIHQVWHU6LJQDORGHULP'LDORJIHQVWHU%HDP3DWK6HWWLQJDQJHNOLFNWLVW Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 124 von 263

125 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ (OHNWURQLVFKHU=RRP )XQNWLRQ In der Konfokalmikroskopie bestimmt zm einen das Objektiv nd zm anderen der elektronische Zoom die Vergrößerng eines Bildes. Das Objektiv erzegt ein Zwischenbild, dessen Vergrößerng vom Vergrößerngsfaktor des Objektivs abhängt. Eine zsätzliche Vergrößerng kann mit dem elektronischen Zoom erreicht werden. Bei einem Zoomfaktor 1 wird die maximale Scanfeldgröße mit einer bestimmten Anzahl von Pnkten gescannt. Stellt man nn den Zoomfaktor 2 ein, wird mit derselben Anzahl von Pnkten ein Scanfeld mit der halben Seitenlänge des maximalen Scanfelds (1/4 des rsprünglichen Scanfelds) abgetastet. Man erhält also eine stärkere Vergrößerng nd damit ach eine verbesserte Aflösng des Bildes, weil ein kleineres Scanfeld mit derselben Freqenz abgetastet wird nd somit eine höhere Informationsdichte erzielt wird. Im Dialogfenster, das mit der Taste Zoom geöffnet wird, können Sie einen der voreingestellten Zoomfaktoren aswählen. Wenn Sie af die Schaltfäche Others klicken, können Sie einen anderen Zoomfaktor af zwei Arten einstellen: Bewegen Sie mit dem Maszeiger den Schieber der Skala. Der entsprechende Wert wird in der Mitte des Dialogfensters angezeigt. Doppelklicken Sie af den fett dargestellten Zahlenwert in der Mitte des Dialogfensters. Es wird ein weiteres Dialogfenster geöffnet, in dem Sie den exakten Wert eintragen können. Sie können den Zoomfaktor ach mit dem entsprechenden Drehknopf der Bedienkonsole einstellen. & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Es können zwar Zoomfaktoren von 1 bis 32 eingestellt werden. Dennoch kann mit dem elektronischen Zoom nicht nbegrenzt sinnvoll vergrößert werden. Die Grenze ist mit dem kleinsten optisch noch aflösbaren Abstand erreicht, der vom Aflösngsvermögen des Objektivs bestimmt wird. Dieser optisch noch aflösbare Abstand wird, gemäß dem Nyqist Theorem, dann ohne Informationsverlst abgebildet, wenn er mit etwa 2 bis 3 Rasterpnkten abgetastet wird. Wird diese Abtastfreqenz bei einem relativ hohen Zoomfaktor nd einem gegebenen Scanformat überschritten, ist eine weitere Vergrößerng nicht mehr sinnvoll, weil keine weiteren optischen Details mehr afgelöst werden können (Leervergrößerng). & siehe Scanformat aswählen (Seite 128) & siehe Objektiv aswählen (Seite 123) %HLEOHLFKHPSILQGOLFKHQ3UlSDUDWHQLVWHVUDWVDPQXULQHLQJHVFKUlQNWHP0D HPLW GHPHOHNWURQLVFKHQ=RRP]XDUEHLWHQ'D6LHEHLKRKHQ=RRPIDNWRUHQHLQHQ $XVVFKQLWWGHV3UlSDUDWHVPLWHLQHUUHODWLYK KHUHQ$EWDVWIUHTXHQ]DXIQHKPHQLVWGDV 3UlSDUDWHLQHUVWlUNHUHQ/LFKWHLQZLUNXQJDXVJHVHW]W'LHVNDQQ]XUSKRWRFKHPLVFKHQ =HUVW UXQJGHV3UlSDUDWHVI KUHQRSWLVFKHV%OHLFKHQ 2SWLPDOH=RRPIDNWRUHQ Die folgende Tabelle zeigt, bei welchen Zoomfaktoren (rot markiert) - in Abhängigkeit einer drch das Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 125 von 263

126 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Objektiv bestimmten Scanfeldgröße nd eines gewählten Scanformats - das Präparat ohne Informationsverlst abgetastet wird: 2EMHNWLY 9HUJU HUXQJ 1XPHULVFKHà $SHUWXU $XIO VXQJà EHLÃλÃà QP 20 0, x x x , x x x , x x x FDQIRUPDW =RRPIDNWRU 6FDQIHOG JU Hà µp $EWDVW IUHTXHQ]à QP $XIO VXQJà $EWDVWIUHTXHQ] 0,4 0,8 1,8 0,2 0,4 0,9 1,8 0,1 0,2 0,3 0,7 1,4 0,4 0,8 1,7 0,2 0,4 0,8 1,7 0,1 0,2 0,3 0,7 1,3 0,9 1,9 0,5 0,9 1,9 0,2 0,4 0,7 1,5 'LH/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUHYHUI JW EHUGUHL]XXQWHUVFKHLGHQGH=RRP)XQNWLRQHQ GHQHOHNWURQLVFKHQ=RRPGHQ'=RRPXQGGHQJUDSKLVFKHQ=RRP & siehe 3D Ansicht zoomen (Seite 186) & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Display (Seite 157) 9HUJU HUWH$XIQDKPHHLQHV%LOGDXVVFKQLWWV Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 126 von 263

127 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ )XQNWLRQ Die Fnktion Zoom In ermöglicht die vergrößerte Afnahme eines frei wählbaren, qadratischen Asschnitts eines Präparates. Klicken Sie af die Taste Zoom In. Gleichzeitig wird atomatisch die Taste Rectangle aktiv. & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Rechteck definieren (Seite 230) Legen Sie den z vergrössernden Asschnitt fest, indem Sie mit der Taste Rectangle einen rechteckigen Aswertngsbereich (Region of interest oder ROI) in das Bild zeichnen. & siehe Aswertngsbereich (ROI) markieren nd verschieben (Seite 231) Mit der Taste Select kann der Asschnitt af dem Bild verschoben werden. Starten Sie die Bildafnahme mit der Taste Continos Scan, Series Scan oder Single Scan. 'LH6RIWZDUHSDVVWGHQIUHLJHZlKOWHQUHFKWHFNLJHQ$XVVFKQLWWDXWRPDWLVFKDQGLH WDWVlFKOLFKYRP6FDQQHUUHDOLVLHUEDUHTXDGUDWLVFKH)RUPDQ'LHJHVWULFKHOWH/LQLH ]HLJWGHQWDWVlFKOLFKHQ%LOGDXVVFKQLWWDQ =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Die vergrößernde Afnahme eines Bildasschnitts wird nr solange zsätzliche Detailinformationen liefern wie der Abstand der Rasterpnkte größer bleibt als die Hälfte des optischen Aflösngsvermögens. Das Aflösngsvermögen wiederm hängt von dem verwendeten Objektiv, dem eingestellten Scanformat nd der verwendeten Lichtwellenlänge ab (Leervergrößerng). 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Alle Anwendngen, bei denen es m die optische Aflösng sehr kleiner Strktren geht nd af ein Übersichtsbild verzichtet werden kann. Bei der Afnahme von solchen Präparaten sollte daraf geachtet werden, dass ach ein Objektiv mit entsprechend hohem optischem Aflösngsvermögen zr Bildafnahme verwendet wird. ÃÃ 'HWHNWLRQVORFKEOHQGHHLQVWHOOHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Pinhole klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie den Öffnngsdrchmesser der Detektionslochblende (des Detektionspinholes) einstellen können. Im Listenfeld oben rechts im Dialogfenster wählen Sie die Einheit as, in welcher der Drchmesser angezeigt werden soll. Sie können zwischen µm, Airy-Einheiten oder Digitalwerten wählen. Sie haben zwei Möglichkeiten, m einen Wert für den Drchmesser der Lochblende einzgeben: Bewegen Sie mit dem Maszeiger den Schieber af der Skala, die links im Dialogfenster eingeblendet ist. Der entsprechende Wert wird in der Mitte des Dialogfensters angezeigt. Doppelklicken Sie af den fett dargestellten Zahlenwert in der Mitte des Dialogfensters. Es wird ein weiteres Dialogfenster geöffnet, in dem Sie den exakten Wert eintragen können. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 127 von 263

128 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Der Öffnngsdrchmesser der Detektionslochblende mss immer af das aktell verwendete Objektiv eingestellt werden. Wenn Sie af die Schaltfläche Airy 1 klicken, wird die Detektionslochblende atomatisch in Abhängigkeit des verwendeten Objektivs af den Optimalwert 1 Airy Einheit eingestellt. Neben der nmerischen Apertr des Objektivs nd der Wellenlänge des Lichtes bestimmt ach die Detektionslochblende die Dicke der optischen Schnitte. =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Der Drchmesser der Lochblende ist optimal eingestellt, wenn er mit dem Drchmesser der Airy Scheibe übereinstimmt. Als Airy Scheibe bezeichnet man den inneren, hellen Kreis des Begngsbildes einer pnktförmigen Lichtqelle. Der Drchmesser dieser Airy Scheibe ist wiederm von mehreren optischen Parametern abhängig nd lässt sich für Leica Konfokalsysteme wie folgt beschreiben: Zr Errechnng des Drchmessers der Airy Scheibe benötigt man also die Anregngswellenlänge λ (bei mehreren Wellenlängen, sollte man mit einem gemittelten Wert rechnen), die nmerische Apertr NA nd den Vergrößerngsfaktor M des Objektivs. Der Faktor 3,6 steht für die Vergrößerng weiterer optischer Komponenten im Leica Konfokalmikroskop. Ist die Lochblende af die Airy Scheibe eingestellt, wird Licht von asserhalb der Foksebene nterdrückt nd das Signal/ Rasch-Verhältnis ist hoch. Unter diesen Bedingngen können optische Schnitte von minimaler Dicke afgenommen werden. Je mehr die Lochblende geöffnet wird, desto mehr Licht erreicht den Detektor. Das Bild wird heller. Aber ach Beiträge von Strktren aßerhalb der Foksebene werden nn abgebildet nd machen das Bild znehmend nscharf. Eine Vergrößerng des Blendendrchmessers über 1 Airy Einheit ist nr dann ratsam, wenn sehr schwache Signale detektiert werden sollen. Bei Afnahmen von materialwissenschaftlichen Präparaten wird in der Regel genügend Licht in die Detektoren reflektiert, so dass das Detektionspinhole ganz geschlossen werden kann (das heißt af den minimalen Drchmesser eingestellt werden kann). 6FDQIRUPDWDXVZlKOHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Format klicken, öffnet sich ein Dialogfenster mit einer Aswahl von verschiedenen Scanformaten. Mit dem Scanformat wählen Sie das für die Bildafnahme verwendete Bildraster as. Unter Bildraster versteht man die Anzahl der Pnkte, mit denen das Präparat in den drei Ramrichtngen abgetastet wird. Neben der nmerischen Apertr des Objektivs nd der Anregngswellenlänge bestimmt das Scanformat zsammen mit dem Elektronischen Zoom wesentlich die rämliche Aflösng der afgenommenen Daten. =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Bei der Wahl des Scanformats sollten Sie beachten, welche Zsammenhänge zwischen dem Bildraster nd der Aflösng des erzegten Bildes bestehen. Gemäß dem Nyqist Theorem (oder Sampling Theorem) kann eine Strktr nr dann ohne Informationsverlst abgerastert werden, wenn der kleinste optisch noch aflösbare Abstand mit etwa 2 bis 3 Rasterpnkten abgetastet wird. Dieser als ODWHUDOH$XIO VXQJ bezeichnete optisch noch aflösbare Abstand hängt von der nmerischen Apertr des Objektivs nd der Wellenlänge des verwendeten Anregngslichtes ab: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 128 von 263

129 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Das folgende Beispiel veranschalicht diesen Zsammenhang: Sie haben zm Beispiel das Objektiv PL APO 100x mit der nmerischen Apertr NA = 1,4 nd eine Wellenlänge von λ = 488 nm asgewählt. Daras ergibt sich der kleinste optisch noch aflösbare Abstand: Gemäß der oben genannten Fastregel beträgt dann der Abstand der Rasterpnkte, der für eine Afnahme ohne Informationsverlst notwendig ist: Haben Sie das Scanformat 1024x1024 asgewählt, ergibt sich bei einem Objektiv PL APO 100x, dessen maximale Scanfeldgröße 150 µm beträgt, jedoch der folgende Abstand der Rasterpnkte: Um den notwendigen Rasterabstand von 47 nm z erreichen, haben Sie nn die Möglichkeit entweder das Scanformat z erhöhen (z.b. af 2048x2048) oder die Scanfeldgröße mit Hilfe des Elektronischen Zooms (Zoom=2) z verkleinern. Der aktelle Rasterabstand wird in der Legende Hardware angezeigt. Dieser Wert wird dort als Voxel Size bezeichnet nd ne berechnet, sobald Sie das Scanformat, den Elektronischen Zoom oder das Objektiv ändern. & siehe Elektronischer Zoom (Seite 125) & siehe Objektiv aswählen (Seite 123) 0DQVSULFKWYRQ2YHUVDPSOLQJZHQQGLH$EWDVWIUHTXHQ]YRQELV3XQNWHQ EHUVFKULWWHQZLUG'DEHLZLUGGLH6WUXNWXU]ZDUYROOVWlQGLJDEJHELOGHWDEHUHVZHUGHQ NHLQH]XVlW]OLFKHQ,QIRUPDWLRQHQPHKUJHZRQQHQ1DFKWHLOGHV2YHUVDPSOLQJLVWGLH ODQJH$EWDVW]HLWXQGEHLEOHLFKHPSILQGOLFKHQ3UlSDUDWHQGLH*HIDKUGHU=HUVW UXQJGHV 8QWHUVXFKXQJVREMHNWV0DQVSULFKWYRQ8QGHUVDPSOLQJZHQQGLH$EWDVWIUHTXHQ]YRQ ELV3XQNWHQXQWHUVFKULWWHQZLUG,QGLHVHP)DOOEHVWHKWGLH*HIDKUGDVVQLFKWDOOH QRWZHQGLJHQ,QIRUPDWLRQHQDEJHUDVWHUWZHUGHQ'DV%LOG]HLJWGDQQP JOLFKHUZHLVH 6WUXNWXUHQGLHHVLP3UlSDUDWQLFKWJLEW'LHVHQ(IIHNWQHQQWPDQ$OLDVLQJ 6FDQPRGXVDXVZlKOHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Mode klicken, öffnet sich ein Dialogfenster mit einer Liste der zr Verfügng stehenden Scanmodi. Der Scanmods bestimmt, welche optischen Ebenen im Präparat abgetastet werden. Grndsätzlich können horizontale xy-schnitte oder vertikale xz-schnitte afgenommen werden. Um ein dreidimensionales Bild vom Präparat z erzegen, werden die optischen Schnitte in die jeweilige dritte Ramrichtng fortgeführt nd so ein Stapel as Einzelbildern afgenommen. Hinz kommt die Möglichkeit, die Bildafnahme in Abhängigkeit von der Zeit oder der Wellenlänge aszführen: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 129 von 263

130 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 0RGXV xyz xzy xt xyt xzt xyzt xyλ xzλ )XQNWLRQ As xy-schnitten wird in z-richtng ein Bildstapel afgenommen. As xz-schnitten wird in y-richtng ein Bildstapel afgenommen. Eine Linie wird mehrere Male hintereinander afgenommen. Ein xy-schnitt wird mehrere Male hintereinander afgenommen. Ein xz-schnitt wird mehrere Male hintereinander afgenommen. As xy-schnitten wird in z-richtng ein Bildstapel mehrere Male hintereinander afgenommen. Ein xy-schnitt wird bei verschiedenen Wellenlängen afgenommen. Ein xz-schnitt wird bei verschiedenen Wellenlängen afgenommen. Alle Scanmodi (mit Asnahme von xt) setzen sich as mindestens drei Dimensionen zsammen. Die dritte nd weitere Dimensionen werden vom Gerät ignoriert, wenn Sie mit der Endlos-Scan Fnktion oder der Einmal-Scan Fnktion Bilder nr as einer optischen Ebene (xy oder xz) afnehmen. 'LH6FDQPRGL[]\XQG[]WZHUGHQQXULQGHU/LVWHDQJH]HLJWZHQQ6LH]XYRUPLWGHU 7DVWH=6FDQGHQ$XVZDKOSXQNW*DOYRDXVJHZlKOWKDEHQ(EHQVRZHUGHQGLH 6FDQPRGLI UHLQH:HOOHQOlQJHQVHULH[\λXQG[]λQXUDQJH]HLJWZHQQLP 'LDORJIHQVWHU%HDP3DWK6HWWLQJQXUHLQ'HWHNWRUDNWLYLHUWLVW & siehe Strahlengang einstellen (Seite 119) 6FDQJHVFKZLQGLJNHLWDXVZlKOHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Speed klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie vier verschiedene Scangeschwindigkeiten einstellen können. *HVFKZLQGLJNHLW 200 Bildzeilen pro Seknde 400 Bildzeilen pro Seknde 800 Bildzeilen pro Seknde 1000 Bildzeilen pro Seknde In Kombination mit dem Bidirektionalen Scan kann die Geschwindigkeit der Datenafnahme noch erhöht werden. & siehe Unidirektionaler oder Bidirektionaler Scan (Seite 143) =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Je höher die eingestellte Scangeschwindigkeit ist, desto kürzer ist die Verweilzeit des Laserpnktes. Dabei ist ach das Scanformat, also die Anzahl der Abtastpnkte in einer Zeile, z berücksichtigen. Je höher das Scanformat bei gleichbleibender Geschwindigkeit, desto geringer ist die Verweilzeit des Laserpnktes über einem Abtastpnkt. Je länger der Lichtpnkt des Laserstrahls über den einzelnen Abtastpnkten im Präparat verweilt, desto mehr Licht wird vom Detektor erfasst. Mit einer geringeren Scangeschwindigkeit können Sie Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 130 von 263

131 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ also ein besseres Signal/ Rasch-Verhältnis erzielen. Der Nachteil einer geringeren Scangeschwindigkeit besteht darin, dass das Präparat drch die relativ längere Lichteinwirkng photochemisch gebleicht nd somit nbrachbar werden kann. Dies ist vor allem bei Floreszenzanwendngen von Bedetng. 6LQGGLH*HVFKZLQGLJNHLWVVWXIHQRGHUHLQJHVWHOOWNDQQDXV JHUlWHWHFKQLVFKHQ*U QGHQQLFKWPHKUGDVPD[LPDOH6FDQIHOGDEJHWDVWHWZHUGHQ'DV 6\VWHPVFKDOWHWDXWRPDWLVFKDXIGHQ=RRPIDNWRUUHVSHNWLYH=RRPIDNWRU =HLWVHULHHLQVWHOOHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Time öffnen Sie das Dialogfenster Time Configration, in dem Sie die Afnahme einer Zeitserie einstellen. Die Parameter, die in diesem Dialogfenster eingestellt werden können, hängen von dem asgewählten Scanmods ab. Sie können eine Linie (xt), einen horizontalen Schnitt (xyt), einen vertikalen Schnitt (xzt) oder einen Stapel as horizontalen Schnitten (xyzt), von einem bestimmten Zeitintervall nterbrochen, viele Male hintereinander afnehmen. 'LH7DVWH7LPHLVWHUVWDNWLYZHQQ6LHPLWGHU7DVWH0RGHHLQHQ6FDQPRGXVPLW =HLWGLPHQVLRQDXVJHZlKOWKDEHQ & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) Für eine Zeitserie im Scanmods xt werden folgende Parameter im Dialogfenster angezeigt. T Lines Lines per page Pages Maximize Complete Time Afnahmezeit für eine Linie NDQQQLFKWYRP%HQXW]HUHLQJHVWHOOWZHUGHQ Anzahl der Afnahmen der Linie Anzahl der Linien pro Speicherseite Anzahl der Speicherseiten ZLUGDXWRPDWLVFKEHUHFKQHW Afnahme der größtmöglichen Anzahl Linien pro Speicherseite Gesamte Afnahmezeit, also Prodkt as T nd Anzahl der Afnahmen Mit der Schaltfläche Calclate können Sie berechnen, wieviele Speicherseiten bei einer bestimmten Anzahl von Linien pro Seite benötigt werden. Für eine Zeitserie im Scanmods xyt oder xzt werden folgende Parameter im Dialogfenster angezeigt: T Minimize Frames Complete Time Afnahmezeit für einen xy-schnitt oder xz-schnitt pls Pasenintervall Das kleinstmögliche Intervall ( T) wird verwendet. Anzahl der Afnahmen des xy-schnitts oder xz-schnitts Gesamte Afnahmezeit, also Prodkt as T nd Anzahl der Afnahmen Für eine Zeitserie im Scanmods xyzt werden folgende Parameter im Dialogfenster angezeigt: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 131 von 263

132 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ T Minimize Stacks Complete Time Afnahmezeit für einen Stapel as xy-schnitten pls Pasenintervall Das kleinstmögliche Intervall ( T) wird verwendet. Anzahl der Afnahmen des Bildstapels Gesamte Afnahmezeit, also Prodkt as T nd Anzahl der Afnahmen Jeder der Parameter kann in Abhängigkeit der anderen Parameter berechnet werden. Beachten Sie bei der Eingabe der Werte die besondere Fnktionsweise des Dialogfensters. Das Eingabefeld, das Sie anklicken, wird deaktiviert: Klicken Sie af den Parameter der berechnet werden soll. Das entsprechende Eingabefeld erscheint gra. Geben Sie nn die Werte für die anderen Parameter ein. Klicken Sie af Apply, m den Parameter z berechnen. Mit einem Klick af Reset werden die zletzt gespeicherten Werte angezeigt. Nachdem Sie diese Einstellngen vorgenommen haben, klicken Sie af die Taste Series Scan. (LQPDO6FDQVWDUWHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Single Scan wird nr ein einziges Bild as einer einzigen optischen Ebene im Präparat afgenommen. Bevor Sie mit der Einmal-Scan Fnktion ein Bild afnehmen, stellen Sie zvor mit der Endlos-Scan Fnktion alle erforderlichen Scanparameter so ein, dass Sie eine optimale Bildqalität erhalten. & siehe Endlos-Scan starten (Seite 132) Typische Anwendngen Die Einmal-Scan Fnktion ist für die Afnahme von bleichempfindlichen Präparaten gedacht. Verwenden Sie bei solchen Präparaten diese Fnktion nicht nr für die Bildafnahme, sondern ach anstelle der Endlos-Scan Fnktion, m die Scanparameter einzrichten. Wenn Sie das Scanfeld zoomen, eignet sich die Einmal-Scan Fnktion ach, m den Bildasschnitt z überprüfen. (QGORV6FDQVWDUWHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Continos Scan werden nnterbrochen nd immer nr as einer einzigen optischen Ebene Bilder vom Präparat afgenommen. Bildserien können dabei nicht erstellt werden, da immer das zletzt erzegte Bild das vorherige ersetzt. Drücken Sie ernet af diese Taste, m den Endlos-Scan z beenden. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 132 von 263

133 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Das Gerät arbeitet atomatisch mit den zletzt eingestellten Scanparametern. Einige dieser Parameter können Sie ZlKUHQG der Bildafnahme verändern. Andere sollten Sie YRU Beginn der Bildafnahme einstellen: 9RUGHU%LOGDXIQDKPH Objektiv aswählen Scanformat aswählen Scanmods aswählen Scangeschwindigkeit aswählen Unidirektionalen oder Bidirektionalen Scan aswählen :lkuhqgghu%logdxiqdkph Strahlengang einstellen Detektionslochblende einstellen Elektronischen Zoom einstellen Detektoren einstellen Phase einstellen Die Tasten der Fnktionen, die während der Bildafnahme mit der Endlos-Scan Fnktion nicht eingestellt werden können, sind deaktiviert nd erscheinen gra nterlegt. 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Die Endlos-Scan Fnktion dient zr Optimierng der Bildqalität bei der ersten Afnahme eines Präparates. Während das Präparat kontinierlich abgetastet wird, können Sie die oben genannten Scanparameter einstellen nd das Ergebnis direkt am Bild überprüfen. %HLEOHLFKHPSILQGOLFKHQ3UlSDUDWHQLVWHVUDWVDPQXULQHLQJHVFKUlQNWHP0D HPLW GHP(QGORV6FDQ]XDUEHLWHQ'LHNRQWLQXLHUOLFKH/LFKWHLQZLUNXQJGHV/DVHUVNDQQGDV 3UlSDUDWSKRWRFKHPLVFK]HUVW UHQRSWLVFKHV%OHLFKHQXQGGDPLW]XU8QEUDXFKEDUNHLW GHV3UlSDUDWHVI KUHQ 'LDORJIHQVWHU6HULHV6FDQ2YHUYLHZ )XQNWLRQ In diesem Dialogfenster können Sie den Anfangspnkt nd den Endpnkt einer Bildserie definieren nd die Afnahme der einzelnen Schnitte mitverfolgen. Der dreidimensionale Scanbereich ist graphisch als Würfel dargestellt. In dieser Graphik symbolisiert ein gelbes Qadrat die aktelle z- Position bzw. y-position, ein grünes den Anfangspnkt nd ein rotes den Endpnkt. Die entsprechenden Positionswerte werden rechts neben der Graphik angezeigt. Stellen Sie Anfangspnkt nd Endpnkt wie folgt ein. Ziehen Sie mit dem Maspfeil das gelbe Qadrat bis af die Ebene, in der die Bildserie beginnen soll. Klicken Sie in das weiße Kästchen für den Anfangspnkt (Begin). Der entsprechende Positionswert wird eingeblendet nd gespeichert. Ziehen Sie mit dem Maspfeil das gelbe Qadrat bis af die Ebene, in der die Bildserie enden soll. Klicken Sie in das weiße Kästchen für den Endpnkt (End). Der entsprechende Positionswert wird eingeblendet nd gespeichert. Die Gesamthöhe des Bildstapels zwischen Anfangs- nd Endpnkt wird errechnet nd angezeigt (Total). Klicken Sie nn af die Taste Series Scan. Das Dialogfenster bleibt geöffnet nd Sie können die Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 133 von 263

134 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Afnahme der Bildserie mitverfolgen. $QIDQJVSXQNWXQG(QGSXQNWN QQHQDXFKPLWGHU%HGLHQNRQVROHXQGGHQVHSDUDWHQ 7DVWHQ%HJLQXQG(QGGHILQLHUWZHUGHQ & siehe Anfangspnkt einer rämlichen Serie definieren (Seite 134) & siehe Endpnkt einer rämlichen Serie definieren (Seite 135) =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Es werden noch folgende zsätzliche Parameter im Dialogfenster Series Scan Overview angegeben, die vor der Afnahme einer Bildserie eingestellt werden müssen: Scanmods (oberste Zeile rechts neben der Graphik) Scanformat (rote Zahlen an den oberen Kanten des Würfels) Anzahl der optischen Schnitte (Teilstriche zwischen Anfangspnkt nd Endpnkt) Die rote Zahl an der vertikalen Kante des Würfels entspricht dem maximalen Verfahrweg des z- Stellantriebs, der nicht verändert werden kann. & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) & siehe Scanformat aswählen (Seite 128) & siehe Anzahl der rämlichen Schnitte bestimmen (Seite 136) $QIDQJVSXQNWHLQHUUlXPOLFKHQ6HULHGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Begin definieren Sie den Anfangspnkt einer rämlichen Bildserie. Stellen Sie zerst die exakte z-position bzw. y-position im Dialogfenster Series Scan Overview oder an der Bedienkonsole mit dem entsprechenden Drehknopf ein. Dann klicken Sie af die Taste Begin. Der Positionswert für den Anfangspnkt wird gespeichert. Af die gleiche Weise wird ach der Endpnkt eingestellt. & siehe Dialogfenster Series Scan Overview (Seite 133) & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) ÃÃ ÃÃ Ã $QIDQJVSXQNWHLQHU:HOOHQOlQJHQVHULHGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Bei einer Wellenlängenserie wird von einer einzigen optischen Ebene ein Stapel as Einzelbildern afgenommen, die jeweils bei einer bestimmten Wellenlänge detektiert werden. Mit der Taste Lambda Scan Begin definieren Sie die Wellenlänge, bei der die Bildafnahme beginnen soll. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 134 von 263

135 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'LH7DVWH/DPEGD6FDQ%HJLQLVWHUVWDNWLYZHQQ6LHPLWGHU7DVWH0RGHHLQHQ 6FDQPRGXVPLWGHU'LPHQVLRQ:HOOHQOlQJHDXVJHZlKOWKDEHQ & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) Öffnen Sie mit der Taste Beam das Dialogfenster Beam Path Setting. Aktivieren Sie einen Detektor, indem Sie af das entsprechende Kontrollkästchen klicken. Ein Wrfschatten verbindet nn den aktivierten Detektor mit dem entsprechenden Schieber af der Skala des Spektrms. Doppelklicken Sie af diesen Schieber. Es wird das Dialogfenster Range Properties geöffnet, in dem Sie die Detektionsbandbreite einstellen können. Ziehen Sie den Schieber af der Skala des Spektrms af die gewünschte Anfangsposition. Der linke Rand des Schiebers kennzeichnet die Wellenlänge, bei der die Bildafnahme beginnen soll. Klicken Sie af die Taste Lambda Scan Begin, m den Wert z speichern. Af die gleiche Weise wird der Endpnkt einer Wellenlängenserie bestimmt. Aßerdem müssen Sie noch die Anzahl der Wellenlängenschritte bestimmen. & siehe Endpnkt einer Wellenlängenserie definieren (Seite 136) & siehe Anzahl der Wellenlängenschritte bestimmen (Seite 137) 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Mit einer Wellenlängenserie können Sie das Emissionsmaximm eines Floreszenzfarbstoffes ermitteln. Dies ist deshalb von Bedetng, weil die Stokes Verschiebng der Emissionskrve eines Floreszenzfarbstoffes vom jeweilig verwendeten Präparat abhängig ist. Somit können Sie den Detektionsbereich präzise af eine spezifische Anwendng einstellen. (QGSXQNWHLQHUUlXPOLFKHQ6HULHGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste End definieren Sie den Endpnkt einer rämlichen Bildserie. Stellen Sie zerst die exakte z-position bzw. y-position im Dialogfenster Series Scan Overview oder an der Bedienkonsole mit dem entsprechenden Drehknopf ein. Dann klicken Sie af die Taste End. Der Positionswert für den Endpnkt wird gespeichert. Af die gleiche Weise wird ach der Anfangspnkt eingestellt. & siehe Dialogfenster Series Scan Overview (Seite 121) & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 135 von 263

136 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ (QGSXQNWHLQHU:HOOHQOlQJHQVHULHGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Bei einer Wellenlängenserie wird von einer einzigen optischen Ebene ein Stapel as Einzelbildern afgenommen, die jeweils bei einer bestimmten Wellenlänge detektiert werden. Mit der Taste Lambda Scan End definieren Sie die Wellenlänge, bei der die Bildafnahme enden soll. 'LH7DVWH/DPEGD6FDQ(QGLVWHUVWDNWLYZHQQ6LHPLWGHU7DVWH0RGHHLQHQ 6FDQPRGXVPLWGHU'LPHQVLRQ:HOOHQOlQJHDXVJHZlKOWKDEHQ & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) Öffnen Sie mit der Taste Beam das Dialogfenster Beam Path Setting. Aktivieren Sie einen Detektor, indem Sie af das entsprechende Kontrollkästchen klicken. Ein Wrfschatten verbindet nn den aktivierten Detektor mit dem entsprechenden Schieber af der Skala des Spektrms. Doppelklicken Sie af diesen Schieber. Es wird das Dialogfenster Range Properties geöffnet, in dem Sie die Detektionsbandbreite einstellen können. Ziehen Sie den Schieber af der Skala des Spektrms af die gewünschte Endposition. Der rechte Rand des Schiebers kennzeichnet die Wellenlänge, bei der die Bildafnahme enden soll. Klicken Sie af die Taste Lambda Scan End, m den Wert z speichern. Af die gleiche Weise wird der Anfangspnkt einer Wellenlängenserie bestimmt. Aßerdem müssen Sie noch die Anzahl der Wellenlängenschritte bestimmen. & siehe Anfangspnkt einer Wellenlängenserie definieren (Seite 134) & siehe Anzahl der Wellenlängenschritte bestimmen (Seite 137) 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Mit einer Wellenlängenserie können Sie das Emissionsmaximm eines Floreszenzfarbstoffes ermitteln. Dies ist deshalb von Bedetng, weil die Stokes Verschiebng der Emissionskrve eines Floreszenzfarbstoffes vom jeweilig verwendeten Präparat abhängig ist. Somit können Sie den Detektionsbereich präzise af eine spezifische Anwendng einstellen. $Q]DKOGHUUlXPOLFKHQ6FKQLWWHEHVWLPPHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Sections klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie die Anzahl der horizontalen xy-schnitte oder vertikalen xz-schnitte für die Afnahme einer Bildserie aswählen können. Wollen Sie eine andere als die in der Liste angegebene Anzahl von Schnitten, klicken Sie af den Aswahlpnkt Others. Es erscheint dann das Dialogfenster Z/Y-Configration mit folgenden Angaben: 3DUDPHWHU Image Dim. z/y (µm) %HVFKUHLEXQJ Höhe des gesamten Bildstapels zwischen Anfangs- nd Endpnkt der Bildserie Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 136 von 263

137 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ # Sections Anzahl der eingestellten Schnitte Step Size (µm) Schrittweite, also der Abstand zwischen zwei Schnitten In diesem Dialogfenster können Sie einen beliebigen Wert für die Anzahl der Schnitte nd die Schrittweite eingeben. Die Höhe des Bildstapels kann nicht verändert werden, da dieser Parameter drch den Anfangs- nd Endpnkt der Bildserie bestimmt wird. Da die Schrittweite immer ein Vielfaches der minimalen Schrittweite des z-stellantriebs sein mss, sind bestimmte Kombinationen von Werten nr möglich, wenn entweder die Höhe des Bildstapels oder die Anzahl der Schnitte angepasst wird. Je nachdem, af welche der beiden Schaltflächen Calclate sie klicken, wird einer der beiden Parameter nicht verändert. Wenn Sie die Anzahl der Schnitte berechnen wollen mit der Priorität, die Höhe des Bildstapels möglichst nverändert z lassen: Geben Sie die gewünschte Schrittweite im Feld Step Size ein. Klicken Sie dann af die Schaltfläche Calclate neben dem Feld Step Size. Wenn Sie die Anzahl der Schnitte berechnen wollen mit der Priorität, die Anzahl der Schnitte möglichst nverändert z lassen: Geben Sie die gewünschte Schrittweite im Feld Step Size ein. Klicken Sie dann af die Schaltfläche Calclate neben dem Feld # Sections. Wenn Sie die Schrittweite berechnen wollen mit der Priorität, die Höhe des Bildstapels möglichst nverändert z lassen: Geben Sie die Anzahl der gewünschten Schnitte (nr ganze Zahlen) im Feld # Sections ein. Klicken Sie dann af die Schaltfläche Calclate neben dem Feld # Sections. Wenn Sie die Schrittweite berechnen wollen mit der Priorität, die Anzahl der Schnitte möglichst nverändert z lassen: Geben Sie die Anzahl der gewünschten Schnitte (nr ganze Zahlen) im Feld # Sections ein. Klicken Sie dann af die Schaltfläche Calclate neben dem Feld Step Size. Wenn Sie af die Taste Reset klicken, werden die zletzt gespeicherten Werte angezeigt. & siehe Serien-Scan starten (Seite 138) & siehe Dialogfenster Series Scan Overview (Seite 133) $Q]DKOGHU:HOOHQOlQJHQVFKULWWHEHVWLPPHQ )XQNWLRQ Bei einer Wellenlängenserie wird von einer einzigen optischen Ebene ein Stapel as Einzelbildern afgenommen, die jeweils bei einer bestimmten Wellenlänge detektiert werden. Die Bildafnahme erfolgt über einen Wellenlängenbereich hinweg, der vom Anfangspnkt nd Endpnkt der Serie begrenzt wird. Mit der Taste Lambda Steps definieren Sie die Anzahl der Afnahmen, die innerhalb dieses Bereichs afgenommen werden. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 137 von 263

138 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'LH7DVWH/DPEGD6WHSVLVWHUVWDNWLYZHQQ6LHPLWGHU7DVWH0RGHHLQHQ6FDQPRGXV PLWGHU'LPHQVLRQ:HOOHQOlQJHDXVJHZlKOWKDEHQ & siehe Scanmods aswählen (Seite 128) & siehe Anfangspnkt einer Wellenlängenserie definieren (Seite 134) & siehe Endpnkt einer Wellenlängenserie definieren (Seite 136) 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Mit einer Wellenlängenserie können Sie das Emissionsmaximm eines Floreszenzfarbstoffes ermitteln. Dies ist deshalb von Bedetng, weil die Stokes Verschiebng der Emissionskrve eines Floreszenzfarbstoffes vom jeweilig verwendeten Präparat abhängig ist. Somit können Sie den Detektionsbereich präzise af eine spezifische Anwendng einstellen. 6HULHQ6FDQVWDUWHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Series Scan wird eine Bildserie erstellt. Dabei wird ein mehrdimensionaler Bilddatensatz des Präparates erzegt. Die für die Afnahme einer Bildserie zr Verfügng stehenden Dimensionen sind neben den drei Ramrichtngen (x, y, z) ach die Dimensionen Zeit (t) nd Wellenlänge (λ). Somit können Sie die Afnahme eines dreidimensionalen rämlichen Bildstapels as xy-schnitten oder xz-schnitten zsätzlich in Abhängigkeit von der Zeit oder von der Wellenlänge drchführen. %HYRU6LHHLQH%LOGVHULHDXIQHKPHQVWHOOHQ6LHPLWGHU(QGORV6FDQ)XQNWLRQ7DVWH &RQWLQXRXV6FDQDOOHHUIRUGHUOLFKHQ6FDQSDUDPHWHUVRHLQGDVV6LHHLQHRSWLPDOH %LOGTXDOLWlWHUKDOWHQ & siehe Endlos-Scan starten (Seite 132) Für die Afnahme einer rämlichen Bildserie sind folgende Einstellngen vorznehmen: Den Scanmods mit der Taste Mode aswählen. & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) Das Scanformat mit der Taste Format aswählen. & siehe Scanformat aswählen (Seite 128) Die gewünschte z-position bzw. y-position im Dialogfenster Series Scan Overview oder mit dem entsprechenden Drehknopf der Bedienkonsole einstellen. & siehe Dialogfenster Series Scan Overview (Seite 133) & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) Den Anfangspnkt der Bildserie mit der Taste Begin oder im Dialogfenster Series Scan Overview speichern. & siehe Anfangspnkt einer rämlichen Serie definieren (Seite 134) Die gewünschte z-position bzw. y-position im Dialogfenster Series Scan Overview oder mit dem entsprechenden Drehknopf der Bedienkonsole einstellen. & siehe Dialogfenster Series Scan Overview (Seite 133) & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 138 von 263

139 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Den Endpnkt der Bildserie mit der Taste End oder im Dialogfenster Series Scan Overview speichern. & siehe Endpnkt einer rämlichen Serie definieren (Seite 135) Die Anzahl der rämlichen Schnitte mit der Taste Sections aswählen. & siehe Anzahl der rämlichen Schnitte bestimmen (Seite 136) Nachdem Sie diese Einstellngen vorgenommen haben, klicken Sie af die Taste Series Scan. Im Dialogfenster Series Scan Overview können Sie die Afnahme des Bildstapels mitverfolgen. Für die Afnahme einer Zeitserie sind folgende Einstellngen vorznehmen: Einen Scanmods mit Zeitdimension mit der Taste Mode aswählen. & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) Das Scanformat mit der Taste Format aswählen. & siehe Scanformat aswählen (Seite 128) Die gewünschte z-position bzw. y-position im Dialogfenster Series Scan Overview oder mit dem entsprechenden Drehknopf der Bedienkonsole einstellen. & siehe Dialogfenster Series Scan Overview (Seite 133) & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) Die Anzahl der Afnahmen, das Pasenintervall zwischen den Afnahmen nd die komplette Bearbeitngszeit einstellen. & siehe Zeitserie einstellen (Seite 131) Für die Afnahme einer Wellenlängenserie sind folgende Einstellngen vorznehmen: Einen Scanmods mit der Dimension Wellenlänge mit der Taste Mode aswählen. & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) Das Scanformat mit der Taste Format aswählen. & siehe Scanformat aswählen (Seite 128) Die Wellenlänge bestimmen, bei der die Wellenlängenserie beginnen soll. & siehe Anfangspnkt einer Wellenlängenserie definieren (Seite 134) Die Wellenlänge bestimmen, bei der die Wellenlängenserie enden soll. & siehe Endpnkt einer Wellenlängenserie definieren (Seite 136) Die gewünschte Anzahl der Afnahmen zwischen Anfangs- nd Endpnkt der Wellenlängenserie aswählen. & siehe Anzahl der Wellenlängenschritte bestimmen (Seite 137) Nachdem Sie diese Einstellngen vorgenommen haben, klicken Sie af die Taste Series Scan. $XIQDKPHVHTXHQ]HQNRQILJXULHUHQ )XQNWLRQ Mit dieser Fnktion können bis z sechs Afnahmeintervalle mit nterschiedlichen Hardwareeinstellngen nd deren Reihenfolge in einer Afnahmeseqenz kombiniert werden. Wenn Sie af die Taste Time Lapse klicken, wird das folgende Dialogfenster geöffnet: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 139 von 263

140 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ.RQILJXUDWLRQGHU$XIQDKPHVHTXHQ] Stellen Sie im Dialogfenster Beam Path Setting nd den Tasten im Arbeitsschritt Acqire (z.b. Pinhole, Series Scan Overview) alle benötigten Hardwareparameter für das erste Afnahmeintervall (Lapse 1) ein. & siehe Strahlengang einstellen (Seite 119) Klicken Sie af die Schaltfläche Define, m diese Hardwareeinstellngen für das Afnahmeintervall z speichern. Es werden atomatisch die Einstellngen sämtlicher Scanfnktionen abgespeichert. Ã :HOFKH+DUGZDUHSDUDPHWHUPLW'HILQHJHVSHLFKHUWZHUGHQNDQQLP'LDORJIHQVWHU6HWWLQJ YDULLHUWZHUGHQ:lKOHQ6LH]XGLHVHP=ZHFNGDV0HQ 7RROV2SWLRQ6HWWLQJV5HJLVWHU,QVWUXPHQW3DUDPHWHU6HWWLQJV.OLFNHQ6LHLP)HOG&KRRVH6HWWLQJVDXI,367LPH/DSVH Wiederholen Sie diesen Vorgang mit nterschiedlichen Einstellngen für jedes weitere Afnahmeintervall (Lapse 2...8). Mit Reset können die Einstellngen wieder rückgängig gemacht werden. Wenn Sie af Apply klicken, werden die für das Afnahmeintervall definierten Einstellngen als aktelle Hardwareeinstellngen übernommen. Diese Schalffläche mss QLFKW betätigt werden, beim Start der Afnahmeseqenz werden die Einstellngen atomatisch übernommen. Sie haben mit dieser Fnktion die Möglichkeit, die jeweiligen Einstellngen nochmals z überprüfen. & siehe Afnahmeparameter eines Experiments übernehmen (Seite 146) Soll vor dem Start eines Afnahmeintervalls das Präparat gebleicht werden, markieren Sie das Kontrollkästchen Bleach. Es wird das Bleichmster verwendet, das im Dialogfenster Bleach definiert wrde. Dieses Bleichmster wird für alle Afnahmeintervalle verwendet. Markieren Sie das Kontrollkästchen Bleach Dialog, m das Dialogfenster Bleach z öffnen nd das Bleichmster ne z definieren. & siehe Definition eines Bleichexperiments (Seite 142) Stellen Sie im ersten Listenfeld nter Contine eine Pasenzeit zwischen der Abarbeitng des aktellen nd des nachfolgenden Afnahmeintervalls ein. Wählen Sie im zweiten Listenfeld nter Contine das Afnahmeintervall (Lapse 1...8) as, das nach der Abarbeitng des aktellen Intervalls asgeführt werden soll. Wenn Sie Finished aswählen, endet die Afnahmeseqenz mit dem aktellen Intervall. Klicken Sie af die Schaltfläche Start, m die Afnahmeseqenz z starten. Mit Stop kann die Afnahmeseqenz abgebrochen werden. %LOGDXIQDKPHQGXUFKH[WHUQH6LJQDOHDXVO VHQEHQ WLJWVSH]LHOOH+DUGZDUHDXVVWDWWXQJ Soll das Afnahmeintervall drch ein externes Signal gestartet werden. klicken Sie af die Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 140 von 263

141 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Schaltfläche Trigger.Im erweiterten Dialogfenster können Sie folgende Einstellngen für die Triggersignale vornehmen: /LVWHQIHOG,QSXW )XQNWLRQ Hier wird der Kanal für eingehende Triggersignale asgewählt. Ist ein Triggerkanal asgewählt, wird das Afnahmeintervall bei Eingang eines TTL-Triggersignals über den asgewählten Kanal gestartet: & siehe Signalstecker der Triggerelektronik (Seite 143),QSXW Pin 4 des Steckers der Triggerelektronik,QSXW Pin 12 des Steckers der Triggerelektronik,QSXW Pin 5 des Steckers der Triggerelektronik,QSXW Pin 13 des Steckers der Triggerelektronik Inpt : Zm Starten des Afnahmeintervalls wird nicht af ein eingehendes Triggersignal gewartet. =XU1XW]XQJGHV7ULJJHUHLQJDQJVPXVV0DVVH9DQ3LQGHV6WHFNHUVGHU 7ULJJHUHOHNWURQLNDQJHOHJWZHUGHQ 2XWSXW Hier wird der Kanal für asgehende Triggersignale asgewählt. Ist ein Triggerkanal asgewählt, wird bei Start eines Afnahmeintervalls ein TTL-Triggersignal über den asgewählten Kanal gesandt: & siehe Signalstecker der Triggerelektronik (Seite 143) 2XWSXW Pin 7 des Steckers der Triggerelektronik. Es handelt sich m ein Zeilensignal, das für die Daer der tatsächlichen Datenafnahme af einer logischen «1» steht. 2XWSXW Pin 15 des Steckers der Triggerelektronik. Es handelt sich m ein freies Signal, das verwendet werden kann, m in Abhängigkeit definierter Ereignisse externe Geräte z triggern. 2XWSXW±: Es wird kein Triggersignal asgegeben. =XU1XW]XQJGHV7ULJJHUDXVJDQJVPXVVHLQH6SDQQXQJYRQ9'&DQ3LQGHV 6WHFNHUVGHU7ULJJHUHOHNWURQLNDQJHOHJWZHUGHQ $OOH(LQJlQJHVLQGHQWNRSSHOWGXUFK2SWRNRSSOHU'HUPD[LPDOH6WURPPLWGHPGLH 2SWRNRSSOHUEHODVWHWZHUGHQG UIHQEHWUlJWP$'LHPLQLPDOH3XOVGDXHUI U HLQJHKHQGH7ULJJHUVLJQDOHEHWUlJWPVHF Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 141 von 263

142 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ :LUGHLQ$XIQDKPHLQWHUYDOOYRQHLQHPHLQJHKHQGHQ7ULJJHUVLJQDOJHVWDUWHWZLUGGLH $EDUEHLWXQJHLQHUEHUHLWVODXIHQGHQ$XIQDKPHDEJHEURFKHQ(LQ$XIQDKPHLQWHUYDOO ZLUGHUVWGDQQYRQHLQHP7ULJJHUVLJQDOJHVWDUWHWZHQQGLH6FKDOWIOlFKH$FWLYDWH RGHU6WDUWJHGU FNWZXUGH 'HILQLWLRQHLQHV%OHLFKH[SHULPHQWV )XQNWLRQ In diesem Dialogfenster können Bleichpnkte nd eine spezifische Bleichdaer für jeden Bleichpnkt definiert nd abgespeichert werden. Diese Fnktion kann nr in Verbindng mit einer Afnahmeseqenz verwendet werden. & siehe Afnahmeseqenz konfigrieren (Seite 139) Halten Sie den Maszeiger über das Bild im Ansichtsfenster Viewer, wenn das Dialogfenster Bleach geöffnet ist. Das Symbol des Maszeigers verändert sich z einem Krez. Wählen Sie im Bild die Bleichpnkte as, indem Sie die entsprechenden Positionen im Bild anklicken. Die Bleichpnkte werden im Listenfeld Bleach Points mit der Bezeichnng POS 1..n eingetragen. Mit der Schaltfläche Remove können die Bleichpnkte wieder entfernt werden. Um die Bleichdaer für einen einzelnen Bleichpnkt einzstellen, markieren Sie den entsprechenden Eintrag im Dialogfenster nd wählen Sie im Feld Dration ein Zeitintervall as. Um für alle Bleichpnkte dieselbe Bleichdaer einzstellen, klicken Sie af die Schaltfläche Select All nd stellen Sie dann die Bleichdaer ein. Klicken Sie af die Schaltfläche Define. Damit wird neben der Bleichdaer ach atomatisch die Laserintensität nd die z-höhe des asgewählten Bleichpnktes gespeichert. Die Laserintensität kann im Dialogfenster Beam Path Setting varriiert werden. & siehe Strahlengang einstellen (Seite 119) Wenn Sie af Apply klicken, werden die für das Bleichmster definierten Einstellngen als aktelle Hardwareeinstellngen übernommen. Klicken Sie af OK bzw. Contine (wenn der Dialog as dem Dialogfenster Time Lapse geöffnet wrde). Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 142 von 263

143 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'HU6LJQDOVWHFNHUGHU7ULJJHUHOHNWURQLNEHILQGHWVLFKDXIGHU5 FNVHLWHGHU 9HUVRUJXQJVHLQKHLW 'LH%HOHJXQJGHV6LJQDOVWHFNHUVGHU7ULJJHUHOHNWURQLN 6LJQDO Inpt 1 Inpt 2 Inpt 3 Inpt 4 Otpt 1 Otpt 2 Otpt 3 Otpt 4 GND + 5 V DC 6LJQDOVWHFNHU Pin 4 des Steckers der Triggerelektronik. Pin 12 des Steckers der Triggerelektronik. Pin 5 des Steckers der Triggerelektronik. Pin 13 des Steckers der Triggerelektronik. Pin 7 des Steckers der Triggerelektronik. Hier handelt es sich m ein Zeilensignal. Im Gegensatz zm Signal Otpt 3 (Pin 6), ist es nr für die Daer der tatsächlichen Datenafnahme af einer logischen «1». & siehe Afnahmeseqenzen konfigrieren (Seite 139) Pin 15 des Steckers der Triggerelektronik. Hier handelt es sich m ein freies Signal, das innerhalb der Time Lapse Fnktion verwendet werden kann, m in Abhängigkeit definierter Ereignisse externe Geräte z triggern. & siehe Afnahmeseqenzen konfigrieren (Seite 139) Pin 6 des Steckers der Triggerelektronik. Hier handelt es sich m ein Zeilensignal (line-clock). Das Signal hat eine ansteigende Flanke bei jedem Start einer neen Zeile. Das Signal bleibt für die gesamte Zeit, in der sich der Abtaststrahl in einer Zeile befindet, af einer logischen «1». Pin 14 des Steckers der Triggerelektronik. Hier handelt es sich m ein Framesignal (frame-clock). Das Signal hat eine ansteigende Flanke bei jedem Start eines neen Frames. Das Signal bleibt während der gesamten Zeit, die für die Afnahme eines Frames benötigt wird, af einer logischen «1». Pin 8 des Steckers der Triggerelektronik zr Ntzng asgehender nd eingehender Triggersignale Pin 11 des Steckers der Triggerelektronik zr Ntzng asgehender Triggersignale 8QLGLUHNWLRQDOHQRGHU%LGLUHNWLRQDOHQ6FDQDXVZlKOHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Unidirectional/ Bidirectional Scan klicken, wird der bidirektionale Scan Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 143 von 263

144 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ aktiviert. Ist die Taste nicht angeklickt, ist atomatisch der nidirektionale Scan eingestellt. Beim nidirektionalen Scan wird jede Zeile von links nach rechts abgetastet. Während der Laserstrahl zm Anfangspnkt der neen Zeile gelenkt wird, werden keine Daten afgenommen. Beim Bidirektionalen Scan wird die erste Zeile von links nach rechts nd die zweite Zeile von rechts nach links abgetastet. Es wird also ach der Rücklaf des Laserstrahles für die Datenafnahme gentzt. Deshalb kann mit dem Bidirektionalen Scan die Scangeschwindigkeit erhöht werden. Ist der Bidirektionale Scan aktiv, können Sie die mit der Taste Speed eingestellte Scangeschwindigkeit verdoppeln: 8QLGLUHNWLRQDO %LGLUHNWLRQDO 200 Aktell nicht verfügbar Bildzeilen pro Seknde Bildzeilen pro Seknde Bildzeilen pro Seknde Bildzeilen pro Seknde & siehe Scangeschwindigkeit aswählen (Seite 130) Um Hin- nd Rücklaf pixelgena afeinander abzgleichen, kann die Phase zwischen Hin- nd Rücklaf eingestellt werden. Verwenden Sie z diesem Zweck die Taste Phase. & siehe Phase einstellen (Seite 144) 6LQGGLH*HVFKZLQGLJNHLWVVWXIHQRGHUHLQJHVWHOOWNDQQDXV JHUlWHWHFKQLVFKHQ*U QGHQQLFKWPHKUGDVPD[LPDOH6FDQIHOGDEJHWDVWHWZHUGHQ'DV 6\VWHPVFKDOWHWDXWRPDWLVFKDXIGHQ=RRPIDNWRUUHVSHNWLYH=RRPIDNWRU & siehe Elektronischer Zoom (Seite 125) 3KDVHHLQVWHOOHQ )XQNWLRQ Bei der bidirektionalen Bildafnahme kann es z einer Phasenverschiebng zwischen hin- nd rücklafendem Abtaststrahl kommen. Mit der Taste Phase öffnen Sie ein Dialogfenster, in dem Sie diese Verschiebng korrigieren können: Bewegen Sie mit dem Maszeiger den Schieber af der Skala bis die Pixelverschiebng im Bild verschwnden ist. Sie können die Phase ach mit dem entsprechenden Drehknopf der Bedienkonsole einstellen. & siehe Fnktionen über die Bedienkonsole steern (Seite 240) =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Für jeden Zoomfaktor wrde werksseitig bereits ein Phasenabgleich vorgenommen nd die entsprechenden Werte eingestellt. Afgrnd der Temperatrabhängigkeit von Mechanik nd Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 144 von 263

145 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Elektronik, kann es beim Betrieb z leichten Abweichngen gegenüber den eingestellten Standardwerten kommen, die mit dieser Fnktion nachgeregelt werden können. 6FDQIHOGGUHKHQ )XQNWLRQ Mit der Fnktion Scan Field Rotation können Sie das Scanfeld drehen. Dabei wird weder das Präparat noch die Richtng der Abtastng gedreht, sondern das mikroskopische Zwischenbild. Wählen Sie im Dialogfenster Scan Field Rotation einen Drehwinkel zwischen 0 Grad nd 90 Grad. Die Ursprngsstellng (0 Grad) richtet sich dabei nach einer im Scankopf festgelegten Referenzposition. Bei Einschalten des Gerätes wird diese Referenzposition atomatisch angefahren. Klicken Sie af die Schalftäche Apply, m den eingestellten Drehwinkel af das aktelle Bild anzwenden. Mit Reset, kehren Sie zm zletzt eingestellten Wert zrück. Ist Ato Apply asgewählt, werden nee Einstellngen atomatisch im Bild aktalisiert. Klicken Sie af das Kontrollkästchen Visalize, m den Drehwinkel im Bild einzblenden. Sie können den Drehwinkel direkt im Bild verändern, indem Sie mit dem Maszeiger die weiße Linie ne positionieren. <3RVLWLRQLHUXQJ Ist der Scanmods xzy, xzt oder xzλ eingestellt, wird drch Aswahl des Kontrollkästchens Visalize zsätzlich die y-ebene als rote Linie im Bild eingeblendet. Im Dialogfenster Series Scan Overview können Sie nn die y-position variieren nd die Positionierng mit Hilfe der roten Linie im Bild überprüfen. & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) & siehe Dialogfenster Series Scan Overview (Seite 133) 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Mit dieser Fnktion können Textren af Oberflächen oder langgestreckte biologische Strktren relativ zm Beobachter asgerichtet werden. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 145 von 263

146 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ $XIQDKPHSDUDPHWHUHLQHV([SHULPHQWV EHUQHKPHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Apply können Sie die Hardwareeinstellngen, die Sie für ein bereits existierendes Experiment verwendet haben, für die Afnahme eines neen Experiments übernehmen. Somit haben Sie die Möglichkeit, für eine Anwendng optimal eingerichtete Scanparameter mit einem Klick für weitere Bildafnahmen ne einzstellen: Aktivieren Sie den Bilddatensatz, dessen Einstellngen Sie übernehmen wollen. Klicken Sie af die Taste Apply. %LOGDXIQDKPHHLQHU/LQLHLP0LWWHOXQJVYHUIDKUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Line Average wird ein Mittelngsverfahren für die Bildafnahme gestartet. Dabei wird jede einzelne Zeile mehrmals abgetastet. As den wiederholt gemessenen Intensitätswerten in einer Zeile wird für jeden Abtastpnkt der arithmetische Mittelwert berechnet nd im Ergebnisbild dargestellt. Erst nach der eingestellten Anzahl von Mittelngsvorgängen wird die nächste Zeile des Präparates abgetastet. Das hier verwendete Verfahren ermittelt einen fortlafenden Mittelwert. Das bedetet, dass nach der ersten Afnahme einer Zeile jede wiederholte Afnahme mit der zvor dargestellten Zeile gemittelt nd im Ergebnisbild dargestellt wird (Dynamischer Mittelwert). Wenn Sie af die Taste Line Average klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie einstellen können, wie oft eine Zeile abgetastet werden soll. Sie können zwischen 1 bis 8 Wiederholngen des Scanvorganges wählen. Mit einer parallelen Fnktion können Sie ach ganze Bilder im Mittelngsverfahren afnehmen. & siehe Bildafnahme im Mittelngsverfahren (Seite 147) 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Diese Fnktion wird vor allem bei der Afnahme von lebenden Proben angewandt. ÃÃ Ã %HLEOHLFKHPSILQGOLFKHQ3UlSDUDWHQLVWGLH%LOGDXIQDKPHLP0LWWHOXQJVYHUIDKUHQQLFKW ]XHPSIHKOHQ'LHZLHGHUKROWHQ$XIQDKPHQXQGGLHGDPLWYHUEXQGHQHODQJH /LFKWHLQZLUNXQJNDQQ]XU=HUVW UXQJGHV3UlSDUDWHVI KUHQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 146 von 263

147 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ %LOGDXIQDKPHLP%XUVWEHWULHE )XQNWLRQ Bei der Afnahme von Bildern, bei denen sehr grosse Datenmengen vom Rechner verarbeitet werden müssen, kann es z einer Verzögerng des Scanvorganges kommen. Die Ursache liegt darin, dass ein afgenommenes Bild erst af dem Bildschirm dargestellt wird, bevor weitere Bilder vom Scanner abgetastet werden können. Mit der Brst Fnktion ist es möglich, den Scanvorgang des Lasers nd die Aktalisierng der Bilddaten af dem Bildschirm z entkoppeln. Z diesem Zweck wird die Weiterleitng der Bilddaten vom Programmspeicher an den Bildschirm verzögert, nicht jedoch der Scanvorgang. Wenn Sie af die Taste Brst klicken, können Sie Betriebsarten mit nterschiedlichen Verzögerngszeiten aswählen: %HWULHEVDUW No Brst Frame Brst Complete Brst Atomatic %HVFKUHLEXQJ Die Bilddaten werden afgenommen nd simltan kontinierlich am Bildschirm dargestellt. Erst nach der Afnahme eines Einzelbildes, werden die Bilddaten am Bildschirm dargestellt. Erst nach der Afnahme einer Bildserie, werden die Bilddaten am Bildschirm dargestellt. Die Software stellt atomatisch die optimale Betriebsart für eine spezifische Anwendng ein. )ROJHQGH3DUDPHWHUN QQHQGLH]XYHUDUEHLWHQGH'DWHQPHQJHVRHUK KHQGDVVHV]X HLQHU9HU] JHUXQJEHLGHU'DUVWHOOXQJDXIGHP%LOGVFKLUPNRPPW6FDQIRUPDW 6FDQJHVFKZLQGLJNHLW%LGLUHNWLRQDOHU6FDQGLH$Q]DKOGHUDNWLYHQ'HWHNWLRQVNDQlOH GLH%HUHFKQXQJHLQHVhEHUODJHUXQJVELOGHVVRZLHGLH*U VVHGHV$QVLFKWVIHQVWHUV 9LHZHU %LOGDXIQDKPHLP0LWWHOXQJVYHUIDKUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Average wird ein Mittelngsverfahren für die Bildafnahme gestartet. Dabei wird jedes einzelne Bild, also jeder xy-schnitt oder xz-schnitt, mehrmals abgetastet. As den wiederholt gemessenen Intensitätswerten wird für jeden Abtastpnkt der arithmetische Mittelwert berechnet nd im Ergebnisbild dargestellt. Das hier verwendete Verfahren ermittelt einen fortlafenden Mittelwert. Das bedetet, dass nach der Afnahme des ersten Bildes jedes ne afgenommene Bild mit dem zvor dargestellten Bild gemittelt nd im Ergebnisbild dargestellt wird (Dynamischer Mittelwert). Wenn Sie af die Taste Average klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie einstellen können, wie oft ein Schnitt abgetastet werden soll. Sie können zwischen 1 bis 64 Wiederholngen des Scanvorganges wählen. 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Die Bildafnahme im Mittelngsverfahren dient vor allem zr Raschnterdrückng. In der Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 147 von 263

148 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Floreszenzmikroskopie gelangt bei schwach floreszierenden Präparaten wenig Licht zm Detektor. Die geringe Photonenzahl führt z verraschten Bildern. In einem solchen Fall können Sie drch mehrmaliges Afnehmen nd stetiger Mittelng des Bildes das Signal/ Rasch-Verhältnis verbessern. %HLEOHLFKHPSILQGOLFKHQ3UlSDUDWHQLVWGLH%LOGDXIQDKPHLP0LWWHOXQJVYHUIDKUHQQLFKW ]XHPSIHKOHQ'LHZLHGHUKROWHQ$XIQDKPHQXQGGLHGDPLWYHUEXQGHQHODQJH /LFKWHLQZLUNXQJNDQQ]XU=HUVW UXQJGHV3UlSDUDWHVI KUHQ %LOGDXIQDKPHLP$NNXPXODWLRQVYHUIDKUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Accmlation wird ein Akkmlationsverfahren für die Bildafnahme verwendet. Dabei wird jedes einzelne Bild, also jeder xy-schnitt oder xz-schnitt, mehrmals abgetastet. Die wiederholt gemessenen Intensitätswerte werden für jeden Abtastpnkt addiert nd die Smme im Ergebnisbild dargestellt. Wenn Sie af die Taste Accmlation klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie einstellen können, wie oft ein Schnitt abgetastet werden soll. Sie können zwischen 1 bis 16 Wiederholngen des Scanvorganges wählen. 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Das Akkmlationsverfahren dient der Verbesserng der Bildqalität bei Bildafnahmen, bei denen nr schwache Floreszenzsignale detektiert werden können. ÃÃ ÃÃ Ã %LOGDXIQDKPHPLWHLQHUGLJLWDOHQ$XIO VXQJYRQ%LWRGHU%LW )XQNWLRQ Mit dieser Fnktion werden die vom Detektor gemessenen analogen Intensitätswerte mittels eines AD-Wandlers entweder als 8-Bit-Signal oder 12-Bit-Signal eingelesen. =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Bei der Digitalisierng des analogen Intensitätssignals mit einer digitalen Aflösng von 8 Bit können 256 verschiedene Intensitätswerte dargestellt werden. Unter Berücksichtigng der natürlichen statistischen Schwankngen des typischen Intensitätswertebereichs von Floreszenzproben, ist eine Digitalisierng mit 8 Bit für eine Bildafnahme ohne Informationsverlst in den meisten Fällen völlig asreichend. Für Proben mit einer größeren Intensitätsdynamik (z.b. bei Proben, bei denen es sehr intensitätsschwache nd sehr intensitätsstarke Bereiche gibt) empfiehlt sich die Bildafnahme mit einer 12-Bit-Digitalisierng. Bei einer 12-Bit-Digitalisierng können 4096 verschiedene Intensitätswerte afgelöst werden. Allerdings verdoppelt sich dabei ach die z speichernde Datenmenge. 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Bei der Bildafnahme von Präparaten mit sehr hoher Intensitätsdynamik (meist Materialproben mit hoher Reflektivität der Oberfäche bei gleichzeitigem Aftreten sehr dnkler Bereiche). Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 148 von 263

149 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ ÃÃÃ Ã 89/LQVHQUDGHLQVWHOOHQRSWLRQ )XQNWLRQ Diese Fnktion vermindert den für jedes Objektiv vorhandenen Foksversatz zwischen sichtbarem nd UV-Anregngslicht af einen Wert, der nterhalb des optischen Aflösngsvermögens liegt. Um dies z erreichen wird atomatisch für jedes Objektiv, das für die Verwendng mit UV-Anregngslicht geeignet ist, eine geeignete Korrektrlinse in den Strahlengang gebracht. Zr Ntzng dieser Korrektrfnktion sollten Sie wie folgt vorgehen: Drücken Sie die Taste Objektive (standardmäßig im Arbeitsschritt Acqire) & siehe Objektiv aswählen (Seite 123) Wählen Sie as der Liste eine UV-tagliches Objektiv as (ist in der Liste gekennzeichnet) In diesem Fall wird die zm asgewählten Objektiv passende Korrektionsoptik atomatisch in den Strahlengang gebracht. 'DV$XIWUHWHQHLQHV)RNXVYHUVDW]HV]ZLVFKHQVLFKWEDUHP/LFKWXQG89/LFKWKDW SK\VLNDOLVFKH8UVDFKHQXQGLVWQLFKWJHUlWHEHGLQJW 5DQGEHGLQJXQJ Um eine atomatische Korrektr des physikalisch bedingten Farblängsfehlers zwischen sichtbarem nd UV-Licht z erreichen, reicht es nicht as, das Objektiv manell in den Strahlengang z drehen. ÃÃ /DVHUOLQLHI U%LOGKLQWHUJUXQGDXVZlKOHQ52,6FDQ )XQNWLRQ Diese Fnktion wird für die Afnahme von Aswertngsbereichen (ROI Scan) benötigt. Bei diesem Afnahmeverfahren wird der Bildhintergrnd mit einer anderen Anregngswellenlänge afgenommen als die asgewählten Aswertngsbereiche (Regions of Interest). Mit der Taste ROI speichern Sie die Lasereinstellngen für den Bildhintergrnd, bevor Sie die Anregngswerllenlänge getrennt für jeden Aswertngsbereich mit der Taste Configration festlegen. :HLWHUH,QIRUPDWLRQHQ]XGLHVHP7KHPDILQGHQ6LHLP.DSLWHOÄ9RUJHKHQVZHLVHQXQG hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq ÃÃ Ã Ä6HLWH Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 149 von 263

150 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ /DVHUOLQLHQI UHLQ]HOQH$XVZHUWXQJVEHUHLFKHDXVZlKOHQ52, 6FDQ )XQNWLRQ Diese Fnktion wird für die Afnahme von Aswertngsbereichen (ROI Scan) benötigt. Bei diesem Afnahmeverfahren wird der Bildhintergrnd mit einer anderen Anregngswellenlänge afgenommen als die asgewählten Aswertngsbereiche (Regions of Interest). Mit der Taste Configration öffnen Sie ein Dialogfenster, indem Sie verschiedene Laserlinien den einzelnen Aswertngsbereichen zordnen können. :HLWHUH,QIRUPDWLRQHQ]XGLHVHP7KHPDILQGHQ6LHLP.DSLWHOÄ9RUJHKHQVZHLVHQXQG hexqjhq]xdxvjhzlkowhq3ur]hvvhq ÃÃ ÃÃ Ã Ä6HLWH ;<2EMHNWWLVFKVWHXHUQ )XQNWLRQGHU'LDORJHOHPHQWH Im Dialogfenster XY-Stage Control finden Sie folgende Dialogelemente zr Steerng des «Märzhäser» XY-Objekttisches: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 150 von 263

151 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Das Symbol des Scanfeldes im Dialogfenster ändert seine Größe in Abhängigkeit der Parameter, die ach physikalisch die Größe des Scanfeldes bestimmen. Diese Parameter sind die Objektivvergrößerng, die Strahlafweitng, das Scanformat nd der Elektronische Zoom. Der Schnittpnkt der Führngslinienan der linken oberen Ecke des Scanfeldes dient als Referenzpnkt für die Positionierng des Objekttisches. Die Koordinaten dieses Referenzpnktes werden im Feld Crrent Position angezeigt. 3RVLWLRQLHUHQGHV;<2EMHNWWLVFKHV Sie können den XY-Objekttisch mit der Schaltfläche Set Position, mit dem Maszeiger, mit den Pfeiltasten im Dialogfenster, mit den Pfeiltasten der Tastatr oder mit dem Joystick positionieren. Positionieren mit der Schaltfläche Klicken Sie af die Schalffläche Set Position. Es wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie die x- nd y-koordinate des Referenzpnktes af mehrere Kommastellen gena eingeben können. Positionieren mit dem Maszeiger Klicken Sie af das Scanfeld im Dialogfenster, halten Sie die linke Mastaste gedrückt nd ziehen Sie das Scanfeld an die gewünschte Position. Erst beim Loslassen der linken Mastaste wird der Tisch bewegt. Um sicherzstellen, dass der Objekttisch erst verfahren wird, wenn die gewünschte Position erreicht ist, können Sie eine Verzögerngszeit zwischen Loslassen der Mas nd Bewegen des Objekttisches einstellen. Klicken Sie af die Schaltfläche Settings nd stellen Sie im Register Delay die Wartezeit ein. Positionieren mit den Pfeiltasten Betätigen Sie die vier Pfeiltasten im Dialogfenster oder die Pfeiltasten der Tastatr. :HQQ6LHGHQ2EMHNWWLVFKPLWGHQ3IHLOWDVWHQGHU7DVWDWXUSRVLWLRQLHUHQZLUGGDV6FDQIHOG H[DNWXPGLH6HLWHQOlQJHGHV6FDQIHOGVYHUVFKREHQVRGDVVHLQ3UlSDUDWGDVJU HULVWDOV GDV6FDQIHOGQDKWORVDEJHWDVWHWZHUGHQNDQQ Um sicherzstellen, dass der Objekttisch erst verfahren wird, wenn die gewünschte Position erreicht ist, können Sie eine Verzögerngszeit zwischen Betätigen der Tasten nd Bewegen des Objekttisches einstellen. Klicken Sie af die Schaltfläche Settings nd stellen Sie im Register Delay die Wartezeit ein. Positionieren mit dem Joystick Wenn Sie den Objekttisch mit dem Joystick bewegen, werden die Koordinaten im Feld Crrent Position nicht aktalisiert. Klicken Sie af die Schaltfläche Update Position m die aktelle Position einzblenden. 3RVLWLRQLHUXQJVJHVFKZLQGLJNHLWHLQVWHOOHQ Die Geschwindigkeit, mit der der Objekttisch verfahren wird, nd die Zeit, die dafür zr Verfügng steht, ist einstellbar. Klicken Sie af die Schaltfläche Settings nd definieren Sie im Register Speed die minimale nd maximale Positionierngsgeschwindigkeit, indem Sie den Schieberegler ziehen oder die entsprechenden Werte in die Eingabefelder eingeben. Im Eingabefeld Positioning Time definieren Sie die Positionierngszeit, also die Zeit, in der der Objekttisch seine Position erreicht haben mss. Beachten Sie, dass eine hohe Geschwindigkeit eine krze Positionierngszeit erfordert nd eine niedrige Geschwindigkeit eine lange Positionierzeit. 1XOOSXQNWVHW]HQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 151 von 263

152 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Schaltfläche Set Zero Position, m die aktelle Position des Objekttisches (Schnittpnkt der Führngslinien im Dialogfenster) als Nllpnkt z definieren. Dieser Wert wird ach in der Legende Hardware geändert. 0D HLQKHLWGHV9HUIDKUEHUHLFKVlQGHUQ Die Maßangaben an den Seitenkanten des Verfahrbereichs des Objekttisches ändern sich entsprechend der asgewählten Einheit. Es können Nanometer (nm), Mikrometer (mm), Millimeter (mm). Zentimeter (cm) oder Meter (m) eingestellt werden. Klicken Sie af die Schaltfläche Settings nd wählen Sie im Register Unit die Maßeinheit as. 'DUVWHOOXQJGHV9HUIDKUEHUHLFKVYHUJU HUQ Um den Objekttisch ach im Mikrometerbereich noch exakt positionieren z können, kann die Darstellng von Scanfeld nd Verfahrbereich im Dialogfenster vergrößert werden. Klicken Sie af die Schalfflächen + nd nd vergrößern oder verkleinern Sie die Darstellng des Verfahrbereichs. 'LH3RVLWLRQGHV;<2EMHNWWLVFKHVNDQQDXFKPLWHLQHP$XIQDKPHSDUDPHWHUVDW] DEJHVSHLFKHUWZHUGHQ'DPLWNDQQGHU;<2EMHNWLVFKDXFKEHL$XIQDKPHVHTXHQ]HQ HLQJHVHW]WZHUGHQ & siehe Afnahmeseqenzen konfigrieren (Seite 139) ÃÃ ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 152 von 263

153 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'DWHQGDUVWHOOXQJVIXQNWLRQHQ $QVLFKWVIHQVWHU9LHZHU In der Standardeinstellng besteht das Ansichtsfenster Viewer as drei wesentlichen Bereichen. In der Mitte befindet sich das Bildfenster (4), in dem die afgenommenen Bilder dargestellt werden. Links nd nterhalb von diesem Bildfenster können Tastenfelder (1) nd (2) nd rechts davon die Legende Experiment (3) angeordnet werden. Es ist möglich, andere Standardeinstellngen des Ansichtsfensters aszwählen nd bentzerdefinierte Konfigrationen als Schablone abzspeichern. & siehe Ansichtsfenster Viewer als Vorlage abspeichern (Seite 241) 7DVWHQIHOGHUXQG Als Standardeinstellng befinden sich im Tastenfeld links vom Bildfenster die Tasten für die Bilddarstellng nd im Tastenfeld nterhalb des Bildfensters die Tasten, mit denen man drch die einzelnen Bilder einer Bildserie blättern kann. Beide Tastenfelder können Sie innerhalb des Ansichtsfensters Viewer verschieben oder as diesem als separates Fenster herasnehmen. Z diesem Zweck klicken Sie mit dem Maszeiger af den Doppelrand des Tastenfeldes nd ziehen sie es bei gedrückter Mastaste an die gewünschte Stelle. %LOGIHQVWHU Wenn Sie den Maszeiger af eine beliebige Stelle innerhalb des Bildfensters positionieren nd af die rechte Mastaste klicken, wird ein Kontextmenü geöffnet, in dem Ihnen folgende Befehle zr Verfügng stehen: %HIHKO )XQNWLRQ Send to 4Experiment 4Selection (raw) Die Rohdaten eines markierten Asschnitts im Bildfenster werden als nees Bild in das aktelle Experiment kopiert. Das nee Bild kann weiterverarbeitet werden. 4Selection (snapshot) Die Bildschirmkopie eines markierten Asschnittes im Bildfenster wird als nees Bild im aktellen Experiment angelegt. Das nee Bild kann nicht mehr weiterverarbeitet werden. 4All (snapshot) Die Bildschirmkopie des gesamten aktellen Bildfensters wird als nees Bild im aktellen Experiment angelegt. Das nee Bild kann nicht mehr weiterverarbeitet werden. 4Printer 4Selection Der im Bildfenster markierte Asschnitt wird gedrckt. 4All Das gesamte aktelle Bildfenster wird gedrckt. Left Das Tastenfeld links vom Bildfenster wird ein- oder asgeblendet. bttons Bottom Das Tastenfeld nterhalb des Bildfensters wird ein- oder asgeblendet. bttons Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 153 von 263

154 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ LUT Legend Fll screen Viewer Options Die Farbzordnngstabellen des aktellen Bildes werden ein- oder asgeblendet. Die Legende Experiment wird ein- oder asgeblendet. Das Ansichtsfenster Viewer wird af die volle Bildschirmgrösse vergrößert. Das Dialogfenster Viewer Options wird geöffnet. Die )DUE]XRUGQXQJWDEHOOHQ werden als Farbleisten rechts neben dem Bildfenster angezeigt. Wenn Sie den Maszeiger über die jeweilige Farbleiste halten, erscheinen Anfasspnkte am oberen nd nteren Ende der Farbleiste. Mit diesen Anfasspnkten können Sie die aktelle Farbzordnngstabelle af einen bestimmten Intensitätswertebereich begrenzen nd eine zweite Farbzordnngstabelle laden. Damit haben Sie die Möglichkeit, den Kontrast des Bildes graphisch z erhöhen. Ziehen Sie den oberen Anfasspnkt nach nten oder den nteren Anfasspnkt nach oben. Doppelklicken Sie af den Bereich oberhalb oder nterhalb des jeweiligen Anfasspnktes. Das Dialogfenster Select LUT's wird geöffnet, in dem Sie eine zweite Farbzordnngstabelle aswählen können. Der obere nd ntere Intensitätswertebereich wird in den Farben der jeweiligen zweiten Farbzordnngstabelle dargestellt. & siehe Farbzordnngstabellen (LUT) aswählen (Seite 166) /HJHQGH([SHULPHQW In der Legende Experiment werden verschiedene Bildparameter einer Bildafnahme registriert. Sie können festlegen, welche Parameter angezeigt werden, indem Sie af einen beliebigen Stelle in der Legende klicken. Es wird die Liste aller verfügbaren Einträge geöffnet. Wählen Sie dann den gewünschten Eintrag. Wenn Sie den Maszeiger über eine beliebige Stelle innerhalb der Legende Experiment halten nd af die rechte Mastaste klicken, stehen Ihnen in einem Kontextmenü noch folgende Befehle zr Verfügng: %HIHKO )XQNWLRQ Experiment 4Edit Im Dialogfenster Edit Legend kann ein Name für die Legende (Title) eingegeben, die Anzahl der Einträge (Nmber of legend entries) bestimmt oder alle Einträge gelöscht werden (Clear all entries). 4Activate Die Legende Experiment wird im Ansichtsfenster Viewer angezeigt. 4Remove Die aktelle Legende Experiment wird gelöscht. Add Eine nee Legende Experiment wird im Ansichtsfenster Viewer angelegt. Experiment tab /HJHQGH+DUGZDUH In der Legende Hardware werden die Hardwareeinstellngen einer Bildafnahme registriert. Um diese Legende z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Hardware Legend. Um die Einträge aszwählen, die in der Legende angezeigt werden sollen, klicken Sie af die Schaltfläche Edit. Es wird das Dialogfenster Edit Legend Entries geöffnet: Im Listenfeld Available Entries werden alle verfügbaren Einträge eingeblendet. Wählen Sie die Einträge as, die in der Legende erscheinen sollen. Klicken Sie dann af die Schaltfläche Add, m diese in das Listenfeld Show entries z übernehmen. Im Listenfeld Show entries stehen die Einträge, die in der Legende angezeigt werden. Mit der Schaltfläche Remove können Sie Einträge wieder as der Legende herasnehmen. Mit den Schaltflächen Move p nd Move down können Sie einzelne oder mehrere Einträge in der Liste nach oben oder nten bewegen. Mit den Schaltflächen Edit grid color nd Edit backgrond color können Sie die Farbe des Rahmens nd des Hintergrnds der Legende verändern. Die Legende Hardware wird atomatisch am rechten Rand der Bedienoberfläche angeordnet. Größe Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 154 von 263

155 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ nd Position der Legende können Sie jedoch beliebig ändern: Um die Breite der Legende z ändern, ziehen Sie mit dem Maszeiger den Rand an die gewünschte Position. Um die Position der Legende z ändern, doppelklicken Sie af den Doppelrand der Legende oder klicken Sie einmal af das Symbol5. Die Legende wird als Fenster as der Bedienoberfläche gelöst. Ziehen Sie die Legende jetzt mit gedrückter linker Mastaste an die gewünschte Stelle.,VWGLH/HJHQGH EHUGLHJHVDPWH%UHLWHGHU%HGLHQREHUIOlFKHYHUJU HUWOlVVWVLHVLFK QXUZLHGHUDQGLHXUVSU QJOLFKH6WHOOHDP5DQGSRVLWLRQLHUHQZHQQ6LH]XHUVWGLH + KHGHU/HJHQGHYHUNOHLQHUQXQGVLHGDQQHUVWDQGHQ5DQGYHUVFKLHEHQ 2SWLRQ1HZ:LQGRZ Wenn Sie im Menü Window die Option New Window anklicken, haben Sie die Möglichkeit, ein weiteres Ansichtsfenster z öffnen, das dasselbe Bild anzeigt wie das aktell geöffnete Ansichtsfenster. Mit diesem Befehl legen Sie also nicht ein nees Experiment an, sondern öffnen nr eine zweite Ansicht af die aktellen Bilddaten. Vorteil dieser Option ist, dass gleichzeitig verschiedene Darstellngen derselben Bilddaten möglich sind. Diese Kopie des aktellen Ansichtsfensters erhält zr Unterscheidng eine lafende Nmmer hinter der Dateiendng. $XIQDKPHQDOV0LQLDWXUDQVLFKWLP([SHULPHQW%URZVHUDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Mit dem Experiment Browser haben Sie die Möglichkeit, alle Afnahmen eines Experiments als Miniatransicht anzzeigen. Damit haben Sie einen Überblick über den vorhandenen Bildbestand nd einen schnellen Zgriff af einzelne Afnahmen. Wählen Sie ein Experiment im Ansichtsfenster Experiment Overview as. Klicken Sie af die Taste Browse, m den Experiment Browser z öffnen. Alle Afnahmen des Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 155 von 263

156 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ ÃÃ ÃÃ Experiments werden als Miniatransicht angezeigt. Bildserien werden als Maximmsprojektion dargestellt. Klicken Sie af eine Miniatransicht, m den vollständigen Bilddatensatz im Ansichtsfenster Viewer z öffnen. Klicken Sie wieder af die Taste Browse, m den Experiment Browser z schließen. 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO' )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. In den Registern des Bildsymbols 3D können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe 3D Ansicht drehen (Seite 184) & siehe 3D Ansicht verschieben (Seite 185) & siehe 3D Ansicht zoomen (Seite 186) Im 5HJLVWHU1DYLJDWLRQwerden die Zahlenwerte der Aktionen angezeigt, die mit den Tasten Rotate, Move nd Zoom (nd dem Maszeiger) asgeführt werden. Im )HOG5RWDWLRQ können Sie drch Ändern des Winkelgrads der drei Achsen eine 3D Ansicht in alle drei Ramrichtngen kippen. Die 3D Ansicht wird m einen Fixpnkt gedreht, der sich in der Mitte des Bildes befindet. Um die Drehfnktion z verstehen, ist es am besten den Winkel nr einer Achse z verändern, während die anderen beiden Achsen af 0 gestellt sind: 5RWDWLRQ X von 0 af 45 Y von 0 af 45 Z von 0 af 45 )XQNWLRQ Die 3D Ansicht wird m den Fixpnkt m 45 in Richtng der negativen z-achse gedreht. Die 3D Ansicht wird m den Fixpnkt m 45 in Richtng der negativen x-achse gedreht. Die 3D Ansicht wird m den Fixpnkt m 45 in Richtng der negativen y-achse gedreht. Im )HOG7UDQVODWLRQ können Sie drch Ändern der Koordinatenwerte eine 3D Ansicht nach rechts oder links, nach oben oder nten verschieben sowie vergrößern oder verkleinern. Wenn Sie Dezimalzahlen eingeben, verwenden Sie den Pnkt als Dezimalzeichen. 7UDQVODWLRQ )XQNWLRQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 156 von 263

157 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ X Y Z Mit positiven Werten wird die 3D Ansicht nach rechts verschoben, mit negativen nach links. Mit positiven Werten wird die 3D Ansicht vergrößert, mit negativen verkleinert. Mit positiven Werten wird die 3D Ansicht nach oben verschoben, mit negativen nach nten. Im )HOG3UHGHILQHG können Sie mit einem Klick af die Schaltflächen Top view nd Side view das Bild in einer voreingestellten Drafsicht oder Seitenansicht darstellen. Im 5HJLVWHU'LVSOD\ können Sie af einen der afgelisteten Befehle klicken, m das entsprechende Gestaltngselement der 3D Ansicht im Ansichtsfenster Viewer ein- oder aszblenden: *UDSKLF(OHPHQWV )XQNWLRQ Show LUT Die asgewählte Farbzordnngstabelle (color look-p table) an der z- Achse anzeigen. Show scale Die Messskala anzeigen. Show bonding box Den Qader anzeigen, der das Messvolmen begrenzt. Show axes Die Koordinatenachsen anzeigen. Show data dring 3D motion Die Bilddaten anzeigen, während die 3D Ansicht gedreht, verschoben oder vergrößert nd verkleinert wird. 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO'LVSOD\ )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. In den Registern des Bildsymbols Display können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe Film starten nd beenden (Seite 171) Im 5HJLVWHU6HWWLQJV kann mit dem graphischen Zoom das im Ansichtsfenster Viewer angezeigte Bild vergrössert oder verkleinert werden: n-1 Das Bild wird verkleinert, indem n Pixel als 1 Pixel im Ergebnisbild dargestellt werden. Atomatic Das Bild wird im rsprünglichen Bildformat angezeigt. 1-n Das Bild wird vergrössert, indem 1 Pixel als n Pixel im Ergebnisbild dargestellt wird. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 157 von 263

158 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'LH/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUHYHUI JW EHUGUHL]XXQWHUVFKHLGHQGH=RRP)XQNWLRQHQ GHQJUDSKLVFKHQ=RRPGHQ'=RRPXQGGHQHOHNWURQLVFKHQ=RRP & siehe 3D Ansicht zoomen (Seite 186) & siehe Elektronischer Zoom (Seite 125) Klicken Sie in demselben Register af einen der Aswahlpnkte, m das entsprechende Gestaltngselement im Ansichtsfenster Viewer ein- oder aszblenden: Coordinates Scale Grid Die z-position des aktellen Bildes wird eingeblendet. Ein Massbalken mit Längenangabe wird angezeigt. Ein Raster wird über das aktelle Bild gelegt. Die Länge des Massbalkens nd die Rasterbreite wird in Abhängigkeit des Objektivs, des elektronischen Zooms nd der Strahlafweitng berechnet. Im 5HJLVWHU0RYLH kann die Geschwindigkeit bestimmt werden, mit der die Filmseqenz einer Bildserie ablafen soll. Sie können einen Wert aswählen zwischen 6 Einzelbildern pro Minte nd 25 Einzelbildern pro Seknde: Ziehen Sie mit dem Maspfeil den Schieber af der Skala af den gewünschten Wert. Wählen Sie den Ping-Pong Mods as, wenn die Filmseqenz vom ersten zm letzten Bild nd dann in mgekehrter Reihenfolge wieder zm ersten Bild ablafen soll. Ist dieser Mods nicht asgewählt, beginnt die Filmseqenz immer wieder mit dem ersten Bild. 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO&KDUWV )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. Im Register des Bildsymbols Charts können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe Messen eines Profils entlang einer Strecke (Seite 224) & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 158 von 263

159 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ & siehe Messen von Oberflächen nd Volmen (Seite 226) & siehe Rahigkeitsmessngen entlang einer Strecke (Seite 243) Die Optionen im 5HJLVWHU&KDUWV können erst angewählt werden, wenn Sie zvor mit einer dieser Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben. =ZHLSXQNWPHVVXQJDNWLYLHUHQ Klicken Sie im )HOG0HDVXUHPHQW af 2 Point, m die Zweipnktmessng z aktivieren. Jede der oben genannten Tasten öffnet ein Ansichtsfenster, in dem eine Messkrve nd statistische Werte angezeigt werden. Ist die Zweipnktmessng asgewählt, wird im Ansichtsfenster nterhalb der Messkrve (1) ein Messschieber (2) mit zwei Messpnkten (3) eingeblendet. Die Position der beiden Messpnkte in der Profilkrve wird drch kleine schwarze Qadrate (4) symbolisiert. So kann der aszwertende Bereich innerhalb der Messkrve mit hoher Genaigkeit eingestellt werden. Zsätzlich wird die Statistik, die nterhalb der Messkrve eingeblendet wird, m folgende Messwerte erweitert: Position der Messpnkte, Abstand der Messpnkte, Messwert an den Messpnkten, Differenz der gemessenen Grösse zwischen den Messpnkten. 3RVLWLRQXQG/lQJHGHV0HVVVFKLHEHUVlQGHUQ Zr Positionsänderng wird der Schieber in der Mitte mit der linken Mastaste angefasst nd bei gedrückter linker Mastaste in die gewünschte Position verschoben. Zr Veränderng der Länge des Schiebers wird er an einem Ende mit dem Maszeiger angefasst nd bei gedrückter linker Mastaste vergrößert oder verkleinert. 6NDOLHUXQJGHU0HVVNXUYHlQGHUQ Standardmäßig wird die Skalierng der Messkrven von der Software atomatisch an den Intensitätswertebereich angepasst, der jeweils in einer Bildafnahme vorliegt. Sie können die Skalierng jedoch ach manell verändern: Entfernen sie das Häkchen im Kontrollkästchen Ato, m die atomatische Skalierng z deaktivieren. Sie können jetzt getrennt für jede Messkrve (jeden Detektionskanal) den oberen nd nteren Grenzwert des Wertebereichs ne definieren. Überprüfen Sie das Resltat der geänderten Skalierng direkt im Ansichtsfenster. ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 159 von 263

160 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO3URMHFWLRQV )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. In den Registern des Bildsymbols Projections können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe Maximmprojektion eines Bildstapels bei invariabler Projektionsachse (Seite 176) & siehe Mittelwertprojektion eines Bildstapels bei invariabler Projektionsachse (Seite 178) & siehe Transparentprojektion eines Bildstapels bei invariabler Projektionsachse (Seite 180) & siehe SFP-Projektion eines Bildstapels erzegen (Seite 182) Im 5HJLVWHU3URMHFWLRQV stehen Ihnen verschiedene Optionen für die Erzegng eines Projektionsbildes zr Verfügng. Wählen Sie as, ob Intensitätsmaxima, das arithmetische Mittel oder ein gewichtetes Mittel der Intensitäten im Projektionsbild dargestellt werden soll. Variieren Sie den Gewichtngsfaktor für die Transparentprojektion. Stellen Sie einen Schwellenwert oder einen Skalierngsfaktor für die darzstellenden Intensitäten ein. 7\SH Maximm projection Average projection Transparent projection )XQNWLRQ As jeder der nterschten Sälen von Abtastpnkten wird der Abtastpnkt mit der maximalen Intensität als Repräsentant aller Werte innerhalb der Säle im Projektionsbild dargestellt. As jeder der nterschten Sälen von Abtastpnkten wird das arithmetische Mittel der in der Säle gemessenen Intensitäten im Projektionsbild dargestellt. As jeder der nterschten Sälen von Abtastpnkten wird ein gewichteter Mittelwert der in der Säle gemessenen Intensitäten im Projektionsbild dargestellt. 7UDQVSDUHQWIDFWRU Ziehen Sie den Schieber af der Skala 7KUHVKROG Ziehen Sie den Schieber af der Skala )XQNWLRQ(nr für Transparentprojektion aktiv) Je höher der Transparentfaktor α (0 < α < 1) eingestellt ist, desto stärker fliessen die Intensitätswerte as den nteren Ebenen im Bildstapel in das Projektionsbild ein. )XQNWLRQ(nr für Mittelwert- nd Transparentprojektion aktiv) Intensitäten, die nterhalb des eingestellten Schwellenwertes liegen, werden für die Berechnng des Projektionsbildes nicht mehr berücksichtigt. 6FDOLQJ Rescale to maximm )XQNWLRQ(nr für Mittelwert- nd Transparentprojektion aktiv) Die gemessenen Intensitätswerte werden af die maximal möglichen Intensitätswerte normiert. Im 5HJLVWHU6)3 stehen Optionen für die Erzegng eines SFP-Projektionsbildes zr Verfügng. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 160 von 263

161 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) )HOG Light Direction ÃÃ Absorption Threshold Rescale to maximm )XQNWLRQ Geben Sie hier jeweils eine Koordinate für x nd y ein.für den Projektionswinkel der SFP-Projektion ein. Dieser Winkel symbolisiert den Einfallswinkel des Laserstrahls af das Präparat. Klicken Sie af die Schaltfläche Apply, m die Projektion mit dem neen Winkel z erzegen. Variieren Sie mit dem Schieber den Absorptionskoeffizienten α. Je höher er eingestellt ist, desto kleiner werden die im Projektionsbild berechneten Werte. Ist der Koeffizient niedrig eingestellt, erreichen viele Pixel im Projektionsbild den Maximalwert, so dass die Strktren immer schwieriger z nterscheiden sind. Definieren Sie mit dem Schieber einen Schwellenwert. Die Intensitätswerte nterhalb dieses Wertes werden für die Erzegng des Projektionsbildes nicht berücksichtigt. Die Intensitätswerte des Bildes werden af die maximal möglichen Intensitätswerte normiert. Dies gewährleistet, dass die errechneten Grawerte des Projektionsbildes innerhalb des Wertebereichs von zm Beispiel 0 bis 255 bei 8 Bit bleiben. Dnkle Bilder können so afgehellt werden. 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO2YHUOD\ $XIEDXGHV$QVLFKWVIHQVWHUV([SHULPHQW2YHUYLHZ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. Im Register des Bildsymbols Overlay können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe Überlagerngsbild anzeigen (Seite 169) Im 5HJLVWHU2YHUOD\ können Sie zwischen drei Arten wählen, wie as den Rohdaten nd den dazgehörigen Farbzordnngstabellen ein Überlagerngsbild erzegt wird: &RORU0HUJLQJ Tre Color (add RGBs) Tre Color (add RGBs) with dynamic adjstment Fast (bitwise "OR" RGB) )XQNWLRQ Die Farbwerte der Pixel in den Ursprngsbildern werden gemittelt nd im Überlagerngsbild dargestellt. Die Farbwerte der Pixel in den Ursprngsbildern werden gemittelt, af die maximal möglichen Farbwerte normiert nd im Überlagerngsbild dargestellt. Die Farbwerte der Pixel in den Ursprngsbildern werden über einen schnellen bitweisen Rechenprozess gemischt nd im Überlagerngsbild dargestellt. & siehe Boolsche Verknüpfngen (Seite 248) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 161 von 263

162 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ &RORULQJ Only Red/ Green/ Ble )XQNWLRQ Für die Erzegng des Überlagerngsbildes werden immer die Farbzordnngstabellen Rot, Grün nd Bla verwendet, nabhängig von den aktellen Farbzordnngstabellen der Ursprngsbilder. 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO6FDQ3URJUHVV )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. Im Register des Bildsymbols Scan Progress können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe Scanmods aswählen (Seite 129) Im 5HJLVWHU6FDQ3URJUHVV wird der aktell eingestellte Scanmods anzeigt. Aßerdem kann der Stats einer Bildafnahme anhand einer Verlafsanzeige überprüft werden. ÃÃ ÃÃ Ã 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO6XUIDFH9LHZ )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. Im Register des Bildsymbols Srface View können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe 3D Ansicht erzegen (Seite 184) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 162 von 263

163 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Im 5HJLVWHU9LVXDOL]DWLRQ können Sie aswählen, ob die 3D Ansicht als Flächenbild (Srface), als Drahtgitterbild (Wireframe) oder als Isolinienbild (Isolines) asgeführt werden soll nd die Perspektive bestimmen, in der die 3D Ansicht dargestellt wird: 5HQGHU 0RGH Srface Wireframe Isolines )XQNWLRQ Die Zwischenräme zwischen den Bildpnkten werden mit Flächen gefüllt. Alle Bildpnkte werden mit Linien verbnden, die Zwischenräme bleiben frei. Bildpnkte, die Werten mit gleicher Intensität entsprechen, werden von einer Krve mschlossen. 3URMHFWLRQ7\SH Perspective Parallel )XQNWLRQ Die 3D Ansicht wird in Zentralperspektive dargestellt. Die 3D Ansicht wird in Parallelperspektive dargestellt. Im )HOG6WUHWFKKHLJKWIDFWRU haben Sie die Möglichkeit, den Skalierfaktor in z-richtng z variieren nd damit die 3D Ansicht in der Höhe z strecken oder z schrmpfen. Im )HOG'RZQVDPSOHUDWH kann die Informationsdichte der 3D Ansicht redziert werden, m die Bildverarbeitng z beschlenigen. Bei einer Bildpnktdichte von 1:1 werden alle gemessenen Intensitätswerte im Bild dargestellt. Bei einer Bildpnktdichte von 1:2 fließt nr jeder zweite Intensitätswert in das Bild ein. Im )HOG,VROLQHLQWHUYDO definieren Sie einen Abstand in µm, der die einzelnen Isolinien trennen soll. Damit können Sie die Anzahl der Isolinien in der 3D Ansicht begrenzen. Im )HOG,VROLQHGHWDLOOHYHO bestimmen Sie drch Eingabe eines Grenzwertes, dass nr Isolinien mit einer bestimmten Länge in der 3D Ansicht dargestellt werden. Damit werden nr die Isolinien angezeigt, die einem mit einer bestimmten Häfigkeit aftretenden Intensitätswert entsprechen. ÃÃ 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO6XUIDFH0HDVXUH )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. Im Register des Bildsymbols Srface Measre können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe Rahigkeitsmessngen entlang einer Strecke (Seite 243) Im )HOG/HYHOOLQJ stehen Optionen zr Verfügng, m Messkrven eines Rahigkeitsprofils, die einen Trendverlaf afweisen, mittels einer Anpassngsfnktion in eine horizontale Lage z bringen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 163 von 263

164 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Z diesem Zweck wird eine lineare Interpolationsfnktion (Polynom) an die Messkrve angepasst. & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner Materials (Seite ) & siehe Anpassngsfnktion zr Korrektr von Trendverläfen None Atomatic linear Interactive level Freeze Es wird keine Anpassngsfnktion af die Messkrve angewendet. Die Messkrve wird mittels einer linearen Anpassngsfnktion in eine horizontale Lage gebracht. Die Lage der Messkrve wird mittels der linearen Anpassngsfnktion so korrigiert, dass die Strecke zwischen den beiden Messpnkten in der Horizontalen liegt. Die ne positionierte Messkrve wird verriegelt, so dass die Position der Messpnkte wieder verändert werden kann, ohne dass die Messkrve interaktiv anpepasst wird. Im )HOG0XOWLSRLQW0HDVXUHPHQW besteht die Möglichkeit, die beiden Messpnkte sowie die Höhendifferenz zwischen den Messpnkten z speichern. ÃÃ ÃÃ Klicken Sie af die Schaltfläche Remember, m die Werte z speichern. Mit der Schaltfläche Clear werden sie wieder gelöscht. 'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQV%LOGV\PERO6XUIDFH&DOFXODWLRQ )XQNWLRQ Um das Dialogfenster Viewer Options z öffnen, wählen Sie im Menü View die Option Experiment Overview. Das Ansichtsfenster Experiment Overview wird af der linken Seite der Bedienoberfläche eingeblendet. Im oberen Teil des Ansichtsfensters werden die afgenommenen Bilder in einem Verzeichnisbam angezeigt. Im nteren Teil befindet sich das Dialogfenster Viewer Options. In diesem Dialogfenster können Sie Grndeinstellngen für verschiedene Softwarefnktionen vornehmen. Links werden die den Fnktionen entsprechenden Bildsymbole nd rechts die dazgehörigen Register angezeigt. Wenn Sie das Dialogfenster öffnen, erscheinen die Bildsymbole der Fnktionen, mit denen Sie gerade arbeiten. Klicken Sie af den Befehl Show all, m alle Bildsymbole anzzeigen. Im Register des Bildsymbols Srface Calclation können optionale Einstellngen für folgende Fnktionen vorgenommen werden: & siehe Topographiebild erzegen Im 5HJLVWHU7RSRJUDSK\ stehen Ihnen verschiedene Optionen für die Erzegng eines Topographiebildes zr Verfügng. Wählen Sie as, ob Intensitätsmaxima oder Flächenschwerpnkte der Intensitäten im Topographiebild als Höhe interpretiert werden sollen. Bestimmen Sie die Art der Visalisierng von Höhe im Topographiebild nd stellen Sie einen Schwellenwert für die darzstellenden Intensitäten ein. 6XUIDFH 5HFRQVWUXFWLRQ Search maximm intensity Calclate center of )XQNWLRQ As jeder der nterschten Sälen as Abtastpnkten wird der Abtastpnkt mit der maximalen Intensität als Repräsentant aller Werte innerhalb der Säle im Topographiebild dargestellt. As jeder der nterschten Sälen as Abtastpnkten wird der Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 164 von 263

165 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ mass of intensities 7RSRJUDSK\ 3URFHVVLQJ Invert height Level )XQNWLRQ Schwerpnkt der Fläche, die von der Krve der gemessenen Intensitätswerte begrenzt wird, im Topographiebild dargestellt. Die Säle as Abtastpnkten wird in mgekehrter Richtng nterscht. Damit wird die Höheninformation mgekehrt. Ein Negativ des Topographiebildes wird dargestellt. Die horizontale Lage einer Afnahme wird mittels einer linearen Interpolationsfnktion (Polynom) korrigiert. & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner Materials (Seite 212) 7KUHVKROG Ziehen Sie den Schieber af der Skala oder geben Sie einen Zahlenwert ein. )XQNWLRQ Intensitäten, die nterhalb des eingestellten Schwellenwertes liegen, werden für die Berechnng des Topographiebildes nicht mehr berücksichtigt. $Q]HLJHQGHU'HWHNWLRQVNDQlOH 'HWHNWLRQVNDQDODQ]HLJHQ )XQNWLRQ Mit einem Klick af die Taste Channel 1-8 werden im Ansichtsfenster Viewer die Bilddaten eingeblendet, die im Detektionskanal 1-8 afgenommen wrden. Sie können dem Detektionskanal eine von vielen Farbzordnngstabellen zweisen. Dies ist sowohl im Ergebnisbild als ach während der Bildafnahme möglich. Öffnen Sie z diesem Zweck das Dialogfenster Select Look-p Tables. Sie haben zwei Möglichkeiten, m das Dialogfenster z öffnen. Klicken Sie af die Taste Select Look-p Tables. Halten Sie den Maszeiger über eine beliebige Stelle im Ansichtsfenster Viewer. Klicken Sie af die rechte Mastaste. Es erscheint ein Kontextmenü, in dem Sie af LUT klicken. Im Ansichtsfenster werden die Farbleisten der aktiven Detektionskanäle eingeblendet. Doppelklicken Sie af die entsprechende Farbleiste. & siehe Farbzordnngstabellen (LUT) aswählen (Seite 166) 'LHVH0HWKRGHGHU=XRUGQXQJYRQ)DUE]XRUGQXQJVWDEHOOHQEHHLQIOXVVWQXUGLHDNWXHOOH %LOGGDUVWHOOXQJ6REDOG6LHHLQHQQHXHQ6FDQYRUJDQJVWDUWHQZHUGHQZLHGHUGLHLP 'LDORJIHQVWHU%HDP3DWK6HWWLQJHLQJHVWHOOWHQ)DUE]XRUGQXQJVWDEHOOHQYHUZHQGHW & siehe Strahlengang einstellen (Seite 119) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 165 von 263

166 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ %LOGHULP$QVLFKWVIHQVWHU9LHZHU]RRPHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Display klicken, öffnet sich ein Listenfeld, in dem Sie den graphischen Zoom einstellen können. Damit wird das im Ansichtsfenster Viewer angezeigte Bild vergrössert oder verkleinert: n-1 Das Bild wird verkleinert, indem n Pixel als 1 Pixel im Ergebnisbild dargestellt werden. Atomatic Das Bild wird im rsprünglichen Bildformat angezeigt. 1-n Das Bild wird vergrössert, indem 1 Pixel als n Pixel im Ergebnisbild dargestellt wird. 'LH/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUHYHUI JW EHUGUHL]XXQWHUVFKHLGHQGH=RRP)XQNWLRQHQ GHQJUDSKLVFKHQ=RRPGHQ'=RRPXQGGHQHOHNWURQLVFKHQ=RRP & siehe 3D Ansicht zoomen (Seite 186) & siehe Elektronischer Zoom (Seite 125) ÃÃ ÃÃ )DUE]XRUGQXQJVWDEHOOHQ/87DXVZlKOHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Look-p Tables öffnen Sie ein Dialogfenster, in dem Sie den Detektionskanälen jeweils eine Farbzordnngstabelle zweisen können. Die Einstellng der Farbzordnngstabellen kann sowohl am Ergebnisbild als ach während der Bildafnahme vorgenommen werden: Klicken Sie im Feld Select Channel af den Detektionskanal, dem Sie eine nee Farbzordnngstabelle zordnen wollen. Wählen Sie im Feld Select LUT die gewünschte Farbzordnngstabelle as. Klicken Sie af die Schaltfläche Apply, m das Ergebnis am Ansichtsfenster Viewer z überprüfen. Sie können das Dialogfenster Select LUT's ach über das Ansichtsfenster Viewer öffnen. Halten Sie den Maszeiger über eine beliebige Stelle im Bildfenster des Ansichtsfensters Viewer. Klicken Sie dann af die rechte Mastaste. Es erscheint ein Kontextmenü, in dem Sie af LUT klicken. Im Ansichtsfenster werden die Farbleisten der aktiven Detektionskanäle rechts neben dem Bildfenster eingeblendet. Doppelklicken Sie af eine der Farbleisten. (LQH]ZHLWH)DUE]XRUGQXQJVWDEHOOHODGHQ Wenn Sie den Maszeiger über die jeweilige Farbleiste halten, erscheinen Anfasspnkte am oberen nd nteren Ende der Farbleiste. Mit diesen Anfasspnkten können Sie die aktelle Farbzordnngstabelle af einen bestimmten Intensitätswertebereich begrenzen nd eine zweite Farbzordnngstabelle laden: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 166 von 263

167 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Ziehen Sie den oberen Anfasspnkt nach nten oder den nteren Anfasspnkt nach oben. Doppelklicken Sie af den Bereich oberhalb oder nterhalb des jeweiligen Anfasspnktes. Das Dialogfenster Select LUT's wird geöffnet, in dem Sie eine zweite Farbzordnngstabelle aswählen können. Der obere nd ntere Intensitätswertebereich wird in den Farben der jeweiligen zweiten Farbzordnngstabelle dargestellt. 'LHVH0HWKRGHGHU=XRUGQXQJYRQ)DUE]XRUGQXQJVWDEHOOHQEHHLQIOXVVWQXUGLHDNWXHOOH %LOGGDUVWHOOXQJ6REDOG6LHHLQHQQHXHQ6FDQYRUJDQJVWDUWHQZHUGHQZLHGHUGLHLP 'LDORJIHQVWHU%HDP3DWK6HWWLQJHLQJHVWHOOWHQ)DUE]XRUGQXQJVWDEHOOHQYHUZHQGHW & siehe Strahlengang einstellen (Seite 119) 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Grndsätzlich ist die Wahl einer geeigneten Farbzordnngstabelle für eine bestimmte Anwendng vom Empfinden des Bentzers abhängig. Die Erfahrng zeigt jedoch, dass sich einzelne Farbzordnngstabellen für bestimmte Anwendngen besonders gt eignen: )DUE]XRUGQXQJVWDEHOOH Green Red Ble Gray $QZHQGXQJ Wird üblicherweise für die Afnahme von Präparaten verwendet, die mit FITC, Cy2, DTAF nd ähnlichen Floreszenzfarbstoffen markiert wrden, die im grünen Spektralbereich emittieren. Wird üblicherweise für die Afnahme von Präparaten verwendet, die mit TRITC, Texas Red, Cy3, Rodamin nd ähnlichen Floreszenzfarbstoffen markiert wrden, die im roten Spektralbereich emittieren. Wird üblicherweise für die Afnahme von Präparaten verwendet, die mit UV-Floreszenzfarbstoffen wie DAPI oder Hoechst oder ähnlichen Farbstoffen markiert wrden, die im blaen Spektralbereich emittieren. Wird üblicherweise für die Darstellng von Transmissionsafnahmen verwendet. P. Color 1 Eignet sich besonders für die Darstellng von 12 Bit Bildern. P. Color 2, 3, 4, 5, 6 Werden üblicherweise für die Afnahme von Präparaten verwendet, die mit ph-sensitiven bzw. ionensensitiven Floreszenzfarbstoffen markiert wrden sowie für die Darstellng von Zeitserien. Geo (Land), Geo (Sea) Geo (Land & Sea) R & B Glow, Glow (Over), Glow (Under), Glow (Over & Under) Cyan, Magenta, Yellow Sind für die Erzegng von Topographiebildern, also für die Abbildng von Oberflächenstrktren, empfehlenswert. Insbesondere Geo Land & Sea eignet sich zr Visalisierng von Vertiefngen oder Stfen. Sind für die Optimierng des Bildkontrastes (Offset nd Gain der Detektoren) z empfehlen. Glow Over hebt Intensitäten am oberen Tabellenrand bla hervor, Glow Under stellt Intensitäten am nteren Tabellenrand grün dar. Glow Over and Under ist eine Kombination as diesen beiden Farbtabellen. Sind für den Asdrck eines Bildes z empfehlen. Die sogenannten CMY(K) Farben werden zr Farbasgabe af Drcksystemen verwendet. RGB Farben, wie die anderen hier gentzten Farbzordnngstabellen, werden für die Farbdarstellng af Monitoren eingesetzt. Da es sich hier m zwei nterschiedliche Farbsysteme handelt, können sich die Farben in der CMY(K) Darstellng stark von der Darstellng af dem Monitor nterscheiden. Alle Farbzordnngstabellen sind ach mit inversem Farbverlaf verfügbar, das heißt hohe Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 167 von 263

168 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Intensitäten werden dnkel, niedrige Intensitäten hell dargestellt. (LQ]HOELOGDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Single klicken, wird nr ein Detektionskanal oder mehrere Detektionskanäle in nr einem Bild im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Je nachdem welche weiteren Tasten Sie gleichzeitig noch aktivieren, sind folgende Darstellngsarten möglich: 7DVWHQNRPELQDWLRQ Single + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Single + Gallery + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Single + Overlay + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Single + Gallery + Overlay + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 'DUVWHOOXQJ Nr ein asgewählter Detektionskanal wird dargestellt, bei einer Bildserie das erste Bild des asgewählten Detektionskanals. Alle Einzelbilder einer Bildserie werden nr für einen asgewählten Detektionskanal dargestellt. Von allen asgewählten Detektionskanälen wird ein einziges Überlagerngsbild erzegt, bei einer Bildserie wird jeweils das erste Bild verwendet. Entsprechend der Anzahl von Einzelbildern einer Bildserie werden Überlagerngsbilder as allen asgewählten Detektionskanälen erzegt. 'LH7DVWH6LQJOHXQGGLH7DVWH7LOHGN QQHQQLFKWJOHLFK]HLWLJDNWLYVHLQGDPLWLKQHQ ]ZHLVLFKDXVVFKOLH HQGH)XQNWLRQHQDNWLYLHUWZHUGHQ 0HKUIDFKELOGDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Tiled klicken, werden die Detektionskanäle getrennt im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Je nachdem welche weiteren Tasten Sie gleichzeitig noch aktivieren, sind folgende Darstellngsarten möglich: 7DVWHQNRPELQDWLRQ Tiled + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Tiled + Gallery + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Tiled + Overlay + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Tiled + Gallery + Overlay + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 'DUVWHOOXQJ Alle asgewählten Detektionskanäle werden getrennt dargestellt, bei einer Bildserie wird jeweils das erste Bild verwendet. Alle Einzelbilder einer Bildserie werden für alle asgewählten Detektionskanäle getrennt dargestellt. Alle asgewählten Detektionskanäle werden getrennt nd zsätzlich zsammen in einem Überlagerngsbild dargestellt. Bei einer Bildserie wird jeweils das erste Bild verwendet. Alle Einzelbilder einer Bildserie werden getrennt für alle asgewählten Detektionskanäle nd zsätzlich zsammen in Überlagerngsbildern dargestellt. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 168 von 263

169 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'LH7DVWH7LOHGXQGGLH7DVWH6LQJOHN QQHQQLFKWJOHLFK]HLWLJDQJHNOLFNWZHUGHQGDPLW LKQHQ]ZHLVLFKDXVVFKOLH HQGH)XQNWLRQHQDNWLYLHUWZHUGHQ hehuodjhuxqjvelogdq]hljhq )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Overlay klicken, werden alle asgewählten Detektionskanäle zsammen in einem Überlagerngsbild im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Im Gegensatz zr Taste Overlay rgb werden die Detektionskanäle immer mit den aktell eingestellten Farbzordnngstabellen dargestellt. Z diesem Zweck werden die Farbwerte der Pixel gemittelt. Je nachdem welche weiteren Tasten Sie gleichzeitig noch aktivieren, sind folgende Darstellngsarten möglich: 7DVWHQNRPELQDWLRQ Overlay + Single + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Overlay + Single + Gallery + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Overlay + Tiled + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Overlay + Tiled + Gallery + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 'DUVWHOOXQJ Von allen asgewählten Detektionskanälen wird ein einziges Überlagerngsbild erzegt, bei einer Bildserie wird jeweils das erste Bild verwendet. Entsprechend der Anzahl von Einzelbildern einer Bildserie werden Überlagerngsbilder as allen asgewählten Detektionskanälen erzegt. Alle asgewählten Detektionskanäle werden getrennt nd zsätzlich zsammen in einem Überlagerngsbild dargestellt, bei einer Bildserie wird jeweils das erste Bild verwendet. Alle Einzelbilder einer Bildserie werden getrennt für alle asgewählten Detektionskanäle nd zsätzlich zsammen in Überlagerngsbildern dargestellt. Im Dialogfenster Viewer Options können Sie zwischen drei verschiedenen Arten der Farbmischng für die Erzegng eines Überlagerngsbildes wählen: Wählen Sie im Menü View die Option Viewer Options. Klicken Sie af das Bildsymbol Óverlay. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Overlay (Seite 161) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 169 von 263

170 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'DUVWHOOXQJYRQ%LOGVHULHQ (UVWHV%LOGHLQHU6HULHDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Die bei einer Bildserie afgenommen Einzelbilder können Sie als Filmseqenz ablafen lassen. Klicken Sie af die Taste First, m zm ersten Bild der Serie z springen.,vwglh7dvwh*doohu\dqjhnolfnwvlqgglh7dvwhq)luvwxqg/dvw1h[wxqg3uhylrxvxqg 3OD\6WRSJUDXXQWHUOHJWXQGN QQHQQLFKWEHWlWLJWZHUGHQ0LWGHU7DVWH*DOOHU\ ZHUGHQDOOH(LQ]HOELOGHUHLQHU%LOGVHULHHLQJHEOHQGHWXQGN QQHQVRPLWQLFKWDOV )LOPVHTXHQ]DEJHVSLHOWZHUGHQ 1lFKVWHV%LOGLQHLQHU6HULHDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Die bei einer Bildserie afgenommen Einzelbilder können Sie als Filmseqenz ablafen lassen. Klicken Sie af die Taste Next, m das nachfolgende Bild in der Serie anzzeigen.,vwglh7dvwh*doohu\dqjhnolfnwvlqgglh7dvwhq1h[wxqg3uhylrxv)luvwxqg/dvwxqg 3OD\6WRSJUDXXQWHUOHJWXQGN QQHQQLFKWEHWlWLJWZHUGHQ0LWGHU7DVWH*DOOHU\ ZHUGHQDOOH(LQ]HOELOGHUHLQHU%LOGVHULHHLQJHEOHQGHWXQGN QQHQVRPLWQLFKWDOV )LOPVHTXHQ]DEJHVSLHOWZHUGHQ 9RUKHULJHV%LOGLQHLQHU6HULHDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Die bei einer Bildserie afgenommen Einzelbilder können Sie als Filmseqenz ablafen lassen. Klicken Sie af die Taste Previos, m das vorherige Bild in dieser Serie anzzeigen.,vwglh7dvwh*doohu\dqjhnolfnwvlqgglh7dvwhq1h[wxqg3uhylrxv)luvwxqg/dvwxqg 3OD\6WRSJUDXXQWHUOHJWXQGN QQHQQLFKWEHWlWLJWZHUGHQ0LWGHU7DVWH*DOOHU\ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 170 von 263

171 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ ZHUGHQDOOH(LQ]HOELOGHUHLQHU%LOGVHULHHLQJHEOHQGHWXQGN QQHQVRPLWQLFKWDOV )LOPVHTXHQ]DEJHVSLHOWZHUGHQ /HW]WHV%LOGHLQHU6HULHDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Die bei einer Bildserie afgenommen Einzelbilder können Sie als Filmseqenz ablafen lassen. Klicken Sie af die Taste Last, m zm letzten Bild der Serie z springen.,vwglh7dvwh*doohu\dqjhnolfnwvlqgglh7dvwhq)luvwxqg/dvw1h[wxqg3uhylrxvxqg 3OD\6WRSJUDXXQWHUOHJWXQGN QQHQQLFKWEHWlWLJWZHUGHQ0LWGHU7DVWH*DOOHU\ ZHUGHQDOOH(LQ]HOELOGHUHLQHU%LOGVHULHHLQJHEOHQGHWXQGN QQHQVRPLWQLFKWDOV )LOPVHTXHQ]DEJHVSLHOWZHUGHQ %HOLHELJHV%LOGHLQHU6HULHDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Selection klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie jedes beliebige Bild in einer Serie aswählen nd im Ansichtsfenster Viewer anzeigen können. Unter der Skala wird die Zahl der EInzelbilder der Serie von 1 bis n angezeigt nd in einem Eingabefeld die Nmmer des aktell dargestellten Bildes. Bewegen Sie mit dem Maszeiger den Schieber der Skala. Das entsprechende Bild wird sofort angezeigt. Geben Sie die Nmmer des gewünschten Bildes in das Eingabefeld ein nd klicken Sie af Apply. )LOPVWDUWHQXQGEHHQGHQ )XQNWLRQ Die bei einer Bildserie afgenommenen Einzelbilder können Sie als Filmseqenz ablafen lassen. Mit der Taste Play/Stop starten nd beenden Sie diesen Film. Die Filmgeschwindigkeit, also die Anzahl der Einzelbilder pro Zeiteinheit, ist variabel nd kann im Dialogfenster Viewer Options eingestellt werden: Wählen Sie im Menü View die Option Viewer Options. klicken Sie af das Bildsymbol Display nd dann af das Register Movie. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Display (Seite 157) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 171 von 263

172 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ,VWGLH7DVWH*DOOHU\DQJHNOLFNWVLQGGLH7DVWHQ3OD\6WRS)LUVWXQG/DVW1H[WXQG 3UHYLRXVJUDXXQWHUOHJWXQGN QQHQQLFKWEHWlWLJWZHUGHQ0LWGHU7DVWH*DOOHU\ZHUGHQ DOOH(LQ]HOELOGHUHLQHU%LOGVHULHHLQJHEOHQGHWXQGN QQHQVRPLWQLFKWDOV)LOPVHTXHQ] DEJHVSLHOWZHUGHQ 6HULHQELOGDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Gallery klicken, werden alle Einzelbilder einer Bildserie im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Je nachdem welche weiteren Tasten Sie gleichzeitig noch aktivieren, sind folgende Darstellngsarten möglich: 7DVWHQNRPELQDWLRQ Gallery + Single + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Gallery + Single + Overlay + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 Gallery + Tiled + Channel 1 / 2 / 3 / 4/ 5 Gallery + Tiled + Overlay + Channel 1 / 2 / 3 / 4 / 5 'DUVWHOOXQJ Alle Einzelbilder einer Bildserie werden nr für einen asgewählten Detektionskanal dargestellt. Entsprechend der Anzahl von Einzelbildern einer Bildserie werden Überlagerngsbilder as allen asgewählten Detektionskanälen erzegt. Alle Einzelbilder einer Bildserie werden für alle asgewählten Detektionskanäle getrennt dargestellt. Alle Einzelbilder einer Bildserie werden getrennt für alle asgewählten Detektionskanäle nd zsätzlich zsammen in Überlagerngsbildern dargestellt. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 172 von 263

173 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 3URMHNWLRQHQ 3ULQ]LSXQG$UWHQYRQ3URMHNWLRQHQ (2a) Projektion bei invariabler Projektionsachse (2b) Projektion bei variabler Projektionsachse 'DV)XQNWLRQVSULQ]LSYRQ3URMHNWLRQHQ Für die Afnahme von biologischen Präparaten wird eine Serie von Bildern erzegt. Jedes Einzelbild wird af einer bestimmten Ebene im Präparat afgenommen. Das Ergebnis ist ein dreidimensionaler Datensatz, der das gesamte Volmen eines Präparates abbildet. Jeder optische Schnitt, das heißt jedes Einzelbild, zeigt dabei nr die Informationen as einer einzigen Ebene im Präparat. Strktren, die sich drch das gesamte Präparat erstrecken, sind also in verschiedenen Bildern partiell abgebildet. Um solche Strktren als Ganzes sichtbar z machen, werden Projektionen benötigt. Mit den Algorithmen der Projektionen ist es möglich, die über mehrere Einzelbilder verteilten relevanten Teilinformationen z selektieren nd in einem einzigen zweidimensionalen Bild sichtbar z machen. Af diese Weise können zsammenhängende Strktren rekonstriert werden. Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist also eine Bildserie. Diese kann as horizontalen xy-schnitten oder vertikalen xz-schnitten bestehen. Für das Verständnis der Fnktionsweise einer Projektion ist es sinnvoll, sich die Bildserie als ein Stapel übereinanderliegender Einzelbilder vorzstellen. Jedes Einzelbild wiederm besteht as einzelnen Abtastpnkten des Lasers. Dabei liegen die einzelnen Abtastpnkte oder Voxel (1), also die in jedem Einzelbild gemessenen Intensitätswerte, übereinander. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte, die entlang der Projektionsachse (2a, 2b) übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen von Abtastpnkten (3a, 3b) wird dann der Intensitätswert, der das Aswahlkriterim erfüllt, oder ein berechneter Wert als Repräsentant aller Intensitätswerte Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 173 von 263

174 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ innerhalb der Säle in einem zweidimensionalen Projektionsbild (4a, 4b) dargestellt. 3URMHNWLRQHQEHLLQYDULDEOHURGHUYDULDEOHU3URMHNWLRQVDFKVH Die Art der Projektionsachse nterteilt die in der Leica Confocal Software zr Verfügng stehenden Projektionsarten in zwei Haptgrppen. Es gibt Projektionen bei einer invariablen nd Projektionen bei einer variablen Projektionsachse. Beim ersten Typ handelt es sich m orthogonale Projektionen. Die Projektionsachse ist immer die optische Achse, die senkrecht zm Bildstapel verläft (z-achse bei horizontalen xy-schnitten nd y-achse bei vertikalen xz-schnitten). Im Gegensatz daz kann beim zweiten Typ die Projektionsachse frei gewählt werden. In beiden Haptgrppen stehen jeweils dieselben 3 Projektionsarten zr Verfügng (mit Asnahme der SFP Projektion). 'LH3URMHNWLRQVDUWHQ 3URMHNWLRQVDUW,QYDULDEOH3URMHNWLRQVDFKVH 9DULDEOH3URMHNWLRQVDFKVH Maximmprojektion Mittelwertprojektion Transparentprojektion SFP-Projektion Die Projektionsarten können zm einen mit der jeweiligen Taste nd zm anderen im Dialogfenster Image Tool aktiviert werden. Wird die Fnktion über die Taste asgelöst, ist das Projektionsbild nr eine temporäre Monitordarstellng. Wird die Fnktion im Dialogfenster asgelöst, wird das Projektionsbild als nee Datei im aktellen Experiment angelegt: Die Projektionen mit invariabler Projektionsachse finden sich im Dialogfenster Image Tool/ Schaltfläche 3D/ Bildsymbol Orthogonal Projection Die Projektionen mit variabler Projektionsachse finden sich im Dialogfenster Image Tool/ Schaltfläche 3D/ Bildsymbol Projections and Animations. Die SFP-Projektion findet sich im Dialogfenster Image Tool/ Schaltfläche 3D/ Bildsymbol SFP. 0D[LPXPSURMHNWLRQ Bei der Maximmprojektion geht man davon as, dass die maximalen Intensitätswerte die für die Rekonstrktion einer Strktr relevante Information sind. Deshalb wird bei der Maximmprojektion in jeder Säle as Abtastpnkten der Maximalwert gescht nd im zweidimensionalen Projektionsbild als Repräsentant für die gesamte Säle dargestellt: Ip = Max(Vn) wobei Ip das Pixel im Projektionsbild ist nd Vn die nterschten Voxel 0LWWHOZHUWSURMHNWLRQ Bei der Mittelwertprojektion soll jeder Intensitätswert mit der gleichen Gewichtng in das Projektionsbild einfliessen. Deshalb wird bei der Mittelwertprojektion in jeder Säle as Abtastpnkten das arithmetische Mittel as allen Intensitätswerten berechnet nd im zweidimensionalen Projektionsbild als Repräsentant für die gesamte Säle dargestellt: wobei IP das Pixel im Projektionsbild ist, Vn die nterschten Voxel nd N die Gesamtzahl der Voxel Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 174 von 263

175 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 7UDQVSDUHQWSURMHNWLRQ Bei der Transparentprojektion sollen ebenfalls alle Intensitätswerte in das Projektionsbild mit einfliessen. Im Gegensatz zr Mittelwertprojektion werden die Intensitätswerte as den verschiedenen Einzelbildern nterschiedlich gewichtet. Die Intensitätswerte as den nteren Einzelbildern im Bildstapel werden weniger berücksichtigt als Intensitätswerte as den oberen Bildern. Deshalb wird bei der Transparentprojektion in jeder Säle as Abtastpnkten ein gewichtetes Mittel as allen Intensitätswerten berechnet nd im zweidimensionalen Projektionsbild als Repräsentant für die gesamte Säle dargestellt: wobei In das Pixel im Projektionsbild ist, Tn = 1 - (Vn / Vmax) die Normierng, α der variable Transparentfaktor, In-1 der Wert des zvor berrechneten Voxels nd Vn das aktell nterschte Voxel Die Berechnng des Projektionsbildes beginnt mit dem ntersten nd endet mit dem obersten Einzelbild im Bildstapel. Die Gewichtng der Intensitätswerte setzt sich as zwei Faktoren zsammen. Der erste Faktor Tn ergibt sich as dem Verhältnis des jeweilig gemessenen Intensitätswertes zr maximal möglichen Intensität (Normierng). Dieser Faktor gewährleistet, dass der Grawertebereich eines Bildes von zm Beispiel 0 bis 255 bei 8 Bit nicht überschritten wird. Der zweite - vom Bentzer einstellbare - Transparentfaktor α (0 < α < 1) bestimmt die Gewichtng des zvor gemessenen Intensitätswertes. Je höher der Transparentfaktor eingestellt ist, desto stärker fliessen die Intensitätswerte as den nteren Ebenen im Bildstapel in das Projektionsbild ein. 6)33URMHNWLRQ6LPXOLHUWHU)OXRUHV]HQ]3UR]HVVPDWKHPDWLVFKH6LPXODWLRQHLQHV )OXRUHV]HQ]SUR]HVVHV Mit dieser Projektionsart wird der as der Floreszenzmikroskopie bekannte Vorgang der Absorption von Laserlicht nd Emission von Floreszenzlicht in einem Präparat mit Rechenoperationen simliert. Dieses Verfahren besteht as zwei Rechenschritten. Im ersten Schritt wird der drch die Probe dringende nd sich abschwächende Laserstrahl (1) simliert. Man geht von einer seitlich gelegenen Lichtqelle as, die af die Voxel des Bildstapels trifft. Die Abschwächng des einfallenden Strahls beim Drchqeren des Bildstapels wird drch den folgenden Asdrck berücksichtigt: wobei In+1 die nach der Absorption im n.-ten Voxel übrigbleibende Intensität des einfallenden Lichtes ist, In die Intensität des einfallenden Lichtes im n.-ten Voxel, α der Absorptionskoeffizient des Laserlichts in der Probe, Vn die Intensität im Voxel nd Vmax die maximale Voxelintensität. Der Qotient Vn / Vmax entspricht der Normierng. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 175 von 263

176 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Für jedes Voxel wird anhand der ermittelten Intensitäten In die Belechtngsstärke VIn = In x Vn asgerechnet nd in einer Tabelle temporär gespeichert (In = Intensität des einfallenden Lichtes im Voxel n, Vn = Intensität des Voxels n). Die Berechnng wird für den gesamten Bildstapel, d.h. für alle Voxel in Richtng der einfallenden Strahlng in einem Schritt drchgeführt. Es ergibt sich daras eine Tabelle von Belechtngsstärken. Im zweiten Schritt wird nter Verwendng der ermittelten Belechtngsstärken die emittierte Floreszenz (2) berechnet. Die Intensität des Pixels im Projektionsbild als Repräsentant der Voxel in Blickrichtng des Beobachters wird berechnet mittels der rekrsiven Formel: Dabei ist α der Absorptionskoeffizient des Floreszenzlichts in der Probe nd VIn die im ersten Schritt berechnete Belechtngsstärke des n.-ten Voxels. 0D[LPXPSURMHNWLRQHLQHV%LOGVWDSHOVEHLLQYDULDEOHU3URMHNWLRQVDFKVH )XQNWLRQ Mit der Taste Fix. Max. starten Sie eine Maximmprojektion. Die Projektionsachse ist bei dieser Fnktion immer die orthogonale Achse (z-achse bei horizontalen xy-schnitten nd y-achse bei vertikalen xz-schnitten). Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist ein Bildstapel, also eine Serie as horizontalen xy- Schnitten oder vertikalen xz-schnitten. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte der Einzelbilder, die entlang der Projektionsachse übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen von Abtastpnkten wird dann der maximale Intensitätswert als Repräsentant aller Intensitätswerte innerhalb der Säle im zweidimensionalen Projektionsbild dargestellt. & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Klicken Sie af die Taste Fix. Max. Es wird eine Maximmprojektion des aktellen Bildstapels erzegt nd im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Sie können jederzeit zm Ursprngsbild zrückkehren, indem Sie af die Taste Original klicken. Im Dialogfenster Viewer Options kann zsätzlich noch ein Schwellenwert (threshold) eingestellt nd der im Bild vorliegende Intensitätswertebereich skaliert werden (scaling). & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Projections (Seite 160) (LQH0D[LPXPSURMHNWLRQNDQQ]XPHLQHQPLWGHU7DVWH)L[0D[XQG]XPDQGHUHQLP $UEHLWVVFKULWW3URFHVV2UGQHU([WHQGHG)RFXVDNWLYLHUWZHUGHQ:LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWHDXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH0RQLWRUGDUVWHOOXQJ & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner Extended Focs (Seite 204) & siehe Experiment anlegen (Seite 241) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 176 von 263

177 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ %HDFKWHQ6LHGHQ8QWHUVFKLHG]ZLVFKHQHLQHU0D[LPXPSURMHNWLRQXQGHLQHP 7RSRJUDSKLHELOGGDVDXV,QWHQVLWlWVPD[LPDHU]HXJWZLUG%HLHLQHU0D[LPXPSURMHNWLRQ ZHUGHQGLH,QWHQVLWlWVPD[LPDGLUHNWHLQHP)DUEZHUW]XJHRUGQHW%HLHLQHP 7RSRJUDSKLHELOGDXV,QWHQVLWlWVPD[LPDZHUGHQGLH,QWHQVLWlWVPD[LPD]XHUVWGHUUHDOHQ ]3RVLWLRQGHVMHZHLOLJHQ$EWDVWSXQNWHV]XJHRUGQHWXQGGDQQIDUENRGLHUW & siehe Topographiebild erzegen (Seite 182) 0D[LPXPSURMHNWLRQHLQHV%LOGVWDSHOVEHLYDULDEOHU3URMHNWLRQVDFKVHRSWLRQDO )XQNWLRQ Mit der Taste 3D Max. starten Sie eine Maximmprojektion. Die Projektionsachse kann frei variiert werden. Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist ein Bildstapel, also eine Serie as horizontalen xy- Schnitten oder vertikalen xz-schnitten. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte der Einzelbilder, die entlang der Projektionsachse übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen von Abtastpnkten wird dann der maximale Intensitätswert als Repräsentant aller Intensitätswerte innerhalb der Säle im zweidimensionalen Projektionsbild dargestellt. & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Klicken Sie af die Taste 3D Max. Es wird eine Maximmprojektion des aktellen Bildstapels erzegt nd im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Sie können nn die Projektionsachse ändern, indem Sie in das Bild im Ansichtsfenster Viewer klicken nd die linke Mastaste gedrückt halten. Es werden gestrichelte Hilfslinien eingeblendet, die den symbolisch dargestellten Bildstapel mgrenzen. Drehen Sie nn den Bildstapel in die gewünschte nee Position, indem Sie bei gedrückter linker Mastaste den Maszeiger bewegen. Wenn Sie dann die linke Mastaste loslassen, wird die nee Maximmprojektion errechnet nd dargestellt. Die Projektionsachse ist dabei die Blickrichtng des Anwenders af den ne positionierten Bildstapel. Mit der Taste Zoom können Sie die Projektion vergrössern oder verkleinern. & siehe 3D Ansicht zoomen (Seite 186) Sie können jederzeit zm Ursprngsbild zrückkehren, indem Sie af die Taste Original klicken. Im Dialogfenster Viewer Options kann zsätzlich noch ein Schwellenwert (threshold) eingestellt nd der im Bild vorliegende Intensitätswertebereich skaliert werden (scaling). & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Projections (Seite 160) (LQH0D[LPXPSURMHNWLRQNDQQ]XPHLQHQPLWGHU7DVWH'0D[XQG]XPDQGHUHQLP $UEHLWVVFKULWW3URFHVV2UGQHU'9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQDNWLYLHUWZHUGHQ:LUG Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 177 von 263

178 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ GLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWHDXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH 0RQLWRUGDUVWHOOXQJ & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner 3D Visalization and Animation (Seite 187) & siehe Experiment anlegen (Seite 241) %HDFKWHQ6LHGHQ8QWHUVFKLHG]ZLVFKHQHLQHU0D[LPXPSURMHNWLRQXQGHLQHP 7RSRJUDSKLHELOGGDVDXV,QWHQVLWlWVPD[LPDHU]HXJWZLUG%HLHLQHU0D[LPXPSURMHNWLRQ ZHUGHQGLH,QWHQVLWlWVPD[LPDGLUHNWHLQHP)DUEZHUW]XJHRUGQHW%HLHLQHP 7RSRJUDSKLHELOGDXV,QWHQVLWlWVPD[LPDZHUGHQGLH,QWHQVLWlWVPD[LPD]XHUVWGHUUHDOHQ ]3RVLWLRQGHVMHZHLOLJHQ$EWDVWSXQNWHV]XJHRUGQHWXQGGDQQIDUENRGLHUW & siehe Topographiebild erzegen (Seite 182) ÃÃ 0LWWHOZHUWSURMHNWLRQHLQHV%LOGVWDSHOVEHLLQYDULDEOHU3URMHNWLRQVDFKVH )XQNWLRQ Mit der Taste Fix. Avg. starten Sie eine Mittelwertprojektion. Die Projektionsachse ist bei dieser Fnktion immer die orthogonale Achse (z-achse bei horizontalen xy-schnitten nd y-achse bei vertikalen xz-schnitten). Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist ein Bildstapel, also eine Serie as horizontalen xy- Schnitten oder vertikalen xz-schnitten. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte der Einzelbilder, die entlang der Projektionsachse übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen as Abtastpnkten wird dann der arithmetische Mittelwert as allen Intensitätswerten berechnet nd im zweidimensionalen Projektionsbild als Repräsentant für die gesamte Säle dargestellt. & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Klicken Sie af die Taste Fix. Avg. Es wird eine Mittelwertprojektion des aktellen Bildstapels erzegt nd im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Sie können jederzeit zm Ursprngsbild zrückkehren, indem Sie af die Taste Original klicken. Im Dialogfenster Viewer Options kann zsätzlich noch ein Schwellenwert (threshold) eingestellt nd der im Bild vorliegende Intensitätswertebereich skaliert werden (scaling). & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Projections (Seite 160) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 178 von 263

179 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ (LQH0LWWHOZHUWSURMHNWLRQNDQQ]XPHLQHQPLWGHU7DVWH)L[$YJXQG]XPDQGHUHQLP $UEHLWVVFKULWW3URFHVV2UGQHU([WHQGHG)RFXVDNWLYLHUWZHUGHQ:LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWHDXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH0RQLWRUGDUVWHOOXQJ & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner Extended Focs (Seite 204) & siehe Experiment anlegen (Seite 241) ÃÃ 0LWWHOZHUWSURMHNWLRQHLQHV%LOGVWDSHOVEHLYDULDEOHU3URMHNWLRQVDFKVHRSWLRQDO )XQNWLRQ Mit der Taste 3D Avg. starten Sie eine Mittelwertprojektion. Die Projektionsachse kann frei variiert werden. Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist ein Bildstapel, also eine Serie as horizontalen xy- Schnitten oder vertikalen xz-schnitten. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte der Einzelbilder, die entlang der Projektionsachse übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen as Abtastpnkten wird dann der arithmetische Mittelwert as allen Intensitätswerten berechnet nd im zweidimensionalen Projektionsbild als Repräsentant für die gesamte Säle dargestellt. & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Klicken Sie af die Taste 3D Avg. Es wird eine Mittelwertprojektion des aktellen Bildstapels erzegt nd im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Sie können nn die Projektionsachse ändern, indem Sie in das Bild im Ansichtsfenster Viewer klicken nd die linke Mastaste gedrückt halten. Es werden gestrichelte Hilfslinien eingeblendet, die den symbolisch dargestellten Bildstapel mgrenzen. Drehen Sie nn den Bildstapel in die gewünschte nee Position, indem Sie bei gedrückter linker Mastaste den Maszeiger bewegen. Wenn Sie dann die linke Mastaste loslassen, wird die nee Mittelwertprojektion errechnet nd dargestellt. Die Projektionsachse ist dabei die Blickrichtng des Anwenders af den ne positionierten Bildstapel. Mit der Taste Zoom können Sie die Projektion vergrössern oder verkleinern. & siehe 3D Ansicht zoomen (Seite 186) Sie können jederzeit zm Ursprngsbild zrückkehren, indem Sie af die Taste Original klicken. Im Dialogfenster Viewer Options kann zsätzlich noch ein Schwellenwert (threshold) eingestellt nd der im Bild vorliegende Intensitätswertebereich skaliert werden (scaling). & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Projections (Seite 160) (LQH0LWWHOZHUWSURMHNWLRQNDQQPLWGHU7DVWH'$YJXQG]XPDQGHUHQLP$UEHLWVVFKULWW Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 179 von 263

180 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 3URFHVV2UGQHU'9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQDNWLYLHUWZHUGHQ:LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWHDXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH0RQLWRUGDUVWHOOXQJ & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner 3D Visalization and Animation (Seite 187) & siehe Experiment anlegen (Seite 241) ÃÃ 7UDQVSDUHQWSURMHNWLRQHLQHV%LOGVWDSHOVEHLLQYDULDEOHU3URMHNWLRQVDFKVH )XQNWLRQ Mit der Taste Fix. Trans. starten Sie eine Transparentprojektion. Die Projektionsachse ist bei dieser Fnktion immer die orthogonale Achse (z-achse bei horizontalen xy-schnitten nd y-achse bei vertikalen xz-schnitten). Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist ein Bildstapel, also eine Serie as horizontalen xy- Schnitten oder vertikalen xz-schnitten. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte der Einzelbilder, die entlang der Projektionsachse übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen as Abtastpnkten wird dann ein gewichteter Mittelwert as allen Intensitätswerten berechnet nd im zweidimensionalen Projektionsbild als Repräsentant für die gesamte Säle dargestellt. & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Die Gewichtng der Abtastpnkte für die Errechng des Mittelwerts kann vom Bentzer drch die Einstellng eines entsprechenden Faktors (transparent factor) im Dialogfenster Viewer Options variiert werden. Zsätzlich kann noch ein Schwellenwert (threshold) eingestellt nd der im Bild vorliegende Intensitätswertebereich skaliert werden (scaling). & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Projections (Seite 160) Klicken Sie af die Taste Fix. Trans. Es wird eine Transparentprojektion des aktellen Bildstapels erzegt nd im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Sie können jederzeit zm Ursprngsbild zrückkehren, indem Sie af die Taste Original klicken. (LQH7UDQVSDUHQWSURMHNWLRQNDQQ]XPHLQHQPLWGHU7DVWH)L[7UDQVXQG]XPDQGHUHQ LP$UEHLWVVFKULWW3URFHVV2UGQHU([WHQGHG)RFXVDNWLYLHUWZHUGHQ:LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWHDXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH0RQLWRUGDUVWHOOXQJ & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner Extended Focs (Seite 204) & siehe Experiment anlegen (Seite 241) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 180 von 263

181 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 7UDQVSDUHQWSURMHNWLRQHLQHV%LOGVWDSHOVEHLYDULDEOHU3URMHNWLRQVDFKVH RSWLRQDO )XQNWLRQ Mit der Taste 3D Trans. starten Sie eine Transparentprojektion. Die Projektionsachse kann frei variiert werden. Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist ein Bildstapel, also eine Serie as horizontalen xy- Schnitten oder vertikalen xz-schnitten. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte der Einzelbilder, die entlang der Projektionsachse übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen as Abtastpnkten wird dann ein gewichteter Mittelwert as allen Intensitätswerten berechnet nd im zweidimensionalen Projektionsbild als Repräsentant für die gesamte Säle dargestellt. & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Die Gewichtng der Abtastpnkte für die Errechng des Mittelwerts kann vom Bentzer drch die Einstellng eines entsprechenden Faktors (transparent factor) im Dialogfenster Viewer Options variiert werden. Zsätzlich kann noch ein Schwellenwert (threshold) eingestellt nd der im Bild vorliegende Intensitätswertebereich skaliert werden (scaling). & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Projections (Seite 160) Klicken Sie af die Taste 3D Trans. Es wird eine Transparentprojektion des aktellen Bildstapels erzegt nd im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Sie können nn die Projektionsachse ändern, indem Sie in das Bild im Ansichtsfenster Viewer klicken nd die linke Mastaste gedrückt halten. Es werden gestrichelte Hilfslinien eingeblendet, die den symbolisch dargestellten Bildstapel mgrenzen. Drehen Sie nn den Bildstapel in die gewünschte nee Position, indem Sie bei gedrückter linker Mastaste den Maszeiger bewegen. Wenn Sie dann die linke Mastaste loslassen, wird die nee Transparentprojektion errechnet nd dargestellt. Die Projektionsachse ist dabei die Blickrichtng des Anwenders af den ne positionierten Bildstapel. Mit der Taste Zoom können Sie die Projektion vergrössern oder verkleinern. & siehe 3D Ansicht zoomen (Seite 186) Sie können jederzeit zm Ursprngsbild zrückkehren, indem Sie af die Taste Original klicken. (LQH7UDQVSDUHQWSURMHNWLRQNDQQ]XPHLQHQPLWGHU7DVWH'7UDQVXQG]XPDQGHUHQ LP$UEHLWVVFKULWW3URFHVV2UGQHU'9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQDNWLYLHUWZHUGHQ :LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWHDXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH 0RQLWRUGDUVWHOOXQJ & siehe Arbeitsschritt Process / Schaltfläche 3D Visalization and Animation (Seite 187) & siehe Experiment anlegen (Seite 241) ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 181 von 263

182 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 6)33URMHNWLRQHLQHV%LOGVWDSHOVHU]HXJHQRSWLRQDO )XQNWLRQ Mit der Taste SFP starten Sie eine SFP-Projektion, die mathematische Simlation eines Floreszenzprozesses. Grndlage für die Anwendng einer Projektion ist ein Bildstapel, also eine Serie as horizontalen xy-schnitten oder vertikalen xz-schnitten. Bei der Erzegng einer Projektion werden die Abtastpnkte der Einzelbilder, die entlang der Projektionsachse übereinanderliegen, drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. Im ersten Schritt wird der drch die Probe dringende nd sich abschwächende Laserstrahl simliert. Im zweiten Schritt wird nter Verwendng der ermittelten Belechtngsstärken die simlierte Floreszenz für jedes Voxel berechnet. & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Klicken Sie af die Taste SFP. Es wird eine SFP-Projektion des aktellen Bildstapels erzegt nd im Ansichtsfenster Viewer dargestellt. Sie können nn die Projektionsachse ändern, indem Sie in das Bild im Ansichtsfenster Viewer klicken nd die linke Mastaste gedrückt halten. Es werden gestrichelte Hilfslinien eingeblendet, die den symbolisch dargestellten Bildstapel mgrenzen. Drehen Sie nn den Bildstapel in die gewünschte nee Position, indem Sie bei gedrückter linker Mastaste den Maszeiger bewegen. Wenn Sie dann die linke Mastaste loslassen, wird die nee SFP-Projektion errechnet nd dargestellt. Die Projektionsachse ist dabei die Blickrichtng des Anwenders af den ne positionierten Bildstapel. Sie können jederzeit zm Ursprngsbild zrückkehren, indem Sie af die Taste Original klicken. 'LH6)33URMHNWLRQNDQQPLWGHU7DVWH6)3XQGLP$UEHLWVVFKULWW3URFHVV2UGQHU' 9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQDNWLYLHUWZHUGHQ:LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWH DXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH0RQLWRUGDUVWHOOXQJ & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner 3D Visalization and Animation (Seite 187) & siehe Experiment anlegen (Seite 241) ÃÃ 7RSRJUDSKLHELOGHU]HXJHQ )XQNWLRQ Mit der Topography Fnktion können Sie bestimmte Intensitätsdaten as einem Bildstapel, also einer Serie von xy-schnitten oder xz-schnitten, aswählen nd in ein zweidimensionales Topographiebild übertragen. Dabei werden die entlang der z-achse übereinanderliegenden Abtastpnkte (Voxel) drch alle optischen Schnitte hindrch nterscht. As jeder dieser Sälen von Abtastpnkten wird nr der Intensitätswert, welcher das Aswahlkriterim erfüllt, als Repräsentant aller Werte innerhalb der Säle im Topographiebild dargestellt. Sie können entweder nach dem Intensitätsmaximm (maximm intensity) oder nach dem Flächenschwerpnkt (center of mass) der gemessenen Intensitäten selektieren. Sollen Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 182 von 263

183 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Intensitätsmaxima im Topographiebild dargestellt werden, wird nr der Abtastpnkt asgewählt, bei dem die maximale Intensität gemessen wrde. Bei der Ermittlng des Flächenschwerpnktes wird as allen übereinanderliegenden Abtastpnkten ein Mittelwert errechnet (der Schwerpnkt der Fläche, die von der Krve der gemessenen Intensitätswerte begrenzt wird). Das Intensitätsmaximm bzw. der Flächenschwerpnkt wird dann der realen z-position des entsprechenden Abtastpnktes zgeordnet nd anschließend farbkodiert. Afgrnd dieser Zordnng bildet ein Topographiebild GLHUHDOH2EHUIOlFKHQVWUXNWXU des Präparates ab. In der Standardeinstellng erscheinen höhere Strktren hell, tiefere Strktren dnkel. Die Einstellng des Aswahlkriterims für das Topographiebild können Sie im Dialogfenster Viewer Options vornehmen: Wählen Sie im Menü View die Option Viewer Options. Klicken Sie af das Bildsymbol Srface Calclation, m das Register Topography einzblenden. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Srface Calclation (Seite 164) In einem zweiten Schritt können Sie das Topographiebild mit der Fnktion 3D Ansicht in einer dreidimensionalen Graphik darstellen. & siehe 3D Ansicht erzegen (Seite 184) 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Die Darstellng der Bilddaten in einem Topographiebild ist vor allem bei materialwissenschaftlichen Unterschngen afschlssreich. Für die Anwendng von Qantifizierngsfnktionen ist die Topographiefnktion nerlässlich. 2ULJLQDOELOGDQ]HLJHQ )XQNWLRQ Klicken Sie af die Taste Original, m ein Projektionsbild oder ein Topographiebild rückgängig z machen. Im Ansichtsfenster Viewer werden wieder die afgenommenen Rohdaten des Bildes angezeigt. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 183 von 263

184 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ (U]HXJXQJYRQ'$QVLFKWHQ '$QVLFKWHU]HXJHQ )XQNWLRQ Mit der Taste 3D View können Sie einen zweidimensionalen Datensatz dreidimensional darstellen. Bei einer Bildserie wird immer der Datensatz der Serie verwendet, der aktell im Ansichtsfenster Viewer eingeblendet ist. Sie können entweder einen einzelnen xy-schnitt oder xz-schnitt as Rohdaten oder ein Ergebnisbild, wie zm Beispiel ein Topographiebild oder Projektionsbild, in der 3D Ansicht darstellen. Je nachdem, welche Grösse im Asgangsbild dargestellt oder berechnet wrde, werden bei der Erzegng der 3D Ansicht entweder Intensitätswerte oder Höhenwerte af der z- Achse der 3D Ansicht abgebildet. 'LHUlXPOLFKH'DUVWHOOXQJYRQ,QWHQVLWlWLQHLQHU'$QVLFKWI KUWOHLFKW]XGHU $QQDKPHGDVVGLH7RSRJUDSKLHGHV3UlSDUDWHVGDUJHVWHOOWZLUG%HDFKWHQ6LHMHGRFK GDVV6LHGLHUHDOH2EHUIOlFKHQVWUXNWXUHLQHV3UlSDUDWHVQXUGDUVWHOOHQN QQHQZHQQ 6LH]XYRUHLQ7RSRJUDSKLHELOGHU]HXJWKDEHQ & siehe Topographiebild erzegen (Seite 182) Die 3D Ansicht kann in drei Darstellngsarten, nämlich als Flächenbild (Srface), als Drahtgitterbild (Wireframe) oder als Isolinienbild (Isolines) erzegt werden. Stellen Sie eine dieser Darstellngsarten im Dialogfenster Viewer Options ein: Wählen Sie im Menü View die Option Viewer Options. Klicken Sie af das Bildsymbol Srface View nd dann af das Register Visalization. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Srface View (Seite 162) ) UMHGHQ'HWHNWLRQVNDQDOZLUGHLQHJHWUHQQWH'$QVLFKWHUVWHOOW(VLVWGDKHUQLFKW P JOLFKDXVHLQHPhEHUODJHUXQJVELOG7DVWH2YHUOD\HLQHHLQ]LJH'$QVLFKW]X HU]HXJHQ '$QVLFKWGUHKHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Rotate können Sie eine 3D Ansicht in alle drei Ramrichtngen drehen. Beachten Sie, dass die 3D Ansicht m einen Fixpnkt gedreht wird, der sich in der Mitte des Bildes befindet. Halten Sie den Maszeiger über eine beliebige Stelle in der 3D Ansicht. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 184 von 263

185 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die linke Mastaste nd halten Sie diese gedrückt. Bewegen Sie den Maszeiger in die Richtng, in die Sie die 3D Ansicht drehen wollen. :lkuhqg6lhglh'$qvlfkwguhkhqzlugglh$xio VXQJGHV%LOGHVOHLFKWKHUDEJHVHW]W XPGDV$UEHLWHQPLWGLHVHU)XQNWLRQ]XEHVFKOHXQLJHQ1DFK/RVODVVHQGHUOLQNHQ 0DXVWDVWHZLUGGDV%LOGLQGHU]XYRUHLQJHVWHOOWHQ$XIO VXQJQHXDQJH]HLJW Als Alternative z dieser manellen Methode eine 3D Ansicht z drehen, gibt es im Dialogfenster Viewer Options ach die Möglichkeit, Drehwinkel für die drei Ramachsen einzgeben: Wählen Sie im Menü View die Option Viewer Options. Klicken Sie af das Bildsymbol 3D nd dann af das Register Navigation. Im Feld Rotation können Sie Drehwinkel für alle drei Achsen eingeben. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol 3D (Seite 156) '$QVLFKWYHUVFKLHEHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Move können Sie eine 3D Ansicht verschieben: Halten Sie den Maszeiger über eine beliebige Stelle in der 3D Ansicht. Klicken Sie af die linke Mastaste nd halten Sie diese gedrückt. Bewegen Sie den Maszeiger in die Richtng, in die Sie die 3D Ansicht verschieben wollen. :lkuhqg6lhglh'$qvlfkwyhuvfklhehqzlugglh$xio VXQJGHV%LOGHVOHLFKW KHUDEJHVHW]WXPGDV$UEHLWHQPLWGLHVHU)XQNWLRQ]XEHVFKOHXQLJHQ1DFK/RVODVVHQ GHUOLQNHQ0DXVWDVWHZLUGGDV%LOGLQGHU]XYRUHLQJHVWHOOWHQ$XIO VXQJQHXDQJH]HLJW Als Alternative z dieser manellen Methode eine 3D Ansicht z verschieben, gibt es im Dialogfenster Viewer Options ach die Möglichkeit, Koordinatenwerte für die Positionierng des Bildes einzgeben: Wählen Sie im Menü View die Option Viewer Options. Klicken Sie af das Bildsymbol 3D nd dann af das Register Navigation. Im Feld Translation können Sie die Koordinatenwerte für die x-achse nd z-achse verändern. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol 3D (Seite 156) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 185 von 263

186 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ '$QVLFKW]RRPHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Zoom können Sie eine 3D Ansicht stfenlos proportional vergrößern oder verkleinern. Hierbei handelt es sich lediglich m eine Skalierng des erzegten Bildes, eine verbesserte Aflösng können Sie mit dieser Zoomfnktion nicht erzielen. Um die 3D Ansicht z vergrössern Um die 3D Ansicht z verkleinern Klicken Sie im Bildfenster des Ansichtsfensters Viewer af eine beliebige Stelle nd ziehen Sie mit gedrückter linker Mastaste den Maspfeil ]XP XQWHUHQ5DQG. Klicken Sie im Bildfenster des Ansichtsfensters Viewer af eine beliebige Stelle nd ziehen Sie mit gedrückter linker Mastaste den Maspfeil ]XP REHUHQ5DQG. :lkuhqg6lhglh'$qvlfkw]rrphqzlugglh$xio VXQJGHV%LOGHVOHLFKW KHUDEJHVHW]WXPGDV$UEHLWHQPLWGLHVHU)XQNWLRQ]XEHVFKOHXQLJHQ1DFK/RVODVVHQ GHUOLQNHQ0DXVWDVWHZLUGGDV%LOGLQGHU]XYRUHLQJHVWHOOWHQ$XIO VXQJQHXDQJH]HLJW Als Alternative z dieser manellen Methode eine 3D Ansicht z zoomen, gibt es im Dialogfenster Viewer Options ach die Möglichkeit, den Zoom über die Eingabe von Zahlenwerten z verändern: Wählen Sie im Menü View die Option Viewer Options. Klicken Sie dann af das Bildsymbol 3D. Im Register Navigation können Sie den Zoom variieren, indem Sie im Feld Translation den y- Wert ändern. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol 3D (Seite 156) 'LH/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUHYHUI JW EHUGUHL]XXQWHUVFKHLGHQGH=RRP)XQNWLRQHQ GHQ'=RRPGHQHOHNWURQLVFKHQ=RRPXQGGHQJUDSKLVFKHQ=RRP & siehe Elektronischer Zoom (Seite 125) & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Display (Seite 157) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 186 von 263

187 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'DWHQYHUDUEHLWXQJ '3URMHNWLRQHQXQG$QLPDWLRQHQYRQ%LOGVHULHQRSWLRQDO,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: 3D Visalization and Animation\ Projections 6 Navigation: 3D Visalization and Animation\ Projections with Animation 6 Navigation: 3D Visalization and Animation\ Stereo 6 Navigation: 3D Visalization and Animation\ Stereo with Animation $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 187 von 263

188 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. 1DYLJDWLRQ'9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQ?3URMHFWLRQV 3URMHNWLRQVELOGHUHQWODQJHLQHUIUHLHLQVWHOOEDUHQ3URMHNWLRQVDFKVHHU]HXJHQ & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie eine der vier Projektionsarten as: Mittelwertprojektion (Average Projection), Maximmprojektion (Maximm Projection), Transparentprojektion (Transparent Projection), SFP-Projektion (SFP Projection, SFP Shadow Projection). 5HJLVWHU2SWLRQV Klicken Sie af Rescale im Feld Options, m bei der Erzegng des Projektionsbildes die Intensitätswerte des Bildes af die maximal möglichen Intensitätswerte z normieren. Dies gewährleistet, dass die errechneten Grawerte des Projektionsbildes innerhalb des Wertebereichs von zm Beispiel 0 bis 255 bei 8 Bit bleiben. Dnkle Bilder können so afgehellt werden. Wenn Sie af Invert im Register Options klicken, wird die Projektionsachse gespiegelt. Die Berechnng des Projektionsbildes erfolgt also in entgegengesetzer Richtng. Dies ist eine Fnktion, die vor allem bei inversen Mikroskopen sinnvoll ist, m die Berechnng des Projektionsbildes dem inversen Strahlengang des Laserlichts anzgleichen. Bewegen Sie den Schieber im Feld Threshold, m einen Schwellenwert z definieren. Die Intensitätswerte nterhalb dieses Wertes werden für die Erzegng des Projektionsbildes nicht berücksichtigt. 5HJLVWHU5RWDWLRQ Im Feld Viewing Direction stellen Sie die gewünschte Projektionsachse ein, indem Sie einen Wert für Z, Y nd X eingeben. Mit diesen drei Werten drehen Sie den Bildstapel in eine bestimmte Position nd definieren so den Winkel, nter dem die Projektion des Bildstapels erfolgt. Die Projektionsachse ist dabei die Blickrichtng des Betrachters af den gedrehten Bildstapel. Das ntenstehende Schema veranschalicht die Rotationsrichtng der jeweiligen Bildebene, bei positiven Werten für Z, Y nd X. Bei negativen Werten ist die Rotationsrichtng gena mgekehrt. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 188 von 263

189 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Im Feld Depth Factor geben Sie einen Wert ein, m die z-achse der Projektionsbilder z skalieren. 5HJLVWHU)DFWRUQXUEHL7UDQVSDUHQWSURMHNWLRQ & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Das Register Factor wird nr bei asgewählter Transparentprojektion angezeigt. Mit dem Schieber variieren Sie den Transparentfaktor α. Je höher er eingestellt ist, desto stärker fliessen die Intensitätswerte as den nteren Ebenen im Bildstapel in das Projektionsbild ein. Klicken Sie af die Kachel Transparency Gallery, m eine Galerie von Vorschabildern des asgewählten Bilddatensatzes z sehen. Jedes der Vorschabilder wrde mit einem anderen Transparentfaktor berechnet. Klicken Sie af eine Kachel, m den Dialog mit den entsprechenden Einstellngen anzzeigen. 5HJLVWHU/LJKWQXUEHL6)33URMHNWLRQ & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Das Register Light wird nr bei asgewählter SFP Projektion angezeigt. Definieren Sie im Feld Light Direction den Projektionswinkel für den ersten Rechenschritt der SFP-Projektion. Dieser Winkel symbolisiert den Einfallswinkel des Laserstrahls af das Präparat. Geben Sie jeweils eine Koordinate für x nd y ein. Bewegen Sie den Schieber im Feld Absorption, m den Absorptionskoeffizienten α z variieren. Je höher er eingestellt ist, desto kleiner werden die im Projektionsbild berechneten Werte. Ist der Koeffizient niedrig eingestellt, erreichen viele Pixel im Projektionsbild den Maximalwert, so dass die Strktren immer schwieriger z nterscheiden sind. Wenn Sie im Register Options im Feld Options af Calc. Shadow klicken, wird ein Schlagschatten für das SFP-Projektionsbild berechnet nd angezeigt. Klicken Sie af die Kachel SFP Light Gallery, m eine Galerie von Vorschabildern des asgewählten Bilddatensatzes z sehen. Jedes der Vorschabilder wrde mit einem anderen Projektionswinkel berechnet. Klicken Sie af eine Kachel, m den Dialog mit den entsprechenden Einstellngen anzzeigen. Klicken Sie af die Kachel SFP Absorption Gallery, m eine Galerie von Vorschabildern des asgewählten Bilddatensatzes z sehen. Jedes der Vorschabilder wrde mit einem anderen Absorptionskoeffizienten berechnet. Klicken Sie af eine Kachel, m den Dialog mit den entsprechenden Einstellngen anzzeigen. 1DYLJDWLRQ'9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQ?3URMHFWLRQVDQG$QLPDWLRQ 3URMHNWLRQVELOGHUDOVGUHLGLPHQVLRQDOH5RWDWLRQVDQLPDWLRQDEODXIHQODVVHQ & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) 5HJLVWHU$QLPDWLRQ Um Einstellngen für die Rotationsanimation vorznehmen, klicken Sie das Kontrollkästchen Animation an. Die entsprechenden Felder werden aktiv. Wählen Sie im Feld Rotation den Animationstyp as: ganze Drehng oder 360 (Fll trn), halbe Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 189 von 263

190 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Drehng oder 180 (half trn), Vierteldrehng oder 90 (qarter trn) oder einen anderen beliebigen Winkel. Geben Sie im Feld Frames die Anzahl der Projektionsbilder ein, die für die Animation erzegt werden sollen. Die Anzahl der Projektionsbilder nd der Animationstyp bestimmen, in welchen Abständen die Projektionsbilder erzegt werden. Bei einer halben Drehng (Winkel von 180 ) nd einer Bildanzahl von beispielsweise 10 wird in Schritten von jeweils 20 (nicht 18 ) ein Bild erzegt, da es bei 10 Afnahmen nr 9 Schritte gibt. (LQHDQGHUH%HUHFKQXQJOLHJWEHLGHUJDQ]HQ'UHKXQJ:LQNHOYRQƒYRU8P]XYHUPHLGHQ GDVVGDVHUVWHXQGGDVOHW]WH3URMHNWLRQVELOGXQWHUGHPVHOEHQ:LQNHODXIJHQRPPHQZHUGHQ ƒ ƒuhfkqhwglh)xqnwlrqplwhlqhu$xiqdkphphkurkqhmhgrfkgdvhqwvsuhfkhqgh 3URMHNWLRQVELOG]XHU]HXJHQ%HLHLQHU%LOGDQ]DKOYRQ]XP%HLVSLHOLVWGHVKDOEGHU$EVWDQG ]ZLVFKHQGHQ3URMHNWLRQVELOGHUQƒQLFKWƒGDPLW$XIQDKPHQDOVR6FKULWWHQ JHUHFKQHWZLUG(U]HXJWZHUGHQMHGRFKQXU3URMHNWLRQVELOGHU Variieren Sie im Feld Rotation Axis die Neigng der Rotationsachse. Um die Rotationsanimation z starten, klicken Sie af die Taste Movie. & siehe Film starten nd beenden (Seite 171) 'LHGUHL3URMHNWLRQVDUWHQN QQHQDXFKGLUHNW EHUGLHHQWVSUHFKHQGHQ7DVWHQ'3URM '0D['$YJ'7UDQVDNWLYLHUWZHUGHQ:LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWH DXVJHO VWLVWGDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH0RQLWRUGDUVWHOOXQJ'LHVHN QQHQ 6LHPLWGHU7DVWH2ULJLQDOZLHGHUU FNJlQJLJPDFKHQ & siehe Maximmprojektion eines Bildstapels bei variabler Projektionsachse (Seite 177) & siehe Mittelwertprojektion eines Bildstapels bei variabler Projektionsachse (Seite 179) & siehe Transparentprojektion eines Bildstapels bei variabler Projektionsachse (Seite 181) 1DYLJDWLRQ'9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQ?6WHUHR 1DYLJDWLRQ'9LVXDOL]DWLRQDQG$QLPDWLRQ?6WHUHRZLWK$QLPDWLRQ 5RWJU QH6WHUHRELOGHU$QDJO\SKHQELOGHUHU]HXJHQ )HOG6WHUHR9LHZ2SWLRQV Bestimmen Sie im Listenfeld Eye Angle den Winkel, nter dem die beiden Stereobilder afgenommen werden. Wenn Sie zm Beispiel den Wert 30 eingeben, wird im Winkel von jeweils 15 rechts nd links von der im Register Rotation eingestellten Projektionsachse ein Stereobild afgenommen. Stereobilder können nr as einem Detektionskanal erzegt werden. Haben Sie ein Bildserie, die in mehreren Detektionskanälen afgenommen wrde, wählen Sie im Listenfeld Detection Channel den gewünschten Bilddatensatz as. Um die beiden Stereobilder in einem Bild im Ansichtsfenster Viewer darzstellen, müssen die Tasten Channel 1, Channel 2, Single nd Overlay gedrückt sein. & siehe Detektionskanal 1 anzeigen (Seite 165) & siehe Detektionskanal 2 anzeigen (Seite (UURU%RRNPDUNQRWGHILQHG) & siehe Einzelbild anzeigen (Seite 168) & siehe Überlagerngsbild anzeigen (Seite 169) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 190 von 263

191 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Anaglyphenbilder erzegen einen rämlichen Tiefeneindrck, wenn man sie mit einer entsprechenden 3D Brille (rot-grünen Stereobrille) betrachtet. Die rämliche Wirkng des Anaglyphenbildes ist möglich, weil der Mensch mit zwei Agen sieht. Drch den Agenabstand von ca. 6,5 cm werden dem Gehirn zwei Bilder as nterschiedlichen Perspektiven geliefert. Unterschiedlich weit entfernte Objekte werden nter verschiedenen Winkeln wahrgenommen. Diese Winkeldifferenz ist für das Gehirn des Menschen ein Maß für die Entfernng. Der Unterschied der von den beiden Agen erzegten ähnlichen Bildern wird vom Gehirn z einem Bild mit rämlichem Tiefeneindrck verarbeitet. Diese Bildnterschiede lassen sich ach simlieren, indem man vor jedes Age ein leicht nterschiedliches Bild hält. Bei Anaglyphenbildern befindet sich die ganze stereoskopische Bildinformation af einem einzigen Bild. Die Informationen des linken nd rechten Bildes sind drch Farben kodiert. Daher benötigt man für das Betrachten der Bilder eine Brille mit einem nterschiedlichen Farbfilter für jedes Age, der die Bildinformationen für jedes Age wieder separiert. Der rote Filter lässt nr rotes Licht ngehindert passieren, wohingegen grünes Licht vollständig von ihm absorbiert wird. Umgekehrt absorbiert der grüne Filter das rote Licht. Jedes Age erkennt je ein Bild, die beide im Gehirn z einem rämlichen Gesamtbild verschmelzen. $ULWKPHWLVFKHXQG%RROHVFKH2SHUDWLRQHQ,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: Arithmetic and Boolean Logic\ Image and Image 6 Navigation: Arithmetic and Boolean Logic\ Image and Constant $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 191 von 263

192 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. Navigation: Arithmetic and Boolean Logic\ Image and Image $ULWKPHWLVFKHXQGORJLVFKH2SHUDWLRQHQPLW]ZHL%LOGGDWHQVlW]HQ 9RUDXVVHW]XQJI UGLH'XUFKI KUXQJDULWKPHWLVFKHU2SHUDWLRQHQVLQGJOHLFKH 'LPHQVLRQHQRGHUHLQHQ%H]LHKXQJGHUEHLGHQ'DWHQVlW]H*OHLFKH'LPHQVLRQHQ EHGHXWHWGDVV]ZHL%LOGHUGDVVHOEH)RUPDWLQ[XQG\KDEHQP VVHQ]ZHL%LOGVWDSHO DXVVHUGHPQRFKGLHVHOEH$Q]DKOYRQ(LQ]HOELOGHUQ]'LHQ%H]LHKXQJLVWGDQQ JHJHEHQZHQQ]XP%HLVSLHO(LQ]HOELOGPLWMHGHPQWHQ(LQ]HOELOGHLQHV%LOGVWDSHOV YHUUHFKQHWZLUG Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 192 von 263

193 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ.DFKHO%RROHDQ/RJLF & siehe Boolesche Verknüpfngen (Seite 248) Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den ersten Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie im Feld Second Sorce Image, den zweiten Bilddatensatz für die Rechenoperation as. Wählen Sie den Operator AND, m die binären Darstellngen der Pixel der beiden asgewählten Bilder mit dem logischen Operator AND z verknüpfen. Das heisst, das Pixel im Ergebnisbild erhält dann den Wert 1, wenn in den beiden Pixeln der Wert 1 vorliegt, ansonsten wird die 0 eingetragen. Mit diesem Booleschen Operator erzielt man sinnvolle Ergebnisse, wenn man ein Bild mit einer binären Maske verknüpft. Wo die Pixel des Bildes af Pixel der Maske mit dem Wert 1 treffen, wird das Pixel im Ergebnisbild angezeigt. Die von der Maske definierten Bereiche werden also as dem Bild herasgestanzt. Wählen Sie den Operator OR, m die binären Darstellngen der Pixel der beiden asgewählten Bilder mit dem logischen Operator OR z verknüpfen. Das heisst, das Pixel im Ergebnisbild erhält dann den Wert 1, wenn in mindestens einem der beiden Pixel der Wert 1 vorliegt, ansonsten wird die 0 eingetragen. Mit diesem Booleschen Operator erzielt man sinnvolle Ergebnisse: 1. Wenn man zwei binäre Masken verknüpft. Das Ergebnisbild ist eine Kombination beider Masken. 2. Wenn man ein Bild mit einer binären Maske verknüpft. Das Ergebnisbild ist ein Bild, in das die Maske eingeblendet wird. 3. Wenn man zwei Bilder miteinander verknüpft. Im Gegensatz zm Überlagerngsbild werden hier reine Intensitätswerte überlagert. Eine RGB-Farbaddition findet hier NICHT statt. & siehe Überlagerngsbild anzeigen (Seite 169) Wählen Sie den Operator XOR, m die binären Darstellngen der Pixel der beiden asgewählten Bilder mit dem logischen Operator XOR z verknüpfen. Das heisst, das Pixel im Ergebnisbild erhält dann den Wert 1, wenn in den beiden Pixeln nterschiedliche Werte vorliegen, ansonsten wird die 0 eingetragen. Mit diesem Booleschen Operator erzielt man sinnvolle Ergebnisse, wenn man zwei binäre Masken von Bildern erstellt nd miteinander verknüpft. Wo die Pixel in den beiden Bildern nterschiedlich sind, wird das Pixel im Ergebnisbild angezeigt..dfkho$ulwkphwlfzlwk:ruog&rruglqdwhv.dfkho$ulwkphwlfzlwk3l[ho9doxhv Wenn Sie Arithmetic with World Coordinates wählen, werden Weltkoordinaten, also zm Beispiel die z-position, der Zeitpnkt oder die Wellenlänge für die arithmetischen Operationen verwendet. Haben Sie Arithmetic with Pixel Vales asgewählt, werden die af das Intervall 0 bis 255 bei 8 Bit bzw. 0 bis 4095 bei 12 Bit normierten Grawerte verwendet. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den ersten Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie im Feld Second Sorce Image, den zweiten Bilddatensatz für die Rechenoperation as. Wählen Sie Addition, m die Intensitätswerte der beiden asgewählten Bilder nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (First Sorce Image) + Pixel (Second Sorce Image) z addieren. Wählen Sie Sbtraction, m die Intensitätswerte der beiden asgewählten Bilder nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (First Sorce Image) Pixel (Second Sorce Image) z sbtrahieren. Wählen Sie Mltiplication, m die Intensitätswerte der beiden asgewählten Bilder nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (First Sorce Image) x Pixel (Second Sorce Image) z mltiplizieren. Wählen Sie Division, m die Intensitätswerte der beiden asgewählten Bilder nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (First Sorce Image) / Pixel (Second Sorce Image) z dividieren. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 193 von 263

194 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Wählen Sie Min, m für jedes Pixel jeweils den Minimalwert der beiden asgewählten Bilder nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = MIN (Pixel (First Sorce Image); Pixel(Second Sorce Image)) im Ergebnisbild z verwenden. Wählen Sie Max, m für jedes Pixel jeweils den Maximalwert der beiden asgewählten Bilder nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = MAX (Pixel (First Sorce Image); Pixel(Second Sorce Image)) im Ergebnisbild z verwenden. Wählen Sie Average, m für jedes Pixel jeweils den Mittelwert der beiden asgewählten Bilder nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = 1/2 x (Pixel (First Sorce Image + Pixel Second Sorce Image) im Ergebnisbild z verwenden. Wenn Sie 12 Bit Otpt im Feld Otpt Option wählen, wird im Ergebnisbild jedes Pixel mit 12 Bit kodiert, d.h. die Speicherng der Ergebniswerte erfolgt in einem Wertebereich von [ ]. Klicken Sie das Aswahlkästchen Absolte Vale an, wenn die Beträge der Ergebnisdaten verwendet werden sollen. As negativen Ergebnissen werden so positive. 1XUEHL$ULWKPHWLFZLWK3L[HO9DOXHV Klicken Sie das Aswahlkästchen Ct at Maximm an, m Werte die nach der Berechnng aßerhalb des Wertebereichs liegen abzschneiden. Werte kleiner als 0 werden af 0 gesetzt. Alle Werte größer als 255 bei 8-Bit Bildern bzw bei 12 Bit-Bildern werden af den Wert 255 bzw gesetzt. Klicken Sie das Aswahlkästchen Rescale an, m die Intensitätswerte des Bildes af die maximal möglichen Intensitätswerte z normieren. Es werden die Extremwerte bestimmt. Der Minimalwert wird der 0 zgeordnet. Der Maximalwert wird im Falle von 8-Bit Bildern dem Wert 255, im Falle von 12 Bit-Bildern dem Wert 4095 zgeordnet. Dies gewährleistet, dass die errechneten Pixelwerte des Ergebnisbildes innerhalb des jeweiligen Wertebereichs bleiben. 1DYLJDWLRQ$ULWKPHWLFDQG%RROHDQ/RJLF?,PDJHDQG&RQVWDQW $ULWKPHWLVFKHXQGORJLVFKH2SHUDWLRQHQPLWHLQHP%LOGGDWHQVDW]XQGHLQHU.RQVWDQWHQ 9RUDXVVHW]XQJI UGLH'XUFKI KUXQJDULWKPHWLVFKHU2SHUDWLRQHQVLQGJOHLFKH 'LPHQVLRQHQRGHUHLQHQ%H]LHKXQJGHUEHLGHQ'DWHQVlW]H*OHLFKH'LPHQVLRQHQ EHGHXWHWGDVV]ZHL%LOGHUGDVVHOEH)RUPDWLQ[XQG\KDEHQP VVHQ]ZHL%LOGVWDSHO DXVVHUGHPQRFKGLHVHOEH$Q]DKOYRQ(LQ]HOELOGHUQ]'LHQ%H]LHKXQJLVWGDQQ JHJHEHQZHQQ]XP%HLVSLHO(LQ]HOELOGPLWMHGHPQWHQ(LQ]HOELOGHLQHV%LOGVWDSHOV YHUUHFKQHWZLUG.DFKHO%RROHDQ/RJLF & siehe Boolesche Verknüpfngen (Seite 248) Geben Sie im Feld Constant einen Wert für die Konstante ein. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie den Operator AND, m die binären Darstellngen der Pixel der Konstante nd des Bildes mit dem logischen Operator AND z verknüpfen. Das heisst, das Pixel im Ergebnisbild erhält dann den Wert 1, wenn in den beiden Pixeln der Wert 1 vorliegt, ansonsten wird die 0 eingetragen. Wählen Sie den Operator OR, m die binären Darstellngen der Pixel der Konstante nd des Bildes mit dem logischen Operator OR z verknüpfen. Das heisst, das Pixel im Ergebnisbild erhält dann den Wert 1, wenn in mindestens einem der beiden Pixel der Wert 1 vorliegt, ansonsten wird die 0 eingetragen. Wählen Sie den Operator XOR, m die binären Darstellngen der Pixel der Konstante nd des Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 194 von 263

195 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Bildes mit dem logischen Operator XOR z verknüpfen. Das heisst, das Pixel im Ergebnisbild erhält dann den Wert 1, wenn in den beiden Pixeln nterschiedliche Werte vorliegen, ansonsten wird die 0 eingetragen..dfkho$ulwkphwlfzlwk:ruog&rruglqdwhv.dfkho$ulwkphwlfzlwk3l[ho9doxhv Wenn Sie Arithmetic with World Coordinates wählen, werden Weltkoordinaten, also zm Beispiel die z-position, der Zeitpnkt oder die Wellenlänge für die arithmetischen Operationen verwendet. Haben Sie Arithmetic with Pixel Vales asgewählt, werden die af das Intervall 0 bis 255 bei 8 Bit bzw. 0 bis 4095 bei 12 Bit normierten Grawerte verwendet. Geben Sie im Feld Constant einen Wert für die Konstante ein. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Geben Sie im Feld Constant einen Wert für die Konstante ein. Der Bilddatensatz ist atomatisch der aktive Bilddatensatz im Ansichtsfenster Viewer. Wählen Sie Addition, m die Konstante pixelweise z den Intensitätswerten des asgewählten Bildes nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (Sorce Image) + Konstante z addieren. Wählen Sie Sbtraction, m die Konstante pixelweise von den Intensitätswerten des asgewählten Bildes nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (Sorce Image) Konstante z sbtrahieren. Wählen Sie Mltiplication, m die Konstante pixelweise mit den Intensitätswerten des asgewählten Bildes nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (Sorce Image) x Konstante z mltiplizieren. Wählen Sie Division, m die Intensitätswerte des asgewählten Bildes drch die Konstante nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = Pixel (Sorce Image) / Konstante z dividieren. Wählen Sie Min, m für jedes Pixel jeweils den Minimalwert von asgewähltem Bild nd Konstante nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = MIN (Pixel (Sorce Image); Konstante) im Ergebnisbild z verwenden. Wählen Sie Max, m für jedes Pixel jeweils den Maximalwert von asgewähltem Bild nd Konstante nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = MAX (Pixel (Sorce Image); Konstante) im Ergebnisbild z verwenden. Wählen Sie Average, m für jedes Pixel jeweils den Mittelwert von asgewähltem Bild nd Konstante nach der Formel: Pixel (Ergebnisbild) = 1/2 x (Pixel (Sorce Image) + Konstante) im Ergebnisbild z verwenden. Wenn Sie 12 Bit Otpt im Feld Otpt Option wählen, wird im Ergebnisbild jedes Pixel mit 12 Bit kodiert, d.h. die Speicherng der Ergebniswerte erfolgt in einem Wertebereich von [ ]. Klicken Sie das Aswahlkästchen Absolte Vale an, wenn die Beträge der Ergebnisdaten verwendet werden sollen. As negativen Ergebnissen werden so positive. 1XUEHL$ULWKPHWLFZLWK3L[HO9DOXHV Klicken Sie das Aswahlkästchen Ct at Maximm an, m Werte die nach der Berechnng aßerhalb des Wertebereichs liegen abzschneiden. Werte kleiner als 0 werden af 0 gesetzt. Alle Werte größer als 255 bei 8-Bit Bildern bzw bei 12 Bit-Bildern werden af den Wert 255 bzw gesetzt. Klicken Sie das Aswahlkästchen Rescale an, m die Intensitätswerte des Bildes af die maximal möglichen Intensitätswerte z normieren. Es werden die Extremwerte bestimmt. Der Minimalwert wird der 0 zgeordnet. Der Maximalwert wird im Falle von 8-Bit Bildern dem Wert 255, im Falle von 12 Bit-Bildern dem Wert 4095 zgeordnet. Dies gewährleistet, dass die errechneten Pixelwerte des Ergebnisbildes innerhalb des jeweiligen Wertebereichs bleiben. ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 195 von 263

196 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ.RQYHUWLHUXQJGHU%LWDXIO VXQJYRQ%LOGHUQ,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: Conversion\ Bit Depth Conversion $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 196 von 263

197 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. 1DYLJDWLRQ%LW'HSWK&RQYHUVLRQ %LOGHUYRQ%LWWLHIHLQ%LWWLHIHNRQYHUWLHUHQXQGXPJHNHKUW ÃÃ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Im Feld Sorce wird die Bittiefe des asgewählten Bildes angezeigt. Wählen Sie im Feld New Resoltion die Bittiefe as, in die der Bilddatensatz konvertiert werden soll. 9HUELQGHQRGHU7UHQQHQYRQ%LOGDXVFKQLWWHQ%LOGHUQXQG %LOGVHULHQ,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: Editing\ Merging 6 Navigation: Editing\ Separation $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 197 von 263

198 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 198 von 263

199 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. 1DYLJDWLRQ(GLWLQJ?0HUJLQJ 0HKUHUH%LOGHURGHU'DWHQVlW]H]XHLQHPQHXHQ%LOGE]Z'DWHQVDW]YHUHLQLJHQ 5HJLVWHU$PSOLWXGH $QSDVVXQJXQWHUVFKLHGOLFKHU%LWDXIO VXQJHQXQGZHLWHUH(LQVWHOOXQJHQ]XU%HUHFKQXQJGHV (UJHEQLVELOGHV Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den ersten Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie im Feld Second Sorce Image, den zweiten Bilddatensatz für die Rechenoperation as. Stellen Sie im Feld Amplitde Image 1/2 Min. den minimalen Intensitätswert ein. Bei Datensätzen mit Grawerten ist dieser Wert «0». Bei Datensätzen mit Weltkoordinaten steht hier das tatsächliche Minimm. Das Minimm ist deshalb einstellbar, damit nterschiedlich skalierte Datensätze afeinander angepasst werden können. Wird ein Datensatz mit einem kleinen Intervall von Intensitätswerten mit einem Datensatz vereinigt, der einen großen Intensitätswertebereich besitzt, wird der erste dnkler dargestellt als der zweite. Drch Anpassen des Minimms beider Datensätze werden diese so skaliert, dass die Intensitätswerte beider Datensätze z gleichen Teilen in das Vereinigngsbild eingehen. Stellen Sie im Feld Amplitde Image 1/2 Max. den maximalen Intensitätswert ein. Bei Datensätzen mit Grawerten ist dieser Wert «255» bei 8-Bit-Daten bzw. «4095» bei 12-Bit- Daten. Bei Datensätzen mit Weltkoordinaten steht hier das tatsächliche Maximm. Das Maximm ist deshalb einstellbar, damit nterschiedlich skalierte Datensätze afeinander angepasst werden können. Wird ein Datensatz mit einem kleinen Intervall von Intensitätswerten mit einem Datensatz vereinigt, der einen großen Intensitätswertebereich besitzt, wird der erste dnkler dargestellt als der zweite. Drch Anpassen des Maximms beider Datensätze werden diese so skaliert, dass die Intensitätswerte beider Datensätze z gleichen Teilen in das Vereinigngsbild eingehen. Im Feld Reslt definieren Sie die Bildaflösng des Vereinigngsbildes. 8 Bit Bildaflösng kann 256 verschiedene Intensitätsstfen darstellen. 12 Bit Bildaflösng kann 4096 verschiedene Intensitätsstfen darstellen. Ist die Option Maximm Vale im Feld Reslt asgewählt, wird as den beiden z vereinigenden Bildern jeweils das hellste Pixel zr Berechnng des entsprechenden Pixels des Vereinigngsbildes verwendet. Ist die Option Average Vale im Feld Reslt asgewählt, wird as den beiden z vereinigenden Bildern jeweils das arithmetische Mittel zr Berechnng des entsprechenden Pixels des Vereinigngsbildes verwendet. :HQQ]ZHLVWDUNXQWHUVFKLHGOLFKH%LOGHUPLWWHOVGHV0LWWHOZHUWYHUIDKUHQV]XHLQHP 9HUHLQLJXQJVELOGEHUHFKQHWZHUGHQVREHZLUNWGHUVFKZDU]H%LOGKLQWHUJUXQGHLQH5HGX]LHUXQJ GHU%LOGKHOOLJNHLW 5HJLVWHU[\]WOD 'HILQLWLRQGHUUlXPOLFKHQ$QRUGQXQJGHU$XVJDQJVELOGHULP(UJHEQLVELOG925GHU 9HUHLQLJXQJ Im Feld Image 1 nd Image 2 geben Sie im Eingabefeld Shift die Position ( x / y / z / t / λ) des Asgangsbildes im Vereinigngsbild ein. Üblicherweise wird dieser Wert «0» sein. Ein Wert > 0 ist dann sinnvoll, wenn beispielsweise eine Verkleinerng des einen Asgangsbildes an einer bestimmten Position des anderen Asgangsbildes gezeigt werden soll. Diese Fnktion ist ach bei lateralen Bildserien sinnvoll, wie sie beispielsweise beim Biomapping vorkommen. & siehe Beispiel für das Verschieben eines Bildes (Seite 247) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 199 von 263

200 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Im Feld Image 1 nd Image 2 geben Sie im Eingabefeld Size die Grösse der Dimensionen ( x / y / z / t / λ) des Asgangsbildes im Vereinigngsbild ein. Wenn Sie das Aswahlkästchen Append aswählen, wird der zweite Datensatz neben den ersten Datensatz platziert. Die Richtng der Platzierng hängt davon ab, ob das Aswahlkästchen im Register x, y oder z asgewählt wrde. Die gleichzeitige Aswahl dieser Fnktion in den verschiedenen Registern für x, y nd z, verschiebt das zweite Asgangsbild entweder nr in einer Dimension oder in mehreren. Im Feld Reslt können Sie angeben, nach welchem Pixel das Vereinigngsbild z Ende ist. +LQWHUJUXQGGLHVHU'HILQLWLRQLVW=XU%HVWLPPXQJGHU'LPHQVLRQHQGHV9HUHLQLJXQJVELOGHV ZHUGHQDEVROXWH/lQJHQYHUZHQGHW+DEHQQXQGLH]ZHL]XYHUHLQLJHQGHQ'DWHQVlW]H]ZDU GLHVHOEHQ/lQJHQDXVGHKQXQJHQDEHUHLQHXQWHUVFKLHGOLFKH$Q]DKOYRQ3L[HOQEHGLQJWGXUFK HLQXQWHUVFKLHGOLFKHV6FDQIRUPDWVRPXVVHQWVFKLHGHQZHUGHQREQXQGLH3L[HODQ]DKORGHU GLHUHVXOWLHUHQGH*HVDPWOlQJHI UGDV9HUHLQLJXQJVELOGHQWVFKHLGHQGVHLQVROOHQ Wenn Sie im Feld Reslt die Option Best Fit aswählen, bentzt die Software für die Berechng des Ergebnisbildes folgendes Verfahren: Für beide Bilder wird berechnet, welcher Breite ein einziges Pixel entspricht: µm/pixel. Ist der Unterschied dieser Größe zwischen beiden Bildern kleiner als ein Faktor 2, so wird bei diesem Verfahren die größere Bildaflösng (d.h. kleinerer Wert µm/pixel) für das Ergebnisbild verwendet. Ist die Abweichng in der Bildaflösng zwischen den Asgangsbildern größer als ein Faktor 2, so wird die kleiner Bildaflösng (d.h. ein größerer Wert µm/pixel) zr Berechnng des Ergebnisbildes verwendet. Die Anzahl der Pixel des Ergebnisbildes (Element Nmber) dividiert drch die Gesamtlänge ergibt die Aflösng des Ergebnisbildes. +LQWHUJUXQGGLHVHU'HILQLWLRQLVW=XU%HVWLPPXQJGHU'LPHQVLRQHQGHV9HUHLQLJXQJVELOGHV ZHUGHQDEVROXWH/lQJHQYHUZHQGHW+DEHQQXQGLH]ZHL]XYHUHLQLJHQGHQ'DWHQVlW]H]ZDU GLHVHOEHQ/lQJHQDXVGHKQXQJHQDEHUHLQHXQWHUVFKLHGOLFKH$Q]DKOYRQ3L[HOQEHGLQJWGXUFK HLQXQWHUVFKLHGOLFKHV6FDQIRUPDWVRPXVVHQWVFKLHGHQZHUGHQREQXQGLH3L[HODQ]DKORGHU GLHUHVXOWLHUHQGH*HVDPWOlQJHI UGDV9HUHLQLJXQJVELOGHQWVFKHLGHQGVHLQVROOHQ & siehe Scanformat aswählen (Seite 128) 5HJLVWHUFK 'HILQLWLRQGHU9HUHLQLJXQJYRQ%LOGHUQPLWXQWHUVFKLHGOLFKHU$Q]DKOYRQ'HWHNWLRQVNDQlOHQ Wenn zwei Bilder oder Datensätze mit nterschiedlicher Anzahl von Detektionskanälen miteinander vereinigt werden sollen, definieren Sie im Feld Image 1, ab welcher Kanalnmmer im Vereinigngsbild die Kanäle des Asgangsbildes 1 eingefügt werden sollen. Wenn zwei Bilder oder Datensätze mit nterschiedlicher Anzahl von Detektionskanälen miteinander vereinigt werden sollen, definieren Sie im Feld Image 2, ab welcher Kanalnmmer im Vereinigngsbild die Kanäle des Asgangsbildes 2 eingefügt werden sollen. Wenn Sie das Aswahlkästchen aswählen, werden die beiden Asgangsbilder af nterschiedliche Kanäle des Vereinigngsbildes verteilt. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 200 von 263

201 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 1DYLJDWLRQ(GLWLQJ?6HSDUDWLRQ (LQ]HOQH%LOGHURGHU%LOGDXVVFKQLWWHDXVHLQHP'DWHQVDW]KHUDXVO VHQ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. )HOG'LPHQVLRQ6HOHFWLRQ Im Eingabefeld ch werden die Detektionskanäle des Bildes oder der Bildserie angezeigt. Wählen Sie die Detektionskanäle as, in denen der Bildasschnitt oder die einzelnen Bilder herasgelöst werden sollen. Im Eingabefeld y wird die Anzahl der Pixel in y angezeigt, die vom Scanformat abhängt. Geben Sie in den Eingabefeldern Start y nd End y die Anzahl der Pixel an, die herasgelöst werden sollen. Mit der Schaltfläche R (Reset) können die Eingaben wieder rückgängig gemacht werden. Im Eingabefeld x wird die Anzahl der Pixel in x angezeigt, die vom Scanformat abhängt. Geben Sie in den Eingabefeldern Start x nd End x die Anzahl der Pixel an, die herasgelöst werden sollen. Mit der Schaltfläche R (Reset) können die Eingaben wieder rückgängig gemacht werden. Im Eingabefeld z wird die Anzahl der Einzelbilder einer Bildserie angezeigt. Geben Sie in den Eingabefeldern Start z nd End z die Anzahl der Bilder an, die herasgelöst werden sollen. Mit der Schaltfläche R (Reset) können die Eingaben wieder rückgängig gemacht werden. Im Eingabefeld Step z / y / x kann innerhalb einer Dimension ein Intervall eingegeben werden. Wenn Sie zm Beispiel im Eingabefeld Step z eine 2 eingeben, wird immer nr jedes 2. Bild herasgeschnitten. %HLVSLHOH Wenn Sie alle Bilder eines Detektionskanals as einer Bildserie herasschneiden wollen, klicken Sie im Eingabefeld ch den Kanal an, der herasgelöst werden soll, ohne die Werte in den Eingabefeldern der anderen Dimensionen z verändern. Wenn Sie einzelne Bilder als Ganzes as einer Bildserie herasschneiden wollen, geben Sie in den Eingabefeldern Start z nd End z die entsprechenden Zahlen ein, ohne die Werte in den Eingabefeldern der anderen Dimensionen z verändern. Wenn Sie einen Asschnitt in allen Bildern einer Bildserie herasschneiden wollen, definieren Sie in den Eingabefeldern Start x, End x nd Start y, End y die Grösse des Asschnitts, ohne die Werte in den Eingabefeldern für z z ändern. ÃÃ (LQVWHOOHQYRQ+HOOLJNHLW.RQWUDVWXQG*DPPDNRUUHNWXU,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: Enhancement\ Contrast and Brightness 6 Navigation: Enhancement\ Gamma Correction $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 201 von 263

202 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 202 von 263

203 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. 1DYLJDWLRQ(QKDQFHPHQW?%ULJKWQHVVDQG&RQWUDVW (LQVWHOOHQYRQ+HOOLJNHLWXQG.RQWUDVW Wenn Sie die Helligkeit des Bildes verändern, werden helle Stellen, dnkle Stellen nd mittlere Helligkeitswerte des Bildes in gleichem Maße afgehellt. Mit dem Kontrast variieren Sie das Verhältnis von hellen nd dnklen Stellen im Bild. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Für Mehrkanalbilder, wählen Sie das Aswahlkästchen Lock Channels, m alle Änderngen für alle Kanäle gleichzeitg nd in gleichem Umfang vorznehmen. Wählen Sie für Bilder, die nicht den gesamten Dynamikbereich asntzen, das Aswahlkästchen Linear Model. Ist das Aswahlkästchen angewählt, so besteht eine lineare Beziehng zwischen der Helligkeit im Asgangsbild nd im Ergebnisbild. Ob ein Bild den gesamten zr Verfügng stehenden Dynamikbereich asntzt, können Sie herasfinden, indem Sie ein Histogramm des Bildes erstellen. Falls sich das Histogramm nicht über den gesamten Intensitätsbereich erstreckt (siehe Minimal- nd Maximalwerte), wird der Dynamikbereich nicht komplett asgentzt. & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) Falls Sie Bilder haben, in denen Sie die mittleren Helligkeitswerte stärker hervorheben wollen, so wählen Sie das nichtlineare Modell (Aswahlkästchen Linear Model nicht asgewählt). Verändern Sie im Feld Channel Adjstment mit dem Schieberegler Brightness die Helligkeit des Ergebnisbildes. Befindet sich der Schieberegler exakt in der Mitte, so sind Asgangsbild nd Ergebnisbild gena gleich hell. Wird der Schieberegler as der Mitte nach rechts geschoben, so wird das Ergebnisbild heller als das Asgangsbild. Wird der Schieberegler as der Mitte nach links geschoben, so wird das Ergebnisbild dnkler als das Asgangsbild. Verändern Sie im Feld Channel Adjstment mit dem Schieberegler Contrast den Kontrast des Ergebnisbildes. Befindet sich der Schieberegler exakt in der Mitte, so haben Asgangsbild nd Ergebnisbild gena denselben Kontrast. Wird der Schieberegler as der Mitte nach rechts geschoben, so wird das Ergebnisbild kontrastreicher als das Asgangsbild. Wird der Schieberegler as der Mitte nach links geschoben, so wird das Ergebnisbild kontrastärmer als das Asgangsbild. 1DYLJDWLRQ(QKDQFHPHQW?*DPPD&RUUHFWLRQ (LQVWHOOHQGHUPLWWOHUHQ+HOOLJNHLWVZHUWH*DPPDNRUUHNWXU Mit der Gammakorrektr wird die Umsetzng des Kontrasts des Asgangsbildes in den Kontrast des Ergebnisbildes af nichtlineare Weise beeinflßt. Die Gammakorrektr wirkt sich nr af die mittleren Helligkeitswerte eines Bildes as, während die sehr hellen nd die sehr dnklen Bildbereiche nverändert bleiben. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Für Mehrkanalbilder, wählen Sie das Aswahlkästchen Lock Channels, m alle Änderngen für alle Kanäle gleichzeitg nd in gleichem Umfang vorznehmen. Verändern Sie im Feld Channel Adjstment mit dem Schieberegler die mittleren Helligkeitswerte des Ergebnisbildes. Befindet sich der Schieberegler exakt in der Mitte, so sind Asgangsbild nd Ergebnisbild gena gleich hell. Wird der Schieberegler as der Mitte nach rechts geschoben, so werden die mittleren Helligkeitswerte afgehellt. Wird der Schieberegler as der Mitte nach links geschoben, so werden die mittleren Helligkeitswerte dnkler. ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 203 von 263

204 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ (UZHLWHUWHU)RNXVGXUFK3URMHNWLRQHQYRQ%LOGVWDSHOQDXIHLQ (LQ]HOELOG,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: Extended Focs\ Average Projection, Maximm Projection, Transparent Projection $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 204 von 263

205 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. 1DYLJDWLRQ([WHQGHG)RFXV?$YHUDJH3URMHFWLRQ0D[LPXP3URMHFWLRQ7UDQVSDUHQW3URMHFWLRQ (LQ3URMHNWLRQVELOGHQWODQJGHURUWKRJRQDOHQ$FKVH]$FKVHEHLKRUL]RQWDOHQ[\6FKQLWWHQ XQG\$FKVHEHLYHUWLNDOHQ[]6FKQLWWHQHU]HXJHQ & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie eine der drei Projektionsarten as: Mittelwertprojektion (Average Projection), Maximmprojektion (Maximm Projection), Transparentprojektion (Transparent Projection). 5HJLVWHU2SWLRQV Im Feld Projection Direction bestimmen Sie, über welche Dimension die Projektion asgeführt wird. Wählen Sie [z] bei rämlichen Serien, [t] bei Zeitserien oder [λ] bei Wellenlängenserien, m die Projektion as allen Bildern eines Detektionskanals, also zm Beispiel von Bild 1 bis Bild 10 im Detektionskanal 1, z erzegen. Wählen Sie [ch], m die Projektion jeweils as einem bestimmten Bild in allen Detektionskanälen, also zm Beispiel von Bild 1 in Detektionskanal 1 nd Bild 1 in Detektionskanal 2, z erzegen. Klicken Sie af Rescale im Feld Options, m bei der Erzegng des Projektionsbildes die Intensitätswerte des Bildes af die maximal möglichen Intensitätswerte z normieren. Dies gewährleistet, dass die errechneten Grawerte des Projektionsbildes innerhalb des Wertebereichs von zm Beispiel 0 bis 255 bei 8 Bit bleiben. Dnkle Bilder können so afgehellt werden. Wenn Sie af Invert im Feld Options klicken, wird die Projektionsachse gespiegelt. Die Berechnng des Projektionsbildes erfolgt also in entgegengesetzer Richtng. Dies ist eine Fnktion, die vor allem bei inversen Mikroskopen sinnvoll ist, m die Berechnng des Projektionsbildes dem inversen Strahlengang des Laserlichts anzgleichen. Bewegen Sie den Schieber im Feld Threshold, m einen Schwellenwert z definieren. Die Intensitätswerte nterhalb dieses Wertes werden für die Erzegng des Projektionsbildes nicht berücksichtigt. 5HJLVWHU)DFWRUQXUEHL7UDQVSDUHQWSURMHNWLRQ & siehe Prinzip nd Arten von Projektionen (Seite 173) Das Register Factor wird nr bei asgewählter Transparentprojektion angezeigt. Mit dem Schieber variieren Sie den Transparentfaktor α. Je höher er eingestellt ist, desto stärker fliessen Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 205 von 263

206 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ die Intensitätswerte as den nteren Ebenen im Bildstapel in das Projektionsbild ein. 'LHGUHL3URMHNWLRQVDUWHQN QQHQDXFKGLUHNW EHUGLHHQWVSUHFKHQGHQ7DVWHQ)L[0D[ )L[$YJ)L[7UDQVDNWLYLHUWZHUGHQ:LUGGLH)XQNWLRQ EHUGLH7DVWHDXVJHO VWLVW GDV3URMHNWLRQVELOGQXUHLQHWHPSRUlUH0RQLWRUGDUVWHOOXQJ'LHVHN QQHQ6LHPLWGHU 7DVWH2ULJLQDOZLHGHUU FNJlQJLJPDFKHQ & siehe Maximmprojektion eines Bildstapels bei invariabler Projektionsachse (Seite 176) & siehe Mittelwertprojektion eines Bildstapels bei invariabler Projektionsachse (Seite 178) & siehe Transparentprojektion eines Bildstapels bei invariabler Projektionsachse (Seite 180) ÃÃ /LQHDUH)LOWHUXQG0RUSKRORJLVFKH)LOWHURSWLRQDO,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Was sind lineare Filter? 6 Navigation: Image Filters\ Linear Filters 6 Was sind morphologische Filter? 6 Navigation: Image Filters\ Morphological Filters $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 206 von 263

207 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. :DVVLQGOLQHDUH)LOWHU" Filter werden daz eingesetzt, die Qalität eines Bildes z verbessern. In der Regel bedetet dies, nerwünschte Bildpnkte (Pixel) as dem Bild z entfernen. Mit der hier verfügbaren Filterfnktion, einem Tiefpassfilter, wird statistisches Raschen, das zm Beispiel drch den Detektor hervorgerfen werden kann, in einem Bild nterdrückt. Das Prinzip eines Filters besteht darin, den Wert eines jeden Pixel in einem Bild mit den Werten seiner Nachbarpixel z verrechnen. Der Filterkern (Kernel) beschreibt die Anzahl nd die Gewichtng der Nachbarpixel, die in die Berechnng des neen Bildpnktes miteinfließen. Der hier verwendete Filterkern lässt sich mit dem Pascalschen Dreieck beschreiben: )LOWHUNHUQJU VVH 3DVFDOVFKHV'UHLHFN 1RUPLHUXQJ 1 1 1/2 Kernel Size / /8 Kernel Size / /32 Kernel Size / /128 Kernel Size / Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 207 von 263

208 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Wählt man zm Beispiel die Filterkerngrösse 5 (Kernel Size 5) as, so werden jeweils 5 Pixel des Originalbildes in die Berechnng 1 Pixels im gefilterten Bild verwendet. Immer das mittlere Pixel im Filterkern ist der z berechnende Bildpnkt. Dabei werden die Grawerte der 5 Pixel, entsprechend dem Gewichtngsschema , mit den Faktoren 1/16, 4/16, 6/16, 4/16, 1/16 mltipliziert nd miteinander zm Endwert addiert. In der folgenden schematischen Darstellng, bedetet dies für die Berechnng des Pixels C, dass die Grawerte der Pixel A, B nd D, E in die Berechng des gefilterten Pixels C' mit einfließen. Die Berechnng von C' latet: 16x1/16 + 4x4/16 + 8x6/ x4/16 + 8x1/16 = ,5 = 13,5 A B C D E Grawerte der Pixel A-E im Originalbild Faktoren der Filterkerngrösse 5 1/16 4/16 6/16 4/16 1/16 Grawert von C' im gefilterten Bild 13,5 Eine solche Berechnng wird für jedes Pixel im Originalbild drchgeführt. Am Rand des Bildes ragt die Filtermaske über das Bild hinas. Für diese Pixel wird der Wert 0 gesetzt. :LUNXQJGHUOLQHDUHQ)LOWHU Intensitätsprofil eines ngefilterten Bildes Intensitätsprofil des Bildes nach der Anwendng des Filters Blr Intensitätsprofil des Bildes nach der Anwendng des Filters Sharpen Intensitätsprofil des Bildes nach der Anwendng des Filters Highpass Wenn Sie den Filter Blr aswählen, wird der oben beschriebene Tiefpassfilter af das Bild angewendet. Dieser Filtertyp filtert die hohen Freqenzen as dem Bild. Das heißt, die stark asgeprägten Übergange von niedrigen z hohen Intensitätswerten werden abgeschwächt. Mit diesem Filter kann Raschen as einem Bild entfernt werden. Wenn Sie den Filter Sharpen aswählen, wird der Tiefpassfilter af das Bild angewendet nd dann werden die Werte des hochpassgefilterten Bildes af die Werte des Originalbildes afaddiert. Dieser Filtertyp filtert die niedrigen Freqenzen as dem Bild. Das heißt, die stark asgeprägten Übergange von niedrigen z hohen Intensitätswerten werden verstärkt. Wenn Sie den Filter Highpass aswählen wird der Tiefpassfilter af das Bild angewendet nd dann werden die Werte des Originalbildes von den Werten des tiefpassgefilterten Bildes sbtrahiert. Das Ergebnis entspricht einem Bild, das mit einem Hochpassfilter bearbeitet wrde. Dieser Filtertyp stellt nr die stark asgeprägten Übergänge von niedrigen z hohen Intensitätswerten im Bild dar. 1DYLJDWLRQ,PDJH)LOWHUV?/LQHDU)LOWHUV /LQHDUH)LOWHU7LHISDVVXQG+RFKSDVVILOWHUDXI%LOGHUDQZHQGHQ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie eine der drei Filtertypen as: Glätten (Blr), Schärfen (Sharpen), Hochpassfilter (Highpass). Im Feld Kernel Size wählen Sie einen Wert für die Filterkerngrösse as. Der Wert, der im Feld Kernel Size als Ct-off Wavelength angegeben wird, ist die Grösse des Filters gemessen in Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 208 von 263

209 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Pixel. Dieser Wert wird af Grndlage der für das jeweilige Bild verwendeten Scanparameter (Vergrößerng des Objektivs, Wellenlänge des Anregngslicht, Scanformat, Elektronischer Zoomfaktor...) berechnet. Im Feld Filter Directions stellen Sie die Dimensionalität des Filters ein. Wählen Sie die Ramachsen as, af die der Filter seqentiell angewendet werden soll. Es werden hier eindimensionale Filter eingesetzt, das heißt der Filter wird af einmal immer nr über eine Achse berechnet. Der Wert, der im Feld Filter Directions als Ct-off Wavelength angegeben wird, ist die Grösse des Filters gemessen in Nanometern. Bei einem Wert von zm Beispiel 160 nm, werden alle Wellenlängen kleiner gleich 160 nm gefiltert. 6KDUS)DFWRUQXUEHL)LOWHUW\S6KDUSHQ Mit dem Schieber im Feld Sharp Factor variieren Sie die Wirkng des Filtertyps Sharp. Ist dieser Faktor af 0 eingestellt, ist der Filter nicht aktiv..dfkhoq%oxu*doohu\6kdushq*doohu\+ljksdvv*doohu\ Klicken Sie af die Kachel Blr (Gallery), Sharpen (Gallery) oder Highpass (Gallery), m eine Galerie von Vorschabildern des asgewählten Bilddatensatzes z sehen. Jedes der Vorschabilder wrde mit einer anderen Filterkerngrösse (nd einem anderen Schärfefaktor) berechnet. Klicken Sie af eine Kachel, m den Dialog mit den entsprechenden Einstellngen anzzeigen. :DVVLQGPRUSKRORJLVFKH)LOWHU" Morphologische Filter dienen daz, mit Hilfe mathematischer Operatoren die Form von zsammenhängenden Strktren im Bild z verändern nd vom Hintergrnd z trennen. Morphologische Operatoren werden üblicherweise af binäre Bilder angewandt. Binärbilder haben Pixel, die nr den Wert 1 oder 0 haben. In der Leica Confocal Software können Sie mit den Segmentierngsfnktionen binäre Bilder erzegen. Es können aber ach Grawertbilder, also Bilder mit einem Wertebereich von zm Beispiel 256 (8 Bit) verschiedenen Grawerten/ Intensitätswerten, mit diesen Operatoren bearbeitet werden. & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner Segmentation (Seite 218) Das Prinzip besteht darin, eine Maske ach Strktrelement genannt Pixel für Pixel über das Bild z bewegen. Das z nterschende Pixel ist immer das zentrale Pixel in der Maske. Die Maske kann in der Leica Confocal Software die Form eines Qadrats, eines Krezes oder eines Kreises haben. Form nd Grösse der Maske bestimmen, welche nd wieviele Nachbarpixel zm Filtern herangezogen werden. Anhand eines bestimmten Kriterims wird nterschieden, welche Pixel als Strktr nd welche als Hintegrnd im Ergebnisbild definiert werden. Bei Binärbildern ist dieses Kriterim die logische Verknüpfng AND bzw. OR, bei Grawertbildern ist es die Höhe des Grawertes/ Intensitätswertes. & siehe Boolesche Verknüpfngen (Seite 248) Mit der Form der Maske beeinflsst man die Strktren, die im Ergebnisbild hervorgehoben werden. Hat man zm Beispiel die Kgel als Maskenform gewählt, werden rnde Formen im Ergebnisbild betont. Es hängt jedoch von dem morphologischen Operator ab, bei welcher Nachbarschaftsbeziehng das entsprechende Pixel im Ergebnisbild als Strktr oder als Hintergrnd kodiert wird. Es gibt folgende zwei elementare Grndtypen morphologischer Operatoren, nämlich die Erosion (Erosion) nd die Dilatation (Dilation), sowie Kombinationen dieser Operatoren: 2SHUDWRU Erosion (Erosion) %HVFKUHLEXQJ Bei Binärbildern wird das nterschte Pixel im Ergebnisbild dann af den binären Wert 1 gesetzt, wenn alle Nachbarpixel (bestimmt drch die Form nd Grösse der Maske) im binären Originalbild mit einer 1 kodiert sind. Bei Grawertbildern wird der minimale Grawert der Nachbarpixel anstelle des Wertes des nterschten Pixels im Ergebnisbild eingetragen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 209 von 263

210 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Dilatation (Dilation) Bei Binärbildern wird das nterschte Pixel im Ergebnisbild dann af den binären Wert 1 gesetzt, wenn mindestens eines der Nachbarpixel (bestimmt drch die Form nd Grösse der Maske) im binären Schwellenwertbild mit einer 1 kodiert ist. Bei Grawertbildern wird der maximale Intensitätswert der Nachbarpixel anstelle des Wertes des nterschten Pixels im Ergebnisbild eingetragen. 2SHUDWRUNRPELQDWLRQ Öffnen (Open) Schließen (Close) Top Hat Bottom Hat %HVFKUHLEXQJ Öffnen ist eine Operatorkombination. Zerst wird eine Erosion nd dann eine Dilatation asgeführt. Schließen ist eine Operatorkombination. Zerst wird eine Dilatation nd dann eine Erosion asgeführt. Top Hat bearbeitet das Bild mit der Operatorkombination Öffnen nd zieht das Ergebnisbild vom Originalbild ab. Bottom Hat bearbeitet das Bild mit der Operatorkombination Schließen nd zieht das Originalbild vom Ergebnisbild ab. )LOWHU Median %HVFKUHLEXQJ Der Medianfilter gehört zr Grppe der nichtlinearen Rangordnngsfilter. Bei der Medianfilterng werden die Intensitätswerte der Nachbarpixel (bestimmt drch die Form nd Grösse der Maske) nach ihrer Größe sortiert. Im Ergebnisbild der Medianfilterng wird dann derjenige Intensitätswert anstelle des nterschten Pixels eingetragen, der in dieser Rangordnng in der Mitte steht. :LUNXQJGHUPRUSKRORJLVFKHQ2SHUDWRUHQ 2ULJLQDOELOG Strktren (mit sehr hohen Intensitätswerten) sind gra farbkodiert, der Hintergrnd (Intensitätswert 0) dnkelbla. Zwischen diesen beiden Extremwerten ist die Spanne von höheren z niedrigeren Intensitätswerten von bran, gelb, grün bis türkis farbkodiert. 1DFKGHU$QZHQGXQJGHV)LOWHUV0HGLDQ Der Medianfilter glättet das Gesamtbild, während er gleichzeitig Strktren im Bild akzentiert nd kontriert. 1DFKGHU$QZHQGXQJGHV2SHUDWRUV(URVLRQ Zsammenhängende Strktren schrmpfen nd kleine Strktren nd Verbindngen zwischen Strktren verschwinden (die Zahl der hohen Intensitätswerte sinkt, während die Zahl der niedrigen Intensitätswerte steigt). 1DFKGHU$QZHQGXQJGHV2SHUDWRUV 'LODWLRQ Zsammenhängende Strktren wachsen nd Zwischenräme innerhalb einer Strktr nd zwischen Strktren werden gefüllt. (die Zahl der hohen Intensitätswerte steigt, während die Zahl der niedrigen Intensitätswerte sinkt). Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 210 von 263

211 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 1DFKGHU$QZHQGXQJGHV2SHUDWRUV2SHQ (URVLRQ'LODWLRQ Zsammenhängende Strktren schrmpfen nd Zwischenräme werden grösser (die Zahl der hohen Intensitätswerte sinkt, während die Zahl der niedrigen Intensitätswerte steigt). 1DFKGHU$QZHQGXQJGHV2SHUDWRUV&ORVH 'LODWLRQ(URVLRQ Zsammenhängende Strktren wachsen nd Zwischenräme bleiben nahez nverändert (die Zahl der hohen Intensitätswerte steigt, während die Zahl der niedrigen Intensitätswerte ngefähr gleich bleibt). 1DFKGHU$QZHQGXQJGHV2SHUDWRUV7RS+DW Die hohen Intensitätswerte werden extrahiert 1DFKGHU$QZHQGXQJGHV2SHUDWRUV %RWWRP+DW Die niedrigen Intensitätswerte werden extrahiert 1DYLJDWLRQ,PDJH)LOWHUV?0RUSKRORJLFDO)LOWHUV 0RUSKRORJLVFKH)LOWHUDXI%LOGHUDQZHQGHQ ÃÃ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie eine der sieben Filtertypen as: Medianfilter (Median), Erosion (Erosion), Dilatation (Dilation), Öffnen (Open), Schließen (Close) sowie Top hat nd Bottom hat. Wählen Sie im Feld Mask die Grndform der Filtermaske as: Qadrat (Cbe), Krez (Cross) oder Kreis (Sphere). Mit der Wahl der Form des Strktrelements beeinflsst man die Bildstrktren, die vom Filter herasgearbeitet werden. Zm Beispiel betonen Kreise rnde Strktren im Ergebnisbild. Geben Sie in den Feldern Size X, Size Y nd Size Z die Grösse der Maske in Pixeln an. Die Maskengrösse bestimmt, wieviele Nachbarpixel in die Filtermaske miteinbezogen werden. Legen Sie im Feld Repetition fest, wie häfig der Filter angewendet werden soll..dfkhoqplwghu%h]hlfkqxqj*doohu\ Klicken Sie af eine der mit (Gallery) benannten Kacheln, m eine Galerie von Vorschabildern des asgewählten Bilddatensatzes z sehen. Jedes der Vorschabilder wrde mit einem anderen Strktrelement nd oder Maskengrösse berechnet. Klicken Sie af eine Kachel, m den Dialog mit den entsprechenden Einstellngen anzzeigen. ÃÃ ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 211 von 263

212 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 1LYHOOLHUHQXQG)LOWHUQYRQ2EHUIOlFKHQDXIQDKPHQRSWLRQDO,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: Materials\ Leveling 6 Was sind lineare Filter? 6 Navigation: Materials\ Roghness Filter 6 Navigation: Materials\ Waviness Filter $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 212 von 263

213 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. 1DYLJDWLRQ0DWHULDOV?/HYHOLQJ $QSDVVHQHLQHU,QWHUSRODWLRQVIXQNWLRQDQHLQHQ'DWHQVDW]]XU.RUUHNWXUYRQ7UHQGYHUOlXIHQ ]%VFKLHIDXIJHQRPPHQHU'DWHQVDW] Ziel des Verfahrens ist es, einen Intensitätsverlaf, der eine Trendkrve afweist, in eine horizontale Lage z bringen. Daz wird zerst eine geeignete Interpolationsfnktion (Polynom) an den Intensitätsverlaf angepasst. Danach wird der Abstand der optimalen Interpolationsfnktion z einem horizontalen Intensitätsplatea berechnet. Die aftretenden Intensitätsdifferenzen werden pixelweise zm Originaldatensatz daz addiert. Damit wird der Trendverlaf kompensiert. & siehe Anpassngsfnktion zr Korrektr von Trendverläfen (Seite 246) Die z optimierende Zielfnktion bei der Ermittlng der Koeffizienten der Anpassngsfnktion latet: Wählen Sie einen der vier Typen der Anpassngsfnktion as: Leveling (Linear), Leveling (Bilinear), Leveling (Qadratic), Leveling (Cbic). )LWWLQJ,QWHUSRODWLRQ)XQFWLRQ Linear Bilinear Qadratic Cbic )RUPHO f(x) = a + bx + cy f(x) = a + bx + cx + dxy f(x) = a + bx + cx + dxy + fx² f(x) = a + bx + cx + dxy + fx² + gxy² + hx³ + iy³ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Wählen Sie die Schrittweite im Feld Sample Step Width. Mit der Schrittweite stellen Sie die Anzahl von Stützstellen für das Polynom ein. Je kleiner die Schrittweite eingestellt wird, desto zeitafwendiger nd genaer ist die Berechnng der Anpassngsfnktion. Falls der Datensatz verrascht ist, empfiehlt es sich, im Feld Threshold die intensitätsschwachen Raschsignale drch Einstellen eines Schwellenwertes aszblenden. Alle Intensitätswerte, die betragsmäßig kleiner sind als der Schwellenwert, werden nicht zr Berechnng herangezogen. Damit vermeidet man, dass die Raschsignale fälschlicherweise als Stützstellen für die Anpassngsfnktion verwendet werden. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 213 von 263

214 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ :DVVLQGOLQHDUH)LOWHU" Filter werden daz eingesetzt, die Qalität eines Bildes z verbessern. In der Regel bedetet dies, nerwünschte Bildpnkte (Pixel) as dem Bild z entfernen. Mit der hier verfügbaren Filterfnktion, einem Tiefpassfilter, wird statistisches Raschen, das zm Beispiel drch den Detektor hervorgerfen werden kann, in einem Bild nterdrückt. Das Prinzip eines Filters besteht darin, den Wert eines jeden Pixel in einem Bild mit den Werten seiner Nachbarpixel z verrechnen. Der Filterkern (Kernel) beschreibt die Anzahl nd die Gewichtng der Nachbarpixel, die in die Berechnng des neen Bildpnktes miteinfließen. Der hier verwendete Filterkern lässt sich mit dem Pascalschen Dreieck beschreiben: )LOWHUNHUQJU VVH 3DVFDOVFKHV'UHLHFN 1RUPLHUXQJ 1 1 1/2 Kernel Size / /8 Kernel Size / /32 Kernel Size / /128 Kernel Size / Wählt man zm Beispiel die Filterkerngrösse 5 (Kernel Size 5) as, so werden jeweils 5 Pixel des Originalbildes in die Berechnng 1 Pixels im gefilterten Bild verwendet. Immer das mittlere Pixel im Filterkern ist der z berechnende Bildpnkt. Dabei werden die Grawerte der 5 Pixel, entsprechend dem Gewichtngsschema , mit den Faktoren 1/16, 4/16, 6/16, 4/16, 1/16 mltipliziert nd miteinander zm Endwert addiert. In der folgenden schematischen Darstellng, bedetet dies für die Berechnng des Pixels C, dass die Grawerte der Pixel A, B nd D, E in die Berechng des gefilterten Pixels C' mit einfließen. Die Berechnng von C' latet: 16x1/16 + 4x4/16 + 8x6/ x4/16 + 8x1/16 = ,5 = 13,5 A B C D E Grawerte der Pixel A-E im Originalbild Faktoren der Filterkerngrösse 5 1/16 4/16 6/16 4/16 1/16 Grawert von C' im gefilterten Bild 13,5 Eine solche Berechnng wird für jedes Pixel im Originalbild drchgeführt. Am Rand des Bildes ragt die Filtermaske über das Bild hinas. Für diese Pixel wird der Wert 0 gesetzt. :LUNXQJGHUOLQHDUHQ)LOWHU Intensitätsprofil eines ngefilterten Bildes Intensitätsprofil des Bildes nach der Anwendng des Filters Waviness Intensitätsprofil des Bildes nach der Anwendng des Filters Roghness Wenn Sie den Filter Waviness aswählen, wird der oben beschriebene Tiefpassfilter af das Bild angewendet. Dieser Filtertyp filtert die hohen Freqenzen as dem Bild. Das heißt, die stark asgeprägten Übergange von niedrigen z hohen Intensitätswerten werden abgeschwächt. Mit Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 214 von 263

215 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ diesem Filter kann Raschen as einem Bild entfernt werden. Wenn Sie den Filter Roghness aswählen wird der Tiefpassfilter af das Bild angewendet nd dann werden die Werte des Originalbildes von den Werten des tiefpassgefilterten Bildes sbtrahiert. Das Ergebnis entspricht einem Bild, das mit einem Hochpassfilter bearbeitet wrde. Dieser Filtertyp stellt nr die stark asgeprägten Übergänge von niedrigen z hohen Intensitätswerten im Bild dar. 1DYLJDWLRQ0DWHULDOV?5RXJKQHVV)LOWHU +RFKSDVVILOWHUDXI%LOGHUDQZHQGHQ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Im Feld Kernel Size wählen Sie einen Wert für die Filterkerngrösse as. Der Wert, der im Feld Kernel Size als Ct-off Wavelength angegeben wird, ist die Grösse des Filters gemessen in Pixel. Dieser Wert wird af Grndlage der für das jeweilige Bild verwendeten Scanparameter (Vergrößerng des Objektivs, Wellenlänge des Anregngslicht, Scanformat, Elektronischer Zoomfaktor...) berechnet. Im Feld Filter Directions stellen Sie die Dimensionalität des Filters ein. Wählen Sie die Ramachsen as, af die der Filter seqentiell angewendet werden soll. Es werden hier eindimensionale Filter eingesetzt, das heißt der Filter wird af einmal immer nr über eine Achse berechnet. Der Wert, der im Feld Filter Directions als Ct-off Wavelength angegeben wird, ist die Grösse des Filters gemessen in Nanometern. Bei einem Wert von zm Beispiel 160 nm, werden alle Wellenlängen kleiner gleich 160 nm gefiltert. ÃÃ 1DYLJDWLRQ0DWHULDOV?:DYLQHVV)LOWHU 7LHISDVVILOWHUDXI%LOGHUDQZHQGHQ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Im Feld Kernel Size wählen Sie einen Wert für die Filterkerngrösse as. Der Wert, der im Feld Kernel Size als Ct-off Wavelength angegeben wird, ist die Grösse des Filters gemessen in Pixel. Dieser Wert wird af Grndlage der für das jeweilige Bild verwendeten Scanparameter (Vergrößerng des Objektivs, Wellenlänge des Anregngslicht, Scanformat, Elektronischer Zoomfaktor...) berechnet. Im Feld Filter Directions stellen Sie die Dimensionalität des Filters ein. Wählen Sie die Ramachsen as, af die der Filter seqentiell angewendet werden soll. Es werden hier eindimensionale Filter eingesetzt, das heißt der Filter wird af einmal immer nr über eine Achse berechnet. Der Wert, der im Feld Filter Directions als Ct-off Wavelength angegeben wird, ist die Grösse des Filters gemessen in Nanometern. Bei einem Wert von zm Beispiel 160 nm, werden alle Wellenlängen kleiner gleich 160 nm gefiltert. ÃÃ ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 215 von 263

216 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 5HGX]LHUHQYRQhEHUVSUHFKHQ]ZLVFKHQ'HWHNWLRQVNDQlOHQ,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Navigation: Mlticolor\ Crosstalk Redction $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 216 von 263

217 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. 1DYLJDWLRQ0XOWLFRORU?&URVVWDON5HGXFWLRQ 5HGX]LHUHQYRQhEHUVSUHFKHQ]ZLVFKHQ'HWHNWLRQVNDQlOHQ Bei der Afnahme von Präparaten, die mit Floreszenzfarbstoffen markiert wrden, deren Emissionsspektren nahe beeinander liegen oder sich überlappen kann es zm Übersprechen von Floreszenzsignalen kommen. Dabei kommt es z einer nerwünschten Übertragng von Signalen von einem Detektionskanal in einen anderen. Mit dieser Fnktion haben Sie die Möglichkeit, diese nerwünschte Signalinformation eines Bilddatensatzes mit bis z vier Detektionskanälen mittels einer Matrixmltiplikation z redzieren. Im Dialog ist die Matrixmltiplikation dargestellt. Die Pixelwerte der bis z 4 möglichen Kanäle des z bearbeitenden Originalbildes werden mit Hilfe von den Faktoren M11 bis M44 miteinander verrechnet. Die Kennzahlen der Faktoren M beziehen sich af die Kanäle. Der Faktor M12 zm Beispiel repräsentiert den Anteil an Signalinformation, den der Kanal 2 des Originalbildes im Kanal 1 des Ergebnisbildes haben soll. Da sich die Faktoren M11, M22, M33 nd M44 af denselben Kanal in Originalbild nd Ergebnisbild beziehen, sind diese Faktoren af den Wert 1 eingestellt. ÃÃ ÃÃ Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Drch Veränderng des Faktors M redzieren oder erhöhen Sie die Signalinformation im Kanal des Ergebnisbildes. Soll zm Beispiel das Übersprechen von Kanal 2 in Kanal 1 as dem Kanal 1 im Ergebnisbild entfernt werden, geben Sie im Feld M12 eine negative Zahl zwischen 0 nd 1 ein. Wenn Sie positive Zahlen zwischen 0 nd 1 in Feld M12 eingeben, wird die Signalinformation in Kanal 1 des Ergebnisbildes erhöht. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 217 von 263

218 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 6HJPHQWLHUXQJYRQ%LOGVWUXNWXUHQRSWLRQDO,QGLHVHP.DSLWHOILQGHQ6LHIROJHQGH7KHPHQ 6 Afba nd Bedienng des Arbeitsschritts Process 6 Was ist Segmentierng in der Bildverarbeitng? 6 Navigation: Segmentation\ Thresholding 6 Navigation: Segmentation\ Seeding (Threshold) 6 Navigation: Segmentation\ Seeding (Single Channel) 6 Navigation: Segmentation\ Seeding (Cross-Channel) $XIEDXXQG%HGLHQXQJGHV$UEHLWVVFKULWWV3URFHVV Wenn Sie af das Pfeilsymbol Process klicken, wird der sonst übliche Afba der Bedienoberfläche vollständig verändert. Alle Fnktionstasten der anderen Schaltflächenbereiche/ Arbeitsschritte werden asgeblendet. Af der linken Seite wird das Ansichtsfenster Experiment Overview mit den geöffneten Experimenten angezeigt. Darnter befindet sich das Navigationsfenster mit dem Verzeichnisbam aller in diesem Arbeitsschritt verfügbaren Fnktionen. In der Mitte der Bedienoberfläche werden 10 große Kacheln angezeigt, die 10 Fnktionsgrppen mfassen. Oberhalb dieser Kacheln befindet sich ein Hilfefeld, in dem eine krze Erläterng z einer Fnktionsgrppe eingeblendet werden kann, indem man den Maszeiger über die entsprechende Kachel hält. Klicken Sie af die Kachel mit der gewünschten Fnktionsgrppe. Af jeder Navigationsebene können Sie eine Erläterng der Fnktionsgrppen oben im Hilfefeld einblenden, indem Sie den Maszeiger über die jeweilige Kachel halten. Wählen Sie in den nachfolgenden Navigationsebenen jeweils eine Kachel, bis Sie af der ntersten Ebene die gewünschte Fnktion mit dem entsprechenden Dialog erreicht haben. Im Navigationsfenster können Sie direkt eine Fnktion anwählen, indem Sie den entsprechenden Ordner anklicken. In der Menüzeile oben rechts stehen Ihnen folgende Tasten zr Verfügng: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 218 von 263

219 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Taste Back, m zr zletzt angezeigten Navigationsebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Forward, m die Ebene anzzeigen, die Sie asgewählt hatten, bevor Sie af die Taste Back geklickt haben. Klicken Sie af die Taste Up, m zr hierarchisch höheren Ebene z gelangen. Klicken Sie af die Taste Reset, m geänderte Variablen af die letzte Einstellng zrückzsetzen. Um den Arbeitsschritt Process z verlassen, klicken Sie af das Pfeilsymbol eines anderen Arbeitsschritts (z.b. Acqire). Am nteren Ende jedes Dialogs finden Sie folgende beiden Schaltflächen: Klicken Sie af die Schalfläche Preview, m die asgewählte Fnktion aszführen nd das Ergebnisbild rechts im Vorschafenster anzzeigen. Klicken Sie af die Taste Apply, m die asgewählte Fnktion af den aktiven Bilddatensatz anzwenden, das Ergebnisbild im Ansichtsfenster Viewer anzzeigen nd eine nee Datei im aktiven Experiment z erzegen. :DVLVW6HJPHQWLHUXQJLQGHU%LOGYHUDUEHLWXQJ" Viele Anwendngen der Konfokalmikroskopie erfordern es, Strktren in einem Bild z extrahieren nd diese als Ganzes zm Beispiel qantitativen Analysen zgänglich z machen. Um relevante von irrelevanter Bildinformation z trennen, wendet man das Verfahren der Segmentierng an. Unter Segmentierng versteht man in der Bildverarbeitng einerseits die Trennng von Hintergrnd nd Strktr nd andererseits die Unterteilng eines Bildes in zsammenhängende Strktren. Es gibt pnktorientierte nd regionenorientierte Verfahren der Segmentierng. Pnktorientierte Verfahren betrachten den Intensitätwert eines isolierten Pixels. Bei diesem Verfahren erfaßt man die Intensitätswertverteilng eines Bildes in einem Histogramm nd verscht, in diesem einen Schwellenwert z finden. Dieses Verfahren ist in der Leica Confocal Software mit der «Thresholding» Fnktion (Schwellenwertfnktion) realisiert. Es kann ein nterer nd ein oberer Schwellenwert eingestellt werden. Für alle Pixel, deren Intensitätswert innerhalb des von den Schwellenwerten definierten Bereiches liegt, wird im Ergebnisbild der binäre Wert 1 eingetragen nd für alle anderen Pixel der binäre Wert 0. Das Ergebnis ist ein Binärbild mit der Information Strktr verss Hintergrnd. Die als Strktr kodierten Pixel werden alle mit dem maximalen Grawert 255 (bei 8 Bittiefe) dargestellt, die als Hintergrnd kodierten Pixel mit dem Grawert 0. Im Gegensatz zm pnktorientierten Verfahren, berücksichtigt das regionenorientierte Verfahren der Segmentierng den Sachverhalt, dass Strktren zsammenhängende Gebilde sind. Dies bedetet für die Bildverarbeitng, dass jedes Pixel immer zsammen mit seinen Nachbarpixeln nterscht werden mss. Entscheidend für die Identifikation eines Pixels als Strktr oder Hintergrnd ist dann nicht mehr die isolierte Betrachtng des Intensitätswertes eines Pixels, sondern der Intensitätswert eines Pixels im Kontext der Intensitätswerte seiner Nachbarpixel. Dieses Verfahren ist in der Leica Confocal Software mit den «Seeding» Fnktionen (Bereichswachstmsfnktionen) realisiert. Asgehend von einem Startpixel (ach «Saatpixel» genannt) wird die Relation der Intensitätswerte von Startpixel nd Nachbarpixel überprüft. Anhand eines Kriterims, zm Beispiel, dass der Intensitätswert eines Nachbarpixels nicht mehr als 75% vom Wert eines Saatpixels abweichen darf, wird dann entschieden, welche Pixel im binären Ergebnisbild zr Strktr (binärer Wert 1) nd welche zm Hintergrnd (binärer Wert 0) gerechnet werden. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 219 von 263

220 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 2ULJLQDOELOG %LQlUELOG Pnktorientiertes Verfahren, Thresholding %LQlUELOG Regionenorientiertes Verfahren, Seeding 1DYLJDWLRQ6HJPHQWDWLRQ?7KUHVKROGLQJ 3XQNWRULHQWLHUWHV6HJPHQWLHUHQPLWWHOV6FKZHOOHQZHUW Es kann ein nterer nd ein oberer Schwellenwert definiert werden. Der Intensitätswert jedes Pixels im Bild wird danach nterscht, ob er innerhalb oder aßerhalb dieses Schwellenwertbereiches liegt. Diese Methode der Segmentierng ist vor allem dann sinnvoll, wenn sich die Strktren im Bild nicht berühren nd detlich vom Hintergrnd abheben. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Legen Sie im Register Lower im Feld Channels getrennt für jeden Detektionskanal den nteren Schwellenwert fest, indem Sie einen Wert zwischen 0 nd 255 (bei 8 Bittiefe) eingeben oder den Schieberegler entsprechend positionieren. Intensitätswerte, die nterhalb dieses Schwellenwertes liegen, werden im binären Ergebnisbild af 0 gesetzt. Legen Sie im Register Upper im Feld Channels getrennt für jeden Detektionskanal den oberen Schwellenwert fest, indem Sie einen Wert zwischen 0 nd 255 (bei 8 Bittiefe) eingeben oder den Schieberegler entsprechend positionieren. Intensitätswerte, die oberhalb dieses Schwellenwertes liegen, werden im binären Ergebnisbild af 0 gesetzt. Klicken Sie im Feld Options af Lock Channels, wenn Sie denselben Schwellenwert für alle Detektionskanäle festlegen wollen. Klicken Sie af die Schaltfläche Sggest, wenn die Software einen geeigneten nteren Schwellenwert berechnen soll. Für die Berechnng des Schwellenwertes wird der Algorithms verwendet, der im Register Estimation asgewählt wrde (siehe nten). 5HJLVWHU(VWLPDWLRQ Entropy Maximisation: Berechnng der maximalen Entropie Grndlage dieses Algorithms ist die Prämisse, dass es einen Zsammenhang zwischen der Wahrscheinlichkeit eines Ereignisses nd seinem Informationsgehalt gibt. Demnach haben häfigere Ereignisse (oftmals Hintergrnd) einen geringeren Informationswert nd seltenere Ereignisse (oftmals Strktr) einen höheren. Die im Bild vorhandenen Iintensitätswerte werden in zwei Mengen nterteilt nd nach dem Intensitätswert nterscht, bei dem die Entropie, die Wahrscheinlichkeit seines Aftretens am größten ist. Der optimale Schwellenwert ist dann jener, bei dem die Smme der Entropien der beiden Mengen am größten ist, oder anders gesagt der Informationsgehalt am geringsten ist. Within Grop Variance Minimisation: Berechng des Minimalwertes der Grppenvarianz Grndlage dieses Algorithms ist die Prämisse, dass in einem Bild zwei Normalverteilngen von einerseits niedrigen nd andererseits hohen Intensitätswerten gefnden werden können, die der Strktr nd dem Hintergrnd entsprechen. Für jeden möglichen Schwellenwert werden die im Bild vorhandenen Intensitätswerte nterscht nd zwei Normalverteilngskrven berechnet. Der Schwellenwert wird dann zwischen diese beiden Krven gelegt. 1DYLJDWLRQ6HJPHQWDWLRQ?6HHGLQJ7KUHVKROG 5HJLRQHQRULHQWLHUWHV6HJPHQWLHUHQPLWWHOV6FKZHOOHQZHUW Der Bentzer kann einen nteren nd einen oberen Schwellenwert definieren. Asgehend von einem Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 220 von 263

221 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ aswählbaren Startpixel werden die Intensitätswerte aller Nachbarpixel danach nterscht, ob sie innerhalb oder aßerhalb dieses Schwellenwertbereiches liegen. Werden keine Nachbarpixel mehr gefnden, die innerhalb des Wertebereichs liegen, wird die Operation beendet. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Legen Sie im Feld Lower Threshold den nteren Schwellenwert nd im Feld Upper Threshold den oberen Schwellenwert fest, indem Sie einen Wert zwischen 0 nd 255 (bei 8 Bittiefe) eingeben oder den Schieberegler entsprechend positionieren. Intensitätswerte, die nterhalb bzw. oberhalb dieses Schwellenwertbereiches liegen, werden im binären Ergebnisbild af 0 gesetzt. Wählen Sie im Feld Position im Listenfeld Channels den Detektionskanal as, dessen Bilddaten segmentiert werden sollen. Ist die Option All asgewählt, wird die Segmentierng getrennt für jeden Detektionskanal asgeführt. Ist der Bilddatensatz eine Zeitserie oder eine Wellenlängenserie, wählen Sie im Listenfeld rechts daneben, noch die vierte Dimension, das heißt einen bestimmten Zeitpnkt bzw. eine bestimmte Wellenlänge as. Positionieren Sie das Fadenkrez im Bild zr Definition des Startpixels. Z diesem Zweck geben Sie im Feld Position je einen Wert für die x-, y- nd z-koordinate ein. Oder ziehen Sie das Fadenkrez im Bild mit gedrückter linker Mastaste an die gewünschte Position. 1DYLJDWLRQ6HJPHQWDWLRQ?6HHGLQJ6LQJOH&KDQQHO 5HJLRQHQRULHQWLHUWHV6HJPHQWLHUHQLQHLQHP.DQDO Der Bentzer kann eine zlässige Abweichng (in Prozent) vom Intensitätswert eines aswählbaren Startpixels definieren. Asgehend von diesem Startpixel werden die Intensitätswerte aller Nachbarpixel danach nterscht, ob sie mehr als zm Beispiel 75% vom Wert des Startpixels abweichen. Werden keine Nachbarpixel mehr gefnden, die innerhalb des zlässigen Wertebereichs liegen, wird die Operation beendet. Diese Operation wird für jeden asgewählten Detektionskanal getrennt asgeführt. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Legen Sie im Feld Threshold die zlässige Abweichng in Prozent fest, indem Sie einen Wert eingeben oder den Schieberegler entsprechend positionieren. Intensitätswerte, die stärker abweichen als der eingestellte Prozentbereich, werden im binären Ergebnisbild af 0 gesetzt. Wählen Sie im Feld Position im Listenfeld Channels den Detektionskanal as, dessen Bilddaten segmentiert werden sollen. Ist die Option All asgewählt, wird die Segmentierng getrennt für jeden Detektionskanal asgeführt. Ist der Bilddatensatz eine Zeitserie oder eine Wellenlängenserie, wählen Sie im Listenfeld rechts daneben, noch die vierte Dimension, das heißt einen bestimmten Zeitpnkt bzw. eine bestimmte Wellenlänge as. Positionieren Sie das Fadenkrez im Bild zr Definition des Startpixels. Z diesem Zweck geben Sie im Feld Position je einen Wert für die x-, y- nd z-koordinate ein. Oder ziehen Sie das Fadenkrez im Bild mit gedrückter linker Mastaste an die gewünschte Position. 1DYLJDWLRQ6HJPHQWDWLRQ?6HHGLQJ&URVV&KDQQHO 5HJLRQHQRULHQWLHUWHV6HJPHQWLHUHQ EHUDOOH.DQlOH Der Bentzer kann eine zlässige Abweichng (in Prozent) vom Intensitätswert eines aswählbaren Startpixels definieren. Asgehend von diesem Startpixel werden die Intensitätswerte aller Nachbarpixel danach nterscht, ob sie mehr als zm Beispiel 75% vom Wert des Startpixels abweichen. Werden keine Nachbarpixel mehr gefnden, die innerhalb des zlässigen Wertebereichs liegen, wird die Operation beendet. Im Gegensatz zr vorhergehenden Fnktion «Seeding (Single Channel)» wird hier die Operation gleichzeitig über alle Detektionskanäle asgeführt. Wählen Sie im Ansichtsfenster Experiment Overview den z bearbeitenden Bilddatensatz as, indem Sie die Datei doppelklicken. Legen Sie im Feld Threshold die zlässige Abweichng in Prozent fest, indem Sie einen Wert eingeben oder den Schieberegler entsprechend positionieren. Intensitätswerte, die stärker Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 221 von 263

222 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ abweichen als der eingestellte Prozentbereich, werden im binären Ergebnisbild af 0 gesetzt. Im Feld Position im Listenfeld Channels ist die Option All fest eingestellt. Ist der Bilddatensatz eine Zeitserie oder eine Wellenlängenserie, wählen Sie im Listenfeld rechts daneben, noch die vierte Dimension, das heißt einen bestimmten Zeitpnkt bzw. eine bestimmte Wellenlänge as. Positionieren Sie das Fadenkrez im Bild zr Definition des Startpixels. Z diesem Zweck geben Sie im Feld Position je einen Wert für die x-, y- nd z-koordinate ein. Oder ziehen Sie das Fadenkrez im Bild mit gedrückter linker Mastaste an die gewünschte Position. ÃÃ 0HVVXQG$QDO\VHIXQNWLRQHQ +LVWRJUDPPEHUHFKQHQ )XQNWLRQ Mit der Fnktion Histogram wird die Häfigkeit einer Messgrösse gemessen, in einer Krve dargestellt nd zsätzlich verschiedene statistische Werte berechnet. Das Histogramm wird as dem im Ansichtsfenster Viewer asgewählten Datensatz gemessen. Bei diesem Datensatz kann es sich m eine rämliche Serie, eine Zeitserie oder eine Wellenlängenserie handeln. Die statistischen Werte werden in Abhängigkeit der Grösse der dritten Dimension - Höhe (z) für rämliche Serien, Zeit (t) für Zeitserien, Wellenlänge (λ) für Wellenlängenserien - berechnet. Klicken Sie af die Taste Histogram. Es wird ein Ansichtsfenster geöffnet, in dem die Messkrve für jeden Detektionskanal nd die statistischen Werte angezeigt werden. 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ )RUPHO # Pixel Gesamtzahl der Pixel, die in die Berechnng des Histogramms eingehen. Entspricht dem eingestellten Scanformat. Mean Der arithmetische Mittelwert Maximm Maximalwert Max ( I) Minimm Minimalwert Min ( I) Variance Varianz Average Deviation Standard Deviation Mean Energy Mittlere Abweichng Standardabweichng Mittlere Bildenergie Root Mean Sqare (RMS) Skewness Qadratischer Mittelwert Schiefe der Verteilng Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 222 von 263

223 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Einige der Parameter sind in wissenschaftlicher Exponentialnotation angegeben, z.b. Pixel = 3.28e+005 = (entspricht dem Scanformat 640 x 512). 0LWGHP0D[LPDOZHUWXQG0LQLPDOZHUWGHU,QWHQVLWlWODVVHQVLFKGHU*DLQ:HUWXQGGHU 2IIVHW:HUWGLH'HWHNWRUHQRSWLPDOHLQVWHOOHQ 0HVVHQHLQHV3URILOVLQQHUKDOEHLQHV$XVZHUWXQJVEHUHLFKV52, )XQNWLRQ Mit der Fnktion Profile (z) wird eine Messgrösse innerhalb eines Aswertngsbereichs gemessen, in einer Krve dargestellt nd verschiedene statistische Werte berechnet. Das Profil wird as dem im Ansichtsfenster Viewer asgewählten Datensatz gemessen. Bei diesem Datensatz kann es sich m eine rämliche Serie, eine Zeitserie oder eine Wellenlängenserie handeln. Die statistischen Werte werden in Abhängigkeit der Grösse der dritten Dimension - Höhe (z) für rämliche Serien, Zeit (t) für Zeitserien, Wellenlänge (λ) für Wellenlängenserien - berechnet. Klicken Sie af die Taste Profile (z) nd zeichnen Sie einen Aswertngsbereich (ROI) im Bild ein. Die Tasten, mit denen Sie einen Aswertngsbereich definieren, werden zsammen mit der Profile (z) Taste aktiviert. & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Ellipse definieren (Seite 228 ff.) & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Polygon definieren & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Rechteck definieren & siehe Aswertngsbereich (ROI) atomatisch definieren & siehe Aswertngsbereich (ROI) marikieren nd verschieben & siehe Aswertngsbereiche (ROI) löschen Es wird atomatisch ein Ansichtsfenster geöffnet, in dem die Messkrve für jeden Detektionskanal nd die statistischen Werte angezeigt werden. 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ )RUPHO # Pixel(ROI) Anzahl der Pixel innerhalb des asgewählten Aswertngsbereichs Area Flächeninhalt des Aswertngsbereichs Length Mean Amplitde Höhe des Bildstapels (Rämliche Serie) Afnahmezeit (Zeitserie) Bandbreite (Wellenlängenserie) Arithmetisches Mittel Maximm Amplitde Maximalwert Max ( I) Position Maximm Position des Maximalwertes Arg Max Ι (z), (t), (λ) Amplitde Minimm Amplitde Minimalwert Min ( I) Position Minimm Amplitde Position des Minimalwertes Arg Min Ι (z), (t), (λ) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 223 von 263

224 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Average Deviation Mittlere Abweichng Standard Deviation Standardabweichng Variance Varianz 'LHIROJHQGHQ0HVVZHUWHHUVFKHLQHQQXUZHQQLP'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQVGLH )XQNWLRQ=ZHLSXQNWPHVVXQJDXVJHZlKOWLVW Wählen Sie Menü View, Option Experiment Overview, Bildsymbol Charts. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Charts (Seite 158) Im Feld Measrement können Sie die Zweipnktmessng ein- oder asschalten, indem Sie 2 Point oder Off wählen. l(µm); I(s); Intensität gemessen an Messpnkt 1 (z, t, λ) I(z 1 ); I(t 1 ); I(λ 1 ) I(nm) l(z); I(t); I(λ) Intensität gemessen an Messpnkt 2 (z, t, λ) I(z2); I(t2); I(λ2) di, dz Differenz der Werte zwischen Messpnkt 1 nd 2 I(z 1 ) - I(z 2 ) ; I(t 1 ) - I(t 2 ), I(λ 1 ) - I(λ 2 ) d(z), (t), (λ) Höhe (z), Afnahmezeit (t), Bandbreite (λ) zwischen den Messpnkten 1 nd 2 z 1 - z 2 ; t 1 - t 2, λ 1 - λ 2 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Diese Fnktion kann zr Ermittlng der Extremwerte der Intensität innerhalb eines Bildstapels verwendet werden. Diese wiederm ermöglichen die optimierte Einstellng der Detektoren. Desweiteren kann mit dieser Fnktion das Emissionsmaximm einer Wellenlängenserie ermittelt werden. Drch Anpassng der Breite nd Position der Blenden vor den Detektoren, kann mehr Emissionslicht as der Probe afgenommen werden als mit konventionellen optischen Filtern. Bei Zeitserien kann mit dieser Fnktion der Zeitpnkt der höchsten Floreszenzaktivität ermittelt werden. ÃÃ 'LHVH4XDQWLIL]LHUXQJVIXQNWLRQLVWQXURIIOLQHGKQXUI UEHUHLWVDXIJHQRPPHQH 'DWHQVlW]HYHUI JEDU 0HVVHQHLQHV3URILOVHQWODQJHLQHU6WUHFNH )XQNWLRQ Mit der Fnktion Profile wird eine Messgrösse entlang einer Strecke gemessen, in einer Krve dargestellt nd verschiedene statistische Werte berechnet. Das Profil wird as dem im Ansichtsfenster Viewer asgewählten Datensatz gemessen. Bei diesem Datensatz kann es sich m eine rämliche Serie, eine Zeitserie oder eine Wellenlängenserie handeln. Die statistischen Werte werden in Abhängigkeit der Grösse der dritten Dimension - Höhe (z) für rämliche Serien, Zeit (t) für Zeitserien, Wellenlänge (λ) für Wellenlängenserien - berechnet. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 224 von 263

225 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Klicken Sie af die Taste Profile. Die Messstrecke wird im Ansichtsfenster Viewer als weiße Linie im Bild eingeblendet. Die Länge nd Position der Messstrecke können Sie beliebig ändern, indem Sie die Strecke anklicken nd mit gedrückter linker Mastaste die Anfasspnkte an die gewünschte Position ziehen. Es wird atomatisch ein Ansichtsfenster geöffnet, in dem die Messkrve für jeden Detektionskanal nd die statistischen Werte angezeigt werden. 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ )RUPHO Length Länge der Meßstrecke Mean Amplitde Maximm Amplitde Minimm Amplitde Average Deviation Standard Deviation Variance Arithmetisches Mittel der Messgröße Maximalwert der Messgröße Max ( I) Minimalwert der Messgröße Min ( I) Mittlere statistische Abweichng der Werte vom Mittelwert der Messgröße Standardabweichng der Werte der Messgröße Varianz der Messgröße 'LHIROJHQGHQ0HVVZHUWHHUVFKHLQHQQXUZHQQLP'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQVGLH )XQNWLRQ=ZHLSXQNWPHVVXQJDXVJHZlKOWLVW Wählen Sie Menü View, Option Experiment Overview, Bildsymbol Charts. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Charts (Seite 158) Im Feld Measrement können Sie die Zweipnktmessng ein- oder asschalten, indem Sie 2 Point oder Off wählen. 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ )RUPHO l(µm); I(s); An Messpnkt 1 gemessener Wert (z, t, λ) I(z 1 ); I(t 1 ); I(λ 1 ) I(nm) l(µm); I(s); An Messpnkt 2 gemessener Wert (z, t, λ) I(nm) I(z2); I(t2); I(λ2) di, dz Differenz der Werte zwischen Messpnkt 1 nd 2 I(z 1 ) - I(z 2 ) ; I(t 1 ) - I(t 2 ), I(λ 1 ) - I(λ 2 ) d(z), (t), (λ) Höhe (z), Afnahmezeit (t), Bandbreite (λ) zwischen den Messpnkten 1 nd 2 z 1 - z 2 ; t 1 - t 2, λ 1 - λ 2 'LHVH4XDQWLIL]LHUXQJVIXQNWLRQLVWQXURIIOLQHGKQXUI UEHUHLWVDXIJHQRPPHQH 'DWHQVlW]HYHUI JEDU ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 225 von 263

226 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 0HVVHQYRQ2EHUIOlFKHQXQG9ROXPHQ )XQNWLRQ Mit der Fnktion Materials werden Oberflächen nd Volmina eines dreidimenionalen, rämlichen Datensatzes berechnet. Wenn Sie af die Taste Materials klicken, wird atomatisch ein Ansichtsfenster geöffnet, in dem eine Messkrve nd die Größe des akkmmlierten Volmens in Abhängigkeit von der z-position angezeigt werden. Akmmliertes Volmen bedetet, dass für jede z-position der Wert des darnterliegenden Volmens des Datensatzes ermittelt wird. Vorassetzng für die Berechnng der Oberflächen nd Volmina ist ein Topographiebild. Die Taste Materials ist deshalb erst aktiv, wenn zvor mit der Taste Topography ein Topographiebild des Datensatzes erzegt wrde. Es kann immer nr ein Detektionskanal qantifiziert werden. & siehe Topographiebild erzegen (Seite 182) 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ Scanned Dieser Wert stellt die horizontale Projektion der Oberfläche eines xy- Schnittes dar. Area A Srface Dieser Wert stellt die tatsächliche Oberfläche eines xy-schnittes dar. Die tatsächliche Area A' Oberfläche ist im Verhältnis zr horizontalen Projektion immer mindestens gleich groß, im allgemeinen sogar größer. Ratio A'/A Dieser Wert stellt das Verhältnis von Oberfläche zr Grndfläche dar. Je größer er ist, desto mehr ist die zweidimensionale Oberfläche in den dreidimensionalen Ram eingebettet. 'LHIROJHQGHQ0HVVZHUWHHUVFKHLQHQQXUZHQQLP'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQVGLH )XQNWLRQ=ZHLSXQNWPHVVXQJDXVJHZlKOWLVW Wählen Sie Menü View, Option Experiment Overview, Bildsymbol Charts. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Charts (Seite 158) Im Feld Measrement können Sie die Zweipnktmessng ein- oder asschalten, indem Sie 2 Point oder Off wählen. V(z<=oberer Positionswert) V(z<=nterer Positionswert) dv dz Dieser Wert stellt das Volmen dar, das nterhalb des oberen Positionswertes des Messschiebers liegt (rechter Eckpnkt des Schiebers) Dieser Wert stellt das Volmen dar, das nterhalb des nteren Positionswertes des Messschiebers liegt (rechter Eckpnkt des Schiebers) Volmen zwischen den beiden Positionswerten des Schiebers Abstand zwischen den beiden Positionswerten des Schiebers 'LHVH4XDQWLIL]LHUXQJVIXQNWLRQLVWQXURIIOLQHGKQXUI UEHUHLWVDXIJHQRPPHQH 'DWHQVlW]HYHUI JEDU ÃÃ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 226 von 263

227 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 4XDQWLIL]LHUXQJVJUDSKHQLQGLH3UlVHQWDWLRQVVHLWHNRSLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Fnktion Snap Qantification Data werden die von Qantifizierngsfnktionen berechneten Daten in eine Präsentationsseite kopiert. Die berechneten Werte der folgenden Qantifizierngsfnktionen, die ach einen Aswertngsgraphen anzeigen, können in eine Präsentationsseite kopiert werden: & siehe Präsentationsseite anlagen (Seite 234) & siehe Messen eines Profils entlang einer Strecke (Seite 224) & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Messen von Oberflächen nd Volmen (Seite 226) & siehe Rahigkeitsmessngen entlang einer Strecke (Seite 243) ÃÃ 4XDQWLIL]LHUXQJVJUDSKHQGUXFNHQ )XQNWLRQ Mit der Fnktion Print Qantification Data werden die von Qantifizierngsfnktionen berechneten Daten an den Standarddrcker gesendet. Die berechneten Werte der folgenden Qantifizierngsfnktionen, die ach einen Aswertngsgraphen anzeigen, können gedrckt werden: & siehe Messen eines Profils entlang einer Strecke (Seite 224) & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Messen von Oberflächen nd Volmen (Seite 226) & siehe Rahigkeitsmessngen entlang einer Strecke (Seite 243) Diese Fnktion steht ach im Kontextmenü innerhalb der Ansichtsfenster von Qantifizierngsfnktionen zr Verfügng: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 227 von 263

228 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Halten Sie den Maszeiger über das von einer Qantifizierngsfnktion geöffnete Ansichtsfenster. Klicken Sie die rechte Mastaste nd wählen Sie den Menüpnkt Print 4XDQWLIL]LHUXQJVGDWHQH[SRUWLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Fnktion Export Qantification Data können Sie die von Qantifizierngsfnktionen berechneten Daten als ASCII-Daten exportieren. Damit können die Daten zm Beispiel in Excel eingelesen nd bearbeitet werden. Die berechneten Werte der folgenden Qantifizierngsfnktionen, die ach einen Aswertngsgraphen anzeigen, können exportiert werden: & siehe Messen eines Profils entlang einer Strecke (Seite 224) & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Messen von Oberflächen nd Volmen (Seite 226) & siehe Rahigkeitsmessngen entlang einer Strecke (Seite 243) Diese Fnktion steht ach im Kontextmenü innerhalb der Ansichtsfenster von Qantifizierngsfnktionen zr Verfügng: Halten Sie den Maszeiger über das von einer Qantifizierngsfnktion geöffnete Ansichtsfenster. Klicken Sie die rechte Mastaste nd wählen Sie den Menüpnkt Export $XVZHUWXQJVEHUHLFK52,DOV(OOLSVHGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Ellipse kann ein elliptischer Aswertngsbereich (Region of Interest oder ROI) im Bild definiert werden: Klicken Sie af die Taste Ellipse. Drücken Sie die linke Mastaste über der Position im Bild, wo sich ein Eckpnkt des Aswertngsbereichs befinden soll. Ziehen sie bei gedrückter linker Mastaste den Crsor diametral in die gegenüberliegende Ecke, m den zweiten Eckpnkt des Aswertngsbereichs z definieren. & siehe Aswertngsbereich (ROI) markieren nd verschieben (Seite 231) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 228 von 263

229 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ & siehe Aswertngsbereich (ROI) verschieben nd drehen (Seite 232) & siehe Aswertngsbereiche (ROIs) löschen (Seite 232) 5DQGEHGLQJXQJHQ Die Definition eines Aswertngsbereichs im Bild ist für Qantifizierngsfnktionen erforderlich. Die Taste Ellipse ist deshalb erst aktiv, wenn Sie zvor mit einer der folgenden Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben: & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) & siehe Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 244) $XVZHUWXQJVEHUHLFK52,DOV3RO\JRQGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Polygon kann ein frei bestimmbarer, polygonförmiger Aswertngsbereich (Region of Interest oder ROI) im Bild definiert werden: Klicken Sie af die Taste Polygon. Drücken Sie die linke Mastaste über der Position im Bild, wo sich ein Eckpnkt des Aswertngsbereichs befinden soll. Um weitere Eckpnkte des Polgons z definieren, lassen Sie die Mastaste los, fahren Sie den Crsor in die nächste Ecke des Polygons nd klicken Sie ernet die linke Mastaste. Wiederholen Sie dies für jede gewünschte Ecke des Polygons. Wenn Sie das Polygon frei Hand zeichnen wollen, halten Sie die linke Mastaste gedrückt, während Sie den Aswertngsbereich in das Bild zeichnen. Sie können das Polygon drch einen Doppelklick schliessen. & siehe Aswertngsbereich (ROI) markieren nd verschieben (Seite 231) & siehe Aswertngsbereich (ROI) verschieben nd drehen (Seite 232) & siehe Aswertngsbereiche (ROIs) löschen (Seite 232) 5DQGEHGLQJXQJHQ Die Definition eines Aswertngsbereichs im Bild ist für Qantifizierngsfnktionen erforderlich. Die Taste Polygon ist deshalb erst aktiv, wenn Sie zvor mit einer der folgenden Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben: & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 229 von 263

230 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ & siehe Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 244) $XVZHUWXQJVEHUHLFK52,DOV5HFKWHFNGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Rectangle kann ein rechteckiger Aswertngsbereich (Region of Interest oder ROI) im Bild definiert werden: Klicken Sie af die Taste Rectangle. Drücken Sie die linke Mastaste über der Position im Bild, wo sich ein Eckpnkt des Aswertngsbereichs befinden soll. Ziehen Sie bei gedrückter linker Mastaste den Crsor diametral in die gegenüberliegende Ecke, m den zweiten Eckpnkt des Aswertngsbereichs z definieren. & siehe Aswertngsbereich (ROI) markieren nd verschieben (Seite 231) & siehe Aswertngsbereich (ROI) verschieben nd drehen (Seite 232) & siehe Aswertngsbereiche (ROIs) löschen (Seite 232) 5DQGEHGLQJXQJHQ Die Definition eines Aswertngsbereichs im Bild ist für Qantifizierngsfnktionen erforderlich. Die Taste Rectangle ist deshalb erst aktiv, wenn Sie zvor mit einer der folgenden Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben: & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) & siehe Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 244) $XVZHUWXQJVEHUHLFK52,DXWRPDWLVFKGHILQLHUHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Wizard können Sie eine beliebige Strktr im Bild als einen Aswertngsbereich (Region of Interest oder ROI) atomatisch vom Rechner im Bild definieren lassen. Je nachdem, welche der Tasten Sie noch angeklickt haben, wird ein elliptischer, rechteckiger oder polygonförmiger Aswertngsbereich m die Strktr gelegt. Klicken Sie af die Taste Ellipse, Rectangle oder Polygon nd dann af die Taste Wizard. Doppelklicken Sie mit der linken Mastaste af die Strktr im Bild, die Sie als Aswertngsbereich markieren wollen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 230 von 263

231 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Die Strktr wird atomatisch als elliptischer, rechteckiger oder polygonförmiger Aswertngsbereich markiert. & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Ellipse definieren (Seite 228 ff.) & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Polygon definieren & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Rechteck definieren & siehe Aswertngsbereiche (ROIs) löschen 5DQGEHGLQJXQJHQ Die Definition eines Aswertngsbereichs im Bild ist für Qantifizierngsfnktionen erforderlich. Die Taste Wizard ist deshalb erst aktiv, wenn Sie zvor mit einer der folgenden Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben: & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) & siehe Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 244) $XVZHUWXQJVEHUHLFK52,PDUNLHUHQXQGYHUVFKLHEHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Select ROI können sie einen Aswertngsbereich (Region of Interest oder ROI) im Bild markieren nd verschieben: Klicken Sie af die Taste Select ROI nd dann af den Aswertngsbereich, den Sie verschieben wollen. Bewegen Sie den Maszeiger in das Innere des Aswertngsbereichs. Sobald sich der Maszeiger z einem überkrezten Doppelpfeil verändert, drücken Sie die linke Mastaste nd halten diese gedrückt. Verschieben Sie den Aswertngsbereich bei gedrückter linker Mastaste. Sie können die Grösse eines einmal gezeichneten Aswertngsbereiches wieder ändern: Halten Sie den Maszeiger über eine Seitenkante des markierten Aswertebereichs, bis ein Doppelpfeil sichtbar wird. Drücken Sie die linke Mastaste m den Aswertngsbereich in eine Richtng z ziehen. Wenn Sie den Maszeiger exakt in einen Eckpnkt des markierten Aswertngsbereichs stellen, können Sie die Asdehnng in zwei Richtngen gleichzeitig verändern. & siehe Aswertngsbereich (ROI) verschieben nd drehen (Seite 232) & siehe Aswertngsbereiche (ROI's) löschen (Seite 232) 5DQGEHGLQJXQJHQ Die Definition eines Aswertngsbereichs im Bild ist für Qantifizierngsfnktionen erforderlich. Die Taste Select ROI ist deshalb erst aktiv, wenn Sie zvor mit einer der folgenden Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben: Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 231 von 263

232 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) & siehe Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 244) $XVZHUWXQJVEHUHLFK52,YHUVFKLHEHQXQGGUHKHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Rotate ROI können sie einen Aswertngsbereich (Region of Interest oder ROI) im Bild verschieben nd drehen: Klicken Sie af die Taste Rotate ROI nd dann af den Aswertngsbereich, den Sie drehen wollen. Stellen Sie den Maszeiger exakt in einen Eckpnkt des markierten Aswertngsbereichs. Sobald sich der Maszeiger z einem Doppelpfeil verändert, drücken Sie die linke Mastaste nd halten diese gedrückt. Drehen Sie den Aswertngsbereich bei gedrückter linker Mastaste. Der Aswertngsbereich wird m seinen Mittelpnkt gedreht. Sie können die Grösse eines einmal gezeichneten Aswertngsbereiches wieder ändern: Halten Sie den Maszeiger über eine Seitenkante des markierten Aswertebereichs, bis ein Doppelpfeil sichtbar wird. Drücken Sie die linke Mastaste m den Aswertngsbereich in eine Richtng z ziehen. & siehe Aswertngsbereiche (ROIs) löschen (Seite 232) 5DQGEHGLQJXQJHQ Die Definition eines Aswertngsbereichs im Bild ist für Qantifizierngsfnktionen erforderlich. Die Taste Rotate ROI ist deshalb erst aktiv, wenn Sie zvor mit einer der folgenden Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben: & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) & siehe Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 244) $XVZHUWXQJVEHUHLFKH52,VO VFKHQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 232 von 263

233 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Clear können alle definierten Aswertngsbereiche (ROI's) af einmal gelöscht werden. Löschen Sie einen einzelnen Aswertngsbereich, indem Sie die Taste Select ROI anklicken, dann den Aswertngsbereich im Bild nd mit der af der Tastatr befindlichen Löschtaste entfernen. 5DQGEHGLQJXQJHQ Die Definition eines Aswertngsbereichs im Bild ist für Qantifizierngsfnktionen erforderlich. Die Taste Clear ist deshalb erst aktiv, wenn Sie zvor mit einer der folgenden Tasten eine Qantifizierngsfnktion aktiviert haben: & siehe Messen eines Profils innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 223) & siehe Histogramm berechnen (Seite 222) & siehe Rahigkeitsmessngen innerhalb eines Aswertngsbereichs (ROI) (Seite 244) Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 233 von 263

234 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'DWHQGRNXPHQWDWLRQ 3UlVHQWDWLRQVVHLWHDQOHJHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Annotation wird ein Fenster geöffnet, in dem Sie afgenommene Bilder z Präsentationszwecken afbereiten können. Haben Sie die Präsentationsseite geöffnet, werden die zsätzlichen Tasten Snap, Line, Rectangle nd Text aktiv. Mit diesen Tasten können Sie das im Ansichtsfenster Viewer geladene Bild in die Präsentationsseite kopieren, bestimmte Bereiche im kopierten Bild mit Linien nd Rechtecken hervorheben nd in einem Textfeld eine Bildbeschriftng einfügen. & siehe Linie zeichnen (Seite 235) & siehe Rechteck zeichnen (Seite 235) & siehe Textfeld anlegen (Seite 236) Wenn Sie den Maszeiger über die Präsentationsseite halten nd dann af die rechte Mastaste klicken, erscheint ein Kontextmenü, in dem Ihnen folgende Befehle zr Verfügng stehen: %HIHKO Line Rectangle Text Zoom Grid )XQNWLRQ Eine Linie im voreingestellten Format wird in die Präsentationsseite eingefügt. Ein Rechteck im voreingestellten Format wird in die Präsentationsseite eingefügt. Ein Textfeld im voreingestellten Schrifttyp wird in die Präsentationsseite eingefügt. Sie können zwischen vier Größendarstellngen der Präsentationsseite aswählen. Ein nicht drckbares Gitterliniennetz wird in der Präsentationsseite eingeblendet. Die Befehle Line, Rectangle nd Text sind nicht nr im Kontextmenü vorhanden, sondern können ach mit den entsprechenden separaten Tasten aktiviert werden. Präsentationsseiten erhalten beim Abspeichern die Dateiendng *.ano. %LOGLQGLH3UlVHQWDWLRQVVHLWHNRSLHUHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Snap klicken, wird das im Ansichtsfenster Viewer geladene Bild in die Präsentationsseite kopiert. Wenn Sie das kopierte Bild markieren nd dann af die rechte Mastaste klicken, erscheint ein Kontextmenü, in dem Ihnen folgende Befehle zr Verfügng stehen: %HIHKO Original size Fit to page Bring to front Send to back Delete )XQNWLRQ Das Bild wird in Originalgröße angezeigt. Das Bild wird af die Größe der Präsentationsseite vergrößert. Das Bild wird in den Vordergrnd gerückt. Das Bild wird in den Hintergrnd gerückt. Das Bild wird gelöscht. Die Größe des Bildes können Sie beliebig verändern, indem Sie mit dem Maszeiger an einem Anfasspnkt des Bildes ziehen. Um das Bild z verschieben, ohne seine Größe z verändern, markieren Sie das Bild nd verschieben Sie es, während Sie die linke Mastaste gedrückt halten. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 234 von 263

235 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'LH7DVWH6QDSNDQQQXUEHWlWLJWZHUGHQZHQQ]XYRUHLQH3UlVHQWDWLRQVVHLWHPLWGHU 7DVWH$QQRWDWLRQJH IIQHWXQGGDQQGDV$QVLFKWVIHQVWHU9LHZHUDQJHNOLFNWZXUGH /LQLHLQGLH3UlVHQWDWLRQVVHLWH]HLFKQHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Line zeichnen Sie eine Linie in die Präsentationsseite. Klicken Sie in der Präsentationsseite af die Stelle, an der die Linie beginnen soll. Halten Sie die linke Mastaste gedrückt nd ziehen Sie den Maszeiger über die Seite, bis z dem Pnkt, an dem die Linie enden soll. Wenn Sie die Linie markieren nd dann af die rechte Mastaste klicken, erscheint ein Kontextmenü, in dem Ihnen folgende Befehle zr Verfügng stehen: %HIHKO Style Color Bring to front Send to back Delete )XQNWLRQ In einem Dialogfenster können Typ, Stärke nd Länge der Linie eingestellt werden. In einem Dialogfenster kann eine beliebige Farbe für die Linie asgewählt werden. Die Linie wird in den Vordergrnd gerückt. Die Linie wird in den Hintergrnd gerückt. Die Linie wird gelöscht. Die Länge der Linie können Sie verändern, indem Sie mit dem Maszeiger an einem der Anfasspnkte der Linie ziehen. Um die Linie z verschieben, ohne ihre Größe z verändern, klicken Sie af den mittleren Anfasspnkt nd verschieben Sie die Linie, während Sie die linke Mastaste gedrückt halten. 'LH7DVWH/LQHNDQQQXUEHWlWLJWZHUGHQZHQQ]XYRUHLQH3UlVHQWDWLRQVVHLWHPLWGHU 7DVWH$QQRWDWLRQJH IIQHWZXUGH 5HFKWHFNLQGLH3UlVHQWDWLRQVVHLWH]HLFKQHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Rectangle zeichnen Sie ein Rechteck in die Präsentationsseite. Klicken Sie in der Präsentationsseite af die Stelle, an der sich eine Ecke des Rechtecks befinden soll. Halten Sie die linke Mastaste gedrückt nd ziehen Sie den Maszeiger über die Seite, m die Größe des Rechtecks z bestimmen. Wenn Sie das Rechteck markieren nd dann af die rechte Mastaste klicken, erscheint ein Kontextmenü, in dem Ihnen folgende Befehle zr Verfügng stehen: %HIHKO Style Color )XQNWLRQ In einem Dialogfenster können Typ nd Stärke der Linie sowie weitere Optionen eingestellt werden. In einem Dialogfenster kann eine beliebige Farbe für das Rechteck asgewählt Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 235 von 263

236 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Bring to front Sent to back Delete werden. Das Rechteck wird in den Vordergrnd gerückt. Das Rechteck wird in den Hintergrnd gerückt. Das Rechteck wird gelöscht. Die Größe des Rechtecks können Sie verändern, indem Sie mit dem Maszeiger an einem der Anfasspnkte des Rechtecks ziehen. Um das Rechteck z verschieben, ohne seine Größe z verändern, klicken Sie in die Mitte des Rechtecks nd verschieben Sie es, während Sie die linke Mastaste gedrückt halten. 'LH7DVWH5HFWDQJOHNDQQQXUEHWlWLJWZHUGHQZHQQ]XYRUHLQH3UlVHQWDWLRQVVHLWHPLW GHU7DVWH$QQRWDWLRQJH IIQHWZXUGH 7H[WIHOGLQGLH3UlVHQWDWLRQVVHLWHHLQI JHQ )XQNWLRQ Mit der Taste Text fügen Sie ein Textfeld in die Präsentationsseite ein. Klicken Sie in der Präsentationsseite af die Stelle, wo sich das Textfeld befinden soll. Halten Sie die linke Mastaste gedrückt nd ziehen Sie den Maszeiger über die Seite, m die Größe des Textfelds z bestimmen. Wenn Sie das Textfeld markieren nd dann af die rechte Mastaste klicken, erscheint ein Kontextmenü, in dem Ihnen folgende Befehle zr Verfügng stehen: %HIHKO Font Transparent Bring to front Send to back Delete )XQNWLRQ In einem Dialogfenster können verschiedene Schrifttypen nd weitere Formatierngen asgewählt werden. Der Hintergrnd scheint drch das Textfeld drch. Der Text wird in den Vordergrnd gerückt. Der Text wird in den Hintergrnd gerückt. Der Text wird gelöscht. Die Größe des Textfelds können Sie verändern, indem Sie mit dem Maszeiger an einem der Anfasspnkte des Textfelds ziehen. Um das Textfeld z verschieben, ohne seine Größe z verändern, klicken Sie in die Mitte des Textfelds nd verschieben Sie es, während Sie die linke Mastaste gedrückt halten. 'LH7DVWH7H[WNDQQQXUEHWlWLJWZHUGHQZHQQ]XYRUHLQH3UlVHQWDWLRQVVHLWHPLWGHU 7DVWH$QQRWDWLRQJH IIQHWZXUGH 'UXFNHQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 236 von 263

237 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ )XQNWLRQ Sie können den Drckbefehl entweder mit der Taste Print oder über das Dialogfenster Printer Selection aslösen. Um dieses Dialogfenster z öffnen, wählen Sie im Menü File die Option Print. Gedrckt werden kann das im Ansichtsfenster Viewer geladene Bild oder eine Präsentationsseite. Wenn Sie mit der Taste Print den Drckbefehl aslösen, wird das im Ansichtsfenster geladene Bild oder die Präsentationsseite mit dem voreingestellten Drcker nd in der voreingestellten Seitendarstellng gedrckt. Diese Standardeinstellngen können Sie im Dialogfenster Printer Selection nach ihren Wünschen verändern. Z diesem Zweck können Sie folgende Schaltflächen in diesem Dialogfenster bedienen: 6FKDOWIOlFKH Printer setp Print Backgrond color Center on page Fit to page Aspect ratio )XQNWLRQ Öffnet ein Dialogfenster, in dem man den Drcker nd Drckereinstellngen ändern kann. Das Bild oder die Präsentationsseite wird asgedrckt. Öffnet ein Dialogfenster, in dem man eine beliebige Hintergrndfarbe für die Seite aswählen kann. Das Bild wird in die Mitte der Seite plaziert. Die Bildgröße wird af die Größe des bedrckbaren Bereichs asgerichtet. Das Seitenverhältnis des Bildes bleibt bei Änderngen von Höhe nd Breite erhalten. Im Feld Image können Sie die Höhe (Size Y) nd Breite (Size X) des Bildes verändern nd einen Seitenrand nach oben (Offset Y) nd einen Seitenrand nach links (Offset X) definieren. Bildgröße nd Seitenränder können nicht verändert werden, wenn die Schaltfläche Fit to page angeklickt ist. Haben Sie die Schaltfläche Center on Page angeklickt, können nr die Seitenränder nicht verändert werden. Mit der im Feld Print Preview eingeblendeten Vorscha der Drckseite können Sie das Ergebnis der vorgenommenen Änderngen überprüfen. Im Feld Page wird Höhe nd Breite des bedrckbaren Bereichs angegeben (der nicht identisch mit dem Papierformat ist). In den ntersten beiden Zeilen des Dialogfensters wird der aktell installierte Drcker nd das eingestellte Papierformat angezeigt. :HQQ6LHGDV'LDORJIHQVWHU3ULQWHU6HOHFWLRQPLW2.YHUODVVHQZHUGHQDOOH (LQVWHOOXQJHQLPDNWLYHQ$QVLFKWVIHQVWHU9LHZHUJHVSHLFKHUW6RPLWN QQHQ6LHI U YHUVFKLHGHQH%LOGHUHLQHXQWHUVFKLHGOLFKH'UXFNHUHLQVWHOOXQJXQG6HLWHQGDUVWHOOXQJ VSHLFKHUQ'LHVH(LQVWHOOXQJHQJHKHQMHGRFKPLWGHP9HUODVVHQGHU/HLFD&RQIRFDO 6RIWZDUHYHUORUHQ Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 237 von 263

238 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 'DWHQKDQGOLQJ 'DWHL IIQHQ )XQNWLRQ In der Leica Confocal Software können Sie mit der Taste Open verschiedene Dateiformate öffnen. 'DWHLIRUPDW Experiment (*.lei) Präsentationsseite (*.ano) Tiff-Dateien (*.tif) %HVFKUHLEXQJ Ein Leica-spezifisches, binäres Datenformat. Beim Lesen der Experimente werden nicht nr die Bilddaten sondern ach die experimentellen Einstellngen geladen. Ein Leica-spezifisches, binäres Datenformat. Die af den Präsentationsseiten vorhandenen Elemente wie Bilder, Texte nd Grafiken liegen jeweils als einzelne Objekte vor. Es handelt sich m Leica Bilddateien im Single- nd Mlti-Tiff-Format. Es können ach externe Dateien im RGB-Tiff-Format eingelesen werden. & siehe Experiment anlegen (Seite 241) & siehe Präsentationsseite anlegen (Seite 234) 'DWHLVSHLFKHUQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste Save klicken, werden die Daten im aktellen Experiment (*.lei) oder in der aktellen Präsentationsseite (*.ano) gespeichert. Wenn Sie mit der Taste Save ein Experiment oder eine Präsentationsseite zm ersten Mal speichern, erscheint zerst das Dialogfenster Save As. 2IWZHUGHQ2ULJLQDOGDWHQXQDEVLFKWOLFKPLWGHU)XQNWLRQ6DYH EHUVFKULHEHQ'LHV N QQHQ6LHYHUKLQGHUQLQGHP6LHGLH)XQNWLRQ6DYH$VYHUZHQGHQXPHLQEHUHLWV JHVSHLFKHUWHV([SHULPHQWXQWHUHLQHPDQGHUHQ1DPHQDE]XVSHLFKHUQ & siehe Datei speichern nter (Seite 238) 'DWHLVSHLFKHUQXQWHU )XQNWLRQ Mit der Taste Save As können Sie ein Experiment (*.lei) oder eine Präsentationsseite (*.ano) nter Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 238 von 263

239 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ einem bestimmten Dateinamen nd in einem bestimmten Dateiformat abspeichern. Beim Abspeichern eines Experiments wird af Dateiebene ein Ordner mit dem Namen des Experiments angelegt. Im Unterverzeichnis dieses Ordners befindet sich die Beschreibngsdatei (*.lei) des Experiments zsammen mit den einzelnen Bilddateien. Bei der Beschreibngsdatei handelt es sich m ein Leica-spezifisches binäres Datenformat. In dieser Datei werden die Parametereinstellngen nd die in Form einer Farbzordnngstabelle gespeicherte Farbinformation jedes z diesem Experiment gehörenden Bildes registriert. Die Bilddateien eines Experiments können im Format WLIoder im Format UDZabspeichert werden. Im Standardformat WLIsind die experimentellen Einstellngen nd die Farbinformation eines Bildes nochmals redndant enthalten. Im Format UDZwerden lediglich die Bilddaten abgespeichert. 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Der Vorteil des Formats UDZ ist die geringere Dateigröße, die jedoch nr bei Bildafnahmen mit relativ geringer Datenmenge zm Tragen kommt. Wenn Sie zm Beispiel eine Bildserie mit einer großen Anzahl von Einzelbildern, aber bei einem kleinen Scanformat afnehmen, können Sie die Bildserie im Format UDZ schneller speichern nd öffnen als im Format WLI. $OOH'DWHLHQVSHLFKHUQ )XQNWLRQ Mit der Taste Save All können Sie mehrere Experimente (*.lei) nd Präsentationsseiten (*.ano) hintereinander nter einem bestimmten Dateinamen nd in einem bestimmten Dateiformat abspeichern. Beim Abspeichern eines Experiments wird af Dateiebene ein Ordner mit dem Namen des Experiments angelegt. Im Unterverzeichnis dieses Ordners befindet sich die Beschreibngsdatei (*.lei) des Experiments zsammen mit den einzelnen Bilddateien. Bei der Beschreibngsdatei handelt es sich m ein Leica-spezifisches binäres Datenformat. In dieser Datei werden die Parametereinstellngen nd die in Form einer Farbzordnngstabelle gespeicherte Farbinformation jedes z diesem Experiment gehörenden Bildes registriert. Die Bilddateien eines Experiments können im Format WLIoder im Format UDZabspeichert werden. Im Standardformat WLIsind die experimentellen Einstellngen nd die Farbinformation eines Bildes nochmals redndant enthalten. Im Format UDZwerden lediglich die Bilddaten abgespeichert. 7\SLVFKH$QZHQGXQJHQ Der Vorteil des Formats UDZ ist die geringere Dateigröße, die jedoch nr bei Bildafnahmen mit relativ geringer Datenmenge zm Tragen kommt. Wenn Sie zm Beispiel eine Bildserie mit einer großen Anzahl von Einzelbildern, aber bei einem kleinen Scanformat afnehmen, können Sie die Bildserie im Format UDZ schneller speichern nd öffnen als im Format WLI. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 239 von 263

240 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ %HQXW]HUVSH]LILVFKH$QSDVVXQJHQ )XQNWLRQHQ EHUGLH%HGLHQNRQVROHVWHXHUQ )XQNWLRQ Verschiedene Parameter müssen während einer Bildafnahme häfig ne eingestellt werden. Mit Hilfe der Bedienkonsole können deshalb Fnktionen schnell nd direkt gesteert werden. Sie können den Drehknöpfen der Bedienkonsole eine Aswahl von Fnktionen frei zordnen: Wählen Sie im Menü View die Option Stats Bars nd dann Control Panel Stats Bar. Die Statsleiste für die Bedienkonsole wird am nteren Ende der Bentzeroberfläche der Leica Confocal Software angezeigt. Von links nach rechts gesehen besteht die Statsleiste as dem Symbol für die Bedienkonsole, den sieben Feldern, die die Drehknöpfe der Bedienkonsole repräsentieren, nd drei Schaltflächen. klicken Sie af eines der Felder, die wie die Drehknöpfe der Bedienkonsole angeordnet sind. Es wird eine Liste geöffnet, in der Sie die gewünschte Fnktion aswählen können. Der Name der zgeordneten Fnktion wird im Feld angezeigt. Die Ansprechempfindlichkeit der Drehknöpfe kann variiert werden: Klicken Sie in der Statsleiste der Bedienkonsole mit der rechten Mastaste af einen Afnahmeparameter. Bei den Afnahmeparametern Phase, Pinhole, Scan Field Rotation nd Zoom kann man zwischen den drei Empfindlichkeitsstfen Smooth, Moderate nd Rogh wählen. Bei den Afnahmeparametern Gain, Offset, Smart Gain nd Smart Offset kann die Anzahl Volt pro Drehng des Drehknopfs variiert werden. Bei den Afnahmeparametern Z Position nd Z Wide Position kann die Anzahl Mikrometer pro Drehng des Drehknopfs variiert werden. :HLWHUH,QIRUPDWLRQHQ]XGLHVHP7KHPDILQGHQ6LHLQGHUVHSDUDWHQ2QOLQH+LOIH 7XWRULDOVhEXQJHQ]XU%HGLHQXQJGHU/HLFD&RQIRFDO6RIWZDUH Haben Sie allen Drehknöpfen eine Fnktion zgeordnet, können Sie diese Konfigration als Vorlage abspeichern. Klicken Sie af die linke der drei Schaltflächen, die sich am rechten Rand der Statsleiste befinden. Ein Dialogfenster wird geöffnet, in dem Sie der Konfigration einen Namen geben nd sie speichern können. Klicken Sie af die mittlere Schaltfläche, m eine Konfigration aszwählen nd z laden. Neben diesen bentzerdefinierten Konfigrationen können Sie ach af weitere werkseitig vordefinierte Konfigrationen zgreifen: Klicken Sie af die rechte der drei Schaltflächen, die sich am rechten Rand der Statsleiste befinden. Ein Dialogfenster wird geöffnet, in dem alle Konfigrationen für die Bedienkonsole afgelistet sind. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 240 von 263

241 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Die voreingestellten Konfigrationen, die mit einem / (Leica) gekennzeichnet sind, können nr geladen aber nicht verändert werden. Die bentzerdefinierten Konfigrationen werden im Listenfeld nter User angelegt nd mit einem 8 (User) gekennzeichnet. Wenn Sie eine dieser Konfigrationen anklicken nd anschließend af die rechte Mastaste klicken, stehen Ihnen in einem Kontextmenü folgende Befehle zr Verfügng: %HIHKO Set as defalt template Remove defalt setting Load Rename (nr bei 8) Delete (nr bei 8) )XQNWLRQ Die Konfigration wird als Standardeinstellng beim Start der Software geladen. Die Konfigration als Standardeinstellng wird rückgängig gemacht. Die Konfigration wird geladen. Die Konfigration kann mbenannt werden. Die Konfigration wird gelöscht. ([SHULPHQWDQOHJHQ )XQNWLRQ Wenn Sie af die Taste New Experiment klicken, wird ein nees Ansichtsfenster Viewer geöffnet nd damit ein nees Experiment angelegt. Ein Experiment ist eine Datei, die as mehreren Einzelbildern oder Bildserien bestehen kann. Sie haben damit die Möglichkeit, mehrere Bilder, die mit nterschiedlichen Scanparametern afgenommen wrden, oder Ergebnisbilder von Bildverarbeitngen, in einem Experiment zsammenzfassen. Bei den Experimenten (*.lei) handelt es sich m ein Leica-spezifisches Datenformat. $QVLFKWVIHQVWHU9LHZHUDOV9RUODJHDEVSHLFKHUQ )XQNWLRQ Mit der Taste Template kann eine bentzerdefinierte Gestaltng des Ansichtsfensters Viewer als Vorlage abgespeichert werden. Die Elemente des Ansichtsfensters Viewer, die ein- oder asgeblendet werden können, sind die Tastenfelder, die Farbleisten der Farbzordnngstabellen sowie die Legende Experiment. & siehe Ansichtsfenster Viewer (Seite 153) Wenn Sie af die Taste Template klicken, wird ein Dialogfenster geöffnet, in dem Sie einen Namen für die Vorlage eingeben. Diese Konfigration des Ansichtsfensters Viewer wird gespeichert nd immer dann geladen, wenn Sie eine Datei öffnen oder ein nees Experiment anlegen. =XVlW]OLFKH,QIRUPDWLRQ Klicken Sie im Menü Tools af Options, m im Register Viewer Template af voreingestellte nd bentzerdefinierte Vorlagen zgreifen z können. Im Listenfeld Leica Templates stehen Ihnen folgende voreingestellte Vorlagen zr Verfügng: 9LHZHU 7HPSODWH Viewer (Pre) Viewer (LUT) *HVWDOWXQJ Das Ansichtsfenster besteht nr as dem Bildfenster. Das Ansichtsfenster besteht as dem Bildfenster nd den Farbleisten der Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 241 von 263

242 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Viewer (Standard) Farbzordnngstabellen. Das Ansichtsfenster besteht as den Tastenfeldern, dem Bildfenster, den Farbleisten der Farbzordnngstabellen nd der Legende Experiment. Im Listenfeld Personal Templates werden die bentzerdefinierten Vorlagen eingetragen. Mit den Schaltflächen Add Active Viewer nd Remove Template können Sie eine nee Vorlage speichern bzw. eine bereits existierende löschen. Klicken Sie im Menü Tools af Options, m im Register Workspace festzlegen, ob, nd wenn ja, wieviele Ansichtsfenster Viewer beim Start der Leica Confocal Software geöffnet werden sollen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 242 von 263

243 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 2SWLRQDOH6RIWZDUHSDNHWH 0DWHULDOV 5DXKLJNHLWVPHVVXQJHQHQWODQJHLQHU6WUHFNH )XQNWLRQ Mit der Fnktion Roghness Profile werden Höhen-, Abstands- nd Winkelwerte einer Oberfläche entlang einer Strecke gemessen nd in einer Krve dargestellt. Das Höhenprofil wird as dem im Ansichtsfenster Viewer asgewählten Datensatz gemessen. Bei diesem Datensatz sollte es sich m eine rämliche Serie handeln. Vorassetzng für die Erzegng des Höhenprofils ist ein Topographiebild. Die Taste Roghness Profile ist deshalb erst aktiv, wenn zvor mit der Taste Topography ein Topographiebild des Datensatzes erzegt wrde. Es kann immer nr ein Detektionskanal qantifiziert werden. & siehe Topographiebild erzegen (Seite 182) Klicken Sie af die Taste Roghness Profile. Die Messstrecke wird im Ansichtsfenster Viewer als weiße Linie im Bild eingeblendet. Die Länge nd Position der Messstrecke können Sie beliebig ändern, indem Sie die Strecke anklicken nd mit gedrückter linker Mastaste die Anfasspnkte an die gewünschte Position ziehen. Es wird atomatisch ein Ansichtsfenster geöffnet, in dem die Messkrve für jeden Detektionskanal nd die statistischen Werte angezeigt werden. 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ )RUPHO Evalation length: I(P) Länge der eingezeichneten Messstrecke nach DIN EN ISO 4287 Max. Peak: Höhe der höchsten Profilspitze (bezogen af die Max (Pp) Pp drchschnittliche Höhe) nach DIN EN ISO 4287 Min. Valley: Tiefe des größten Profiltales (bezogen af die Min (Pv) Pν drchschnittliche Höhe) nach DIN EN ISO 4287 Deviation: Pa Arithmetischer Mittelwert der Profilordinate innerhalb der Messstrecke (drchschnittliche Höhe) nach DIN EN ISO 4287 mit RMS: Pq Qadratischer Mittelwert der Profilordinate innerhalb der Messstrecke nach DIN EN ISO 4287 mit 'LHIROJHQGHQ0HVVZHUWHHUVFKHLQHQQXUZHQQLP'LDORJIHQVWHU9LHZHU2SWLRQVGLH )XQNWLRQ=ZHLSXQNWPHVVXQJDXVJHZlKOWLVW Wählen Sie Menü View, Option Experiment Overview, Bildsymbol Charts. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Charts (Seite 158) Im Feld Measrement können Sie die Zweipnktmessng ein- oder asschalten, indem Sie 2 Point oder Off wählen. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 243 von 263

244 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ )RUPHO h (Position linker Messpnkt Höhe des Profils an der Position des linken h 1 ( l 1) des Schiebers) Messpnktes des Schiebers h (Position rechter Höhe des Profils an der Position des rechten h 2 ( l 2) Messpnkt des Schiebers) Messpnktes des Schiebers Step Height dh Höhendifferenz des Profils zwischen linkem nd rechtem Messpnkt des Schiebers dx Abstand zwsichen linkem nd rechtem Eckpnkt des Schiebers alpha Winkel zwischen der Verbindngslinie linker Messpnkt-rechter Messpnkt zr Horizontalen 6SHLFKHUQYRQ0HVVZHUWHQ Die Werte an den Positionen der beiden Messpnkte sowie die Höhendifferenz zwischen den beiden Messpnkten können von der Software gespeichert werden. Wählen Sie Menü View, Option Experiment Overview, Bildsymbol Srface Measre. & siehe Dialogfenster Viewer Options, Bildsymbol Srface Measre (Seite 163) Klicken Sie im Feld Mltipoint Measrement af die Schaltfläche Remember, m die Werte z speichern. Mit der Schaltfläche Clear werden sie wieder gelöscht. ÃÃ Ã 'LHVH4XDQWLIL]LHUXQJVIXQNWLRQLVWQXURIIOLQHGKQXUI UEHUHLWVDXIJHQRPPHQH 'DWHQVlW]HYHUI JEDU 5DXKLJNHLWVPHVVXQJHQLQQHUKDOEHLQHV$XVZHUWXQJVEHUHLFKV 52, )XQNWLRQ Mit der Fnktion Roghness Area werden Höhen-, Abstands- nd Winkelwerte einer Oberfläche innerhalb eines Aswertngsbereichs gemessen. Das Profil wird as dem im Ansichtsfenster Viewer asgewählten Datensatz gemessen. Bei diesem Datensatz sollte es sich m eine rämliche Serie handeln. Vorassetzng für die Erzegng des Höhenprofils ist ein Topographiebild. Die Taste Roghness Area ist deshalb erst aktiv, wenn zvor mit der Taste Topography ein Topographiebild des Datensatzes erzegt wrde. & siehe Topographiebild erzegen (Seite 182) Klicken Sie af die Taste Roghness Area nd zeichnen Sie einen Aswertngsbereich (ROI) im Bild ein. Die Tasten, mit denen Sie einen Aswertngsbereich definieren, werden zsammen mit der Taste Roghness Area aktiviert. & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Ellipse definieren (Seite 228 ff.) & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Polygon definieren & siehe Aswertngsbereich (ROI) als Rechteck definieren & siehe Aswertngsbereich (ROI) atomatisch definieren & siehe Aswertngsbereich (ROI) marikieren nd verschieben & siehe Aswertngsbereiche (ROI) löschen Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 244 von 263

245 %HVFKUHLEXQJGHU(LQ]HOIXQNWLRQHQ Es wird atomatisch ein Ansichtsfenster geöffnet, in dem die statistischen Werte angezeigt werden. 3DUDPHWHU %HGHXWXQJ )RUPHO # Pixel Anzahl der Pixel innerhalb des asgewählten Aswertngsbereichs Area Flächeninhalt Avg. Height Drchschnittliche Höhe der Profilordinate Pa Arithmetischer Mittelwert der Profilordinate innerhalb der Messstrecke (drchschnittliche Höhe) nach DIN EN ISO 4287 mit RMS (Pq) Qadratischer Mittelwert der Profilordinate innerhalb der Messstrecke nach DIN EN ISO 4287 mit Min Valley (Pν) Max Peak (Pp) Minimale Höhe der Profilordinate (bezogen af die drchschnittliche Höhe) Maximale Höhe der Profilordinate (bezogen af die drchschnittliche Höhe) Min (Pv) Max (Pp) ÃÃ ÃÃ 'LHVH4XDQWLIL]LHUXQJVIXQNWLRQLVWQXURIIOLQHGKQXUI UEHUHLWVDXIJHQRPPHQH 'DWHQVlW]HYHUI JEDU Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 245 von 263

246 $QKDQJ $QKDQJ $QSDVVXQJVIXQNWLRQ]XU.RUUHNWXUYRQ7UHQGYHUOlXIHQ & siehe Arbeitsschritt Process / Ordner Materials (Seite 212) 1. Wahl der Schrittweite, also des Abstandes der Stützstellen 2. Aswahl des Charakters der anzpassenden Interpolationsfnktion 3. Berechnng der Interpolationsfnktion f(x) = a + bx + cy 4. Addition der Intensitätsdifferenzen zm Asgleich des Trendverlafs Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 246 von 263

247 $QKDQJ vor dem Asgleich nach dem Asgleich ÃÃ Ã %HLVSLHOI UGDV9HUVFKLHEHQHLQHV%LOGHVLP(UJHEQLVELOG %HLVSLHOI UGLH9HUHLQLJXQJYRQ%LOGHUQXQWHUVFKLHGOLFKHU.DQDO]DKO0HUJLQJ a.) Erstes Asgangsbild (Einstellng: Start=2) b.) Zweites Asgangsbild (Einstellng: Start=1) c.) Vereinigngsbild Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 247 von 263

248 $QKDQJ )XQNWLRQVZHLVHGHU%RROHVFKHQ9HUNQ SIXQJHQ AND Schreibe eine 1, wenn in Pixel 1 UND in Pixel 2 eine 1 steht, ansonsten schreibe 0 OR Schreibe eine 1, wenn in Pixel 1 ODER in Pixel 2 eine 1 steht, ansonsten schreibe 0 a.) Binäre Darstellng Pixel 1 b.) Binäre Darstellng Pixel 2 c.) Binäre Darstellng Ergebnispixel AND stellt die Schnittmenge von zwei Bildern dar XOR Schreibe eine 1, wenn die Werte in Pixel 1 nd in Pixel 2 sich nterscheiden, ansonsten schreibe 0 a.) Binäre Darstellng Pixel 1 b.) Binäre Darstellng Pixel 2 c.) Binäre Darstellng Ergebnispixel OR stellt die Vereinigngsmenge von zwei Bildern dar a.) Binäre Darstellng Pixel 1 b.) Binäre Darstellng Pixel 2 c.) Binäre Darstellng Ergebnispixel XOR stellt die Vereinigngsmenge ohne die Schnittmenge von zwei Bildern dar. Bentzerhandbch Leica TCS SP2 detsch Seite 248 von 263