HTLV I/II ELISA REVISIONSDATUM: 11/05 MBN 0011-GER-1 NAME UND VERWENDUNGSZWECK

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1 BEDEUTUNG DER VERWENDETEN SYMBOLE Bei Produkten und Verpackungen von MP Diagnostics werden die folgenden grafischen Symbole verwendet. Die Symbole entsprechen den bei medizinischen Instrumenten und deren Verpackungen üblicherweise verwendeten Symbolen. Eine umfassende Symbolerklärung enthält die Britische und Europäische Norm BS EN 980: HTLV I/II ELISA REVISIONSDATUM: 11/05 MBN 0011-GER T : (Kit für 96 Tests) T : (Kit für 192 Tests) T : (Kit für 480 Tests) NAME UND VERWENDUNGSZWECK Hinweiss: Anderungen hervorgehoben. Der MP Diagnostics (MPD) HTLV I/II ELISA 3.0 ist ein Enzym- Immunoassay für den Nachweis von HTLV-I- und HTLV-II- Antikörpern in humanem Serum oder Plasma. Er wird als Screening-Test eingesetzt, wobei initial reaktive Proben erneut nachgetestet werden müssen. Verwendbar bis Synonym hierfür: Verfalldatum Chargencode Synonyme hierfür: Chargennummer Referenznummer Temperaturbegrenzung Hersteller Ausreichend für <n> Tests Nicht wiederverwenden In-vitro- Diagnostikum Katalognummer Achtung. Siehe Bedienungsanleitung Autorisierte Vertretung in der Europäische Gemeinschaft Gebrauchsanweisung beachten EINFÜHRUNG Kürzlich durchgeführte epidemiologische Studien in den USA und Europa haben das Vorliegen eines gemischt prävalenten Virusbefalls mit HTLV-I und HTLV-II in verschiedenen risikogefährdeten Populationen nachgewiesen, beispielsweise bei Drogenabhängigen mit i.v.-applikation sowie Transfusionsempfängern. Basierend auf der Kreuzreaktivität von anti-htlv-i- und anti-htlv-ii-seren auf Viruslysat verwendete die erste Testgeneration virales HTLV-I-Lysat. Bei der zweiten Testgeneration wurden für das Screening virales HTLV-I-Lysat plus rekombinante Antigene eingesetzt. Jedoch sind derzeit verfügbare HTLV-I/II-Screening-Immunoassays der ersten und zweiten Generation, die auf dem Einsatz von Viruslysat basieren, durch mangelnde Sensitivität gegenüber HTLV-II eingeschränkt und weisen bei nichtinfizierten Proben einen hohen Anteil falsch-positiver Ergebnisse auf. Der Nachweis von HTLV-I- und HTLV-II-Antikörpern erfordert einen HTLV-I/II ELISA, der sowohl hochempfindlich als auch hochspezifisch ist. Der MP Diagnostics HTLV I/II ELISA 3.0 stützt sich ausschließlich auf eine Kombination rekombinanter Antigene. Bei diesem Test werden HTLV-I und HTLV-II anhand spezifischer Epitope nachgewiesen. Der MP Diagnostics HTLV I/II ELISA 3.0 ist ein rein qualitativer Enzym-Immunoassay für den Nachweis von HTLV-I und HTLV- II-Antikörpern in humanem Serum bzw. Plasma. Er wird für das Screening eingesetzt, wobei initial reaktive Proben wiederholt nachgetestet und mit zusätzlichen Assays, beispielsweise dem MPD HTLV BLOT 2.4 Western Blot Test, nachuntersucht werden müssen. CHEMISCHE UND BIOLOGISCHE GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Die Vertiefungen (Wells) der Mikrotiterplatten-Streifen aus Polystyrol sind mit einer Kombination aus rekombinanten HTLV- I- und HTLV-II-Antigenen beschichtet, die den hochspezifischen Antigen-Strukturregionen von HTLV-I und HTLV-II entsprechen. In diesen Vertiefungen wird mit entsprechendem Puffer verdünntes Humanserum bzw. -plasma inkubiert. Eventuell vorhandene spezifische Antikörper gegen HTLV-I/II binden an die in der Festphase fixierten Antigene. Die Vertiefungen werden gründlich gewaschen, um ungebundene Probenanteile zu entfernen. Ein hoch aufgereinigter antihumaner IgG-Antikörper der Ziege wird hinzugegeben, der an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist. Der so gekoppelte Antikörper bindet an jeden vorher gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex, während überschüssige freie Antikörper durch Waschen entfernt werden. In jede Vertiefung wird dann eine Substratlösung mit 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin (TMB) gegeben. Eine Blaufärbung nach der Substratzugabe weist auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper hin. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Salzsäure beendet. Die Reaktion wird durch die Zugabe von Salzsäure beendet. Die Intensität des gelben Reaktionsprodukts wird spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen. Sie ist proportional zu der in der Probe vorkommenden Antikörpermenge. 1

2 EINZELKOMPONENTEN DES TESTS Komponentenbeschreibung HTLV-MIKROTITERPLATTE Zwölf 8er Streifen pro Platte. Jede Mikrotiterplatten-Vertiefung (Well) enthält adsorbierte rekombinante HTLV-I- und HTLV- II-Proteine. Lagerung bei 2-8 C. NICHTREAKTIVE KONTROLLE Normales Humanserum, nicht reaktiv für Anti-HCV, Anti-HIV-1/ 2, Anti-HTLV-I/II und HBsAg. Enthält Thimerosal und Natriumazid als Konservierungsstoffe. Füllmenge: 280 Øl pro Ampulle Lagerung bei 2-8 C REAKTIVE KONTROLLE Inaktiviertes Humanserum mit einem hohen Titer an HTLV-I/IIspezifischen Antikörpern und nicht reaktiv für Anti-HCV, Anti- HIV-1/2 und HBsAg. Enthält Thimerosal und Natriumazid als Konservierungsstoffe. Füllmenge: 300 Øl pro Ampulle Lagerung bei 2-8 C. LIEFERMENGE 1 PLATTE 2 PLATTEN 5 PLATTEN 96 tests 192 tests 480 tests Ampulle Ampullen Ampullen Ampulle Ampullen Ampullen STOPP-LÖSUNG 1N Salzsäurelösung. Lagerung im Dunkeln bei 2-8 C. Füllmenge: 30 ml pro Flasche PLATTENABDECKUNGEN Selbstklebende Abdeckungen für die Mikrotiterplatte während der Inkubation. BEDIENUNGSHANDBUCH Flasche Flasche Flaschen Stück Stück Stück Exemplar Exemplar Exemplar * Bronidox TM ist ein Warenzeichen der Henkel Chemical Co. WARNUNGEN UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur für die in vitro Diagnostik. 2. Nur für Fachpersonal. 3. Bitte beachten Sie die Produktkennzeichnung hinsichtlich potenziell gefährlicher Komponenten. HINWEISE ZU GESUNDHEITLICHEN RISIKEN UND SICHERHEIT WARNUNG: Dieser Test enthält Bestandteile aus menschlichem Serum. Bei keiner Testmethode ist ausgeschlossen, dass mögliche Infektionen durch humane Blutprodukte übertragen werden können. VERDÜNNUNGSMITTEL Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit hitzebehandeltem normalen Ziegenserum, bovinem Serumalbumin und Stabilisatoren. Enthält Bronidox TM als Konservierungsstoff. Füllmenge: 100 ml pro Flasche. Lagerung bei 2-8 C. PLATTEN-WASCHKON- ZENTRAT (20fach) Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20. Enthält Chloracetamid als Konservierungsstoff. Füllmenge: 120 ml pro Flasche. Lagerung bei 2-8 C. KONJUGAT Antihumaner an Meerrettich- Peroxidase gekoppelter IgG- Antikörper der Ziege. Füllmenge: 70 Øl pro Ampulle Lagerung bei 2-8 C. SUBSTRAT Der Puffer enthält 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin (TMB). Lagerung im Dunkeln bei 2-8 C. Füllmenge: 12.5 ml pro Flasche Flasche Flasche Flaschen Flasche Flasche Flaschen Ampulle Ampullen Ampullen Flasche Flaschen Flaschen BEHANDELN SIE ALLE UNTERSUCHUNGSPROBEN SOWIE REAKTIVE UND NICHTREAKTIVE KONTROLLEN ALS POTENZIELL INFEKTIÖSES MATERIAL. Es wird empfohlen, beim Umgang mit Bestandteilen und Testproben entsprechend den Grundsätzen der Guten Laborpraxis zu arbeiten. Das Material ist gemäß den vorgeschriebenen Sicherheitsmaßnahmen zu entsorgen. Die Reaktive Kontrolle und Nichtreaktive Kontrolle enthalten Thimerosal und Natriumazid. Natriumazid kann mit Kupfer und Blei, die in einigen Abwasserleitungen vorkommen, reagieren und explosive Salze bilden. Die in diesem Test verwendeten Mengen sind zwar gering, doch sollten azidhaltige Stoffe unter Beimengung relativ großer Wassermengen hinweggespült werden, damit sich in der Abwasserleitung keine Metallazide bilden. Folgende Risiko- (R) und Sicherheits-Sätze (S) sind entsprechend zu beachten: R20/21/22 Schädlich bei Einatmung, Hautkontakt und Verschlucken. R32 Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase. S7-32 Behälter dicht geschlossen halten. Dampf nicht einatmen. S35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden. S36 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen. S46 Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. 2

3 Das Verdünnungsmittel enthält Bronidox und Tris-Puffer. Diese Substanzen werden gemäß den geltenden Richtlinien der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft (EWG) als reizend (Xi) eingestuft. Folgende Risiko- (R) und Sicherheits-Sätze (S) sind entsprechend zu beachten: R36/38 Reizt die Augen und die Haut. S26/28 Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und den Arzt konsultieren. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser abwaschen. Das Plattenwaschkonzentrat (20X) enthält 2 % Chloracetamid. Diese Substanz wird gemäß den geltenden Richtlinien der Europäischen Wirtschaftsgemeinschaft (EWG) als reizend (Xi) eingestuft. Folgende Risiko- (R) und Sicherheits- Sätze (S) sind entsprechend zu beachten: R22-43 Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. S22-36/37-45 Staub nicht einatmen. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). 1. Vermeiden Sie beim Öffnen oder bei der Entnahme aus den Originalampullen und -flaschen die mikrobielle Kontamination der Reagenzien. 2. Nicht mit dem Mund pipettieren. 3. Alle Untersuchungsproben, Mikrotiterplatten, reaktive und nichtreaktive Kontrollen sind als potenziell infektiöses Material zu behandeln. 4. Beim Arbeiten mit dem Assay stets Einmal-Handschuhe und Laborkittel tragen. Die Handschuhe als biologisch gefährliches (Biohazard-) Material entsorgen. Anschließend gründlich die Hände waschen. 5. Es wird dringend empfohlen, diesen Test nur unter einer entsprechenden Schutzhaube durchzuführen. 6. Niemals in die Nähe von Lebensmitteln bringen 7. Bei Unfall oder Augenkontakt sofort mit reichlich Wasser spülen und in ärztliche Behandlung begeben. 8. Beim Verschlucken kontaminierter Substanzen oder bei Materialkontakt mit offenen Hautstellen ist sofort ein Arzt aufzusuchen. 9. Salzsäure kann Verätzungen verursachen. BERÜHRUNG VERMEIDEN. Bei Berührung mit der Haut gründlich mit Wasser abwaschen. 10. Salzsäure sollte nicht mit Oxidationsmitteln oder Metall in Kontakt kommen. 11. Die unnötige Lichtexposition der Substrat-Tablette und des Puffers vermeiden. Die OPD-Tabletten nur mit einer nichtmetallischen Pinzette handhaben. 12. Kein Wasser in die Stopp-Lösung geben. 13. Verschüttete potenziell infektiöse Substanzen mit saugfähigem Papierhandtuch aufnehmen und den kontaminierten Bereich sofort mit einprozentiger Natriumhypochlorit-Lösung säubern. Natriumhypochlorit sollte nicht bei verschütteten säurehaltigen Substanzen angewendet werden, sofern der betreffende Bereich vorher nicht gründlich mit einem saugfähigen Papierhandtuch trockengewischt wurde. Verwendete Materialien (einschließlich Einmal-Handschuhe) sind als potenzielles Biohazard-Material zu entsorgen. Natriumhypochlorithaltiges Material nicht autoklavieren. 14. Alle benutzten und kontaminierten Materialien vor der Entsorgung bei 121 C und 103,42 kpa (15 p.s.i.) 30 Minuten autoklavieren. Alternativ können Materialien vor der Entsorgung als Biohazard Minuten in 5 %-iger Natriumhypochlorit-Lösung dekontaminiert werden. 15. Alle verwendeten Chemikalien und Reagenzien in mindestens einprozentiger Natriumhypochlorit-Lösung dekontaminieren. Zur effektiven Dekontamination 30 Minuten darin ruhen lassen. HINWEISE ZUM TESTVERFAHREN 1. Zur Verwendung geeignet sind Serum- oder Plasmaproben, die mit EDTA, Heparin oder Natriumcitrat gewonnen wurden. Stellen Sie vor der Lagerung sicher, dass geronnenes Blut bzw. Blutkörperchen durch Zentrifugation getrennt wurden. 2. Optimale Testergebnisse erfordern ein STRENGES EINHALTEN des im Bedienungshandbuch beschriebenen Testverfahrens. Abweichungen vom Verfahren können die Ergebnisse verfälschen. 3. REAGENZIEN NICHT MODIFIZIEREN UND KEINESFALLS REAGENZIEN ANDERER CHARGEN VERWENDEN. Zur Erzielung optimaler Ergebnisse sind die Kontrollen, Konjugate und Mikrotiterplatten aufeinander abgestimmt. Nur die im Kit mitgelieferten Reagenzien verwenden. 4. Die Komponenten nicht nach dem Verfalldatum verwenden. 5. Beim Öffnen oder bei der Entnahme aus den Originalampullen und -flaschen die mikrobielle Kontamination der Reagenzien vermeiden. Dies führt ansonsten zu kürzerer Haltbarkeit des Kits und verfälschten Ergebnissen. Bei der Materialentnahme aus Ampullen sind sterile Arbeitsmittel, einschließlich der Pipetten bzw. Einmal-Pipettenspitzen, zu verwenden. 6. Zur Vermeidung einer Kreuzkontamination ist bei der Entnahme aus Ampullen für jede Probe eine neue Pipettenspitze zu nehmen. Die Ober- und Unterseite der Streifen sowie die Ränder der Vertiefungen dürfen nicht angefasst oder mit der Pipettenspitze berührt werden. 7. Es wird empfohlen, Glasbehälter vor dem Gebrauch mit 2M Salzsäure zu waschen und mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gründlich nachzuspülen. 8. Die besten Testergebnisse werden erzielt, wenn Reagenzien und Proben vor Gebrauch auf Raumtemperatur (25 ± 3 C) erwärmt sind. Direkt nach dem Gebrauch wieder bei 2-8 C lagern. 9. Zur Verdünnung von Reagenzien nur hochreines entionisiertes oder destilliertes Wasser verwenden. 10. Alle Reagenzien vor dem Gebrauch gut mischen. 11. Die Konjugat-Arbeitslösung und der verdünnte Waschpuffer erst kurz vor Gebrauch angesetzen. 3

4 12. Die Reagenzien während der Lagerung, Inkubationsphasen und Testdurchführung keinen konzentrierten Dämpfen chemischer Desinfektionsmittel (z. B. Hypochloritdämpfen) aussetzen. Die Farbreaktion wird durch den Kontakt inhibiert. Eine unnötige Lichtexposition der Reagenzien vermeiden. 13. Die Mikrotiterplatten erst kurz vor der Verwendung aus der Verpackung nehmen. Geöffnete unbenutzte Streifen sind bei 2-8 C in ihrer Verpackung samt dem dort beigelegten Trocknungsmittel zu lagern. 14. Die Kontrollproben bei jedem Test gleichzeitig mit den Patientenproben analysieren. 15. Den Rand der Vertiefungen keinesfalls anfassen oder mit dem Konjugat in Berührung bringen. Die Mikropipette niemals durchblasen. Es wird empfohlen, mit der reversen Pipettiertechnik zu arbeiten. 16. Die Verwendung stark hämolysierter Proben, unvollständig geronnener Seren, fibrinhaltiger Plasmaproben oder mikrobiell kontaminierter Proben kann die Testergebnisse verfälschen. 17. PLATTEN NICHT IM WASSERBAD INKUBIEREN. 18. Keine CO 2 -Inkubatoren verwenden. 19. Während der Inkubation bei 37 C darf es zu keiner Verdunstung kommen. Die Platten mit den beigelegten selbstklebenden Abdeckungen verschließen. 20. Während der Inkubationsphasen das wiederholte Öffnen und Schließen des Inkubators vermeiden. 21. Die Stopp-Lösung nicht in einer flachen Schale aufbewahren oder in die Vorratsflasche zurückfüllen. 22. Darauf achten, dass der Plattenboden sauber und trocken ist und dass die Flüssigkeitsoberfläche vor dem Ablesen der Platte blasenfrei ist. Sämtliche Blasen in den Vertiefungen entfernen, z. B. durch leichtes Klopfen. 23. Beim Arbeiten mit Laborautomaten darauf achten, dass diese validiert sind. 24. Es wird dringend empfohlen, das Aspirations- und Waschsystem regelmäßig zu warten, damit es zu keiner Materialverschleppung von den hochreaktiven zu den areaktiven Proben kommt. HINWEISE ZUR LAGERUNG 1. Der MPD HTLV I/II ELISA 3.0 Kit und seine Komponenten sind bei 2-8 C zu lagern. 2. Alle Testreagenzien und Streifen sind bei Lagerung zwischen 2 C und 8 C in verschlossenem oder ungeöffnetem Zustand bis zum auf dem Kit angegebenen Verfallsdatum stabil. Die Reagenzien nicht einfrieren. 3. Nach dem Öffnen bleibt das Kit 12 Monate stabil. Es gilt jeweils das früheste Verfallsdatum im verschlossenen oder geöffneten Zustand. 4. Wird das Platten-Waschkonzentrat (20fach) bei 2-8 C gelagert, können sich Kristalle bilden. Diese müssen vor der Anwendung durch Erwärmen auf 37 C wieder aufgelöst werden. 5. Wird das Verdünnungsmittel bei 2-8 C gelagert, kann es zu Ausfällungen kommen. Die Testergebnisse werden dadurch nicht beeinflusst. 6. Geöffnete unbenutzte Streifen sind bei 2-8 C in ihrer Verpackung samt dem dort beigelegten Trocknungsmittel zu lagern. PROBENENTNAHME, TRANSPORT UND LAGERUNG Zur Verwendung geeignet sind Serum- oder Plasmaproben, die mit EDTA, Heparin oder Natriumcitrat gewonnen wurden. Stellen Sie vor der Lagerung sicher, dass geronnenes Blut bzw. Blutkörperchen durch Zentrifugation getrennt wurden. Die Proben lassen sich bei 2-8 C lagern, sofern der Test innerhalb von 7 Tagen nach der Entnahme durchgeführt wird. Wird der Test mehr als 7 Tage nach der Probenentnahme durchgeführt, sollten die Proben bei mindestens -20 C eingefroren werden. Vorzugsweise sind klare, nichthämolysierte Proben zu verwenden. Lipämische, ikterische und (mit Partikeln) kontaminierte Proben sind vor dem Test zu filtern (0,45 Øm) oder zu zentrifugieren. Die Patientenseren können inaktiviert werden, jedoch ist dies nicht notwendig, um optimale Testergebnisse zu erhalten. Die Inaktivierung wird folgendermaßen durchgeführt: 1. Verschlusskappen der Serumbehälter lösen. 2. Das Serum für 30 Minuten in einem Wasserbad bei 56 C erhitzen. 3. Das Serum abkühlen lassen, bevor die Kappen wieder verschlossen werden. 4. Das Serum kann bis zur Analyse eingefroren werden. Es wird empfohlen, Patientenseren nicht mehrfach einzufrieren und aufzutauen. ZUSÄTZLICH ERFORDERLICHE MATERIALIEN (NICHT ENTHALTEN) 1. Saugfähiges Einmal-Papier für die Arbeitsfläche und Papierhandtücher. 2. Polypropylen-Röhrchen oder -Behälter 3. Pipetten unterschiedlicher Größe: 5 ml, 10 ml 4. Mehrkanal-Pipette für 50 Øl, 100 Øl und 200 Øl. 5. Pipettierhilfe für Øl. 6. Einmal-Pipettenspitzen. 7. Reagenzbehälter (Wannen) mit 25 ml Fassungsvolumen. 8. Entionisiertes oder destilliertes Wasser hochreiner Qualität. 9. Flaschen: 500 ml, 1000 ml. 10. ELISA Mikrotiterplatten-Wascher. Alternativ können die Mikrotiterplatten manuell mit einem 0,3-ml-Mehrkanal- Pipettor und einem Aspirator gewaschen werden ± 1 C Inkubator. 12. Mikrotiterplatten-Fotometer, Ein- oder Zweikanalversion (A 450 bzw. A ). 13. Natriumhypochlorit-Lösung (5 %) oder haushaltsübliche Flüssigbleiche. 4

5 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN 1. KONJUGAT-ARBEITSLÖSUNG a. Die KONJUGAT-ARBEITSLÖSUNG sollte erst kurz vor Gebrauch angesetzt werden. b. Zum Ansetzen der verdünnten Konjugatlösung wird das Konjugat mit der im Kit mitgelieferten Verdünnungslösung auf 1:500 verdünnt, beispielsweise 10 Øl Konjugat auf 5 ml Verdünnungsmittel. c. Nur Behälter und Röhrchen aus Polypropylen verwenden. d. Für eine Mikrotiterplatte werden 12,0 ml KONJUGAT- ARBEITSLÖSUNG benötigt. VORBEREITUNG DES KONJUGATS Anzahl der Tests Vol. Konjugat (Øl) Vol. Verdünnungsmittel (ml) 24 10,0 5, ,0 7, ,0 10, ,0 12,0 2. VERDÜNNTE WASCHPUFFERLÖSUNG a. Die VERDÜNNTE WASCHPUFFERLÖSUNG sollte erst kurz vor Gebrauch angesetzt werden. b. Das WASCHKONZENTRAT mit hochreinem destillierten Wasser im Verhältnis 1:19 verdünnen. Gut durchmischen. Zum Waschen einer Platte werden etwa 400 ml Waschpufferlösung benötigt. TESTVERFAHREN WICHTIG: - Immunoassays dieser Art sind temperaturempfindlich und zeitabhängig. Durch strenges Einhalten des Testverfahrens werden die Testergebnisse optimiert. Abweichungen von der empfohlenen Vorgehensweise können die Ergebnisse verfälschen. 1. Die Mikrotiterplatte aus der Aluminiumverpackung nehmen. 2. Vor Gebrauch Patientenprobe und Kontrollampullen schütteln. 7. Jeweils 20 Øl REAKTIVE KONTROLLE in die Vertiefungen E1, F1 und G1 geben. Durch leichtes seitlichen Beklopfen der Mikrotiterplatte gut durchmischen und darauf achten, dass die Platte flach auf der Arbeitsfläche liegen bleibt. 8. Die Mikrotiterplatte vorsichtig abdecken, damit es während der Inkubation zu keiner Verdunstung kommt. 9. Für 60 Minuten bei 37 C inkubieren (für die Inkubation kein 37 C Wasserbad verwenden). 10. Wie im Abschnitt VORBEREITUNG DER REAGENZIEN beschrieben die KONJUGAT-ARBEITSLÖSUNG vor dem Waschen der Mikrotiterplatte ansetzen. 11. Die Plattenabdeckung entfernen und entsorgen und die Mikrotiterplatte mit V E R D Ü N N T E R WASCHPUFFERLÖ SUNG entsprechend einer der beiden empfohlenen Methoden waschen. A. Voll- oder halbautomatischer Mikrotiterplatten-Waschautomat - Sechs (6) Waschzyklen mit mindestens 300 Øl je Vertiefung und Zyklus. B. Mikrotiterplatten-Wäsche von Hand - Den Inhalt der Vertiefungen vollständig aspirieren, indem die Absaugspitze vorsichtig bis auf den Boden jeder Vertiefung abgesenkt wird. VORSICHTIG DURCHFÜHREN, DAMIT DIE OBERFLÄCHE DER VERTIEFUNGEN NICHT ZERKRATZT WIRD. Die gesamte Platte mit mindestens 300 Øl je Vertiefung füllen und danach sofort in derselben Reihenfolge aspirieren. Diesen Vorgang insgesamt sechs (6) Mal durchführen. 20 Øl 60 Minuten 300 Øl je Vertiefung und Zyklus. 3. Reagenzbehälter mit VERDÜNNUNGSLÖSUNG befüllen. Mit einer Mehrkanal-Pipette 200 Øl VERDÜNNUNGSLÖSUNG in alle Vertiefungen geben. 4. Vertiefung A1 und B1 sind LEERPROBEN. IN DIESE VERTIEFUNGEN KEINE PROBEN GEBEN. In diese Vertiefungen zusätzliche 20 Øl Verdünnungslösung geben Øl der Probe in die ihr zugeordnete Vertiefung geben, dabei mit H1 beginnen. Die Probe ist nun letztendlich verdünnt im Verhältnis 1: 11. PROBEN NICHT IN LEERE VERTIEFUNGEN GEBEN. 6. Nach Hinzufügen der Proben jeweils 20 Øl NICHTREAKTIVE KONTROLLE in die Vertiefungen C1und D1 geben. 200 Øl 20 Øl 20 Øl 20 Øl 12. Die Mikrotiterplatte umdrehen und durch festes Ausklopfen auf das saugfähige Papiertuch trocknen. Es sollten alle Rückstände der Waschpufferlösung auf diese Weise trockengetupft werden. Ansonsten könnte die Farbentwicklung während der Substratinkubation durch Rückstände der Waschpufferlösung gehemmt werden. 13. Einen Reagenzbehälter mit KONJUGAT- ARBEITSLÖSUNG füllen. Mit einer Mehrkanal-Pipette in jede Vertiefung 100 Øl KONJUGAT-ARBEITSLÖSUNG geben. Eine neue Plattenabdeckung aufbringen. 14. Für 30 Minuten bei 37 C inkubieren (für die Inkubation kein 37 C Wasserbad verwenden). 100 Øl 30 Minuten 5

6 15. Die Plattenabdeckung entfernen und entsorgen. Den Waschvorgang entsprechend der Schritte 11 und 12 wiederholen. 16. Einen Reagenzbehälter mit SUBSTRAT füllen. Mit einer Mehrkanal-Pipette 100 Øl SUBSTRAT-ARBEITSLÖSUNG in jede Vertiefung geben. Die Platte abdecken. 17. Für 15 Minuten im Dunkeln bei 37 C inkubieren. (Für die Inkubation kein 37 C Wasserbad verwenden). 18. Die Plattenabdeckung entfernen und entsorgen. 19. Mit einer Mehrkanal-Pipette in jede Vertiefung 100 Øl STOPP-LÖSUNG geben. Durch leichtes Antippen der Platte gut durchmischen. 100 Øl 15 Minuten 100 Øl TESTERGEBNISSE Die Testergebnisse sind für jede Mikrotiterplatte getrennt zu berechnen und auszuwerten, und zwar unabhängig davon, mit wie vielen Platten gleichzeitig gearbeitet wird. DER MITTLERE ABSORPTIONSWERT DER LEERPROBEN IST VON ALLEN ABSORPTIONSWERTEN EINER PLATTE ZU SUBSTRAHIEREN, BEVOR SICH DIE ERGEBNISSE AUSWERTEN LASSEN. Das Vorliegen bzw. Fehlen spezifischer HTLV-I/II-Antikörper wird durch die Relation der Probenabsorption zum CUT-OFF-WERT bestimmt. Der CUT-OFF-WERT errechnet sich aus (0,45 Absorptionseinheit + NRC mittlere Absorption):- CUT-OFF-WERT = 0,45 + NRCx BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 20. Die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm messen. Bei Verwendung eines Zweikanal-Fotometers sollte die Referenzwellenlänge bei 620 nm liegen. BITTE BEACHTEN: Die Extinktion sollte 10 Minuten nach Zugabe der STOPPLÖSUNG gemessen werden. QUALITÄTSKONTROLLE 1. Bei jedem Probenlauf sollten die LEERPROBEN und die NICHTREAKTIVEN KONTROLLEN auf jeder Platte doppelt und die REAKTIVEN KONTROLLEN dreifach bestimmt werden. 2. Die Extinktion der Leerwerte muss 0,100 betragen. 3. Nichtreaktive Kontrollen müssen nach Subtraktion der Leerprobenabsorption eine Absorption von 0,000 und 0,100 aufweisen. 4. Mindestens 2 der 3 reaktiven Kontrollen müssen nach Subtraktion des Leerwerts eine Extinktion von 0,800 aufweisen. Alle Messwerte außerhalb dieses Bereichs sollten nicht in die Berechnung der mittleren Absorption der reaktiven Kontrolle (RC x ) einfließen. 5. Weichen mindestens zwei der Reaktivkontrollen um > 30 % vom entsprechenden MITTELWERT ab, ist der Probenlauf UNGÜLTIG und muss wiederholt werden. 6. Der Test ist valide, wenn die Differenz zwischen der mittleren Absorption der reaktiven und nichtreaktiven Kontrolle (RC x - NRC x ) 0,700 beträgt. Trifft dies nicht zu, ist ein Fehler bei der Testdurchführung zu vermuten und der Test muss wiederholt werden. Konstant niedrige Ergebnisse für die mittlere Absorptionsdifferenz (RC x- NRC x) lassen eine Qualitätsminderung der Reagenzien vermuten. 1. Berechnung der mittleren Absorption der nichtreaktiven Kontrolle (NRC x ) Beispiel: Vertiefung Nr. Absorption C1 0,020 D1 0,022 Gesamt 0,042 Mittelwert 0,042 / 2 = 0,021 (NRC x ) Die Werte der nicht reaktiven Kontrollen sollten jeweils 0,100 betragen. Falls ein Absorptionswert der nichtreaktiven Kontrolle nicht beide obigen Kriterien erfüllt, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. 2. Berechnung der mittleren Absorption der reaktiven Kontrolle (RC x ) Beispiel: Vertiefung Nr. Absorption E1 1,221 F1 1,144 G1 1,298 Gesamt 3,663 Mittelwert 3,663 / 3 = 1,221 (RC x ) Die Werte der reaktiven Kontrollen müssen jeweils 0,800 betragen. Wenn eine reaktive Kontrolle die oben genannten Kriterien nicht erfüllt, muss sie als abweichend ausgeschlossen werden. In diesem Fall sollte die mittlere Absorption der reaktiven Kontrolle (RC x ) dann nur anhand der Werte der verbleibenden reaktiven Kontrollen berechnet werden. Jeder der verbleibenden Messwerte für die reaktive Kontrolle muss allen obengenannten Testkriterien entsprechen, ansonsten ist der Test ungültig und muss wiederholt werden. 6

7 3. Berechnung der Differenz zwischen RC x und NRCx Beispiel: NRC x = 0,021 RC x = 1,221 RC x - NRC x = 1,221-0,021 = 1,200 Der Test ist dann valide, wenn die Differenz RC x - NRC x mindestens 0,700 beträgt. Ist dies nicht der Fall, sind Fehler bei der Durchführung oder eine Qualitätsminderung der Reagenzien zu vermuten und der Test sollte wiederholt werden. 4. Berechnung des CUT-OFF-WERTES CUT-OFF-WERT = 0,450 + NRCx Beispiel: NRC x = 0,021 CUT-OFF-WERT = 0, ,021 = 0,471 BEURTEILUNG DER ERGEBNISSE 1. Proben mit Absorptionswerten < CUT-OFF-WERT werden beim MPD HTLV I/II ELISA 3.0 als nichtreaktiv eingestuft. 2. Proben mit Extinktionswerten größer oder gleich dem Cutoff-Wert gelten nach den Kriterien des MPD HTLV I/II ELISA 3.0 als initial reaktiv und sollten vor der Auswertung erneut in Doppelbestimmung getestet werden. 3. Sind die Proben auch beim Nachtest erneut reaktiv, werden sie nach den Kriterien des MPD HTLV I/II ELISA 3.0 als wiederholt reaktiv auf Antikörper gegen HTLV-I/II eingestuft. 4. Proben, die beim ersten Testen reaktiv, jedoch nach Wiederholung des Tests nichtreaktiv sind, werden nach den Kriterien des MPD HTLV I/II ELISA 3.0 als negativ eingestuft. 5. Proben, die beim MPD HTLV I/II ELISA 3.0 wiederholt reaktiv sind, sollten zusätzlich mit noch spezifischeren Tests, beispielsweise mit dem MPD HTLV BLOT 2.4., nachgetestet werden. SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE Der MPD HTLV I/II ELISA 3.0 (TMB-Version) entspricht dem MPD HTLV I/II ELISA 3.0 (OPD-Version). Aus technischer und biologischer Sicht ähneln sich die beiden Assays in folgenden Aspekten: Einsatzbedingungen Spezifikationen/Eigenschaften Design Einsatzmethoden Funktionsprinzip Kontakt der gleichen Materialien mit den gleichen Körperflüssigkeiten Die Assays unterscheiden sich in folgenden Aspekten: verwendetes Substrat (OPD vs. TMB) Typ & Menge der erforderlichen Stopplösung (Schwefelsäure vs. Salzsäure) Wellenlänge, bei der der Assay abgelesen wird (492 vs. 450 nm) Die Leistungsfähigkeit des MPD HTLV I/II ELISA 3.0 beim Nachweis von Antikörpern gegen HTLV-I und HTLV-II wurde zunächst anhand der OPD-Version untersucht. Die wie unten angegeben erzielten Ergebnisse wurden anschließend auf die TMB-Version extrapoliert. HINWEIS: Die australische Studie wurde sowohl mit OPDals auch mit TMB-Substratsystemen durchgeführt und ergab konkordante Werte [155/155] für beide Substrattypen ( 99,9 %). Sensitivität 420 reaktive Proben (mit ELISA und/oder Western Blot positiv getestet) wurden an drei Orten - hausintern, in Schweden und in Australien - in drei getrennten Auswertungen untersucht. Die schwedische Studie (n=163) deutet auf eine mit den modernsten Testsystemen vergleichbare Sensitivität hin. Während bei der australischen Auswertung (n=155) eine Sensitivität von 100 % ermittelt wurde, ergab sich bei der hausinternen Auswertung ausgehend von kommerziellen Proben und dem Mixed Titer Performance Panel PRP206 eine Sensitivität von 99 % (105/ 106). Die eine Probe, die bei der hausinternen Auswertung mit dem MPD HTLV I/II ELISA 3.0 negativ getestet wurde, wurde auch mit einem ELISA eines anderen Herstellers negativ getestet. Im Western Blot wurde die Probe als fraglich eingestuft; sie wies schwache GD21- und p19-banden auf. Alle drei Auswertungen weisen insgesamt auf eine Sensitivität von über 99,7 % hin. Spezifität Insgesamt wurden 5300 Proben untersucht, darunter 5000 Proben von zufällig ausgewählten Blutspendern, 200 klinische Proben und 100 potenziell störende Proben. Die diagnostische Spezifität betrug in der Gruppe der Proben von zufällig ausgewählten Blutspendern 99,8 %, in der Gruppe der klinischen Proben 98 % und in der Gruppe der potenziell störenden Proben 97 %. Der MPD HTLV I/II ELISA 3.0 zeigte bei allen drei untersuchten Probengruppen eine hohe Spezifität von über 99 %. Reproduzierbarkeit Die Inter- und Intra-Chargen-Reproduzierbarkeit des MPD HTLV I/II ELISA 3.0 wurde hausintern mit den Kitkontrollen, einer HTLV-I-positiven Probe, einer HTLV-I/II-negativen Probe und ACCURUN 24, einer Multi-Marker-Bestätigungskontrolle der Firma BBI, ausgewertet. Inter-Chargen-Reproduzierbarkeit : Zwei Mikrotiterplatten- Chargen wurden an vier verschiedenen Terminen mit drei Replikaten jeder Kitkontrolle und acht Replikaten der bei jedem Termin verbleibenden Proben getestet. Intra-Chargen-Reproduzierbarkeit : Eine Mikrotiterplatten-Charge wurde an vier verschiedenen Tagen zweimal pro Tag mit acht Replikaten jeder Probe, einschließlich Kitkontrollen für jeden Testdurchlauf, getestet. Die Ergebnisse deuteten auf einen Variationskoeffizienten (VK) von 3-8 % für die untersuchten Proben hin. EINSCHRÄNKUNGEN FÜR DAS TESTVERFAHREN Wiederholt reaktive Ergebnisse beim MPD HTLV I/II ELISA 3.0 deuten auf das Vorliegen von Antikörpern gegen HTLV-I/II in der Probe hin. Ein NICHTREAKTIVES Ergebnis beim MPD HTLV I/II ELISA 3.0 deutet darauf hin, dass die Probe wahrscheinlich keine nachweisbaren Antikörper gegen HTLV-I/ II aufweist. Es liegen jedoch keine aussagekräftigen Daten vor, um bei Blutproben, die mit dem MPD HTLV I/II ELISA 3.0 als nichtreaktiv eingestuft wurden, eine Infektion mit HTLV-I/II absolut sicher auszuschließen. Bei einem NEGATIVEN Ergebnis ist ein Kontakt bzw. die Infektion mit HTLV-I/II nicht definitiv ausgeschlossen. Mit einem Test dieser Art kann es zu falsch-reaktiven Ergebnissen kommen. Der Anteil falsch-reaktiver Ergebnisse hängt von der Sensitivität und Spezifität des Testkits ab. Für die meisten Screening-Tests gilt: Je höher die Prävalenz der HTLV-I/II- Antikörper in einer Population, desto geringer der Anteil der falsch-reaktiven Tests. 7

8 EINGESCHRÄNKTE GARANTIE Der Hersteller sichert lediglich die Funktionstüchtigkeit des Assays zum Gebrauch für die in vitro Diagnostik innerhalb der Bestimmungen und Einschränkungen zu, die im Bedienungshandbuch des Tests beschrieben sind, sofern der Test unter Beachtung der dortigen Anweisungen durchgeführt wird. Der Hersteller lehnt jegliche - ausdrückliche oder stillschweigende - Gewährleistung ab, einschließlich einer solchen ausdrücklichen oder stillschweigenden Garantie auf Marktgängigkeit, Gebrauchsfähigkeit oder unterstellter Verwendbarkeit für andere Zwecke. Die Haftung des Herstellers beschränkt sich auf entweder Ersatz des Produktes oder Rückerstattung des Kaufpreises für das Produkt. Der Hersteller haftet nicht gegenüber dem Käufer oder gegenüber Dritten für jedwede Schäden, Verletzungen oder wirtschaftliche Verluste, in welcher Form auch immer diese durch den Gebrauch oder in der Anwendung des Produktes hervorgerufen werden mögen. TECHNISCHE PROBLEME/REKLAMATIONEN Bei eventuellen technischen Problemen/Reklamationen bitte folgende Hinweise beachten: 1. Die Chargennummer und das Verfalldatum notieren. 2. Den Kit und die damit gewonnenen Testergebnisse verwahren. 3. Mit der nächstgelegenen Vertretung von MP Biomedicals oder dem für Sie zuständigen Repräsentanten in Verbindung setzen. LITERATUR 1. Poisez B.J. et al. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77: Regionale Vertretungen: MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd. 85 Science Park Drive #04-01, The Cavendish Singapore Science Park Singapur Tel. : Fax : enquiry_ap@mpbio.com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St.Ingbert Deutschland Tel. : Fax : info@mt-procons.com MP Biomedicals Suisse S.A. Halle de Fret/Aeroport P.O. Box Genf 5 Schweiz Tel. : Fax : mpbiosuisse@mpbio.com 2. Kalyanaraman V.S. et al. A new subtype of human T-cell leukemia virus (HTLV-II) associated with a T-cell variant of hairy cell leukemia. Science 1982, 218: Williams A.E. et al. Seroprevalence and epidemiological correlates of HTLV-I infection in U.S. blood donors. Science 1988, 240: Lipka J.J. et al. (1990). Enhancing the sensitivity of HTLV-I immunoassays in Human Retrovirology. HTLV, W.A. Blattner (ed.), Raven Press (NY): Lee H. et. al. High rate of HTLV-II infection in seropositive IV drug abusers in New Orleans. Science 1989, 244: Lipka J.J. et al. Modified Western Blot Assay for confirmation and differentiation of Human T-cell Lymphotropic Virus Type- I and II. J. Infect Dis. 1991, 164: Lipka J.J. et al. Segregation of Human T-Cell Lymphotropic Virus Type I and II infections by Antibody Reactivity to Unique Viral Epitopes.J. Infect. Dis. 1992, 165: Hadlock K.G., Goh C.J., Bradshaw P.A.,Perkins S., Lo J., Habbas R.K., Kaplan L. und Foung S.K.H. Delineation of an Immunodominant and highly HTLV specific epitope within the HTLV-I transmembrane glycoprotein. Blood 1995, 68 (4): Varma M., Rudolph D., Knuchel M., Switzer W., Hadlock K.G., Velligan M., Chan L., Foung S.K.H. und Lal R.B. Enhanced specificity of truncated transmembrane protein for serologic confirmation of HTLV-I and HTLV-II infection by Western Blot assay containing recombinant envelope glycoproteins. J. Clin. Micro 1995, 33 (12): * Patent - Australien , , * Patent - USA 5,066,579, 5,614,366 5,763,572, 5,814,441 5,871,933, 5,643,714 * Patent - Kanada * Patent - Europa * Patent - Japan * Schriftzug und Logo von Genelabs sind von Genelabs Technologies, Inc. lizenziert.