Hochdurchsatz-Screening zur frühzeitigen Erkennung von Pathogenbefall der Zuckerrübe Dr. Sandra Fischer

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1 Hochdurchsatz-Screening zur frühzeitigen Erkennung von Pathogenbefall der Zuckerrübe Dr. Sandra Fischer

2 Projekt Förderung: Laufzeit:

3 Projektpartner Fraunhofer-Institut für Fabrikbetrieb und - automatisierung (IFF) Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) Strube Research GmbH & Co. KG 3

4 Biogas aus Zuckerrüben Stromerzeugung / Jahr 1 ha Quelle: Fachagentur nachwachsende Rohstoffe e.v. Agentur für erneuerbare Energien e.v.

5 Methanerträge einiger Biomassearten für die Biogasanlage Quelle: KTBL-Substratrechner ZR-Rübe (frisch) 58 t ZR-Blatt (frisch) 29 t ZR-Rübe (Silage) 58 t/ha Frischmasse ZR-Blatt (Silage) 29 t Gras, frisch 32 t Grünroggensilage 50 t Maissilage, teigreif 50 t Methanertrag (m³/ha)

6 Merkmale für Züchtung für Biogas Trockenmasseertrag und Methanertrag haben eine sehr enge Korrelation Zuckergehalt und Trockenmassegehalt haben eine sehr enge Korrelation Relative Trockenmasse und Methanerträge für ausgewählte Genotypen Genotyp Rübe mit Kopf Trockenmasseertrag Methanertrag relativ 1 259,8 100,6 9, ,6 104,2 98,6 3 21,0 102,04 103, ,8 99,6 104, 5 256, 83,59 80, ,2 104,08 103,3 280,2 106,06 110,8 8 24,0 99,6 101,8 Total 26,8 100,0 100,0

7 Neue Sorten für Biogas Sorten für Biogas müssen neben hohem Zuckergehalt und hohem Rübenertrag gesund sein Für eine schnelle Umsetzung, ist es essentiell z.b. Biotests im Gewächshaus zu verkürzen hyperspektralen Bilddaten (IFF) sollen aufgrund der Metabolitanalysen (IPK) und der visuellen Boniturergebnisse (Strube Research) justiert und die gemessene Dynamik in Prognosemodellen umgesetzt werden

8 Übersicht Biotests Krankheit/ Schädling Anzuchterde Infektionsmaterial Testdauer (Wochen) Bonitur Cercospora Lavaterrerde Sporensuspension 13 Blattbonitur Rizomania Infizierte Erde + Perlite Infizierte Erde 8 ELISA Rhizoctonia Lavaterrerde Infizierte Gerste 12 Wurzelbonitur Testdauer soll durch hyperspektrale Messungen verkürzt werden Modell wird mit Biotestergebnissen und Ergebnissen aus 8 nasschemischer Analyse kalibriert

9 Hyperspektrale Messkampagne 2013 & 2014 Messaufbau Hyperspektrale Messkampagne 2013 & 2014 Messaufbau

10 Hyperspektrale Messkampagne 2013 & 2014 Messtechnik HySpex SWIR-320m-e HyperspektralKamera Short Wave Infrared (SWIR) 90 nm nm 6 nm Schritte x 256 Bänder Zeilenkamera mit 320 Pixel örtlicher Auflösung Maximale Framerate 100 fps

11 Hauptexperiment Messtermine 2013: für Cercospora und Rhizoctonia, 8 für Rizomania Messtermine 2014: 3 für alle Pathosysteme Pflanzen/ Messtag 11 Anfällig Tolerant Resistent Stark resistent Kontrolle Cercospora Cercospora Kontrolle Rhizoctonia Rhizoctonia Kontrolle Rizomania Rizomania

12 Ergebnisse Strube Rhizoctonia 2013 und Genotyp Bonitur % Wurzelfäule 2013 % Wurzelfäule 2014 Anfällig Wurzel 6 61,1 Tolerant Wurzel 22,8 18,1 Resistent Wurzel 11,6,

13 Ergebnisse Strube Rizomania Genotyp Gewicht Wurzel 2013 ELISA OD405nm 2013 Gewicht Wurzel 2014 Erde 1 ELISA OD405nm 2014 Erde 1 Gewicht Wurzel 2014 Erde 2 Anfällig 0,2 0, 0,2 2,2 0,2 2,1 resistent 0,2 0,5 0,2 1,9 0,3 2,2 13 ELISA OD405nm 2014 Erde 2

14 Ergebnisse Strube Cercospora Blätter wurden direkt an Messtagen entfernt Befall konnte nicht bonitiert werden 14

15 Hyperspektrale Messkampagne 2013 & 2014 Bilddaten Vorverarbeitung und Segmentierung 1. Spektralbild (1 Kanal) 4. Automatische Objektsegmentierung 2. Detektion Kalibriernormal 3. Gruppierung Materialien (eingefärbt) 5. Extraktionsmaske für 6. Kalibriertes (normiertes) Spektraldaten Blattspektrum (für jedes Pixel)

16 Hyperspektrale Messkampagne 2013 & 2014 Klassifikation Kontrolle vs. Infiziert (Bsp. Cercospora) Korrektklassifikationsrate Kontrolle vs. Infiziertes Blatt Korrektklassifikationsrate Kontrolle vs. Infiziertes Blatt 1 1,000 0,9 0,900 0,8 0,800 0, 0,00 0,6 0,600 0,5 0,500 0,4 0,400 0,3 0,300 0,2 0,200 0,1 0, ,000 D1 D2 D3 C Typ r D4 C Typ s D5 C Typ t Hauptexperiment 2013 D6 D D1 D2 C Typ r C Typ s D3 C Typ t Hauptexperiment 2014

17 Experimentelles Design Licht Experiment Genotyp: Cercospora tolerant, anfällig, resistent Biologischen Replikate: ,5 Wochen µmol/m2s µmol/m2s µmol/m2s Zeitpunkt der Ernte [d] Hyperspektrale Bildgebung LC-MS Analyse von semi-polaren Metaboliten GC-MS Analyse: polar + apolaren Metaboliten Aminosäure Analytik via UPLC-FL Quantitative real time PCR von ausgewählten Genen des Phenylpropanoid Stoffwechsel 1

18 LC- MS basierende Analyse von Sekundärmetaboliten 1. Schritt Methanolische Extraktion LC-MS Messung Daten Analyse - Trennung auf Phenyl Hexyl Säule - Electrospray Ionisierung -qtof-ms - Aufnahme des PDA signales im Bereich von nm - Detektion des Masse/Ladungs (m/z) Signales in Kombination mit der Retentionszeit 2. Schritt - Data Analysis (Qualitätskontrolle) - Profile Analysis (Identifizierung von regulierten Kandidaten) - Hauptkomponentenanalyse (PCA) - Statistische Auswertung (T-test) Intens. x106 Refere nz1_ra3_01_458.d: +MS, mi n # MS m/z Intens. Referenz1_RA3_01_458.d: +MS2( ), 35.0eV, min # Annotation I - Smart formula (Berechnung der Summenformel) - Compound crawler (KEGG, Pubchem, Chemspider, Metlin) m/z Annotation II - MS/MS - MetFusion (MetFrag + MassBank) 18

19 Sekundärmetabolite PCA Die Metabolitprofile (semipolare Metabolite) der Genotypen sind eindeutig zu unterscheiden, sowohl bezüglich der Genotypen als auch der Lichtbedingungen

20 Sekundärmetabolite Phenolische Substanzen # Peaks 50 Peak Fläche 280 nm Die Konzentration an phenolischen Substanzen kann mit dem Grad der Resistenz korreliert werden Außerdem sind phenolische Substanzen unterschiedlich stark Licht-induziert in den verschiedenen Genotypen 20

21 Hyperspektrale Messkampagne 2013 & 2014 Datenanalyse mittels Maschinellen Lernens Soft-Sensor Untersuchungsobjekt Lernfähiges Mathematisches Modell Hardware Sensor Extraktion relevanter Zielgrößen (Zusammenhang zwischen Hardware-Sensor-Daten und chemischer Zusammensetzung / Klassifikationsziel) Chemische Analyse / Festlegung Klassifikationsziel Verknüpfung mit konkreter Anwendung

22 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!